KR100829595B1

KR100829595B1 - 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100829595B1
Application number: KR1020060125542A
Authority: KR
Inventors: 신병철; 송충길; 성하수; 조선행
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2006-12-11
Publication date: 2008-05-14

Abstract

본 발명은 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인지질을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 말단에 당을 결합시키고, 이를 리포솜에 도입함으로써, 리포솜의 안정성 및 세포내 이입율이 향상되어 약물전달체로 사용시 약물의 세포내 이입효과의 향상을 기대할 수 있으므로 주사제로 특히 유용하게 사용할 수 있는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당, 인지질, 리포솜

Description

당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법{Liposome containing saccharide-conjugated phospholipid and preparing method for them}

도 1a는 락토실-DSPE-PEG2000로 표시되는 당이 결합된 인지질의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 1b는 말토실-DSPE-PEG2000 로 표시되는 당이 결합된 인지질의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이며, 도 1c는 수크로실-DSPE-PEG2000으로 표시되는 당이 결합된 인지질의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2a ~ 2e는 당이 결합된 인지질을 포함하는 리포솜의 세포이입율을 유세포 분석기로 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 2a는 간암 세포주인 HepG2 세포주, 도 2b는 자궁경부암 세포주인 Hela 세포주, 도 2c는 피부암 세포주인 A375P 세포주, 도 2d는 유방암 세포주인 MCF-7 세포주, 및 도 2e는 폐암 세포주인 NCI-H358 세포주에 적용한 결과이다.

본 발명은 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 당이 결합된 지질을 포함한 리포솜을 약물 전달체로 사용시 세포내 이입효과를 얻게 되어 주사제에 유용하게 사용할 수 있는 리포솜에 관한 것이다.

리포솜은 인지질로 이루어진 이중막을 가지는 소포체로써 소포체의 크기, 표면의 전하 그리고 이중막의 유동성 등을 소포체를 이루는 구성에 따라 다양하게 변화할 수 있는 장점을 가지며 또한 세포막 구조와 매우 유사하여 약물전달체로서 사용 되고 있다 [A.D. Bangham, M. Standish, J. C. Watkis, J. Mol. Biol., 13, 238(1965)].

그러나, 약물전달체로서 사용되는 리포솜은 혈류내 단백질 흡착 및 세망내피계에 의한 소실 등의 짧은 체내순환시간에 의하여 표적세포에 도달하지 못하고 비특이적인 세포이입에 의하여 특정세포내 약물을 전달하지 못하는 문제를 가지고 있다.

상기의 리포솜의 체내순환시간을 극복하기 위한 방안으로 생체 적합성 고분자 물질인 폴리에틸렌글리콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐알콜 및 폴리아크릴이미드 등으로 리포솜을 수식하여 리포솜의 안정성을 증가시키고 있다. 이러한 고분자중 폴리에틸렌글리콜은 리포솜의 안정성을 향상시키기 위한 물질로 가장 많이 사용되고 있다[Lasic D. D., Adv. Dr㎍ Delivery. Rev., 24, 65(1997); Moghimi S. M., Prog. Lipid Res., 42, 463(2003)].

또한 특정세포내로 약물을 전달시키기 위하여 세포의 수용체를 표적화해야 한다. 이러한 문제를 극복하기 위한 방안으로 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레 오티드 그리고 항체를 리포솜의 표면에 결합하여 세포의 표적화를 증가시키고 있다 [Torchilin V. P., Adv . Dr ㎍ Delivery . Rev ., 57, 95(2005); Terada T., Iwai M., Kawakami S. Yamashita F., Hashida M., J. Control. Release, 111, 333(2006)].

그러나, 종래의 체내순환증가나 표적화 물질을 통한 특정세포에 대한 약물 전달은 단일방법으로 사용하는 경우 효과가 떨어지는 문제가 제기되는 바, 리포솜의 안정성 향상 및 특정세포에 대한 약물 전달을 위한 논의가 활발하게 대두되고 있다.

한편, US 6,071,532 호는 당이, 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 인지질의 말단과 아민결합된 사례를 제시하고 있으며, US 6,171,614 호는 2차 또는 3차 아민을 링커로 하는 탄화수소기가 인산기와 직접 결합된 인지질의 사례를 제시하고 있다.

