EP1841847A1 - Verfahren zur herstellung einer dha-haltigen fettsäure-zusammensetzung - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer dha-haltigen fettsäure-zusammensetzung

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EP1841847A1
EP1841847A1 EP06701343A EP06701343A EP1841847A1 EP 1841847 A1 EP1841847 A1 EP 1841847A1 EP 06701343 A EP06701343 A EP 06701343A EP 06701343 A EP06701343 A EP 06701343A EP 1841847 A1 EP1841847 A1 EP 1841847A1
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EP
European Patent Office
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fatty acid
acid composition
biomass
equal
esters
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06701343A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Fabritius
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celanese Sales Germany GmbH
Original Assignee
Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH filed Critical Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Publication of EP1841847A1 publication Critical patent/EP1841847A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fatty acid composition which contains, based on the total weight of the fatty acids contained in the fatty acid composition and / o "of the fatty acid derivatives at least 70.0 wt .-% docosahexaenoic acid and / or docosahexaenoic.
  • PUFAs Highly unsaturated polyunsaturated fatty acids
  • PUFAs are essential fatty acids in human metabolism.
  • PUFAs can be divided into two large groups.
  • ⁇ -6 PUFAs which is formulated starting from linoleic acid
  • ⁇ -3 PUFAs which is built up from the ⁇ -linolenic acid.
  • PUFAs are important building blocks of cell membranes, retina and meninges and precursors of important hormones such as prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • precursor fatty acids precursors, eg ⁇ -linolenic acid
  • the human is able to synthesize highly unsaturated fatty acids.
  • this amount is sufficient to meet the need for high-unsaturated fatty acids is controversial.
  • vegetable oils are enriched with ⁇ -6 fatty acids, (for example, evening primrose oil contains ⁇ -linolenic acid (GLA)), but only up to a chain length of Cl 8, and fish oils or oils from microorganisms with ⁇ -3 fatty acids (eg, salmon oil contains eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA; all-cis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenoic acid)).
  • GLA ⁇ -linolenic acid
  • fish oils or oils from microorganisms with ⁇ -3 fatty acids eg, salmon oil contains eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA; all-cis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenoic acid).
  • fish oils and microorganism oils are the only commercial source of highly unsaturated fatty acids.
  • the content of the desired PUFA is low and these are present in a mixture, and antagonistic PUFAs may also be included.
  • antagonistic PUFAs may also be included.
  • a high amount of oil must be taken.
  • this applies to those patients who must take high doses of PUFAs (for example, in cystic fibrosis).
  • enriched or high-purity PUFAs must be used. There is therefore a high demand for high-purity PUFAs in the prior art.
  • WO 01/51598 A1 discloses a process for the preparation of an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters, in which an oil of Schizochytrium sp. transesterified with an alcohol (methanol). The fatty acid esters are then dissolved together with urea in a medium and cooled or concentrated to at least partially separate the saturated fatty acid esters which precipitate together with the urea. In this way, an oil can be obtained which, according to gas chromatography, contains 23.4% by weight of ⁇ -6 DPA methyl ester, 65.2% by weight of ⁇ -3-DHA methyl ester, 2.9% by weight of myristic acid. Methyl ester and 1.5 wt .-% palmitic acid methyl ester.
  • the process should provide a fatty acid composition with the highest possible purity and quality, in particular with the lowest possible acid value and / or with the lowest possible heavy metal content.
  • the process should be as gentle as possible and in particular to fatty acid compositions with the lowest possible peroxide - lead.
  • the process according to the invention should be possible as far as possible using solvents which are as suitable as possible for food.
  • the use of hazardous substances should be avoided as far as possible.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process should have the lowest possible ethyl carbamate content, in particular the Application of fatty acid compositions in the food industry without hesitation.
  • a fatty acid composition which, based on the total weight of the fatty acids and / or fatty acid derivatives present in the fatty acid composition, contains at least 70.0% by weight of all-cis 4,7,10, 13,16,19 docosahexaenoic acid and / or allcis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenoic acid alkyl ester, wherein: a) one from Ulkenia sp.
  • transesterifying available biomass with at least one alcohol to form at least one docosahexaenoic acid alkyl ester and at least one saturated fatty acid ester b) preparing a solution containing urea, at least part of the transesterified biomass from step a) and at least one organic solvent, c ) cooling or concentrating the solution of step b) to i) a precipitate containing urea and at least a portion of the saturated fatty acid esters, and ii) forming a liquid fraction, d) the precipitate i) of the liquid fraction ii) disconnects, fails to provide a novel and useful process for preparing a fatty acid composition which, based on the total weight of the fatty acids and / or fatty acid derivatives present in the fatty acid composition, is at least 70.0 wt.
  • the method according to the invention can be carried out in a simple manner, on an industrial scale and at low cost. > The inventive method is extremely efficient and makes the
  • the process according to the invention provides a fatty acid composition with comparatively high purity and quality, in particular with a comparatively low acid number and with a comparatively low heavy metal content.
  • the acid number of the fatty acid composition is preferably less than or equal to 1.5 mg KOH per g of fatty acid composition, desirably less than or equal to 0.8 mg KOH per g of fatty acid composition, preferably smaller or equal to 0.2 mg KOH per g fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.06 mg KOH per g fatty acid composition.
  • the process according to the invention is comparatively gentle and leads to fatty acid compositions with a comparatively low peroxide content.
  • the peroxide value of the fatty acid composition measured according to AOCS Official Method Cd-3d 63, is preferably less than or equal to 0.5 meq. per kg of fatty acid composition, suitably less than or equal to 0.1 meq. per kg of fatty acid composition, preferably less than or equal to 0.05 meq. per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.01 meq. per kg fatty acid composition.
  • the heavy metal content of the fatty acid composition is preferably less than or equal to 0.7 mg per kg fatty acid composition, advantageously less than or equal to 0.4 mg per kg fatty acid composition, preferably smaller or equal to 0.3 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.2 mg per kg of fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are distinguished by a comparatively low cadmium content.
  • the cadmium content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured in accordance with LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.20 mg per kg of fatty acid
  • Composition suitably less than or equal to 0.10 mg per kg of fatty acid composition, preferably less than or equal to 0.05 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.03 mg per kg of fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are characterized by a comparatively low lead content.
  • the lead content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured in accordance with LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.20 mg per kg fatty acid composition, advantageously less than or equal to 0.10 mg per kg fatty acid composition , preferably less than or equal to 0.05 mg per kg fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.03 mg per kg fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are characterized by a comparatively low mercury content.
  • the mercury content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured according to LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.10 mg per kg fatty acid composition, suitably less than or equal to 0.05 mg per kg fatty acid composition, preferably less than or equal to 0.01 mg per kg fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.005 mg per kg fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are distinguished by a comparatively low arsenic content.
  • the arsenic content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured in accordance with LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.20 mg per kg of fatty acid
  • Composition suitably less than or equal to 0.10 mg per kg of fatty acid composition, preferably less than or equal to 0.05 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.03 ⁇ mg per kg of fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are characterized by a comparatively low copper content.
  • the copper content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured according to LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.25 mg per kg fatty acid composition, advantageously less than or equal to 0.20 mg per kg fatty acid composition , preferably less than or equal to 0.10 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.06 mg per kg of fatty acid composition.
  • r> obtainable by the process of fatty acid compositions are characterized content of iron by a comparatively low.
  • the iron content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured in accordance with LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.25 mg per kg fatty acid composition, advantageously less than or equal to 0.20 mg per kg fatty acid composition , preferably less than or equal to 0.10 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.06 mg per kg of fatty acid composition.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process are characterized by a comparatively low nickel content.
  • the nickel content of the fatty acid compositions obtainable according to the invention, measured according to LMBG ⁇ 35 L06.00-7, is preferably less than or equal to 0.25 mg per kg fatty acid
  • Composition expediently less than or equal to 0.20 mg per kg of fatty acid composition, preferably less than or equal to 0.10 mg per kg of fatty acid composition, in particular less than or equal to 0.06 mg per kg of fatty acid composition.
  • comparatively food-safe solvents are used.
  • the fatty acid compositions obtainable by the process according to the invention furthermore have a comparatively low ethylcarbamate content and are therefore particularly suitable for applications in the foodstuffs sector.
  • the present invention relates to a process for preparing a fatty acid composition which, based on the total weight of the fatty acids and / or fatty acid derivatives present in the fatty acid composition, preferably based on the total weight of the fatty acids and / or fatty acid esters contained in the fatty acid composition, in particular based on the total weight of the fatty acids and / or fatty acid triglycerides contained in the fatty acid composition, at least 70.0% by weight of all-cis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenoic acid and / or all-cis 4,7, 10,13,16,19 docosahexaenoic acid alkyl ester.
  • fatty acid composition in this context includes both compositions containing free fatty acids and compositions containing fatty acid derivatives, preferably fatty acid esters, especially fatty acid triglycerides, wherein the fatty acid residues may in principle be the same or different.
  • fatty acids denote aliphatic carboxylic acids which may be saturated or mono- or polyunsaturated and preferably have from 6 to 30 carbon atoms.
