JP3920330B2 - ポリエチレングリコール変性されたセラミド脂質類及びそれらのリポソームへの使用 - Google Patents

Description

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、新規のポリエチレングリコール（PEG）誘導体化脂質類、それらの調製方法、及びリポソーム又は他の脂質基材とするキャリヤーへのそれらの使用に関する。より特定的には、本発明は、PEG−セラミド脂質及び薬物供給に使用するためのリポソームへのそれらの包含に関する。
２．関連技術
リポソームは、水性相を封入する同心円的に規則付けられた脂質二重層から構成される小胞である。リポソームは、脂質、すなわち１又は複数の長脂肪族鎖の末端に結合される極性先端基を典型的に含んで成る分子、たとえばリン脂質が水に暴露される場合に形成する。そのような媒体への遭遇に基づいて、脂質は凝集して構造体を形成し、極性先端基のみが外部媒体に暴露されて外殻を形成し、その内側では脂肪族尾部が封鎖される。たとえば、Lehninger, Principles of Biochemistry（Worth, 1982）を参照のこと。リポソームは、インビボで細胞及び組織への生物活性又は医薬剤の供給のために種々のそれらの剤を閉じ込めることができる。たとえば、アメリカ特許第5,185,154号（Lasic、など、）；ヨーロッパ特許出願第526,700号（Tagawa、など、）；及びアメリカ特許第5,013,556号（Woodle、など、）を参照のこと。
リポソームは、封入される生物活性剤の生体分布及び供給速度を種々の手段で変更することができる。たとえば、リポソームに封入された薬物は、薬物を化学的に分解できる血清因子との相互作用から保護される。遊離薬物に比較してリポソームの大きさはまた、身体におけるある部位へのその接近に影響を及ぼし；その性質はある部位への薬物供給の制限において好都合であり得る。細網内皮系統（RES）による摂取は、他の脂質、たとえばガングリオシドGM₁と共にPEG−脂質を用いることによって、リポソームとのタンパク質の会合又はRES細胞とのリポソームの相互作用を阻害する、リポソーム表面上の因子を包含することによって阻害され得る。Woodle、前記を参照のこと。
種々のリポソーム構造体が１又は複数の脂質を用いて形成され得る。典型的な種類のリポソーム構造体は、単一層の小胞（SUV）、大きな単一層の小胞（LUV）又は複層の小胞（MLV）を包含する。リポソームの構成及び供給システムとしてのそれらの適用は当業界において知られている。たとえば、Liposomes, Mare J. Ostro, ed. (Marcel Dekker 1983)を参照のこと。
リポソームは、新規のリポソーム構造体を形成するために存在する脂質系を誘導体化することによって調製されて来た。たとえば、ポリエチレングリコール(PEG)誘導体化脂質が開発されて来た。Woodls、前記を参照のこと。
典型的には、PEG−脂質は、ジアシルグリセロリン脂質、たとえばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）の極性先端基のPEGによる誘導体化により調製される。それらのリン脂質は通常、エステル結合によりグリセロールの１−及び２−位置に結合される２つの脂肪アシル鎖を含む。不都合なことには、それらのアシル基は、酸性又は塩基性条件下での環境に敏感である。その得られる加水分解生成物、たとえばリゾリン脂質及びグリセロホスフェートの類似体は、リポソームの二層構造に関連して存続しない。そのような分解はリポソーム構造体の結合性を弱くし、リポソームからの生物活性剤又は薬物の有意な漏れを導びき、そして貯蔵の間、不安定性に寄与し、そして従って、リポソーム生成物の貯蔵寿命を短くする。さらに、リポソームからのそれらの加水分解生成物、たとえばPEG−リゾリン脂質の損失は、他方では、PEG−リン脂質の存在に起因する利益を無効にする。
脂質の安定性は、リポソーム薬物供給システムの開発において重要である。これは、極端な酸性（pH２〜４）又は塩基性（pH10〜12）条件が効果的な薬物摂取及び保護を達成するために使用されるので、トランスメンブランpHグラジエントがリポソームに生物活性剤を閉じ込め、又は封入するために使用される場合に特に適切である。従って、加水分解に対して敏感でなく、それにより、リポソームの環境寿命を高めるPEG−脂質を開発することが所望される。
発明の要約
１つの観点において、本発明は、PEG−脂質、たとえば下記式Ｉ：

〔式中、Ｒ¹，Ｒ²、及びＲ³は独立して、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり；
Ｒ⁴は水素、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₃₀アルキニル又はアリールであり；
Ｒ⁵は水素、アルキル、アシル、アリール又はPEGであり；
Ｘ¹は−Ｏ−，−Ｓ−、又は−NR⁶−であり、ここでＲ⁶は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり；又はＲ⁵がPEGであり、そしてｂが１である場合、Ｘ¹はさらに、-Y¹-alk-Y²-であり；
Ｙは−NR⁷−であり、ここでＲ⁷は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり、あるいはＹは−Ｏ−，−Ｓ−又は-Y¹-alk-Y²-であり、ここでＹ¹及びＹ²は独立して、アミノ、アミド、カルボキシル、カルバメート、カルボニル、カルボネート、ウレア又はホスホロであり；そしてalkはＣ₁−Ｃ₆アルキレンであり；
PEGはＣ₁−Ｃ₃アルキル、アルコキシ、アシル又はアリールにより場合によっては置換されている、約550〜約8,500ドルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールであり；ここで、ａは０又は１であり；そしてｂは０又は１であるが、Ｒ⁵がPEGでない場合、ｂは１である〕で表わされるPEG−変性されたセラミドを包含する。
Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³、及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がアルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙがスクシネートであり；そしてPEGが約2,000又は約5,000ドルトンの平均分子量を有し、そして末端ヒドロキシル位置でメチルにより置換されているそれらの化合物がより好ましい。
Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³、及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がアルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙが−NH−であり；そしてPEGが約2,000又は約5,000ドルトンの平均分子量を有し、そして末端位置でメチルにより置換されているそれらの化合物がまた、好ましい。
他の好ましい脂質化合物は、Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がＣ₇−Ｃ₂₃アルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙがスクシネートであり；そしてPEGが約2,000ドルトンの平均分子量を有し、そして末端のヒドロキシル位置でメトキシにより置換されているものであり；より好ましい化合物は、Ｒ⁴がＣ₁₃−Ｃ₁₉アルキルであるそれらの脂質化合物である。
もう１つの観点においては、本発明は上記PEG−セラミド脂質を含むリポソーム又は他の脂質基材のキャリヤーを包含する。好ましいリポソーム組成物は、上記好ましい脂質を含む。リポソームの構成においては、前記PEG−セラミド脂質の種々の混合物が、他の脂質型、たとえばDOPE及びDODAC、並びにDSPC, SM, Chol及び同様のものと組合して及びそれらと一緒に使用され得、そしてDOPE及びDODACが好ましい。典型的には、PEG−セラミドは最終リポソーム構造体の約５〜約30モル％を含んで成るが、しかし約0.0〜約60モル％又は約0.5〜約５モル％を含むこともできる。より好ましい脂質組成物は、薬物又は生物学的剤がリポソーム内に封入されているものである、本発明はまた、脂質複合体も含み、それにより、PEG−セラミド脂質はその複合体の約0.01〜約90モル％を含んで成る。
さらにもう１つの観点においては、本発明は、本発明のリポソーム又は脂質を基材とするキャリヤーにおける治療的有効量の治療剤、たとえば薬物及びワクチンを患者に投与することを含んで成る、そのような治療剤をそれを必要とする患者に供給するための方法を包含する。また、PEG−セラミド脂質、及び医薬製剤含有リポソームを包含する、ラベルされたリポソームを調製するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び１Ｂは、本発明のPEG変性されたセラミドリポソームの循環寿命をグラフ的に示す。図１Ａは、ジステアリルホスファチジルコリン（DSPC）／コレステロール（Chol）（55：45モル％；白丸）、DSPC／Chol／PEG₂₀₀₀セラミド（55：45：５モル％；黒丸）及びDSPC／Chol／PEG₅₀₀₀セラミド（55：45：５モル％；黒の四角）から調製された100nmのリポソームの血漿クリアランスを示す。図１Ｂは、DSPC／Chol／（55：45モル％；白丸）、スフィンゴミエリン（SM）Chol（55：45モル％；黒丸）及びスフィンゴミエリン／CholPEG₂₀₀₀セラミド（50：45：５モル％；白の四角）から調製された100nmにリポソームの血漿クリアランスを示す。
図２は、リポソームビンクリスチン配合物中へのPEG変性されたセラミドの組込みが薬物保持特徴に悪い影響を及ぼさないことをグラフ的に示す。循環内でのスフィンゴミエリン／Chol（55：45モル％；黒丸）リポソームによるビンクリスチン保持性は、PEG₂₀₀₀セラミド（50：45：５モル％；白丸）の組込みにより影響されない。ビンクリスチン保持性はまた、DSPC／Chol（55：45モル％：白丸）及びSM／Chol／PEG-PE（ホスファチジルエタノールアミン）（50：45：５モル％；黒の四角）についても示される。