따라서, 현재 사용되고 있는 리포솜에 비하여 리포솜의 안정성 향상을 통하여 체내에서 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 하고, 종양세포 내에 약물이 농축될 수 있도록 세포의 표적화를 가능하게 하는 제형의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 세포내 이입효과를 향상시키기 위하여 연구한 결과, 인지질 내 폴리에틸렌글리콜기의 말단에 당을 아미드 결합시키고 이를 리포솜에 도입함으로써, 제조된 리포솜의 체내 안정성 및 세포내 이입율이 향상됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 리포솜 수식용 인지질을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R_1,R₂는 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl), 알킬기(alkyl), 알케닐기(alkenyl), 알키닐기(alkynyl) 및 아릴기(aryl) 중에서 선택된 탄화수소기이고, X는 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류 중에서 선택된 당류이며, n는 3 ∼ 150 범위의 정수이다.

또한, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 인지질로 수식된 리포솜과 그의 제조방법을 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인지질을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 말단에 당을 결합시키고, 이를 리포솜에 도입함으로써, 리포솜의 안정성 및 세포내 이입율이 향상되어 약물 전달체로 사용시 약물의 세포내 이입효과의 향상을 기대할 수 있으므로 주사제로 특히 유용하게 사용할 수 있는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 당이 아미드 결합된 인지질은, 인지질을 구성하는 인산기와 폴리에틸렌글리콜이 아미드 결합으로 결합되고, 상기 폴리에틸렌글리콜 말단의 카르복시기가 당과 아미드 결합되어진 구조적 특징을 가진다. 이러한 구조적 특징으로 인해 본 발명의 당이 아미드 결합된 인지질을 사용하여 리포솜을 수식할 경우 세포내 이입효율이 증가하는 특징이 부가된다.

본 발명의 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜은 다음 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 먼저, 당을 아민화시켜 아민기를 부여하고, 그리고, 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 인지질의 카르복시 말단을 활성화시킨 후에 상기 아민기가 부여된 당과 인지질 말단의 카르복시기를 아미드 결합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 리포솜 수식용 당이 결합된 인지질을 제조한 후 상기 리포솜 수식용 당이 결합된 인지질을 리포솜화하여 리포솜을 수식하는 단계를 포함하여 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜을 제조한다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서; R₁,R₂, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

본 발명에서는 인지질에 결합되는 당인 X는 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류 중에서 선택된 당류를 사용하는 것이 가능하며, 세포이입율 향상의 측면에서 이당류를 사용하는 것이 더욱 좋다.

또한, 상기 R₁과 R₂ 은 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl), 알킬기(alkyl), 알케닐기(alkenyl), 알키닐기(alkynyl) 및 아릴기(aryl) 중에서 선택된 탄화수소기로서, 구체적으로 예를 들면 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 팔미토레오일, 스테아로일, 오레오일, 리노레노일, 아라치도일, 아라치도노일, 디아세틸레닉, 메타크릴오일, 아클릴오일, 디에노일, 소르빌 및 스티릴 등 중에서 선택된 것이 사용될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

당과 인지질은 아미드 결합으로 폴리에틸렌글리콜과 결합되어 있으며, n의 수에 따라 유동성을 가지는데, 이때 n이 3보다 적으면 리포솜의 안정성을 증가시킬 수 없으며, n이 150을 초과하면 리포솜의 크기가 커지는 경향을 나타낸다.

또한, 본 발명의 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜은 당에 아민기를 부여하고, 카르복시 말단을 가진 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 인지질을 리포솜화하여 리포솜을 제조한 다음, 상기 리포솜 표면의 카르복시 말단을 먼저 활성화시킨 후 상기 아민기가 부여된 당과 아미드 결합시켜 상기 화학식 1로 표시되는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜을 제조하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명은 상기 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜을 포함하는데, 본 발명의 리포솜은 지질성분을 사용하여 통상적인 방법으로 리포솜화시킨 것이다. 즉, 상기 당이 결합된 인지질을 제조한 후 이를 콜레스테롤, 지질 등의 통상적으로 리포솜 제조시 사용되는 지질과 혼합 및 수화시켜 제조하게 되고, 이에 따라 상기 당이 결합된 인지질을 포함하는 리포솜은 표면이 폴리에틸렌글리콜과 공유결합된 당으로 수식되게 된다.