  • Biomass used as starting material From Ulkenia sp. Available biomasses are known per se. According to the invention, both biomasses of Ulkenia sp. Wild-type strains as well as biomass of mutant or recombinant Ulkenia sp. Strains that efficiently produce DHA (all-cis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenoic acid) and / or DPA (all-cis 4,7,10,13,16 docosapentaenoic acid). Such mutant or recombinant strains include microorganisms which, compared to the percentage of the original Ulkenia sp.
  • Wild-type strain using the same substrate, a higher percentage of DHA and / or DPA in fats and / or compared to that obtained by the original Ulkenia sp. Wild-type strain, using the same substrate, containing a higher total amount of lipids.
  • a Ulkenia sp. Dry mass used as starting material.
  • an oil from Ulkenia sp. used as starting material.
  • Oils from Ulkenia sp. are conveniently obtained by cultivating the microorganism rich in DHA, harvesting the biomass from the culture, digesting and isolating the oil.
  • a very particularly favorable method in this context is described in WO 03/033631 A1, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • Extractions with organic solvents are described inter alia in WO 9737032, in WO 9743362 and EP 515460. A particularly detailed presentation can also be found in the Journal of Dispersion Science and Technology, 10, 561-579, 1989 "Biotechnological. Processes for the Production of PUFAs".
  • the extraction can also be carried out without solvent.
  • a particularly favorable process in this context is described in EP-A-1178118. In this process, a solvent is avoided by preparing an aqueous suspension of the biomass and separating the oil phase from the aqueous phase by centrifugation.
  • the composition of Ulkenia sp. Biomass available can vary widely.
  • it contains at least one glyceride, in particular a triglyceride, which comprises at least one polyunsaturated fatty acid radical.
  • at least 10%, more preferably at least 25% and especially at least 30% of the fatty acid residues in the biomass are DHA residues.
  • a “glyceride”, as used herein, is an ester of glycerin and at least one fatty acid wherein one to three hydroxyl groups of the glycerol have been esterified with one or more fatty acid residues Radicals may be the same or different.
  • Triglycerides ie esters of three fatty acid residues and glycerine.
  • Each fatty acid residue may be either saturated (ie all bonds between the carbon atoms are single bonds) or unsaturated (ie there is at least one carbon-carbon double or triple bond).
  • the nature of the unsaturated fatty acid residues are sometimes characterized herein with a ⁇ . This number indicates the position of the first double bond, when counting from the terminal methyl group of the fatty acid or fatty acid residue.
  • the transesterification step is to cleave the fatty acid residues from the glycerol backbone of the glycerides in the starting material and form separate esters from each of the residues (at least one docosahexaenoic acid alkyl ester and at least one saturated fatty acid ester) such that the esters are separated can be.
  • the transesterification is preferably carried out using at least one alcohol of the formula R 1 -OH, where R 1 is a linear or branched alkyl radical having 1 to 20, preferably 1 to 6, in particular 1 to 4, carbon atoms. Particularly preferred are the methyl esters and ethyl esters, especially the ethyl esters.
  • the transesterification is catalyzed by at least one base.
  • bases include sodium methoxide, potassium methoxide, elemental sodium, sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • the volume ratio of the biomass to the base / alcohol mixture is 1: 1 to 1: 5.
  • the concentration of the base in the alcohol is preferably 0.1 to 2 M.
  • the transesterification reaction is carried out at room temperature (ie at a temperature in the range of about 20-25 ° C.) for 6-20 hours.
  • the transesterification reaction at a temperature above room temperature, preferably at a temperature of at least 40 0 C, more preferably at a temperature of 70 to 150 0 C, in particular at a temperature above the boiling point of one or more components in the Mixture (under reflux), carried out.
  • the transesterification is catalyzed by at least one acid, preferably by the biomass at a temperature of about 0 to about 15O 0 C in a mixture which incubates the at least one alcohol and at least one acid, preferably HCl, preferably under an inert gas atmosphere and in the absence of water.
  • the triglyceride / acid / alcohol mixture is refluxed for at least 2 hours.
  • the triglyceride / acid / alcohol mixture is maintained at a temperature of 0 to 5O 0 C for at least 12 hours.
  • the triglyceride concentration in the alcohol / acid mixture is 0.1 to 15% by weight.
  • the concentration of the acid, preferably HCl, in the alcohol / acid mixture is preferably 4 to 15% by weight.
  • Such a mixture can be prepared by many different methods known in the art, such as, for example, by introducing gaseous hydrogen chloride into dry alcohol or by adding acetyl chloride to alcohol.
  • HCl is most preferred in the present invention, other acids may alternatively be used.
  • Such an acid is H 2 SO 4 , which is preferably used at a concentration of 0.5 to 5% by weight in the alcohol.
  • H 2 SO 4 is a strong oxidizing agent, and therefore preferably only in combination with short reflux times (ie, less than 6 hours), low concentrations (ie, less than 5 wt%), and low temperatures (ie, less 15O 0 C) is used.
  • boron fluoride which is preferably used at a concentration of 1-20% by weight.
  • HCl is preferred over boron fluoride because boron fluoride is more prone to form undesired by-products.
  • the transesterification reaction is preferably carried out under an inert gas atmosphere (eg noble gas and / or N 2 ). Furthermore, an antioxidant (eg Ascorbyl palmitate or propyl galate) may be added to the reaction mixture to prevent autooxidation.
  • an antioxidant eg Ascorbyl palmitate or propyl galate
  • At least one organic solvent is preferably added.
  • preferred solvents include those compounds which are capable of dissolving the fatty acid esters to be transesterified.
  • the organic solvent is preferably capable of dissolving all the fatty acid esters to be transesterified.
  • Very particularly suitable solvents according to the invention include dichloromethane, acetonitrile, ethyl acetate and diethyl ether, in particular dichloromethane.
  • the esters are preferably separated from the reaction mixture by addition of water. Often, the esters (which are organic) float on top of the reaction mixture and can easily be separated from the remaining reaction mixture. This is especially true for large-scale, industrial applications.
  • a liquid-liquid solvent extraction can be used to separate the esters from the remaining reaction mixture.
  • This extraction can vary within a wide range.
  • water is added to the mixture and the esters are extracted with a non-polar solvent. If the transesterification has been catalyzed by at least one base, the water preferably comprises a sufficient amount of acid, preferably HCl, citric acid or acetic acid, especially HCl, to neutralize the mixture or more preferably to give the mixture a weakly acidic pH.
  • the ratio of the total volume of the non-polar solvent to the volume of the reaction mass (including the added water) can also be varied within a wide range, and is more preferably from 1: 3 to 4: 3.
  • the mixture is extracted with several fractions of the non-polar organic solvent, which are finally combined.
  • Particularly suitable non-polar solvents according to the present invention include petroleum ether, pentane, hexane, cyclohexane and heptane, with hexane and petroleum ether being most preferred.
  • the non-polar solvent may also contain a small amount of a weakly polar organic solvent, such as diethyl ether.
  • a weakly polar organic solvent such as diethyl ether.
  • the volumetric concentration of the weakly polar component to the nonpolar component is preferably not greater than about 20%, more preferably not greater than 10%, and most preferably from 5% to 10%.
  • the resulting organic extraction solvent layer may be washed to remove, for example, any acid residues and / or remaining water.
  • the removal of acid residues is preferably accomplished by washing the layer with an aqueous solution containing a weak base, e.g. For example, potassium carbonate.
  • Remaining water removal can be achieved, for example, by washing the layer with a brine (i.e., a saturated brine) and / or by drying with an anhydrous salt (e.g., sodium sulfate or magnesium sulfate).
  • the fatty acid esters can be concentrated in the non-polar solvent layer. According to a preferred embodiment, the fatty acid esters can be concentrated in the non-polar solvent layer. According to a preferred
  • the esters are concentrated by evaporating a portion of the non-polar solvent.
  • the transesterification of a from Ulkenia sp. Biomass available in addition to the DHA alkyl ester usually provides other fatty acid esters. Many of these fatty acid esters, especially the saturated fatty acid esters, have unknown and / or adverse medical properties and nutritional properties. It is therefore necessary, as completely as possible to remove the saturated fatty acid esters from the transesterification reaction mixture.
  • the process according to the invention therefore comprises a urea crystallization in which b) first produces a solution containing urea, at least part of the transesterified biomass from step a) and at least one organic solvent, c) cooling the solution from step b) or concentrated to i) a precipitate containing urea and at least a portion of the saturated fatty acid esters, and ii) forming a liquid fraction, d) separating the precipitate i) from the liquid fraction ii).
  • urea crystallizes in a solution containing polyunsaturated fatty acid esters (eg, esters of DHA) and saturated fatty acid esters obtained by transesterification using the method described above
  • a precipitate forms which comprises the urea and at least a portion thereof containing the saturated fatty acid ester.
  • this precipitate comprises a much lower proportion of polyunsaturated fatty acid esters than the starting solution. The majority of polyunsaturated fatty acid esters therefore remain in solution and can be easily separated from the precipitated saturated fatty acid esters.
  • the urea crystallization separation process of the present invention comprises first forming a solution containing the fatty acid esters and urea.