図３は、種々のSM／コレステロールリポソーム、たとえば種々の脂肪酸鎖長のPEG₂₀₀₀−セラミドを含むもの及びPEG₂₀₀₀−DSPE（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）を含むものの脂質循環半減（Ｔ_1/2）期（時間による）を示す。
図４は、種々のPEG₂₀₀₀−セラミド及びPEG₂₀₀₀−DSPEと共にビンクリスチンを含むリポソームについてのビンクリスチン／脂質の割合（ビンクリスチン保持率）の循環半減期（Ｔ_1/2）（時間による）を示す。
図５は、ビンクリスチン含有リポソームの循環半減期（Ｔ_1/2）（時間による）を示す。
図６は、血液及び肝臓におけるリポソームの生体物分布に対するPEG−セラミド（Ｃ20）の上昇する濃度の効果をグラフ的に示す。DOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、15モル％のDODAC（Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）及び指示された濃度のPEG−セラミド（Ｃ20）から成る³Ｈ−ラベルされたリポソームが、マウス中にi.v.注射された。生物分布を注射の１時間後に試験され、そしてそのデータが、SD(標準偏差）（ｎ＝３）を伴って、血液（上方のパネル）及び肝臓（下方のパネル）における注射された用量の百分率として示された。
図７は、血液におけるリポソームの生物分布に対するDODACの上昇する濃度の効果をグラフ的に示す。DOPE, 10モル％（白の四角）又は30モル％（白の三角）のPEG−セラミド（Ｃ20）、及び指示された濃度のDODACから成る³Ｈ−ラベルされたリポソームがマウス中にi.v.注射された。生物分布を注射の１時間後に試験し、そしてデータが血液における注射された用量の％として示された。
図８は、注射の後、種々の時間での血液及び肝臓におけるリポソームレベルをグラフ的に示す。DOPE／DODAC（85：15モル／モル）（白丸、０％ PEG−セラミド（Ｃ20））、DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（75：15：10モル／モル／モル）（白丸、10％ PEG−セラミド（Ｃ20））、及びDOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）(55：15：30モル／モル／モル）（白の三角、30％ PEG−セラミド（Ｃ20））から成る³Ｈ−ラベルされたリポソームがマウス中にi.v.注射された。生物分布が指示された時間で試験され、そしてそのデータが、SD（ｎ＝３）を伴って、血液（上方のパネル）及び肝臓（下方のパネル）における注射された用量の％として示された。
図９は、アニオン性標的とPEG₂₀₀₀−DMPE及びPEG₂₀₀₀−セラミド（Ｃ40：０）含有小胞との融合をグラフ的に示す。
好ましい態様の詳細な記載
式ＩのPEG−変性されたセラミド脂質は、リポソームの循環寿命を長くすることにより；たとえば標的化のためのタンパク質共有結合の間、リポソームの凝集を妨げることにより；標的化成分又は薬物、たとえば抗体及びDNAを組込むリポソームの凝集を妨げることにより；リポソーム内の薬物保持を促進することにより；そして／又は低いpHが生物活性剤の封入のために必要とされる場合、リポソームの二層又は他の安定性を高めることによりリポソームの性質を増強する。それらのPEG−セラミド脂質はまた、リポソーム二層の脂質アシル鎖の加水分解による漏れを減じ、そして他の脂質形よりも一層、安定している。
定義
本明細書で使用される場合、用語“アルキル”とは、枝分れ鎖又は枝なし鎖の炭化水素鎖、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル及び２−メチルペンチルを示す。それらの基は、アルキル基、たとえばトリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピル、２−フルオロエチル、カルボキシメチル、シアノブチル及び同様のものを形成するために、そのような鎖に通常結合される１又は複数の官能基、たとえばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト又はチオ、シアノ、アルキルチオ、複素環式、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、カルコキシル、アミド及び同様のものにより任意に置換され得る。
用語“アルキレン”とは、上記で定義されたような二価のアルキル、たとえばメチレン（-CH₂-）、プロピレン（-CH₂CH₂CH₂-）、クロロエチレン（-CHClCH₂-）、２−チオブラン（-CH₂CH(SH)CH₂CH₂-）、１−ブロモ−３−ヒドロキシル−４−メチルペンテン（-CHBrCH₂CH(OH)CH(CH₃)CH₂-)及び同様のものを意味する。
用語“アルケニル”とは、１又は複数の炭素−炭素二重結合を含む枝分れ鎖又は枝なし鎖の炭化水素鎖を示す。
用語“アルキニル”とは、１又は複数の炭素−炭素三重結合を含む枝分れ鎖又は枝なし鎖の炭化水素鎖を示す。
用語“アリール”とは、好ましくは、約６〜14個の炭素原子を有する少なくとも１つの芳香族環、たとえばフェニル、ナフチル、インデニル及び同様のものを形成する炭素原子の鎖を示し、そしてアリール基、たとえばビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ビロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニル及び同様のものを形成するために、そのような鎖に通常結合される１又は複数の官能基、たとえばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト又はチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環式、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミド及び同様のものにより置換され得る炭素原子の鎖を示す。
用語“アシル”とは、基−C(O)R（ここでＲは、上記で定義されたようなアルキル又はアリールである）、たとえばホルミル、アセチル、プロピオニル又はブチリルを示す。
用語“アルコキシ”とは、−OR−（ここでＲはアルキルである）を示す。
用語“アミド”とは、アミド結合、すなわち−C(O)NH−を示す。
用語“アミノ”とは、アミン結合、すなわち−NR−（ここでＲは水素又はアルキルである）を示す。
用語“カルボキシル”とは-C(O)O-を示し、そして用語“カルボニル”とは−C(O)−を示す。
用語“カーボネート”とは、−OC(O)O−を示す。
用語“カルバメート”とは-NHC(O)O-を示し、そして用語“ウレア”とは−NHC(O)NH−を示す。
用語“ホスホロ”とは、−OP(O)(OH)O−を示す。
脂質化合物の構造及び調製
本発明の化合物は標準的技法及び試薬を用いて合成される。本発明の化合物は種々のアミド、アミン、エーテル、チオ、エステル、カーボネート、カルバメート、ウレア及びホスホロ結合を含むであろうことが認識されるであろう。当業者はそれらの結合を形成するための方法及び試薬は十分に知られており、そして容易に入手できることを認識するであろう。たとえば、March, Advanced Organic Chemistry（Wiley 1992）；Larock, Comprehonsine Organic Transformations（VCH, 1989）；及びFurniss, Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry 5th ed.（Longman 1989）を参照のこと。存在するいづれかの官能基が本発明の化合物の合成における異なった点で保護及び保護解除を必要とすることも認識されるであろう。当業者は、そのような技法が良く知られていることを認識するでろう。たとえば、Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis（Wiley 1991）を参照のこと。
本発明の化合物を形成するための反応の一般的な順序は、下記反応スケムＩに示される。ここで示されるように、セラミド誘導体１はPEG誘導体PEG-Y¹-alk-RGと反応せしめられる。Ｒ¹−Ｒ⁴及びＹ¹は上記で定義されたような意味を有する。RGは、PEGとセラミド誘導体（すなわち-Y¹-alk-Y²-）との間で所望するＹ²結合を形成するためにＸ²と反応する基である。従って、RG及びＸ²の同定はお互いに対して相補的であり、そして所望する結合を供給するように定義されるであろう。たとえば、RGが求核中心、たとえば−SH，−OH、又は−NH₂である場合、Ｘ²は良好な脱離基、たとえば−OTs（ここでTsはトシル基又はハロゲンを表わす）を形成するために誘導体化された酸素であり得る。逆に言えば、Ｘ²は求核中心、たとえば−SH，−OH、又は−NH₂であり得、そしてRGは求核攻撃に対して反応性である基、たとえばジシクロヘキシルカルボイミド（DCC）又は塩化アシル（−COCl）により活性化されたカルボキシルであり得る。RG及びＸ²の適切な選択により、リンカーとセラミドとの間のカルボキシル、カルバメート、カルボニル、カーボネート、ウレア又はホスホロ結合が得られる。最終的に、中間体Ｚ上に残存するいづれかの保護基、たとえばＲ⁸は、所望するPEG−セラミド誘導体３を形成するために転換される。

Ｙ¹及びＹ²がカルボキシルである本発明のPEG−セラミド脂質の典型的な合成が下記反応スケムIIに示される。架橋形成の可能性ある問題を排除するために、PEGは非反応基、たとえばメトキシ又はエトキシにより一端でキャップされる。PEG分子の他端での第２ヒドロキシル基は、適切な試薬、たとえばシアヌル酸、１，１′−カルボニルジイミダゾール（CDI）又はハロゲン化トレシルにより活性化される。他方、末端ヒドロキシル基は最初に、適切な縮合試薬、たとえばスクシネート又はアミンの存在下でセラミドと容易に反応され得る誘導体に転換され得る。他の方法においては、セラミド上のヒドロキシル基がPEGとの連結のために選択的に活性化され得、又は２種の化合物が確立したカップリング法により一致したカップリング反応において結合され得る。