상기와 같이 당이 아미드 결합된 인지질은, 리포솜을 구성하는 전체 지질 성분 중 0.1 ∼ 20 몰% 범위로 포함된 것이 구조적 안정성을 유지하는 측면에서 좋다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 리포솜은, 인지질에 포함된 폴리에틸렌글리콜의 말단에 당이 아미드 결합됨으로써 체내순환시간이 향상이 되고 세포내 특이적으로 이입률을 향상시킬 수 있으므로, 약물전달체로서 특히 유용한데, 이때 사용되는 약물로는 안트라사이클린 계열, 알킬화제 계열, 백금 화합물 등 중에서 선택된 어느 하나의 약물이 봉입될 수 있다. 상기와 같이 약물이 봉입된 리포솜은 주사제 등으로 제형화하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 ∼ 3 : 당이 결합된 인지질의 제조

1) 아민기가 결합된 당의 제조

이당류인 락토오스, 말토오스 및 수크로오스을 각 11 g씩 둥근플라스크에 넣고 28 ml 물에 용해시킨 후 15 g 암모늄 히드로겐 카보네이트 15 g을 첨가한 후 상온에서 교반하면서 반응을 시켜주었다.

반응의 진행과정은 전개용액을 클로로포름, 메탄올 그리고 물을 각각 1:2:0.5 v/v/v으로 사용하는 얇은막 크로마토그래피를 통하여 확인하였다. 반응 후 동결건조하여 물을 제거하였고, 아민그룹을 가지고 있는 이당류인 락토실-아민(lactosyl-amine), 말토실-아민(maltosyl-amine) 및 수크로실-아민(sucrosyl-amine)을 합성하였다.

2) 당이 결합된 인지질의 제조

10 mmol의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[카르복시(폴 리에틸렌글리콜)2000](DSPE-carboxy-PEG2000)을 5 ml의 PBS 완충용액에 용해시킨 후 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 N-하이드록시-숙시니이미드(NHS)를 각 300 mmol 첨가하여 카르복시 말단을 활성화시켰다. 활성 후 상기 1) 단계에서 제조된 락토실-아민(lactosyl-amine), 말토실-아민(maltosyl-amine) 및 수크로실-아민(sucrosyl-amine)을 각 50 mmol 첨가한 후 20 시간동안 상온에서 교반시켜 얻어진 용액을 투석막에 담아 4 ℃에서 72시간 동안 막투석을 실시하여 정제하였다.

막투석을 통해 정제된 용액은 동결 건조를 통하여 건조한 후 각각 락토실DSPE-PEG2000(lactosyl-DSPE-PEG2000)[실시예 1], 말토실DSPE-PEG2000(maltosyl- DSPE-PEG2000)[실시예 2] 및 수크로실DSPE-PEG2000(sucrosyl-DSPE-PEG2000)[실시예 3]을 얻었다. 반응 생성물은 도 1에 나타낸 바와 같이 NMR 분광분석을 통하여 확인하였다.

실시예 4 ∼ 6 : 당이 결합된 인지질을 포함하는 리포솜의 제조

표면에 당이 수식된 리포솜을 제조하기 위하여 지질성분인 L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL)과, 락토실-DSPE-PEG2000(lactosyl-DSPE-PEG2000), 말토실-DSPE-PEG2000(maltosyl-DSPE-PEG2000) 및 수크로실-DSPE-PEG2000(sucrosyl- DSPE-PEG2000)를 3 : 1 : 1의 질량비율로 혼합하여 클로로포름 용매에 용해시킨 후, 둥근 플라스크에 넣고 회전 증발응축기를 이용하여 용매를 제거한 후 필름형태의 지질막을 얻었다.

250 mM 암모늄 설페이트 용액 10 ml을 이용하여 필름형태의 지질막을 수화시켰고, 가압 압출기를 이용하여 리포솜의 크기를 100 nm 내외로 성형하였다. 제조된 리포솜에 약물을 봉입시키기 위하여 항암제(독소루비신, 2 mg/ml)와 리포솜 용액을 1:1(v/v)로 혼합하여 60℃에서 2시간동안 숙성시켰다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 항암제는 막 투석을 실시하여 제거하였다.

비교예 1

상기 실시예 4와 동일하게 실시하되, L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000]을 3:1:1의 질량비율로 사용하여 리포솜을 제조하였다.