  • the amount of urea is preferably proportional to the
  • Urea is preferably 1: 1 to 1: 4.
  • the solution also preferably comprises at least one organic solvent which dissolves urea and the desired DHA ester, more preferably urea and all fatty acid esters in the mixture.
  • particularly suitable solvents include alcohols having 1 to 4 carbon atoms, with methanol and ethanol, especially ethanol, being particularly preferred.
  • the volumetric ratio of the mixture of the fatty acid esters to the solvent is preferably 1: 5 to 1:20.
  • substantially all of the urea is dissolved in the solution.
  • This can generally be achieved by heating the solution, preferably to a temperature of greater than 50.degree.
  • the solution is prepared by dissolving the urea and the fatty acid ester mixture from each other, preferably, dissolved separately under heating, particularly at temperatures greater than 5O 0 C in the solvent and the resulting solutions then mixed together ,
  • the solution containing the fatty acid esters and the urea is preferably cooled to form a precipitate comprising urea.
  • the solution is cooled to a temperature of less than 40 ° C, preferably less than or equal to 30 0 C, in particular less than or equal to 25 ° C, the temperature conveniently greater than 10 0 C, preferably greater than or equal to 15 0 C, suitably greater or equal to 20 ° C, is.
  • the cooled solution is preferably allowed to stand for a certain period of time, typically not longer than about 20 hours, preferably for 5 to 20 hours, at the cooled temperature with occasional stirring.
  • a urea-containing precipitate is formed by concentrating the solution containing the fatty acid esters and the urea.
  • the solution can be concentrated by adding a portion of the solvent evaporated in the solution.
  • the amount of solvent removed is preferably sufficient to effect a urea concentration in the solution that exceeds the saturation concentration.
  • the urea crystallization is conveniently carried out under an inert gas atmosphere (eg noble gases and / or N 2 )
  • the precipitate is preferably separated from the liquid fraction enriched with polyunsaturated esters. This is preferably achieved by filtration or centrifugation. According to a particularly preferred embodiment, the precipitate is then (preferably saturated with urea) with a small amount of the organic solvent washed 'by adhering to the precipitate, polyunsaturated recover fatty acid esters. This washing solution is in turn preferably combined with the liquid fraction.
  • the liquid fraction is preferably concentrated, combined with water, and the esters contained in the liquid fraction are preferably extracted with a non-polar solvent.
  • the liquid fraction may be concentrated by vaporizing a portion of the solvent from the liquid fraction, wherein the vaporized amount of the solvent is preferably not so large that further urea precipitates.
  • the amount of water added to the concentrated liquid fraction may vary within a wide range. Preferably that is
  • volume ratio of water to the concentrated liquid fraction 4 1 to 1: 1.
  • a sufficient amount of acid is also added to neutralize the urea.
  • Particularly suitable nonpolar solvents for the purposes of the present invention include petroleum ether, pentane, hexane, cyclohexane, Ethyl acetate and heptane, with hexane being most preferred.
  • the volumetric ratio of the nonpolar solvent to the concentrated liquid fraction / water mixture is preferably 1: 5 to 5: 1.
  • the liquid fraction is also extracted with a weakly polar organic solvent to maximize the recovery of the fatty acid esters (which, as noted previously, are weakly polar).
  • a weakly polar organic solvent particularly useful in the present invention include diethyl ether and ethyl acetate, with diethyl ether being most preferred.
  • the volumetric ratio of the weakly polar solvent to the concentrated liquid fraction / water mixture is 1: 5 to 5: 1.
  • the extracts may be dried by, for example, washing with a brine and / or using an anhydrous salt (e.g., sodium sulfate).
  • an anhydrous salt e.g., sodium sulfate
  • the solution is then preferably concentrated, for example by partial or complete evaporation of the solvent.
  • the inventive method is characterized in particular by an extremely efficient separation of the saturated fatty acid esters. Therefore, in the context of the present invention, the transesterified biomass is preferably directly, i. without further intermediate steps, subjected to urea crystallization.
  • nonpolar solvents as described above, as well as winterization, have proven particularly useful.
  • Winterization involves cooling a solution containing the transesterified biomass to a temperature which causes at least a portion of the saturated fatty acid ester to precipitate, while a much lower proportion of the polyunsaturated fatty acid ester precipitates.
  • the solution is at a temperature less, more preferably to a temperature in the range -30 to -10 0 C, in particular to a temperature in the range of -25 to -15 ° C, cooled 0 ° C.
  • the solution is preferably maintained at these temperatures for up to 20 hours and under an inert gas atmosphere.
  • the winterization is preferably carried out in an organic solvent which dissolves the DHA ester and at least one saturated fatty acid ester in the fatty acid ester mixture.
  • organic solvents include methanol and ethanol, with methanol being most preferred.
  • the volumetric ratio of the fatty acid ester mixture to the organic solvent is 1: 5 to 1:20.
  • the solution is preferably separated from the precipitate to form a liquid fraction enriched in the desired polyunsaturated fatty acid esters. This is preferably achieved by filtration or centrifugation. After the liquid fraction is separated, it is conveniently concentrated by evaporation of the solvent in a rotary evaporator.
  • the fatty acid compositions obtainable according to the invention are immediately obvious to the person skilled in the art. They are particularly suitable for all applications that are pre-defined for PUFAs and PUFA esters.
  • the fatty acid compositions according to the invention can usually be used directly.
  • fatty acid compositions obtainable according to the invention are used in particular as an active ingredient or component in pharmaceutical fatty acid compositions, as a constituent in cosmetic preparations, as a food additive or food ingredient, as a component of functional foods and for the production of higher-concentration PUFA derivatives, such as esters and acids.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure-Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure-Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäurederivate, mindestens 70,0 Gew.-% Docosahexaensäure und/oder Docosahexaensäurealkylester enthält, bei welchem man: a) eine aus Ulkenia sp. erhältliche Biomasse mit mindestens einem Alkohol umestert, um mindestens einen Docosahexaensäurealkylester und mindestens einen gesättigten Fettsäure-Ester zu bilden, b) eine Lösung herstellt, die Harnstoff, mindestens einen Teil der umgeesterten Biomasse aus Schritt a) und mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, c) die Lösung aus Schritt b), abkühlt oder aufkonzentriert, um i) einen Niederschlag, welcher Harnstoff und zumindest einen Teil der gesättigten Fettsäure-Ester enthält, und ii) eine flüssige Fraktion zu bilden, d) den Niederschlag i) von der flüssigen Fraktion ii) abtrennt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die nach dem Verfahren erhältliche Fettsäure-Zusammensetzung sowie ihre Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung einer DHA-haltigen Fettsäure-Zusammensetzung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure- Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure- Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/o"der Fettsäurederivate, mindestens 70,0 Gew.-% Docosahexaensäure und/oder Docosahexaensäurealkylester enthält.
Hochungesättigte, langkettige Fettsäuren (Polyunsaturated Fatty Acids; PUFAs) stellen essentielle Fettsäuren des menschlichen Stoffwechsels dar. PUFAs können in zwei große Gruppen unterteilt werden. Neben der Gruppe der ω-6 PUFAs, die ausgehend von Linolsäure formuliert wird, gibt es die Gruppe der ω-3 PUFAs, die ausgehend von der α— Linolensäure aufgebaut wird.
PUFAs sind wichtige Bausteine der Zellmembranen, der Retina und der Hirnhaut und Vorläufer für wichtige Hormone, beispielsweise Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene.
Neben der Funktion als Bausteine hat sich im Laufe der letzten Jahre immer mehr gezeigt, dass PUFAs direkt vielfältige positive Wirkungen auf den menschlichen Organismus bzw. Erkrankungen haben.
Eine Vielzahl von klinischen Studien haben gezeigt, dass PUFAs z.B. bei Krebs, rheumatischer Arthritis, Bluthochdruck und Neurodermitis und vielen anderen Erkrankungen einen wichtigen Beitrag zur Heilung oder Linderung leisten können. Dabei ist die Verwendung von Docosahexaensäure (DHA; all-cis
4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäure) -Estern (im Gegensatz zu der freien DHA) , oftmals besonders vorteilhaft, weil derartige Ester (insbesondere die Ethylester und Triglyceride) dazu neigen, einen angenehmen Geschmack zu haben und leicht durch das Verdauungssystem absorbiert zu werden. Diese Erkenntnisse waren ursächlich dafür verantwortlich, dass internationale Institutionen und Behörden Empfehlungen ausgesprochen haben, die die tägliche Aufnahmemenge von PUFAs regeln. PUFAs können vom Menschen nicht de-novo synthetisiert werden, da ihnen die Enzymsysteme fehlen, die eine Doppelbindung in die Kohlenstoffkette an Positionen > C9 einführen können (fehlende Δ12-Desaturase). Erst durch die Zufuhr von sogenannten Vorläufer-Fettsäuren (Precursoren, z.B. α-Linolensäure) über die Nahrung ist der Mensch in der Lage, hochungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren. Ob diese Menge jedoch ausreicht, um den Bedarf an hochungesättigten Fettsäuren zu decken, ist umstritten.