示される例においては、セラミド〔Sigma Chemical Company(St. Louis, Missouri)及びAvanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama）から市販されている〕の第一ヒドロキシル基は、第二及び第三アルコールよりも第一アルコールでの反応を好むタイプのヒドロキシル保護基と反応される。好ましい保護基は、立体的にヒンダードされると思われるもの、たとえば中心の炭素原子に結合される３つのフェニル環を含んで成る塩化トリチル（TrCl）である。しかしながら、他の保護基は当業界において知られている（Green and Wuts、前記を参照のこと）。この反応は標準の技法及び条件を用いて実施される。
Ｃ₁ヒドロキシル基の保護に続いて、Ｃ₃での第二アルコールが第二保護基により保護される。その第二保護基は、よりヒンダードされた第二アルコールに対して反応性であるが、しかしＧアルコールをブロックする保護基を除去するために効果的な条件下では除去されない基であるべきである。好ましい保護基はベンジル（Bn）である。再び、他の適切な保護基の組合せは、当業者に明らかであろう。
両ヒドロキシル基が保護されれば、Ｃ₁−OH保護基は、Ｃ₃アルコールで保護基に影響を及ぼさない条件下で除去される。次に、遊離ヒドロキシル官能基は、所望するPEG−セラミド誘導体を形成するためにジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及び４−Ｎ，Ｎ′−ジメチルアミノピリジン（DMAP）と共にPEG誘導体Me(PEG)OC(O)CH₂CH₂CO₂Hと反応せしめられる。
Ｃ₃での保護基は、所望には、他の置換基を得るためにこの部位で他の反応を可能にするために除去され得る。

下記反応スケムIIIに示されるもう１つのアプローチにおいては、Ｙ¹はカルボキシルエステル基-OC(O)-であり、そしてＹ²はアミド−C(O)NH−である。このスケムに示されるように、セラミドの１−アミノ類似体が、その反応するＣ₁アルキルスルホネート（たとえば、メチルスルホネート、又は２，２，２−トリフルオロエタンスルホネート）にまず、Ｃ₁ヒドロキシル基の誘導体化により調製され得る。後者は、アンモニアにより直接的に、又は示されるようにアジド中間体を通してアミノ類似体に転換される。次に、１−アミノ−セラミドは、アミド結合を有するMe PEG−Ｓ−セラミドを形成するためにMePEG-ＳのＮ−ヒドロキシスクシンアミド（NHS）エステルに結合される。

他方、基Ｙは−NR⁷−であり得、ここでＲ⁷は水素、アルキル、アシル又はアリールであり；又はＹは−Ｏ−又は−Ｓ−であり得る。そのような具体例は、十分に知られた方法及び試薬を用いて形成され得る。たとえば、Ｙが−NH−である具体例は、下記反応スケムIVに示される合成路により製造され得る。ここで、上記１−メシル−セラミドが、アミノ結合を有する所望するMePEG−セラミド結合体を形成するために(MePEG−NH₂)のアミノ類似体と反応せしめられる。

セラミドにおけるＣ₁及びＣ₃両ヒドロキシル官能基は、その対応するビス−イミダゾリルホルメートを形成するために試薬、たとえばCDIにより活性化され得る。次に、後者は、１つのセラミドに結合される２つのMePEG分子との結合体を形成するために、MePEG−NH₂のアミノ基と反応せしめられる。１又は２つのいづれかのPEG分子が個々のセラミドに結合するために選択され、リポソームシステムへの特定の性質の導入のためのより柔軟な配置を可能にする。
基Ｙ＝Y¹-alk-Y²は、既知の技法を用いて、容易に入手できる出発材料から形成され得る。好ましい態様は、Ｙ¹及びＹ²の両者がカルボニル（−C(O)−）であり、又はＹ¹又はＹ²の１つがカルボニルであり、そして他の１つがアミド（−C(O)NH−）であるものを包含する。それらの基は、市販の二酸、たとえばマロン酸(CH₂(CO₂H)₂)、琥珀酸(HO₂CCH₂CH₂CO₂H)、グルタル酸(HO₂CCH₂CH₂CH₂CO₂H)、及びアジピン酸(HO₂CCH₂CH₂CH₂CH₂CO₂H)並びに同様のもの；及び置換された二酸、たとえば酒石酸(HO₂CCH(OH)CH(OH)CO₂H)、３−メチルグルタル酸(HO₂CCH₂CH(CH₃)CH₂CO₂H)及び同様のものから、化学者に良く知られた方法を用いて形成され得る。アシル誘導体、たとえばアシルクロリド、たとえば３−カルボメトキシプロピポニルクロリド(ClC(O)C₂H₄CO₂CH₃)及びそれらの化合物に反応するアミドは市販されており、又は既知の方法を用いて形成され得る。
PEGは、２つの末端ヒドロキシル基を有する酸化エチレン反復単位の線状水溶性ポリマーである。PEGはそれらの分子量により分類され；たとえば、PEG2000は約2,000ドルトンの平均分子量を有し、そしてPEG5000は約5,000ドルトンの平均分子量を有する。PEGはSigma Chemical Co.及び他の会社から市販されており、そしてモノメトキシポリエチレングリコール（MePEG−OH）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（MePEG−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（MePEG−Ｓ−NHS）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（MePEG−NH₂）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（MePEG−TRES）及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（MePEG−IM）を包含する。
リンカーＹへのPEGの結合は、当業界において知られている方法及び材料を用いて実施され得る。一般的に、PEG基のヒドロキシル又はアミノ成分が、所望する結合を形成するためにＹの適切な誘導体と反応せしめられる。たとえば、MePEG−OHの遊離ヒドロキシル官能基と、アシルクロリド誘導体、たとえばAldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsinから市販されている３−カルボメトキシプロピポニルクロリド（ClC(O)C₂H₄CO₂CH₃）との反応は、Me(PEG)-OC(O)C₂H₄CO₂CH₃を供給する。メチルエステルはさらに、標準の方法を用いて、たとえばアシルクロリド又はアミドに誘導体化され得る。他方、Me(PEG)OC(O)CH₂CH₂CO₂Hは下記に示されるようにMe(PEG)-OH及び無水琥珀酸から形成され得る：

さらなる他の方法は当業者に明らかであろう。
セラミドに直接的にPEGを結合するためには、MePEGにおけるヒドロキシ官能基が、その対応するイミダゾリルホルメートを形成するために試薬、たとえばCDIにより直接的に活性化され得る。次に、後者は、カーボネート結合を有する接合体を形成するために求核試薬、たとえばアルコール官能基又はセラミドの１つ又は両者と反応せしめられる。他方、１−アミノセラミドによるMePEGイミダゾリルホルメートの結合化は、カルバメート結合を有するMePEG−セラミドアダクトの形成をもたらすであろう。
スフィンゴシンのＮ−アシル脂肪酸である市販のセラミドは、卵黄及び脳組織から抽出される各自のスフィンゴミエリン前駆体におけるホスホコリンのホスホリパーゼＣ分解により得られる。スフィンゴミエリン脂質は、脂肪アミド鎖の組成において、たとえば炭素鎖の長さ及び二重結合の数において異なる。次のセラミドは、Sigma Chemical Co.及びAvanti Polar Lipids Inc.から市販されている：（１）ウシ脳からのタイプIII（約99％）；（２）ウシ脳からのタイプIV（約99％）；（３）脳から（約99％）；及び（４）卵から（約99％）。脂肪アミド鎖は、下記表Ｉに示されるように、スフィンゴミエリンの源に基づいて組成が異なる：

広範囲の種類のセラミド誘導体が、既知の方法を用いて、通常の出発材料から合成され得る。たとえば、市販のエリトリトール（Aldrich, Milwaukee, Wisconsin）から出発すれば、いづれかのセラミド誘導体が下記反応スケムＶに例示されるようにして合成され得る。既知の方法を用いてのエリトリトールの選択的保護は、反応スケムＶに示される出発材料を提供し、ここでＣ₁及びＣ₃炭素がベンジル（Bn）誘導体として保護され、Ｃ₂炭素がメチルメトキシ（MOM）エーテルとして保護され、そしてＣ₄炭素が３，４−ジメトキシベンジル（DMPM）エーテル誘導体として保護される。ジクロロジシアノキノン（DDQ）を用いてのDMPM基の選択的除去は、示されるようにアルデヒドを形成するために標準の方法を用いて酸化され得るその対応するアルコールを提供する（たとえば、Larock、前記を参照のこと）。
Wittig試薬Et₃P⁺C₁₄H₂₉Br^-とアルデヒドとの反応は、トランス−オレフィンを選択的に提供する。他方、トリフェニルホスフィン誘導体Ph₃P⁺C₁₄H₂₉Br^-との反応はシス−オレフィンを優先的に提供する。再び、オレフィン形成の他の方法は当業者に明らかであろう。MOM保護基の除去、アジ化ナトリウム（NaN₃）及び水素化リチウムアルミニウム（LiAlH₄）を用いてのアルコールの続く転換は、示されるアミドを生成するためにアシルクロリドと反応せしめられる所望するアミンを提供する。−78℃〜０℃の温度グラジエントを用いての塩化メチレン（CH₂Cl₂）における弗化硼素（BCl₃）とアミドとの反応、−78℃でのメタノール（MeOH）との続く反応は、所望するジオールを提供する。他の同等の合成方法は、当業者に明らかであろう。スフィンゴ脂質及び光学的活性のセラミドの合成に関する追加の情報は、Schmidt、など、Angew. Chem. Int. Ed. Engl（1987）26：793；Kiso、など、J. Carbohydr. Chem.（1986）５：335；及びNicolaou、など、J. Amer. Chem. Soc.（1988）110：7910に見出され得る。
種々の脂肪酸鎖長のセラミドがまた、種々のアシルクロリド〔R⁴C(O)Cl〕又は他のアシル、又は酸誘導体とのスケムＶのアミンとの反応により調製され得、これにより炭素鎖長は使用される特定のアシル基に基づかれる。典型的且つ好ましくは、炭素鎖長は、存在するいづれの二重結合を伴わないで約８〜約24個のアルキル鎖のものである。二重結合を有さない20個の炭素鎖長、すなわち脂肪アミド鎖として完全に飽和されたＣ₂₀アルキルを示す20：0として示されるそれらのセラミドが最とも好ましい。他方、均質組成物の特定のアシル鎖を有するセラミドは、Ｄ−スフィンゴシンのアミノ官能基による、適切に活性化されたカルボン酸化合物、たとえば脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルの接合により調製され得る。たとえば、エイコサン酸（また、アラキジン酸としても知られている）のアシルクロリドは、その得られるアミド側鎖のために長さ20個の炭素鎖（Ｃ20）を提供するであろう。他の酸は好ましくは、Ｃ８のためのオクタン酸（カプリル酸としても知られる）；Ｃ14のためのミリスチン酸；Ｃ16のためのパルミチン酸（ヘキサデカン酸としても知られる）；及びＣ24のためのテトラコサン酸（リグノセリン酸としても知られる）を包含する。14〜20個の炭素原子の脂肪アミド鎖長を有するセラミドが特に好ましい。最とも好ましくは、長さ14〜20個の炭素原子のものである。（Ｒ４は出発のアシルクロリド又は酸よりも長さにおいて１つ短い炭素のものであることが理解される。）