시험예 1

실시예 4 ∼ 6 과 비교예 1에 의해 제조한 리포솜의 입자 크기와 표면 전하를 전기영동 광산란 분광 광도기(ELS-8000, Otuska, Japan)를 이용하여 측정하였고, 항암약물의 함유율은 형광 분광광도계(Turner quantech fluorometer, Barnstead international, USA)를 이용하여 흡수파장 490 nm, 방출파장 585 nm에서 측정하였으며, 그 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

구 분	성 분	입자크기 (nm)	표면전하 (mV)	약물함유율 (%)
비교예	HSPC:CHOL:DSPE-mPEG2000	115.6 ± 3.2	-18.7 ± 2.2	93.2
실시예 4	HSPC:CHOL:Lactosyl-DSPE-PEG2000	121.0 ± 3.5	-39.0 ± 1.9	92.9
실시예 5	HSPC:CHOL:Maltosyl-DSPE-PEG2000	119.3 ± 4.9	-28.9 ± 0.6	95.2
실시예 6	HSPC:CHOL:Sucrosyl-DSPE-PEG2000	116.1 ± 4.9	-26.1 ± 3.4	93.4

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 4 ∼ 6의 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜의 물리적 특성을 확인하고, 이를 비교예 1의 리포솜과 대비한 결과 입자크기 그리고 약물함유율은 큰 차이를 보이지 않았으나 표면전하의 값은 낮아졌다. 이는 인지질의 말단에 결합된 당의 히드록시기에 의하여 리포솜의 표면전하가 낮아진 것을 확인할 수 있다.

시험예 2

리포솜의 세포 이입률을 측정하기 위하여, 24 웰 플레이트에 세포를 2 x 10⁴ cells/well씩 2일간 배양 후 독소루비신 약물과 상기 실시예 4 ∼ 6 및 비교예 1에서 제조된 리포솜을 15 ㎍/ml의 농도인 소 혈청이 들어있지 않은 배지로 교체하여 2시간동안 처리하였다. 2시간 후 배지를 제거한 후 PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 세포를 5 ml 튜브에 모은다. 유세포 분석기를 통하여 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜의 세포의 이입률을 판단하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 간암 세포주인 HepG2 세포주, 자궁경부암 세포주인 Hela 세포주, 피부암 세포주인 A375P 세포주, 유방암 세포주인 MCF-7 세포주 그리고 폐암 세포주인 NCI-H358 세포주에서 모두 비교예에 비해 더 높은 세포이입효과를 확인할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌글리콜 말단에 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜은 당에 의한 세포이입율이 향상될 뿐 아니라 리포솜 표면에 수식된 폴리에틸렌글리콜에 의한 리포솜의 안정성 증가가 기대되고 세포내 약물의 이입이 용이하므로 장기순환형 및 특정세포 표적형 약물전달체 등에 응용이 기대된다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 리포솜 수식용 당이 결합된 인지질;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R_1,R₂는 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl)이고, X는 이당류이며, n는 3 ∼ 150 범위의 정수이다.
다음 화학식 1로 표시되는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R_1,R₂는 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl)이고, X는 이당류이며, n는 3 ∼ 150 범위의 정수이다.
제 2 항에 있어서,

상기 당이 결합된 인지질은 리포솜을 구성하는 전체 지질 성분 중 0.1 ∼ 20 몰% 범위로 포함된 것을 특징으로 하는 리포솜.
제 2 항에 있어서,

상기 화학식 1로 표시되는 인지질을 함유하는 리포솜은 리포솜의 표면에 당이 공유결합된 것을 특징으로 하는 리포솜.
1) 당에 아민기를 부여하는 단계,

2) 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 인지질의 카르복시 말단을 활성화시킨 후 상기 아민기가 부여된 당과 아미드 결합시켜 다음 화학식 1로 표시되는 리포솜 수식용 당이 결합된 인지질을 제조하는 단계, 및

3) 상기 리포솜 수식용 당이 결합된 인지질을 리포솜화하여 리포솜을 수식하는 단계

를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜의 제조방법;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R_1,R₂는 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl)이고, X는 이당류이며, n는 3 ∼ 150 범위의 정수이다.
1) 당에 아민기를 부여하는 단계,

2) 카르복시 말단을 가진 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 인지질을 리포솜화하여 리포솜을 제조하는 단계, 및,

3) 상기 리포솜 표면의 카르복시 말단을 활성화시킨 후 상기 아민기가 부여된 당과 아미드 결합시켜 다음 화학식 1로 표시되는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜을 제조하는 단계

를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜의 제조방법;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R_1,R₂는 각각 독립적으로 탄소수 8 ∼ 24 범위의 아실기(acyl)이고, X는 이당류이며, n는 3 ∼ 150 범위의 정수이다.
삭제
청구항 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 항의 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜에 안트라사이클린 계열, 알킬화제 계열, 백금 화합물 중에서 선택된 어느 하나의 약물이 봉입된 약물전달체.