Der allergrößte Teil der essentiellen Fettsäuren wird durch die Nahrung aufgenommen. Insbesondere Pflanzenöle sind angereichert mit ω-6 Fettsäuren, (beispielsweise enthält Nachtkerzenöl γ-Linolensäure (GLA)), j edoch nur bis zu einer Kettenlänge von Cl 8, und Fischöle bzw. Öle aus Mikroorganismen mit ω-3 Fettsäuren (z.B. enthält Lachsöl Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA; all-cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäure)). Grundsätzlich stellen Fischöle und Öle aus Mikroorganismen die einzige kommerzielle Quelle für hochungesättigte Fettsäuren dar. Im Allgemeinen ist jedoch der Gehalt an der erwünschten PUFA gering und diese liegen in einer Mischung vor, wobei antagonistisch wirkende PUFAs ebenfalls enthalten sein können. Um die empfohlene tägliche Dosis an PUFAs zu sich zu nehmen, muss also eine hohe Ölmenge aufgenommen werden. Insbesondere trifft das auf solche Patienten zu, die hohe Dosen von PUFAs zu sich nehmen müssen (beispielsweise bei Cystischer Fibrose). Um eine möglichst gezielte Wirkung der einzelnen PUFAs zu erreichen, müssen angereicherte bzw. hochreine PUFAs eingesetzt werden. Es besteht daher im Stand der Technik ein hoher Bedarf an hochreinen PUFAs.
Zahlreiche Verfahren wurden einzeln oder in Kombination verwendet, um bestimmte Fettsäuren und ihre Derivate aus einer Vielzahl natürlich vorkommender Quellen zu isolieren (oder zumindest aufzukonzentrieren) und zurückzugewinnen. Diese Verfahren schließen fraktionierte Kristallisation bei niedrigen Temperaturen, molekulare Destillation, Harnstoffadukt-Kristallisation, Extraktion mit Metallsalzlösungen, superkritischer Fluidfraktionierung auf gegenläufigen Kolonnen und HPLC-Verfahren ein.
In W.W. Christi, Lipid Analysis, S.147-149 (Pergamon Press, 1976) wird ein allgemeines Verfahren offenbart, bei welchem man Harnstoff verwendet, um Methylester gesättigter Fettsäuren aus einer Mischung abzutrennen, welche auch Methylester mehrfach ungesättigter Fettsäuren enthält. Gemäß Christi werden, wenn man Harnstoff in der Gegenwart mehrerer, verschiedener, langkettiger aliphatischer Verbindungen kristallisieren lässt, hexagonale Kristalle gebildet, welche die aliphatischen Verbindungen einschließen (sog. „Harnstoff-Komplexe). Die aliphatischen Verbindungen können dann leicht von der Lösung durch Filtration abgetrennt werden.
Christie führt allgemein aus, dass die Methylester gesättigter Fettsäuren leichter Harnstoff-Komplexe als die Methylester ungesättigter Fettsäuren mit gleicher Kettenlänge bilden und dass die Methylester ungesättigter Fettsäuren mit transDoppelbindungen leichter Harnstoff-Komplexe als die Methylester der entsprechenden ungesättigter Fettsäuren mit cis-Doppelbindungen bilden. Christie beschreibt auch die Verwendung der Harnstoff-Kristallisation zur Aufkonzentrierung von Methylestern mehrfach ungesättigter Fettsäuren aus einer Mischung, die Methylester mehrfach ungesättigter Fettsäuren und Methylester gesättigter Fettsäuren enthält. Auf diese Weise können scheinbar Fettsäure- Zusammensetzungen mit einer Massenausbeute von 20 % erhalten werden, wobei in der Druckschrift jedoch konkrete Angaben zur Versuchsdurchführung und zur PUF A- Ausbeute fehlen. Weiterhin können ihr auch keine Angaben zur Qualität der Produkte, beispielsweise zum Peroxidgehalt, entnommen werden.
Eine weitere Druckschrift, die die Abtrennung von Fettsäure-Methylestern unter Verwendung der Harnstoff-Kristallisation beschreibt, ist T. Nakahara, T. Yokochi, T. Higashihara, S. Tanaka, T. Yaguchi, D. Honda „Production of Docosahexaenoic and Docosapentaenoic Acids by Schizochytrium sp. isolated from Yap Islands", JAOCS, Band. 73, Nr. 11, S. 1421-26 (1996). Nakahara et al. beschreiben die Herstellung einer Mischung von Fettsäure-Methylestern, indem man Schizochytrium sp. Zellen wäscht und trocknet und dann direkt mit Methanol in der Gegenwart von 10%iger HCl methylverestert. Nakahara et al. berichten, dass 34,9 % der resultierenden Methylester DHA-Reste und 8,7 % der resultierenden Methylester DPA-Reste enthielten. Zur Aufkonzentrierung dieser mehrfach ungesättigten Fettsäure-Ester wird Methanol und Harnstoff zu der Mischung gegeben. Die Mischung wird dann auf 60 °C erwärmt, um den Harnstoff aufzulösen, und anschließend auf 10 0C abgekühlt, um den Harnstoff auszukristallisieren. Laut Nakahara et al. wurde auf diese Weise eine Mischung erhalten, die 73,3 % DHA-Methylester und 17,7 % DPA-Methylester enthält. Weitere Angaben zur' Versuchsdurchführung, zur Ausbeute und zur Qualität der erhaltenen Produkte können der Druckschrift nicht entnommen werden.
WO 01/51598 Al offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer angereichten Mischung mehrfach ungesättigter Fettsäure-Ester, bei welchem man ein Öl von Schizochytrium sp. mit einem Alkohol (Methanol) umestert. Die Fettsäure-Ester werden dann zusammen mit Harnstoff in einem Medium gelöst und abgekühlt oder aufkonzentriert, um die gesättigten Fettsäure-Ester, die zusammen mit dem Harnstoff ausfallen, zumindest teilweise abzutrennen. Auf diese Weise kann ein Öl erhalten werden, welches gemäß Gaschromatographie 23,4 Gew.-*% ω-6 DPA- Methylester, 65,2 Gew.-% ω -3 DHA-Methylester, 2,9 Gew.-% Myristinsäure- Methylester und 1,5 Gew.-% Palmitinsäure-Methylester enthält.
Nachteilig an den vorstehend beschriebenen Vorgehensweisen ist insbesondere die Verwendung des giftigen Methanols zur Veresterung der Fettsäuren. Daher .sind die in diesen Druckschriften beschriebenen Fettsäure-Zusammensetzungen nicht für Anwendungen im Lebensmittelbereich geeignet. Weiterhin ist die Offenbarung der Verfahren, insbesondere des Verfahrens von Christie und des Verfahrens von Nakahara et al., derart lückenhaft und unvollständig, dass sie nicht nachgearbeitet werden können. Darüber hinaus ist insbesondere für das in Nakahara et al. beschriebene Verfahren davon auszugehen, dass aufgrund der W 2
verhältnismäßig starken Erhöhung des DHA-Gehaltes eine vergleichsweise geringe Gesamtausbeute erhalten wird.
Die wachsende Verwendung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, insbesondere von DHA, und von ihren Estern in der Medizin und der Ernährung bedingt den
Wunsch nach einem möglichst kosteneffizienten und verlässlichen Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure-Zusammensetzung mit einem möglichst hohen Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere an Docosahexaensäure und/oder Docosahexaensäurealkylester und gleichzeitig einem möglichst geringen Anteil an gesättigten Fettsäuren.
In Anbetracht dieses Standes der Technik war es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Verfahren bereitzustellen. Dabei sollte das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung der Fettsäure-Zusammensetzung auf möglichst einfache Art und Weise, großtechnisch und kostengünstig erlauben.
Gleichzeitig sollte das Verfahren eine Fettsäure-Zusammensetzung mit möglichst hoher Reinheit und Qualität, insbesondere mit einer möglichst geringen Säurezahl und/oder mit einem möglichst geringen Schwermetallgehalt, liefern.
Darüber hinaus sollte das Verfahren möglichst schonend sein und insbesondere zu Fettsäure-Zusammensetzungen mit einem möglichst geringen Peroxidgehalt - führen.
Weiterhin sollte das erfindungsgemäße Verfahren möglichst unter Verwendung möglichst lebensmittelechter Lösungsmittel durchführbar sein. Insbesondere sollte die Verwendung gesundheitsgefährdender Substanzen bestmöglich vermieden werden.
Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen sollten einen möglichst geringen Ethylcarbamatgehalt aufweisen, insbesondere um die Anwendung der Fettsäure-Zusammensetzungen im Lebensmittelbereich ohne Bedenken zu ermöglichen.
Gelöst werden diese sowie weitere Aufgaben, die zwar nicht wörtlich genannt werden, sich aber aus den hierin diskutierten Zusammenhängen wie selbstverständlich ableiten lassen oder sich aus diesen zwangsläufig ergeben, durch ein Verfahren mit allen Merkmalen des vorliegenden Anspruchs 1. Zweckmäßige Abwandlungen des erfmdungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen beschrieben. Die Ansprüche der Produktkategorie schützen die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Fettsäure-Zusammensetzung und die Verwendungsansprüche geben besonders vorteilhafte Anwendungsgebiete der erfmdungsgemäßen Fettsäure- Zusammensetzung an.