リポソーム調製
式Ｉの脂質を調製した後、それらを１又は複数の生物活性剤を組込み又は閉じ込めるリポソーム構造体に利用し、ここで１又は複数の脂質化合物がリポソームを構成する。たとえば、脂肪アミド鎖は脂質のセラミド部分上に種々の長さを有し、そしてその得られる種々の脂質化合物の混合物が所望するリポソームを形成する。さらに、非−PEGセラミド脂質は、式Ｉの脂質と共にリポソームを構成するために使用され得る。
種々の方法が、たとえばSzokaなど、９ Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 467（1980）；アメリカ特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号；テキストLiposomes Ch. １（前記）及びHopeなど、40 Chem. Phys. Lip. 89（1986）に記載されるようにリポソームを調製するための利用できる。１つの方法は、不均質サイズの多層小胞を生成する。この方法においては、小胞形成脂質が適切な有機溶媒又は溶媒システムに溶解され、そして真空又は不活性ガス下で乾燥せしめられ、薄い脂質のフィルムが形成される。他方では、脂質は有機溶媒、たとえばtert−ブチルアルコール又はベンゼン：メタノール（95：５ｖ／ｖ）に溶解され、そして凍結乾燥せしめられ、より容易に加水分解される粉末様形で存在する均質の脂質混合物が形成される。その乾燥脂質混合物は、緩衝水溶液により被覆され、そして撹拌を伴って、典型的には15〜60分間にわたって水和化される。得られる多層小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和化することによって、より小さなサイズに移行され得る。脂質の十分な水和化は、液体窒素下で凍結し、そして約50℃に融解することによって増強され得る。このサイクルは通常、約５回、反復される。
リポソーム調製に続いて、リポソームは所望するサイズ範囲及びリポソームサイズの比較的狭い分布を得るために分類され得る。約0.05〜0.20ミクロンのサイズ範囲が、典型的には0.22ミクロンのフィルターを用いての従来のフィルターを通しての濾過によりリポソーム懸濁液の除菌を可能にする。フィルター除菌法は、リポソームが約0.05〜0.20ミクロンに細かくされる場合、高い処理量で実施され得る。
いくつかの技法、たとえばアメリカ特許第4,737,323号に記載されるサイズ分け法がリポソームをサイズ分けするために利用できる。たとえば、槽又はプローブ音波処理によるリポソーム懸濁液の波処理は、約0.05ミクロン以下のサイズの小さな単層小胞への前進的なサイズ低下をもたらす。均質化は、大きなリポソームをより小さなリポソームに断片化する剪断エネルギーに頼るもう１つの方法である。典型的な均質化方法においては、多層小胞が、典型的には、約0.01〜0.5ミクロンの選択されたリポソームサイズが観察されるまで、標準のエマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。両方法においては、粒子サイズ分布は、従来のレーザー光粒子サイズ識別によりモニターされ得る。
小さな孔のポリカーボネート膜又は非対象セラミック膜を通してのリポソームの押出しもまた、リポソームを比較的十分に定義されたサイズ分布にするための効果的な方法である。典型的には、懸濁液は、所望するリポソームサイズ分布が達成されるまで、１回又は複数回、膜を通して循環される。リポソームは、リポソームサイズの徐々の低下を達成するために、連続的に小さな孔の膜を通して押出される。本発明への使用のためには、約0.05ミクロン〜約0.20ミクロンのサイズを有するリポソームが好ましい。リポソーム調製はまた、Deamerなど、Liposomes（前記）Liposome Preparation：Methods and Mechanismsにも記載されている。
リポソームサイズ分布はまた、疑似−弾性光散和技法により決定され得る。Bloomfield, 10 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 421（1981）を参照のこと。
供給ビークルとしてのリポソームの使用
本発明の脂質化合物を用いて調製されたリポソームは、種々の疾病状態、たとえば腫瘍、炎症性関節又は病巣の診断影像化を促進するであろうマーカーによりラベルされ得る。典型的には、それらのラベルは、放射性マーカーであるが、但し、螢光ラベルもまた使用され得る。γ−放出性放射性同位体の使用は、それらが容易にシンチレーションウェルカウンターで計数され得、計数の前、組織の均質化を必要とせず、そしてγ−カメラにより影像化され得るので、特に好都合である。
γ−又は陽電子−放出性放射性同位体が典型的には使用され、ここで⁹⁹Tc, ²⁴Na, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe ⁶⁷Ga, ⁸⁶Rb, ¹¹¹In, ¹²⁵Ｉ及び¹⁹⁵Ptがγ−放出性であり；そして⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ²²Na, ⁷⁵Br, ¹²²Ｉ及び¹⁸Ｆが陽電子放出性である。
リポソームはまた、磁気共鳴画像法（MRI）又は電子スピン共鳴法（ESR）の使用を通してのように、インビボ診断のために常磁性同位体によりラベルされ得る。たとえば、アメリカ特許第4,728,575号を参照のこと。
リポソームは、薬物の調節された供給のための価値あるシステムである。初めに論じたように、PEG−脂質から調製されたリポソームは、それらがより安定しており、そして従来のリポソームよりも循環中に長い半減期を有するので、特に好都合である。薬物キャリヤーとしてのリポソームの使用は、薬物の開放の部位又は速度の一層の調節を可能にし、従って、薬物及び／又はその代謝物の血液及び器官レベルを調節する際の一層の正確さの獲得を可能にする。従って、臨床効果を得るために必要とされる薬物の用量を減じることができ、従って毒性が減じられる。毒性関係は、有益な効果のために必要とされる用量レベル及び有意な毒性をもたらす用量レベルがひじょうに接近している癌の化学療法において特に価値ある。従って、癌の化学療法のためには、抗腫瘍薬物のためのリポソームキャリヤーの使用は、有意な治療利点を提供することができる。
リポソーム内への捕獲体積及び生物活性剤の化学的及び物理的性質に依存して、相溶性生物活性剤は、単一のリポソームに同時に封入され得る。この態様での複数の相乗薬物の同時供給は、身体における同じ位置へのそれらの薬物の供給を確保し、そして薬物を作用部位に接近して維持し、従って治療を非常に促進することができる。
広範囲の種類の生物活性剤、医薬物質又は薬物が、リポソームの比較的不透過性の二層膜の内部に封入され得、ここでそれらの物質はそれらの標的領域に運ばれる間、環境から保護される。それらの物質は、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症薬物、及び中枢神経系（CNS）に対して作用する薬物を包含する。特に好ましい抗腫瘍剤は、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスチンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗物質、及びヌクレオシド類似体、たとえばメトトレキサート及びプリン並びにピリミジン類似体を包含する。骨髄、リンパ系器官、肝臓、脾臓及び肝、並びにマクロファージ細胞による静脈内注射されたリポソームの好ましい摂取を考慮する場合、新生物及びそれらの器官を包含する他の疾病が、PEG由来のリポソームを閉じ込められた薬物により効果的に処理され得る。（Daondなど、“Liposomes In Concer Therapy”, ３ Adv Drng Delivery Revions 405-415, 1989を参照のこと。）
リポソームのもう１つの臨床学的適用は、動物及びヒトの両者の免疫化のためのアジュバントとしてである。タンパク質抗原、たとえばジフテリアトキソイド、コレラトキシン、寄生性抗原、ウィルス抗原、免疫グロブリン、酵素、組織適合性抗原が、免疫化目的のためにリポソーム中に組込まれ又はリポソーム上に結合され得る。
リポソームはまた、免疫応答を刺激するために適切なリンパ系器官に標的化されるワクチンのためのキャリヤーとしても特に有用である。
リポソームは、マクロファージに免疫抑制剤又は免疫刺激剤を選択的に供給するためのベクターとして使用されて来た。特に、マクロファージ活性、及びマクロファージを活性化するリンホカインを抑制するために有用なグルココルチコイドは、リポソームにおいて供給されて来た。
標的化分子を有するリポソームは、細胞を刺激し又は抑制するために使用され得る、たとえば、特定の抗原を組込むリポソームは、その抗原を特異的に結合する表面抗体を示すＢ細胞集団を刺激するために使用され得る。同様に、リポソーム表面上に成長因子又はリンホカインを組込むPEG−安定化リポソームは、それらの因子のための適切な受容体を発現する細胞を刺激するために指図され得る。そのようなアプローチは、たとえば、幹細胞及び活動的に分裂する細胞を破壊する放射線又は化学療法に続いて、癌患者の治療の一部として骨髄細胞の増殖を刺激することに使用され得る。
リポソーム−封入された抗体は、薬物過剰用量を処理するために使用され得る。肝臓に供給されるべき封入された抗体を有するリポソームの傾向は、血液循環から毒性物質をクリアランスすることにおいて治療利点を有する。ジゴキシンに対する封入されていない抗体は薬物の血管内保持を引き起こすが、封入された抗体は高められた脾臓及び肝臓摂取及びジゴキシンの高められた排泄速度を引き起こすことが示されている。
PEG−脂質を含んで成るリポソームはまた、抗原を欠いている細胞の血漿膜中に脂質又はタンパク質抗原を導入する際にキャリヤーとしても使用される。たとえば、組織適合性抗原又はウィルス抗原は、免疫システムによりウィルス感染された細胞又は腫瘍細胞の認識及び殺害を促進するためにそれらの細胞の表面中に導入され得る。