Dadurch, dass man ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure- Zusammensetzung bereitstellt, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure-Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäurederivate, mindestens 70,0 Gew.-% all-cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäure und/oder all- cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäurealkylester enthält, wobei man: a) eine aus Ulkenia sp. erhältliche Biomasse mit mindestens einem Alkohol umestert, um mindestens einen Docosahexaensäurealkylester und mindestens einen gesättigten Fettsäure-Ester zu bilden, b) eine Lösung herstellt, die Harnstoff, mindestens einen Teil der umgeesterten • Biomasse aus Schritt a) und mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, c) die Lösung aus Schritt b), abkühlt oder aufkonzentriert, um i) einen Niederschlag, welcher Harnstoff und zumindest einen Teil der gesättigten Fettsäure-Ester enthält, und ii) eine flüssige Fraktion zu bilden, d) den Niederschlag i) von der flüssigen Fraktion ii) abtrennt, gelingt es auf nicht ohne weiteres vorhersehbare Weise, ein neues und nützliches Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure-Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure- Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäurederivate, mindestens 70,0 Gew.-% Docosahexaensäure und/oder Docosahexaensäurealkylester enthält. Dies war insbesondere deshalb überraschend, weil die Anreicherung insbesondere der DHA und/oder der DHA-Ester erfindungsgemäß erreicht wird, obwohl die erfindungsgemäß zu trennenden Verbindungen sehr komplexe Moleküle sind und es nur minimale Strukturunterschiede zwischen ihnen gibt.
Gleichzeitig weist die erfindungsgemäße Vorgehensweise eine Reihe weiterer Vorteile auf:
> Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf einfache Art und Weise, großtechnisch und kostengünstig durchführbar. > Das erfindungsgemäße Verfahren ist überaus effizient und macht die
Fettsäure-Zusammensetzungen mit vergleichsweise hohen Ausbeuten zugänglich.
> Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine Fettsäure-Zusammensetzung mit vergleichsweise hoher Reinheit und Qualität, insbesondere mit einer vergleichsweise geringen Säurezahl und mit einem vergleichsweise geringen Schwermetallgehalt. Die Säurezahl der Fettsäure- Zusammensetzung, gemessen gemäß AOCS Official Method Ja 8-87, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 1,5 mg KOH pro g Fettsäure- Zusammensetzung, günstigerweise kleiner oder gleich 0,8 mg KOH pro g Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,2 mg KOH pro g Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,06 mg KOH pro g Fettsäure-Zusammensetzung.
> Das erfindungsgemäße Verfahren ist vergleichsweise schonend und führt zu Fettsäure-Zusammensetzungen mit einem vergleichsweise geringen Peroxidgehalt. Die Peroxidzahl der Fettsäure-Zusammensetzung, gemessen gemäß AOCS Official Method Cd-3d 63, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,5 meq. pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,1 meq. pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,05 meq. pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,01 meq. pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. Der Schwermetallgehalt der Fettsäure-Zusammensetzung, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,7 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,4 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,3 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,2 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung.
^ Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Cadmium-Gehalt aus. Der Cadmium-Gehalt der erfmdungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure-
Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,05 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,03 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. > Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Blei-Gehalt aus. Der Blei-Gehalt der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0, 10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,05 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,03 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. > Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Quecksilber-Gehalt aus. Der Quecksilber-Gehalt der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,10 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,05 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,01 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,005 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung.
> Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Arsen-Gehalt aus. Der Arsen-Gehalt der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure-
Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,05 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,03 ■ mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. > Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Kupfer-Gehalt aus. Der Kupfer-Gehalt der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,25 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,06 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. )r> Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Eisen-Gehalt aus.
Der Eisen-Gehalt der erfmdungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,25 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0, 10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,06 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. > Die durch das Verfahren erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen zeichnen sich durch einen vergleichsweise niedrigen Nickel-Gehalt aus. Der Nickel-Gehalt der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, ist vorzugsweise kleiner oder gleich 0,25 mg pro kg Fettsäure-
Zusammensetzung, zweckmäßigerweise kleiner oder gleich 0,20 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, bevorzugt kleiner oder gleich 0,10 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung, insbesondere kleiner oder gleich 0,06 mg pro kg Fettsäure-Zusammensetzung. > Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vergleichsweise lebensmittelechte Lösungsmittel eingesetzt.
> Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen weisen weiterhin einen vergleichsweise geringen Ethylcarbamatgehalt auf und eignen sich daher insbesondere für Anwendungen im Lebensmittelbereich.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure-Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure-Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäurederivate vorzugsweise bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure- Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäureester, insbesondere bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure-Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäuretriglyceride mindestens 70,0 Gew.-% all-cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäure und/oder all-cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäurealkylester enthält.
Der Begriff „Fettsäure-Zusammensetzung" umfasst in diesem Zusammenhang sowohl Zusammensetzungen, die freie Fettsäuren enthalten, als auch Zusammensetzungen, die Fettsäurederivate, vorzugsweise Fettsäureester, insbesondere Fettsäuretriglyceride, enthalten, wobei die Fettsäurereste prinzipiell gleich oder verschieden sein können. Fettsäuren bezeichnen erfmdungsgemäß aliphatische Carbonsäuren, die gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein können und vorzugsweise 6 bis 30 Kohlenstoffatome aufweisen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine aus Ulkenia sp. erhältliche
Biomasse als Ausgangsmaterial eingesetzt. Aus Ulkenia sp. erhältliche Biomassen sind an sich bekannt. Erfindungsgemäß können sowohl Biomassen von Ulkenia sp. Wildtyp-Stämmen als auch Biomassen von mutanten oder rekombinierten Ulkenia sp. Stämmen eingesetzt werden, die DHA (all-cis 4,7,10,13,16,19 Docosahexaensäure) und/oder DPA (all-cis 4,7, 10, 13 , 16 Docosapentaensäure) effizient herstellen. Derartige mutante oder rekombinierte Stämme schließen Mikroorganismen ein, die, verglichen mit der Prozentsatz des original Ulkenia sp. Wildtyp-Stamms, unter Verwendung desselben Substrates, einen höheren Prozentsatz DHA und/oder DPA in Fetten und/oder, verglichen mit der durch den original Ulkenia sp. Wildtyp-Stamm hergestellten Menge, unter Verwendung desselben Substrates, eine höhere Gesamtmenge der Lipide enthalten.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Ulkenia sp. Trockenmasse als Ausgangsmaterial eingesetzt. Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Öl von Ulkenia sp. als Ausgangsmaterial eingesetzt.
Öle von Ulkenia sp. werden zweckmäßigerweise erhalten, indem man den Mikroorganismus, der reich an DHA ist, züchtet, die Biomasse aus der Kultur erntet, aufschließt und das Öl isoliert. Ein in diesem Zusammenhang ganz besonders günstiges Verfahren wird in der WO 03/033631 Al beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit explizit bezug genommen wird.
Zur Isolierung des Öls werden vorzugsweise Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere Hexan, oder mit superkritischen Flüssigkeiten verwendet. Zweckmäßigerweise wird das Öl aus der Biomasse durch Perkolation der getrockneten Biomasse mit Hexan extrahiert. Derartige Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln sind u. a. in der WO 9737032, in der WO 9743362 und der EP 515460 beschrieben. Eine besonders ausführliche Darstellung findet sich auch im Journal of Dispersion Science and Technology, 10, 561-579, 1989 "Biotechnological.Processes for the Production of PUFAs".
Alternativ kann die Extraktion auch ohne Lösungsmittel erfolgen. Ein in diesem Zusammenhang besonders günstiges Verfahren wird in der EP-A-1178118 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein Lösungsmittel vermieden, indem man eine wässrige Suspension der Biomasse herstellt und die Ölphase durch Zentrifugation von der wässrigen Phase abtrennt.
Die Zusammensetzung der aus Ulkenia sp. erhältlichen Biomasse kann in einem weitem Bereich variieren. Vorzugsweise enthält ist sie mindestens ein Glycerid, insbesondere ein Triglycerid, welches mindestens einen mehrfach ungesättigten Fettsäure-Rest umfasst. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 25% und insbesondere mindestens 30% der Fettsäure-Reste in der Biomasse DHA-Reste.
Ein „Glycerid" ist, so wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ein Ester von Glycerin und mindestens einer Fettsäure, wobei eine bis drei Hydroxylgruppen des Glycerins mit einem oder mehreren Fettsäure-Resten verestert wurden. Wenn mehrere Fettsäure-Reste vorliegen, können die Fettsäure-Reste gleich oder verschieden sein.
Bei vielen geeigneten Ausgangsmaterialien sind der Hauptanteil der Glyceride
Triglyceride, d. h. Ester von drei Fettsäure-Resten und Glyeerin. Dabei kann jeder Fettsäure-Rest entweder gesättigt (d.h. alle Bindungen zwischen den Kohlenstoff- Atomen sind Einfachbindungen) oder ungesättigt (d.h. es gibt mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppel- oder -Dreifachbindung) sein. Die Art der ungesättigten Fettsäure-Reste werden hierin gelegentlich mit einem ω gekennzeichnet. Diese Nummer gibt die Position der ersten Doppelbindung an, wenn man ausgehend von der terminalen Methylgruppe der Fettsäure oder des Fettsäure-Restes auszählt.