ある態様においては、細胞タイプ又は組織に対して特異的である標的化成分を用いて本発明のリポソームを標的化することが所望される。種々の標的化成分、たとえばリガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質及びモノクローナル抗体を用いてのリポソームの標的化は、これまで記載されている。アメリカ特許第4,957,773号及び第4,603,044号を参照のこと。標的化成分は、完全なタンパク質又はそのフラグメントを含んで成る。
標的化の機構は一般的に、標的化成分が標的物、たとえば細胞表面受容体との相互作用のために利用できるような態様で、標的化剤がリポソームの表面上に配置されることを必要とする。リポソームは、リポソーム形成の時点で膜中に連結部分を組込むように企画される。その連結部分は、膜中に堅く埋封され、そして固定される親油性部分を有すべきである。それはまた、リポソームの水性表面上で化学的に利用できる親水性部分も有すべきである。その親水性部分は、その部分及び標的化剤が安定した化学結合を形成するように、前記剤と化学的に適合できるよう選択される。従って、連結部分は通常、リポソームの表面から延長し、そして標的化剤を正しく位置づけるように形成される。ある場合、連結部分に直接的に標的化剤を結合することが可能であるが、しかし多くの場合、“分子橋”として作用する第三分子を用いることがより適切である。前記橋はリポソームの表面の連結部分及び標的剤を連結し、細胞標的物との相互作用のためにその標的化剤を自由に利用できるようにする。
標的化剤を結合するための標準の方法が使用され得る。たとえば、標的化剤、又は誘導体化された親油性化合物、たとえば脂質−誘導体化されたブレオマイシンの結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミンが使用され得る。抗体−標的化リポソームは、たとえば、プロテインＡを組込むリポソームを用いて構成され得る。Renneisenなど、265 J. Biol. Chem. 16337-16342（1990）及びLeonettiなど、87 Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）2488-2451（1990）を参照のこと。抗体接合の他の例は、1994年９月30日に出願されたアメリカ特許出願第08／316,394号に開示されており、この技術を引用により本明細書に組込む。標的化成分の例はまた、細胞成分に対して特異的な他のタンパク質、たとえば新生物又はは腫瘍に関連する抗原を包含する。標的化成分として使用されるタンパク質は、共有結合を有してリポソームに結合され得る。Heath, Coralent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119（Academic Press, Inc. 1987）を参照のこと。他の標的化方法は、ビオトン−アビジンシステムを包含する。
ある場合、リポソームの診断標的化は、標的化された細胞又は組織を処理するために用いられ得る。たとえば、トキシンが標的化されたリポソームに結合される場合、そのトキシンは標的化された細胞、たとえば新生細胞を破壊することにおいて効果的であり得る。
封入された生物活性剤又はリポソーム自体が細胞により取られると、その生物活性剤はまた、標的認識成分がその剤中に組込まれる場合、作用の特定の細胞内部位に標的化され得る。たとえば、核に供給されるべきタンパク質剤は、そのタンパク質中に組換え的に構築される核局在化シグナル配列を含むことができ、又はそのシグナル配列は一次タンパク質に共有結合される別のタンパク質又はペプチド上に存在することができる。同様に、核のために向けられた非タンパク質薬物は、共有結合されるそのような成分を有することができる。リポソームにより供給されるべきタンパク質成分中に組換え的に構築され又はその成分に共有結合され得る他の標的認識成分は、リガンド、受容体及び抗体又はそれらのフラグメントを包含する。
本発明はまた、ラベルされたリポソームを調製するためのキットも提供する。キットは典型的には、キットの種々の要素を保持するために区分される容器から構成されるであろう。１つの区画は、使用の直前、ラベルを調製するための材料を含むことができる。第２の区画は、約７〜約８の生理学的範囲にその組成物のpHを調節するためのpH緩衝剤と共に又はそれを伴わないでリポソームを含むことができる。リポソームはまた、使用の時点で再構成のために凍結乾燥された形で提供され得る。他の試薬及び使用のための説明書もまた、キット内に含まれるであろう。
本発明の脂質化合物を含んで成るリポソームは、許容できるアジュバント又はキャリヤーを用いて標準的技法に従って医薬組成物又は製剤として配合され得る。好ましくは、生理学的医薬組成物は、非経口的に、すなわち静脈内、皮下又は筋肉内投与される。本発明への使用のための適切な製剤は、Remington's Pharmaceutocal Sciences（Mack Publishing Co., 18th ed. 1990）。
好ましくは、組成物は静脈内投与される。従って、本発明は、生理学的に許容できるアジュバント又はキャリヤー、好ましくは水性キャリヤー、たとえば水、緩衝水、等張塩溶液及び同様のものに懸濁されたリポソームの溶液を含んで成る、静脈内投与のための組成物を提供する。組成物は従来の良く知られた殺菌技法により殺菌され得、又は殺菌濾過され得る。得られる水溶液は使用のために包装され、又は凍結乾燥せしめられ；凍結乾燥された調製物は、投与の前、殺菌された水溶液と組合される。組成物は、適切な生理学的条件に近づくために必要とされるような医薬的に許容できる補助物質、たとえばpH調節及び緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤及び同様のものを含むことができる。そのような剤は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート及び同様のものを包含する。
医薬組成物において有用なリポソームの濃度は、その組成物の約0.05％から通常、約２〜５％、又は約10〜30％（重量による）の範囲であり、そしてその濃度範囲は、投与の態様及びリポソーム内にふくまれる生物活性剤に従って選択される。
PEG−セラミド脂質から製造された本発明のリポソームは加水分解に対してほとんど敏感ではないので、それらは延長された循環をもたらす延長された半減期を有する。さらに、リポソーム医薬組成物は貯蔵に基づいての遊離基及び脂質−過酸化損傷に対してリポソームを保護する脂質−保護剤を含むことができる。そのような保護剤は、α−トコフェロール及び水溶性の鉄−特異的キレート剤、たとえばフェリオキサミンを包含する。
供給ビークルとしての脂質又は脂質を基材とするキャリヤーの使用
カチオン性脂質は、細胞内でのあるタンパク質の生成を誘発し、又は阻止するように意図された治療剤又はオリゴヌクレオチドの供給に使用され得る。核酸が負に荷電され、そして製剤化及び細胞性供給のために適切な脂質複合体を形成するために正に荷電された物質と組合せされるべきである。
カチオン性脂質は、インビトロ及びインビボでの細胞のトランスフェクションに使用されて来た（Wang C-Y, Huang L. pH-sensitive immunoliposomes mediate terget cell-specific delivery and controlled expression of a foreign gene in mouse（pH感受性免疫リポソームは、マウスにおける標的細胞特異的供給及び調節された発現を仲介する）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987;84:7851-7855及びHyde SC. Gill DR. Higgins CF, など、Correction of the ion transport defect in cyotic fibrosis transgenic mice by gene therapy.（遺伝子療法によるのう胞性繊維症トランスジェニックマウスにおけるイオン輸送欠陥の補正）、Nature, 1993;362：250-255.）。このトランスフェクションの効能は、種々の理由のために、しばしば、所望よりも低かった。１つは、核酸に複合体化されるカチオン性脂質が不十分なキャリヤーを形成する傾向である。それらのキャリヤーは、本発明のPEG−変性されたセラミド脂質の添加により改良される。PEG−変性されたセラミド脂質の添加は、粒子の凝集を妨げ、そして循環寿命を高め、そして標的細胞への脂質−核酸粒子の供給を高めるための手段を提供する。さらに、カチオン性脂質キャリヤーシステムが標的細胞とより容易に融合し、そして従って、負に荷電されたPEG−PE脂質（たとえば、PEG₂₀₀₀−DMPE）の添加は、カチオン性キャリヤープラスミドシステムの凝集及び自己−融合を妨げるから、アニオン性PEG−PEとカチオン性脂質との間に追加の静電相互作用を導入することができることが見出された。そのような相互作用は、キャリヤーシステム上にPEG−PEを効果的に保持し、そして従って、立体安定効果を保持し、そして標的細胞とカチオン性キャリヤーシステムとの融合を阻害する。中性のPEG−変性されたセラミド脂質は、カチオン性キャリヤー成分とのそのような静電相互作用を有さず、そして従って、それらは特定のセラミド脂質と前記システムにおける他の疎水性成分との間の親和性の強度に従ってそのシステムを変換することができる。これは、PEG−変性されたセラミド脂質がプログラム可能なフソゲン性カチオン性キャリヤーシステムの形成においてPEG−PEを有する明白な利点である（下記例12を参照のこと）。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド供給のための脂質基材のキャリヤーの生成において有用なカチオン性脂質は、LIPOFECTION（Eppsteinなど、によるアメリカ特許第4,897,355号；第4,946,787号；及び第5,208,036号）及びLIPOFECTACE（Roseによるアメリカ特許第5,279,883号）である。両剤及び他の形質転換性カチオン性脂質は、Life Technologies, Inc, Gaithersburg, Marylandから入手できる。
本発明は、次の例により良好に理解されるであろう。ここで、それらの例は、本発明の観点を例示するためのものであって、制限するものではない。
例１.
Ｎ−エイコサノイル−Ｄ−スフィンゴシン〔Ｃ20：0−セラミド〕
エイコサン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルを、Lapidotなど、（J. Lipid Res., 1967, 8:142)の方法を用いて合成した。前記エステル428mgを、無水塩化メチレン（CH₂Cl₂, 16ml）及びトリエチルアミン（118mg）中、Ｄ−スフィンゴシン（Avanti Polar Lipids, Inc.）（300mg）の溶液に、20℃で４時間、窒素（N₂）下で撹拌しながら添加した。薄層クロマトグラフィー（t. l. c.）（シリカゲル、CHCl₃:CH₃OH:H₂O-65:25:４ｖ／ｖ又はCHCl₃:CH₃OH-90:10ｖ／ｖ）による分析は、Ｄ−スフィンゴシンのほとんどが反応したことを示唆した。〔必要なら、エイコサン酸のNHS−エステルの他の少量（20〜30mg）を添加し、Ｄ−スフィンゴシンのアシル化を完結することができる〕。反応混合物を氷において冷却し、そしてCH₂Cl₂（60ml），H₂O（30ml）により希釈し、そして１ＮのHClにより中和した。CH₂Cl₂層をH₂Oにより洗浄し（２×30ml）、そして乾燥せしめ（MgSO₄）、その後、真空下で蒸発乾燥せしめた。残留物をアセトンから２度、再結晶化し、純粋な生成物Ｎ−エイコサノイル−Ｄ−スフィンゴシン（428mg）を白色固体として得た。T. l. c.は、単一のスポットを示し、そして¹H-NMRスペクトルは予測される構造体と一致した。
例２.
モノメトキシポリエチレングリコール ₂₀₀₀ −スクシネート（MePEG ₂₀₀₀ −Ｓ）
CH₂Cl₂（30ml）に溶解された、2000ドルトンの平均分子量を有するモノメトキシポリエチレングリコール（MePEG₂₀₀₀）（Sigma Chemical Co.）（４ｇ）を、無水琥珀酸（600mg）、トリエチルアミン（400mg）及び４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）（250mg）により処理し、そして20℃で16時間、窒素下で撹拌した。その反応溶液をCH₂Cl₂（60ml）により希釈し、氷において冷却し、そしてH₂O（50ml）を添加した。その混合物を１ＮのHClにより酸性化し、そして有機層を分離した。水性層をCH₂Cl₂によりさらに洗浄した（２×30ml）。組合された有機抽出物を乾燥せしめ（MgSO₄）、そして次に、蒸発乾燥せしめた。その粗生成物を、２〜８％のメタノールを含むCH₂Cl₂の溶媒システムにより溶出することによりシリカゲル（Ｇ60）カラム上で精製した。集められた画分をt. l. c.（シリカゲル、CHCl₃：CH₃OH-88:12ｖ／ｖ）により分析し、そして0.4のRf値を有する純粋な生成物（MePEG₂₀₀₀−Ｓ）を含む画分をプールし、そして濃縮した。ジエチルエーテルによる生成物の粉砕は、白色固体（3.2g）として、MePEG₂₀₀₀−Ｓをもたらした。
例３.
モノメトキシポリエチレングリコール ₅₀₀₀ −スクシネート（MePEG ₅₀₀₀ −Ｓ）
標記化合物を、MePEG₂₀₀₀−Ｓについて上記に記載される方法に類似する方法で、5000ドルトンの平均分子量を有するモノメトキシポリエチレングリコール(MePEG₅₀₀₀)（Sigma Chemical Co.）から調製した。
例４.
１−Ｏ−（MePEG ₂₀₀₀ −Ｓ）−（Ｃ20：０−セラミド）
Ｃ20：０−セラミド（60mg）、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)（28mg）及びDMAP（13mg）を、暖かな無水CH₂Cl₂（６ml）に溶解した。無水CH₂Cl₂（１ml）中、MePEG₂₀₀₀−Ｓ（230mg）を、25℃で６時間、N₂下で撹拌しながら、上記溶液に滴下した。沈殿したジシクロヘキシルウレア（DCU）を濾過し、そしてその濾液を真空下で濃縮した。ジエチルエーテルによる固体残留物の粉砕は、ほとんどのDCC, DMAP及び未反応のＣ20：０−セラミドを除去した。得られる粗生成物を、CH₂Cl₂:CH₃OH-98:２（ｖ／ｖ）により溶出することにより短いシリカゲルカラム（Ｇ60）上でクロマトグラフィー処理した。生成物を含む画分を組合し、そして真空下で蒸発乾燥せしめた。得られる固体を蒸留されたH₂O（２ml）に溶解し、そして蒸留水に対して４℃で一晩、透析した。純粋な生成物を、凍結乾燥により白色粉末（160mg）として得た。T. l. c.（シリカゲル、CHCl₃：CH₃OH-90:10ｖ／ｖ）は単一のスポットを示した（Rf 0.5）。生成物の¹H-NMRスペクトルは、１−Ｏ−（MePEG₂₀₀₀−Ｓ）−（Ｃ20：０−セラミド）の構造と一致した。〔PEG₂₀₀₀セラミド〕。
例５.
１−Ｏ−（MePEG ₂₀₀₀ −Ｓ）−（卵セラミド）〔PEG ₂₀₀₀ セラミド〕
卵セラミド（Avanti Polar Lipids, Inc.）(100mg)，DCC（48mg）及びDMAP（25mg）を、暖かな無水CH₂Cl₂（８ml）に溶解した。無水CH₂Cl₂（２ml）中、MePEG₂₀₀₀−Ｓ（450mg）を、上記溶液に、25℃で６時間、N₂下で撹拌しながら滴下した。沈殿したDCUを濾過し、そしてその濾液を真空下で濃縮した。ジエチルエーテルによる固体残留物の粉砕は、ほとんどの残留試薬及び少量の未反応卵セラミドを除去した。粗生成物を、CH₂Cl₂:CH₃OH-98:２（ｖ／ｖ）により溶出することにより短いシリカゲルカラム上でクロマトグラフィー処理した。生成物を含む画分を組合し、そして真空下で蒸発乾燥せしめた。得られる固体を蒸留水（２ml）に溶解し、そして蒸留水に対し24℃で一晩、透析した。前記溶液の凍結乾燥は、白色粉末（338mg）として純粋な生成物を付与した。T. l. c.（シリカゲル、CHCl₃：CH₃OH-90:10ｖ／ｖ）は単一のスポットを示した（Rf 0.5）。生成物の¹H-NMRスペクトルは、１−Ｏ−（MePEG₂₀₀₀−Ｓ）−（卵セラミド）の構造に一致した。
例６.
１−Ｏ−（MePEG ₅₀₀₀ −Ｓ）−（卵セラミド）〔PEG ₅₀₀₀ セラミド〕
標記化合物を、無水CH₂Cl₂（６ml）において縮合試薬としてDCC（28mg）及びDMAP（13mg）を用いて、１−Ｏ−（MePEG₂₀₀₀−Ｓ）−（卵セラミド）について上記に記載される方法に類似する方法により、MePEG₅₀₀₀−Ｓ（550mg）及び卵セラミド（54mg）から調製した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル）及び透析による類似する精製は、白色粉末（310mg）として純粋な生成物１−Ｏ−（MePEG₅₀₀₀−Ｓ）−（卵セラミド）を付与した。
例７.
特定のリポソームの血漿クリアランス
この例においては、ジステアリルホスファチジルコリン（DSPC）／コレステロール（Chol）（55:45モル％；白丸）；DSPC／Chol／PEG₂₀₀₀セラミド（50:45:５モル％；黒丸）、及びDSPC／Chol／PEG₅₀₀₀セラミド（50:45:５モル％；黒の四角）から調製された100nmのリポソームについての血漿クリアランスを決定した。その結果は図１Ａに示される。脂質混合物をクロロホルム（CHCl₃）において調製し、そして続いて、窒素ガスの流れ下で乾燥せしめた。得られる脂質フィルムを少なくとも２時間、高い真空下に置き、その後、150mMの塩化ナトリウム及び20mMのHepes(pH7.4)（Hepes緩衝塩溶液）により水和化した。次に、リポソームを、押出しの前、65℃に予備加熱された押出し機を用いての100nmの孔サイズのフィルターを通しての押出しにより調製した。得られるリポソームは、約120nmの平均直径を示した。それらのリポソームを、マウス（雌のCD1）が200μｌの注射容積において50μモル／kgに等しい脂質のi.v.用量を与えられるよう希釈した。図１Ａに示される種々の時点で、血液サンプルを尾の静脈を切ることによって採取し、そしてEDTA（エチレンジアミン四酢酸）により被覆された細管中に血液25μｌを集めた。その得られるサンプル中の脂質の量を、存在する³〔Ｈ〕−コレステリルヘキサデシルエーテルの量を測定することによって決定した。この非交換性、非代謝性脂質マーカーは、脂質フィルムの形成の前のリポソーム中に組込まれた。
例８.
特定のリポソームの血漿クリアランス
この例は、DSPC／Chol（55:45モル％；白丸）、スフィンゴミエリン／Chol（55:45モル％；黒色）及びスフィンゴミエリン／Chol／PEG₂₀₀₀セラミド（55:45:５モル％；白の四角）から調製された100nmのリポソームについての血漿クリアランスを示す。結果は図１Ｂに示される。脂質混合物をクロロホルム（CHCl₃）において調製し、そして続いて、窒素ガスの流れ下で乾燥せしめた。得られる脂質フィルムを少なくとも２時間、高い真空下に置き、その後、300mMのクエン酸緩衝液（pH4.0）により水和化した。次に、リポソームを、押出しの前、65℃に予備加熱された押出し機を用いての100nmの孔サイズのフィルターを通しての押出しにより調製した。得られる小胞を、150mMのNaCl, 20mMのHepes（pH7.4）により希釈し、そしてそのpHを500mMのリン酸ナトリウムによる滴定により7.4に調節した。次に、サンプルンを60℃で10分間、加熱した。得られるリポソームは、約120nmの平均直径を示した。それらのリポソームを、マウス（雌のBDF1）が200μｌの注射容積において20mg／kgに等しい脂質のi.v.用量を与えられるよう希釈した。図１Ｂに示される時点で、血液サンプルを心臓を突き刺すことによって採取した。得られるサンプル中の脂質の量を、存在する³〔Ｈ〕−コレステリルヘキサデシルエーテルの量を測定することによって決定した。この非交換性、非代謝性脂質マーカーは、脂質フィルムの形成の前、リポソームに組込まれた。
例９.