Erfindungsgemäß wird die aus Ulkenia sp. erhältliche Biomasse zunächst mit mindestens einem Alkohol umestert. Das Ziel des Umesterungsschrittes besteht in der Abspaltung der Fettsäure-Reste von dem Glycerin-Rückgrat der Glyceride in dem Ausgangsmaterial und der Bildung getrennter Ester von jedem der Reste (mindestens ein Docosahexaensäurealkylester und mindestens ein gesättigter Fettsäure-Ester), so dass die Ester voneinander getrennt werden können.
Erfindungsgemäß erfolgt die Umesterung bevorzugt unter Verwendung mindestens eines Alkohols der Formel R1 -OH, wobei R1 ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 6, insbesondere mit 1 bis 4, Kohlenstoffatomen ist. Besonders bevorzugt werden die Methylester und Ethylester, insbesondere die Ethylester.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Umesterung durch mindestens eine Base katalysiert. Bevorzugte Basen umfassen Natriummethoxid, Kaliummethoxid, elementares Natrium, Natriumhydroxid und KaliumhydiOxid. Vorzugsweise ist das Volumenverhältnis von der Biomasse zu der Base/Alkohol-Mischung 1 : 1 bis 1 :5. Die Konzentration der Base in dem Alkohol ist vorzugsweise 0,1 bis 2 M. Gemäß einer bevorzugten Variante wird die Umesterungsreaktion bei Raumtemperatur (d.h. bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 20 - 25 0C) für 6 - 20 Stunden durchgeführt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Variante wird die Umesterungsreaktion bei einer Temperatur oberhalb der Raumtemperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 40 0C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 70 bis 150 0C, insbesondere bei einer Temperatur oberhalb des Siedepunktes einer oder mehrerer Komponenten in der Mischung (unter Rückfluss), durchgeführt.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Umesterung durch mindestens eine Säure katalysiert, indem man vorzugsweise die Biomasse bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis ungefähr 15O0C in einer Mischung, welche den mindestens einen Alkohol und mindestens eine Säure, bevorzugt HCl, vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre und in Abwesenheit von Wasser, inkubiert. Gemäß einer bevorzugten Variante wird die Triglycerid/Säure/Alkohol-Mischung für mindestens 2 Stunden refluxiert. Gemäß einer weiteren bevorzugten Variante wird die Triglycerid/Säure/Alkohol- Mischung bei einer Temperatur von 0 bis 5O0C für mindestens 12 Stunden gehalten.
Da die Säure-katalysierte Umesterung üblicherweise reversibel ist, wird der
Alkohol vorzugsweise in einem großen Überschuß vorgelegt, so dass die Reaktion im Wesentlichen bis zum vollständigen Umsatz fortschreitet. Vorzugsweise ist die Triglycerid-Konzentration in der Alkohol/Säure-Mischung 0,1 bis 15 Gew.-%. Die Konzentration der Säure, vorzugsweise HCl, in der Alkohol/Säure-Mischung ist vorzugsweise 4 bis 15 Gew.%. Eine derartige Mischung kann durch viele, • verschiedene, im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie beispielsweise durch Einleiten von gasförmigen Wasserstoffchlorid in trocknen Alkohol oder durch Zugabe von Acetylchlorid zu Alkohol, hergestellt werden. Obwohl HCl erfindungsgemäß am meisten bevorzugt wird, können andere Säuren alternativ verwendet werden. Eine derartige Säure ist H2SO4, welche vorzugsweise mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.% in dem Alkohol verwendet wird. Es sollte jedoch bedacht werden, dass H2SO4 ein stark oxidierendes Agens ist und daher vorzugsweise nur in Kombination mit kurzen Refluxionszeiten (d.h. kleiner 6 Stunden), mit niedrigen Konzentrationen (d.h. kleiner 5 Gew.%) und mit niedrigen Temperaturen (d.h. kleiner 15O0C) verwendet wird. Ein weiteres
Beispiel einer geeigneten Säure ist Borfluorid, welches vorzugsweise mit einer Konzentration von 1 - 20 Gew.% verwendet wird. HCl wird jedoch gegenüber Borfluorid bevorzugt, weil Borfluorid stärker zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte neigt.
Die Umesterungsreaktion erfolgt vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre (z.B. Edelgas und/oder N2). Weiterhin kann auch ein Antioxidanz (z.B. Ascorbylpalmitat oder Propylgalat) zu der Reaktionsmischung zugegeben werden, um eine Autooxidation zu verhindern.
Während der Umesterung wird vorzugsweise mindestens ein organisches Lösungsmittel zugesetzt. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen insbesondere solche Verbindungen, die in der Lage sind, die umzuesternden Fettsäure-Ester zu lösen. Wenn das Ausgangsmaterial mehrere umzuesternde Fettsäure-Ester enthält, ist das organische Lösungsmittel vorzugsweise in der Lage, alle umzuesternden Fettsäure-Ester zu lösen. Erfindungsgemäß ganz besonders geeignete Lösungsmittel umfassen Dichloromethan, Acetonitril, Ethylacetat und Diethylether, insbesondere Dichloromethan.
Nach der Umesterung werden die Ester vorzugsweise von der Reaktionsmischung durch Zugabe von Wasser abgetrennt. Oftmals schwimmen die Ester (die organisch sind) oben auf der Reaktionsmischung und können einfach von der verbleibenden Reaktionsmischung abgetrennt werden. Dies trifft insbesondere für großtechnische, industrielle Anwendungen zu.
Alternativ kann eine Flüssig-Flüssig-Lösungsmittelextraktion verwendet werden, um die Ester von der verbleibenden Reaktionsmischung abzutrennen. Diese Extraktion kann in einem weiten Bereich variieren. Gemäß einer bevorzugten Variante gibt man Wasser zu der Mischung und extrahiert die Ester mit einem unpolaren Lösungsmittel. Falls die Umesterung durch mindestens eine Base katalysiert wurde, umfasst das Wasser vorzugsweise eine hinreichende Menge Säure, vorzugsweise HCl, Zitronensäure oder Essigsäure, insbesondere HCl, um die Mischung zu neutralisieren oder besonders bevorzugt der Mischung einen schwach sauren pH zu verleihen. Das Verhältnis des Gesamtvolumens des unpolaren Lösungsmittels zu dem Volumen der Reaktionsmasse (inklusive dem zugegebenen Wasser) kann auch in einem weiten Bereich variiert werden und ist besonders bevorzugt von 1 :3 bis 4:3. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Mischung mit mehreren Fraktionen des unpolaren organischen Lösungsmittels extrahiert, welche am Ende kombiniert werden. Erfindungsgemäß besonders geeignete unpolare Lösungsmittel schließen Petrolether, Pentan, Hexan, Cyclohexan und Heptan ein, wobei Hexan und Petrolether am meisten bevorzugt werden.
Das unpolare Lösungmittel kann auch eine kleine Menge eines schwach polaren, organischen Lösungsmittels, wie beispielsweise Diethylether, enthalten. Die Verwendung einer derartigen polaren Komponente führt tendenziell zu einer Verbesserung der Extraktion der Fettsäure-Ester von der wässrigen Schicht, weil derartige Ester ebenfalls schwach polar sind. Falls eine schwach polare, organische Komponente verwendet wird, ist die volumetrische Konzentration der schwach polaren Komponente zu der unpolaren Komponente vorzugsweise nicht größer als ungefähr 20%, besonders bevorzugt nicht größer als 10% und insbesondere 5% bis 10%.
Die resultierende, organische Extraktionslösungsmittelschicht kann gewaschen werden, um beispielsweise irgendwelche Säurereste und/oder verbleibendes Wasser zu entfernen. Die Entfernung von Säureresten wird vorzugsweise durch Waschen der Schicht mit einer wässrigen Lösung erreicht, die eine schwache Base, z. B. Kaliumcarbonat, enthält. Die Entfernung von verbleibendem Wasser kann beispielsweise durch Waschen der Schicht mit einer Lake (d.h. einer gesättigten Salzlösung) und/oder durch Trocknen mit einem wasserfreien Salz (z.B. Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat) erreicht werden.
Nach der Extraktion können die Fettsäure-Ester in der unpolaren Lösungsmittelschicht aufkonzentriert werden. Gemäß einer bevorzugten
Ausführungsform dieser Erfindung werden die Ester aufkonzentriert, indem man einen Teil des unpolaren Lösungsmittels verdampft. . '
Die Umesterung einer aus Ulkenia sp. erhältlichen Biomasse liefert zusätzlich zu dem DHA-Alkylester üblicherweise weitere Fettsäure-Ester. Viele dieser Fettsäure-Ester, insbesondere die gesättigten Fettsäure-Ester, haben unbekannte und/oder nachteilige medizinische Eigenschaften und Ernährungseigenschaften. Es ist daher notwendig, insbesondere die gesättigten Fettsäure-Ester möglichst vollständig aus der Umesterungsreaktionsmischung zu entfernen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst daher eine Harnstoff-Kristallisation, bei welcher man b) zunächst eine Lösung herstellt, die Harnstoff, mindestens einen Teil der umgeesterten Biomasse aus Schritt a) und mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, c) die Lösung aus Schritt b), abkühlt oder aufkonzentriert, um i) einen Niederschlag, welcher Harnstoff und zumindest einen Teil der gesättigten Fettsäure-Ester enthält, und ii) eine flüssige Fraktion zu bilden, d) den Niederschlag i) von der flüssigen Fraktion ii) abtrennt.