ビンクリスチン保持
この例においては、循環内でのスフィンゴミエリン／Chol（55:45モル％）リポソームによるビンクリスチン保持は、PEG₂₀₀₀セラミドの組込みにより影響されないことを示された。対照的に、PEG₂₀₀₀−ホスファチジルエタノールアミン（PEG−PE）により調製された類似する配合物は、有意に減じられた薬物保持を示す。リポソームビンクリスチンのi.v.注射を与えられたBDF1マウス（２mg薬物／kg）から採取された血漿におけるリポソーム脂質（¹⁴〔Ｃ〕−コレステリルヘキサデシルエーテル）及び薬物（³〔Ｈ〕−ビンクリスチン）の両者を測定することによって、結果を得た。サンプルは、200μｌの体積で注射された。リポソームは下記のようにして調製された。
乾燥脂質を、300mMのクエン酸緩衝液（pH4.0）により水和化した。押出しに続いて、小胞（100mg／ml）を、ビンクリスチンの溶液（Oncovin；１mg／ml）に添加し、0.1：１の薬物：脂質の重量比を達成した。リポソーム／ビンクリスチン混合物の外部pHを、500mMのリン酸ナトリウムによる粉砕により7.0〜7.2に上昇せしめ、そしてすぐに、サンプルを60℃で10分間、加熱し、ビンクリスチンの封入化を達成した。図２に示される、マウスへのi.v.投与後の時点で、血液サンプルが心臓を突き刺すことによって採取された。ビンクリスチンの量／及び脂質の量を、適切にラベルされたマーカーの使用により測定した。薬物：脂質の比を決定し、そして元の薬物／脂質の割合の％としてプロットした。DSPC／Cholリポソームは白丸により示され；SM／Cholリポソームは黒丸により示され；SM／Chol／PEG₂₀₀₀−セラミドは白の四角により示され；そしてSM／Chol／PEG-PEは黒の四角により示される。
例10.
種々のPEG−セラミドアシル鎖長及び保持時間に対する効果
方法
100mgの合計脂質を、５μCiの¹⁴Ｈ−コレステリルヘキサデシルエーテル（Amersham注文の合成）を含むCHCl₃中に溶解した。脂質調製物は、卵スフィンゴミエリン（SM）／コレステロール／PEG₁₀₀₀−セラミド（SM／Chol／PEG−セラミド；55／40／５、モル／モル／モル）又は卵スフィンゴミエリン／コレステロール／PEG₂₀₀₀−ジステアロールホスファチジルエタノールアミン（SM／Chol／PEG-DSPE；55／40／５、モル／モル／モル）から成った。この研究に使用されるPEG₂₀₀₀−セラミドは、Ｃ８，Ｃ14，Ｃ20又はＣ24の脂質アミド鎖長を有し、又は卵セラミド（卵−CER）から合成された。多量のCHCl₃を窒素ガスの流れ下で除去し、次に、残留溶媒を、高い真空下に脂質フィルムを一晩、置くことによって除去した。
0.3Ｍのクエン酸塩（pH4.0）1.0mlと共に脂質フィルムを、広範な回転及び65℃への短い加熱を用いて水和化することによって、リポソームを調製した。（この懸濁液のアリコートを、比活性の決定のために除去した。）得られる脂質懸濁液を、−196℃〜65℃の間で５回、凍結／融解を繰り返した。大きな単層リポソームを押出し技法により製造し；脂質懸濁液を、押出し機（Lipex Biomembranes, Vancouver, B. C.）を用いて65℃で0.1μｍのフィルターに通した。
別の操作として、ビンクリスチン2.0mg（1.0mg／mlでのビンクリスチンスルフェート2.0mlとして；David Bull Laboratories, Mulgrave, Australia)を、５μCiの³Ｈ−ビンクリスチン（Amersham)の添加によりラベルし、そしてアリコートをビンクリスチン比活性の決定のために除去した。
ビンクリスチンのリポソーム封入のために、個々の脂質５〜６mgをガラス試験管に取り、そしてラベルされたビンクリスチンを添加し、0.1／1.0（wt／wt）の比のビンクリスチン／脂質を達成した。この混合物を65℃で5〜10分間、平衡化し、次に、ビンクリスチン封入を、その溶液のpHを7.0〜7.5にするための十分な0.5ＭのNa₂HPO₄の添加により開始した。ビンクリスチン採取を65℃で10分間、進行せしめ、そして次に、サンプルを室温に冷却し、そしてインビボ試験のために必要とされる最終濃度に150mMのNaCl, 20mMのHepes(pH7.5)（HBS）により希釈した。リポソーム中へのビンクリスチンの摂取を、HBSにおいて予備平衡化されたSephadex G-50の1.0mlミニカラム上で100μｌのリポソームを遠心分離することにより決定した。溶出液を、液体シンチレーション計数（LSC）によりビンクリスチン／脂質比についてアッセイした。
雌のBDF1マウスの尾の静脈に、20mg脂質／kg又は２mgビンクリスチン／kgの用量でリポソームビンクリスチンを注射した。投与の１，４及び24時間後、血液を、心臓を突き刺すことによりEDTA含有Micro−Tainer管中に回収した。血漿を、2000ｇを15分間で遠心分離により得、そしてアリコートをLSCにより脂質及びビンクリスチン含有率についてアッセイした。
すべてのデータは、時点当たり３匹のマウス、すなわち９匹の動物／グループからの平均（±標準誤差）を表わす。脂質、ビンクリスチンの半減期及びビンクリスチン／脂質比を、濃度vs.時間の片対数プロットの傾斜から得た。それらの傾斜の直線回帰のためのすべてγ²値は0.98以上であった。PEG₂₀₀₀−セラミドのＣ20鎖長による実験を２度、行ない、そして別々に表わす。
結果
図３に表わされる結果（脂質Ｔ_1/2）は、５モル％のPEG₂₀₀₀−DSPEを含むSM／コレステロールリポソームの半減期が、鎖長にかかわらず、PEG₂₀₀₀−セラミド（PEG−セラミド）を含むSM／コレステロールリポソームよりも約２倍、大きいことを示す。PEG−セラミドに関しては、それらのビンクリスチン負荷されたリポソームにおける循環寿命に対して脂肪アシル鎖長の有意な影響は存在しなかった。
図４に示される結果（ビンクリスチン／脂質Ｔ_1/2）は、血漿における循環の間、リポソームにおけるビンクリスチン保持に対してアシル鎖長の有意な影響が存在することを示唆する。特に、Ｃ20 PEG−セラミドは、PEG−セラミドの両者の短い（Ｃ８，Ｃ14、卵−CER及びＣ24）鎖長よりも有意に良好に保持され、そしてまた、PEG−DSPEよりも良好であった。PEG−セラミドのＣ20鎖長は、28〜30時間のビンクリスチン／脂質比についての半減期を有し；15時間で最低のビンクリスチン保持配合物（CSPEG−セラミド及びPEG−DSPE）について観察される値の約２倍の長さであった。
脂質循環寿命及びそれらのリポソーム内での薬物保持の組合された結果が、ビンクリスチンの循環半減期である（図５を参照のこと）。PEG−セラミドの中で、Ｃ20鎖長がビンクリスチンについての最大の循環寿命をもたらした（9.5〜10.5時間のＴ_1/2vs. Ｃ８，Ｃ14，Ｃ24及び卵-CER鎖長について７〜９時間）。PEG−DSPEを含むサンプルにおいては、良好でないビンクリスチン保持（図４）と対照される長いリポソーム循環寿命（図３）の組合された影響は、Ｃ20 PEG−セラミドにひじょうに類似する全体の薬物半減期をもたらした。
例11.