Wenn Harnstoff in einer Lösung kristallisiert, welche mehrfach ungesättigte Fettsäure-Ester (z.B. Ester von DHA) und gesättigte Fettsäure-Ester enthält, welche durch Umesterung unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens erhalten wurden, bildet sich ein Niederschlag, welcher den Harnstoff und zumindest einen Teil der gesättigten Fettsäure-Ester enthält. Dieser Niederschlag umfasst jedoch einen wesentlich geringeren Anteil der mehrfach ungesättigten Fettsäure-Ester als die Ausgangslösung. Der Großteil der mehrfach ungesättigten Fettsäure-Ester verbleibt daher in Lösung und kann leicht von den ausgefallenen gesättigten Fettsäure-Estern abgetrennt werden.
Das erfindungsgemäße Harnstoff-Kristallisations-Abtrennungsverfahren umfasst zunächst die Bildung einer Lösung, welche die Fettsäure-Ester und Harnstoff enthält. Die Menge des Harnstoffs ist vorzugsweise proportional zu der
Gesamtmenge der gesättigten Fettsäuren, welche von der Lösung abgetrennt ' werden sollen. Das Massenverhältnis der Mischung der Fettsäure-Ester zu dem
Harnstoff ist vorzugsweise 1:1 bis 1:4. Die Lösung umfasst vorzugsweise auch mindestens ein organisches Lösungsmittel, welches Harnstoff und den gewünschten DHA-Ester, besonders bevorzugt Harnstoff und alle Fettsäure-Ester in der Mischung, löst. In diesem Zusammenhang besonders geeignete Lösungsmittel schließen Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ein, wobei Methanol und Ethanol, insbesondere Ethanol, besonders bevorzugt werden. Das volumetrische Verhältnis der Mischung der Fettsäure-Ester zu dem Lösungsmittel ist vorzugsweise 1:5 bis 1:20.
Vorzugsweise ist im Wesentlichen der gesamte Harnstoff in der Lösung gelöst. Dies kann im Allgemeinen dadurch erreicht werden, dass man die Lösung, vorzugsweise auf eine Temperatur größer 50°C, erwärmt. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Lösung hergestellt, indem man den Harnstoff und die Fettsäure-Ester-Mischung getrennt voneinander, vorzugsweise unter Erwärmen, insbesondere auf Temperaturen größer 5O0C, in dem Lösungsmittel löst und die resultierenden Lösungen dann miteinander vermischt.
Zur Abtrennung der gesättigten Fettsäure-Ester wird die die Fettsäure-Ester und den Harnstoff enthaltende Lösung vorzugsweise abgekühlt, um einen Harnstoff umfassenden Niederschlag zu bilden. Vorzugsweise wird die Lösung auf eine Temperatur kleiner 40 °C, vorzugsweise kleiner oder gleich 30 0C, insbesondere kleiner oder gleich 25 °C abgekühlt, wobei die Temperatur günstigerweise größer als 100C, bevorzugt größer oder gleich 15 0C, zweckmäßigerweise größer oder gleich 20 °C, ist. Die abgekühlte Lösung wird vorzugsweise für eine bestimmt Zeitspanne, typischerweise nicht länger als ungefähr 20 Stunden, vorzugsweise für 5 bis 20 Stunden, bei der abgekühlten Temperatur unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Harnstoff enthaltender Niederschlag gebildet, indem man die die Fettsäure-Ester und den Harnstoff enthaltende Lösung aufkonzentriert. Die Lösung kann beispielsweise aufkonzentriert werden, indem man einen Teil des Lösungsmittels in der Lösung verdampft. Die entfernte Menge Lösungsmittel ist vorzugsweise hinreichend, um eine Harnstoff-Konzentration in der Lösung zu bewirken, welche die Sättigungskonzentration übersteigt.
Die Harnstoff-Kristallisation wird zweckmäßigerweise unter einer Inertgasatmosphäre (z. B. Edelgase und/oder N2) durchgeführt
Nachdem sich der Harnstoff-enthaltende Niederschlag gebildet hat, wird der Niederschlag vorzugsweise von der flüssigen Fraktion, welche mit mehrfach ungesättigten Estern angereichert ist, abgetrennt. Dies wird vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation erreicht. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Niederschlag danach mit einer kleinen Menge des organischen Lösungsmittels (vorzugsweise gesättigt mit Harnstoff) gewaschen, ' um am Niederschlag anhaftende, mehrfach ungesättigte Fettsäure-Ester zurückzugewinnen. Diese Waschlösung wird wiederum vorzugsweise mit der flüssigen Fraktion kombiniert.
Die flüssige Fraktion wird vorzugsweise aufkonzentriert, mit Wasser kombiniert und die in der flüssigen Fraktion enthaltenen Ester werden vorzugsweise mit einem unpolaren Lösungsmittel extrahiert. Die flüssige Fraktion kann beispielsweise durch Verdampfen eines Teils des Lösungsmittels aus der flüssigen Fraktion aufkonzentriert werden, wobei die verdampfte Menge des Lösungsmittels vorzugsweise nicht so groß ist, dass weiterer Harnstoff ausfällt. Die Wassermenge, welche zu der aufkonzentrierten flüssigen Fraktion gegeben wird, kann in einem weiten Bereich variieren. Vorzugsweise ist das
Volumenverhältnis vom Wasser zu der aufkonzentrierten flüssigen Fraktion 4:1 bis 1:1.
Im Rahmen einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird auch eine hinreichende Menge Säure, vorzugsweise HCl, zugegeben, um den Harnstoff zu neutralisieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignete unpolare Lösungsmittel umfassen Petrolether, Pentan, Hexan, Cyclohexan, Ethylacetat und Heptan, wobei Hexan am meisten bevorzugt wird. Das volumetrische Verhältnis des unpolaren Lösungsmittels zu der aufkonzentrierten flüssigen Fraktion/Wasser-Mischung ist vorzugsweise 1:5 bis 5:1.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird die flüssige Fraktion auch mit einem schwach polaren, organischen Lösungsmittel extrahiert, um die Rückgewinnung der Fettsäure-Ester (welche, wie zuvor angemerkt, schwach polar sind) zu maximieren. Erfindungsgemäß besonders geeignete, schwach polare Lösungsmittel schließen Diethylether und Ethylacetat ein, wobei Diethylether am meisten bevorzugt wird. Vorzugsweise ist das volumetrische Verhältnis des schwach polaren Lösungsmittels zu der aufkonzentrierten flüssigen Fraktion/Wasser-Mischung 1:5 bis 5:1. Nach der Extraktion mit dem schwach polaren Lösungsmittel werden die Extrakte vorzugsweise kombiniert.
Nach der Extraktion können die Extrakte beispielsweise durch Waschen mit einer Lake und/oder unter Verwendung eines wasserfreien Salzes (z.B. Natriumsulfat) getrocknet werden. Die Lösung wird dann vorzugsweise, beispielsweise durch teilweises oder vollständiges Verdampfen des Lösungsmittels, aufkonzentriert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere durch eine überaus effiziente Abtrennung der gesättigten Fettsäure-Ester aus. Daher wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die umgeesterte Biomasse vorzugsweise direkt, d.h. ohne weitere Zwischenschritte, der Harnstoff-Kristallisation unterzogen.
Obwohl in der Regel nicht nötig, ist es auch möglich, vor der Harnstoff- Kristallisation den Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der umgeesterten Biomasse durch teilweises Abtrennen der sonstigen Bestandteile zu erhöhen, um auf diese Weise die Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahren noch weiter zu steigern. Dies kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, wobei sich die Verwendung von Extraktionsverfahren, insbesondere die Extraktion mit W
unpolaren Lösungsmitteln (wie zuvor beschrieben), sowie Winterisierungsverfahren, ganz besonders bewährt haben.
Die Winterisierung umfasst das Abkühlen einer Lösung, welche die umgeesterte Biomasse enthält, auf eine Temperatur, welche bedingt, dass zumindest ein Teil der gesättigten Fettsäure-Ester ausfällt, während ein wesentlich geringerer Anteil der mehrfach ungesättigten Fettsäure-Ester ausfällt. Vorzugsweise wird die Lösung auf eine Temperatur kleiner 0 °C, besonders bevorzugt auf eine Temperatur im Bereich von -30 bis -10 0C, insbesondere auf eine Temperatur im Bereich von —25 bis -15 °C, abgekühlt. Die Lösung wird vorzugsweise bei diesen Temperaturen für bis zu 20 Stunden und unter einer Inertgasatmosphäre gehalten.
Die Winterisierung wird vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, welches den DHA-Ester und mindestens einen gesättigten Fettsäure-Ester in der Fettsäure-Estermischung löst. Besonders geeignete Lösungsmittel schließen Methanol und Ethanol ein, wobei Methanol am meisten bevorzugt wird. Vorzugsweise ist das volumetrische Verhältnis der Fettsäure- Ester-Mischung zu dem organischen Lösungsmittel 1:5 bis 1:20.
Nach der Bildung des Niederschlages wird die Lösung vorzugsweise von dem Niederschlag abgetrennt, um eine flüssige Fraktion zu bilden, welche an den gewünschten, mehrfach ungesättigen Fettsäure-Estern angereichert ist. Dies wird vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation erreicht. Nachdem die flüssige Fraktion abgetrennt ist, wird sie zweckmäßigerweise durch Verdampfen des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer aufkonzentriert.
Mögliche Anwendungsgebiete der erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure- Zusammensetzungen sind dem Fachmann unmittelbar offensichtlich. Sie eignen sich insbesondere für alle Anwendungen, die für PUFAs und PUFA-Ester vorgezeichnet sind. Dabei können die erfindungsgemäßen Fettsäure- Zusammensetzungen meist direkt eingesetzt werden. Für manche Anwendungen ist es jedoch nötig, den oder die Fettsäure-Ester in der flüssigen Phase vorher zu verseifen. Dies kann beispielsweise durch Umsetzung mit KOH in Ethanol erreicht werden.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Fettsäure-Zusammensetzungen werden insbesondere als Wirkstoff oder Bestandteil in pharmazeutischen Fettsäure- Zusammensetzungen, als Bestandteil in kosmetischen Zubereitungen, als Lebensmittelzusatzstoff oder Lebensmittelzutat, als Bestandteil funktioneller Nahrungsmittel und zur Herstellung höher konzentrierter PUFA-Folgeprodukte, wie Ester und Säuren, eingesetzt.
Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele eingehender erläutert, ohne dass hierdurch eine Beschränkung des Erfindungsgedankens erfolgen soll.
Beispiel 1
1. Umesterung
Zu einer Mischung aus 560,5 g Ulkenia sp. Rohöl und 292 g absolutem Ethanol wird unter Rühren eine Lösung von 13,12 g Na-Ethylat in 228 g absolutem
Ethanol zugetropft. Die resultierende Mischung wird 2,5 Stunden gerührt. Danach werden 4466 g Wasser zugegeben und der Ansatz wird für eine Stunde stehen gelassen. Nach 1 Stunde werden weitere 171 g Wasser zugegeben. Der Ansatz wird weitere 12 Stunden stehen gelassen, woraufhin sich 2 Phasen bilden. Die Ölphase wird abgetrennt und am Rotationsverdampfer werden Ethanol- und Wasserreste entfernt. Es werden 405,7 g umgeestertes Ethylesteröl erhalten.
2. Harnstoff-Fällung
680 g Harnstoff werden in 4430 ml Ethanol bei 77 0C gelöst (6 Liter Vierhalsrundkolben mit Rührer, Thermometer und Kühler). Parallel werden 404 g umgeestertes Ethylesteröl in 443 ml Ethanol bei 7O0C vormkubiert und zu der Harnstofflösung zugegeben. Der Ansatz wird 12 Stunden stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und die verbleibende flüssige Phase wird am Rotationsverdampfer auf 1,5 Liter eingeengt. Danach werden 1,5 Liter 2 molare Salzsäure und 2,5 Liter Wasser zu der flüssigen Phase zugegeben. Die organische Phase wird abgetrennt und bei 450C an der Vakuumpumpe getrocknet. Es werden 230 g aufgereinigtes Öl erhalten. Das Fettsäureprofil des Öls wird in Tabelle 1 und die Kenndaten zur Qualität des Öls (Säurezahl, Peroxidzahl, Schwermetallgehalt) werden in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 2 1. Umesterung
1 kg Ulkenia sp. Biotrockenmasse werden mit 2,5 Liter 10 %iger ethanolischer Schwefelsäure bei 75 0C unter Stickstoff für 48 Stunden gerührt. Der Ansatz wird auf 50 0C abgekühlt und mit 3,5 Liter Hexan extrahiert. Die Hexanphase wird abgetrennt und das Lösungsmittel (Hexan) wird am Rotationsverdampfer entfernt. Es werden 390,1 g umgeestertes Ethylesteröl erhalten.
2. Harnstoff-Fällung
599 g Harnstoff werden in 3,9 Liter Ethanol bei 77 °C gelöst (6 Liter Vierhalsrundkolben mit Rührer, Thermometer und Kühler). Parallel werden 390 g umgeestertes Ethylesteröl in 390 ml Ethanol bei 7O0C vorinkubiert und zu der Harnstofflösung zugegeben. Der Ansatz wird 12 Stunden stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und die verbleibende flüssige Phase wird am Rotationsverdampfer auf 1,5 Liter eingeengt. Danach werden 1,5 Liter 2 molare Salzsäure und 2,5 Liter Wasser zu der flüssigen Phase zugegeben. Die organische Phase wird abgetrennt und bei 450C an der Vakuumpumpe getrocknet. Es werden 216,2 g aufgereinigtes Öl erhalten. Das Fettsäureprofil des Öls wird in Tabelle 1 und die Kenndaten zur Qualität des Öls (Säurezahl, Peroxidzahl, Schwermetallgehalt) werden in Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 1 : Fettsäureprofil des aufgereinigten Öls (Angaben in Gew.-%)
Tabelle 2: Qualität des aufgereinigten Öls
: gemessen gemäß AOCS Official Method Ja 8-87
2: gemessen gemäß AOCS Official Method Cd-3d 63 (American OiI Chemists
Society)
3: gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7 (Lebensmittelbedarfsständegesetz)

Claims

W 2Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung einer Fettsäure-Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der in der Fettsäure-Zusammensetzung enthaltenen Fettsäuren und/oder Fettsäurederivate, mindestens 70,0 Gew.-% Docosahexaensäure und/oder Docosahexaensäurealkylester enthält, bei welchem man: a) eine aus Ulkenia sp. erhältliche Biomasse mit mindestens einem Alkohol umestert, um mindestens einen Docosahexaensäurealkylester und mindestens einen gesättigten Fettsäure-Ester zu bilden, b) eine Lösung herstellt, die Harnstoff, mindestens einen Teil der umgeesterten Biomasse aus Schritt a) und mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, c) die Lösung aus Schritt b), abkühlt oder aufkonzentriert, um iii)einen Niederschlag, welcher Harnstoff und zumindest einen Teil der gesättigten Fettsäure-Ester enthält, und iv)eine flüssige Fraktion zu bilden, d) den Niederschlag i) von der flüssigen Fraktion ii) abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biomasse . ein Öl von Ulkenia sp. einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Biomasse Ulkenia sp. Biotrockenmasse einsetzt.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Umesterung einen Alkohol der Formel R1 -OH einsetzt, wobei R1 ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen ist.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umesterung in der Gegenwart mindestens einer Base durchfuhrt.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umesterung in der Gegenwart mindestens einer
Säure durchfuhrt.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel aus Schritt b) mindestens . einen Alkylalkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfasst.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt c) die Lösung auf auf eine Temperatur nicht größer gleich 15 0C abkühlt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung auf eine Temperatur im Bereich von 15 0C bis 25 °C abkühlt.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) die umgeesterte Biomasse aus Schritt a) direkt einsetzt.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) ein Öl einsetzt, welches aus der umgeesterten Biomasse aus Schritt a) erhalten wird, indem man den Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der umgeesterten Biomasse durch teilweises Abtrennen der sonstigen Bestandteile erhöht.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der umgeesterten Biomasse durch Extraktionsverfahren erhöht.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der umgeesterten Biomasse durch Winterisierungsverfahren erhöht.
14. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den oder die Fettsäure-Ester in der flüssigen Phase verseift.
15. Fettsäure-Zusammensetzung, erhältlich nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche.
16. Fettsäure-Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Säurezahl, gemessen gemäß AOCS Offϊcial Method Ja 8-87, von kleiner oder gleich 1,5 mg KOH pro g Fettsäure.-Zusammensetzung aufweist.
17. Fettsäure-Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Peroxidzahl, gemessen gemäß AOCS Official Method Cd-3d 63, von kleiner oder gleich 0,5 meq. pro kg Fettsäure- Zusammensetzung aufweist.
18. Fettsäure-Zusammensetzung nach Anspruch 15, 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Schwermetallgehalt, gemessen gemäß LMBG §35 L06.00-7, von kleiner oder gleich 0,7 mg pro kg Fettsäure- Zusammensetzung aufweist.
19. Verwendung einer Fettsäure-Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 als Wirkstoff oder Bestandteil in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
20. Verwendung einer Fettsäure-Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 als Bestandteil in kosmetischen Zubereitungen.
21. Verwendung einer Fettsäure-Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 als Lebensmittelzusatzstoff und/oder als Lebensmittelzutat.
22. Verwendung einer Fettsäure-Zusammensetzung gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 als Bestandteil von Tierfutter.
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