融合性（fusogenic）リポソーム
インビボで、カチオン性脂質を含む融合性リポソームを安定化する両親媒性ポリエチレングリコール（PEG）誘導体の能力を、次の研究において試験した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）及びＮ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）から成るリポソームの凍結−破損電子顕微鏡分析は、両親媒性PEG誘導体、PEG−DSPE及びPEG−セラミドの包含が、マウス血清の存在においてリポソーム凝集を効果的に妨げたことを示した。DOPE及びDODACから成り、さらに両親媒性ポリエチレングリコール（PEG）誘導体を含む融合性リポソームの生物分布を、脂質マーカーとして³Ｈ−ラベルされたコレステリルヘキサデシルエーテルを用いてマウスにおいて試験した。両親媒性PEG誘導体は、PEG−DSPE、及びＣ８〜Ｃ28の範囲の異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド（PEG−Cer）を含んだ。DOPE／DODACリポソーム（85：15、モル／モル）は、血液から急速に排除され、そして肝臓に独占的に蓄積することが示された。脂質混合物の5.0モル％で両親媒性PEG誘導体の包含は、血液中に残存するリポソームレベルの上昇及び肝臓における付随する蓄積の低下をもたらした。種々の両親媒性PEG誘導体の中で、PEG−DSPEは、DOPE／DODACリポソームの循環時間を延長することに最高の活性を示す。PEG−セラミドの活性は、アシル鎖長に直接的に比例し、すなわちアシル鎖が長いほど、その活性は高くなる。最良のアシル鎖長を示すPEG−セラミド（Ｃ20）の活性は、脂質混合物のその濃度に依存し、そして最大の循環時間は脂質混合物の30モル％で得られた。脂質組成物への両親媒性PEG誘導体の包含はDOPE／DODACリポソームの高められた循環時間を一般的にもたらすが、カチオン性脂質、すなわちDODACの存在は血液からのそれらの急速なクリアランスを促進するように見えた。
DODACリポソームの調製及び使用は、1994年９月30日に出願されたアメリカ特許出願第08／316,399号に開示されている（この技法は引用により本明細書中に組込まれる）。
二層安定化成分を組込む融合性リポソームは、1994年９月30日に出願されたアメリカ特許出願第08／316,407号及び1995年６月７日に出願されたアメリカ特許出願第 号（アトニー事件整理番号016303−001310）に開示されており、それらの技法は引用により本明細書に組込まれる。
材料及び方法
リポソーム調製
DOPE及びDODACから成り、そしてさらに、種々の割合で両親媒性PEG誘導体を含む小さな単層リポソームを、押出し法により調製した。手短に言及すれば、交換可能で且つ非代謝性の脂質マーカーとして³Ｈ−ラベルされたCHEを含む溶媒フリーの脂質混合物を、蒸留水により一晩、水和化した。通常、リポソーム懸濁液（１ml当たり５mgの脂質）を、Lipex Biomenbranes, Inc.から入手できる押出し装置を用いて、Nuclepore膜（0.1μｍの孔サイズ）を通して室温で10度、押出し、均質なサイズ分布を有するリポソームを生成した。リポソームサイズは、粒子サイザーを用いて準弾性光散乱により決定され、そして標準偏差（SD）を伴って、平均直径として表わされた。
リポソーム生物分布の研究
種々の脂質組成を有する³Ｈ−ラベルされたリポソームを、蒸留水0.2mlにおける1.0mgの脂質の用量で、雌のCD−１マウス（生後８〜10週）中にi.v.注射した。特定の間隔で、マウスを二酸化炭素への過剰暴露により殺害し、そして血液を1.5mlのマイクロ遠心分離管に心臓を突き刺すことにより集め、そして遠心分離し（12000rpm，２分、４℃）、血液細胞をペレット化した。脾臓、肝臓、肺、心臓及び腎臓を含む主要器官を集め、重量を計り、そして蒸留水中で均質化した。血漿及び組織ホモジネートの画分を、ガラスシンチレーションバイアルに移し、製造業者の説明書に従って50℃でSolvable（NEN）により溶解し過酸化水素により脱色し、そしてBeckmanカウンターによりシンチレーション流体における³Ｈ放射能を分析した。データは、個々の器官における³Ｈ−ラベルされたリポソームの注射された全用量の％として表わされた。血漿にぽけるリポソームのレベルを、マウスの血漿体積が全体重の5.0％であると仮定することにより、決定した。
結果及び議論
凍結−破損電子顕微鏡研究
DOPE／DODAC（85：15、モル／モル）、DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（80：15：５、モル／モル）及びDOPE／DODAC／PEG-DSPE（80：15：５、モル／モル）から成るリポソームが、押出し法により調製され、そしてそれは類似する平均直径（100nm）を有した。３種のリポソーム配合物の凍結−破損電子顕微鏡は、比較的狹サイズ範囲を有する単層リポソームを示した。しかしながら、37℃で30分間、50％マウス血清中でのDOPE／DODACリポソームのプレインキュベーションは、それらの大量の凝集をもたらした。他方、DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）及びDOPE／DODAC／PEG-DSPEリポソームの両者は、それらのリポソームがマウス血清により予備処理される場合、いづれの凝集も示さなかった。従って、それらの結果は、DOPE／DODACリポソームの血清誘発性の急速な凝集を妨げる上で、両親媒性PEG誘導体の有効性を示す。
両親媒性PEG誘導体を含むDOPE／DODACリポソームの生物分布
両親媒性PEG誘導体を有するか又はそれを有さないDOPE／DODACリポソームを、脂質マーカーとして³Ｈ−ラベルされたコレステロールヘキサデシルエーテルを含むように調製し、そしてそれらの生物分布を、注射の１時間後、マウスにおいて試験した。この研究において試験されるリポソームは、DOPE／DODAC（85：15、モル／モル）、DOPE／DODAC／PEG−セラミド（80：15：５、モル／モル）及びDOPE／DODAC／PEG-DSPE（80：15：５、モル／モル）から構成された。また、リポソームの生物分布に対する疎水性アンカーの効果を試験するために、異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体を用いた。それらのリポソーム配合物は、99〜103nmの範囲の類似する平均直径を有した。下記表IIは、血液、脾臓、肝臓、肺、心臓及び腎臓におけるリポソームのレベル、及びそれぞれの血液／肝臓の割合を示す。DOPE／DODACリポソームが、血液から急速に排除され、そして約0.01の血液／肝臓の割合を伴って、肝臓に優先的に蓄積することが示された。脂質組成物における5.0モル％での両親媒性PEG誘導体の包含は、それらの高められた血液レベル及び従って、異なった程度での低められた肝臓蓄積をもたらした。DOPE／DODAC／PEG-DSPEリポソームは、最高の血液レベル（約59％）、及び最低の肝臓蓄積（約35％）並びに注射の１時間後、約1.7の血液／肝臓割合を示した。異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体の中で、PEG−セラミド（Ｃ20）−含有リポソームは、最高の血液レベル（約30％）及び約0.58の血液／肝臓割合を示し、そしてPEG−セラミド（Ｃ８）−含有リポソームは最低の血液レベル（約６％）及び約0.1の血液／肝臓割合を示した。異なったPEG−セラミド誘導体の中で、リポソームの血液レベルを高めることにおける活性は、セラミドのアシル鎖長に直接的に比例し；より長いアシル鎖長ほど、その活性は高くなるように思えた。リポソームの血液レベルを高めるための最適な誘導体はPEG−セラミド（Ｃ20）であることがまた明らかになった。

延長された循環時間のためのDOPE／DODACリポソームの最適化
DOPE／DODACリポソームの生物分布に対する、脂質組成物中のPEG−セラミド（Ｃ20）の上昇する濃度の効果を試験した。PEG−セラミド（Ｃ20）が脂質組成物において上昇する濃度（0〜30モル％）でDOPE／DODACリポソームに含まれ、そしてDODACの濃度は脂質混合物の15モル％で維持された。リポソームが押出し法により調製され、そして102nm〜114nmの範囲の類似する平均直径を有した。リポソームをマウス中にi.v.注射し、そして生物分布を、注射の１時間後に試験した。図６は、PEG−セラミド（Ｃ20）濃度の関数として、注射の１時間後、血液及び肝臓におけるリポソーム・レベルを示す。明らかに、脂質組成物におけるPEG−セラミドの濃度の上昇は、血液におけるリポソームレベルの漸進的な上昇をもたらすし、そして肝臓においては、低められた蓄積が付随した。最高の血液レベル（注射の１時間後、約84％）が、約6.5の血液／肝臓割を示すDOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（55：15：30、モル／モル）に関して得られた。
DOPE／DODACリポソームの生物分布に対するDODACの上昇する濃度の効果をまた試験した。10モル％又は30モル％のPEG−セラミド（Ｃ20）及び種々の濃度（15，30，50モル％）のPEG−セラミドを含むDOPE／DODACリポソームが押出し法により調製され、そして103〜114nmの範囲の類似する平均直径を有した。生物分布を、注射の１時間後に試験し、そしてDODAC濃度の関として、血液におけるリポソームの％を示した（図７）。図７に示されるように、脂質組成物における上昇するDODAC濃度が、両リポソーム配合物について、血液における低められたレベルをもたらした。従って、脂質組成物におけるカチオン性脂質、すなわちDODACの存在は、血液からの急速なクリアランスをもたらした。また、そのようなDODACの効果が、脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度を高めることによって妨害され得ることが図７に示される。
図８は、PEG−セラミドを有するか又はそれを有さないDOPE／DODACリポソームの血液からの時間依存性クリアランスを示す。注射されたDOPE／DODACリポソームの少量のみが血液に残存し、そして脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度の上昇が血液における延長された循環時間をもたらした。DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（75：15：10、モル／モル）及びDOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）（55：15：30、モル／モル）についてのα−相における評価された半減期は、それぞれ、１時間以下及び５時間であった。
結論
上記研究は、カチオン性脂質を含むフソゲン性リポソームの生物分布が両親媒性PEG誘導体の包含により調節され得るいくつかのレベルが存在することを示唆する。表IIにおけるデータは、両親媒性PEG誘導体の疎水性アンカーがDOPE／DODACリポソームの生物分布を決定する上で重要な役割を有することを示す。異なったアシル鎖長を有する種々のPEG−セラミド誘導体を用いての研究は、PEG−セラミドのアシル鎖長が長いほど、DOPE／DODACリポソームの循環時間を延長することにおける活性が高くなることを示した。これらの結果は、両親媒性PEG誘導体が、疎水性アンカーのサイズに直接的に比例して、リポソーム膜から分離する割合と一致した。従って、長いアシル鎖を有するPEG−セラミド誘導体は、リポソーム膜における他のアシル鎖との強い相互作用を有することができ、そしてリポソーム膜からの分離の減じられた割合を示し、従って、延長された期間、DOPE／DODACリポソームの安定化をもたらし、そして従って、血液におけるそれらの延長された循環時間をもたらした。
両親媒性PEG誘導体の疎水性アンカーの他に、脂質膜における両親媒性PEG誘導体の濃度がまた、DOPE／DODACリポソームのインビボ挙動を調節するために使用され得る。図６におけるデータは、脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の濃度の上昇が血液における高められたリポソームレベルをもたらしたことを示す。脂質組成物におけるPEG−セラミド（Ｃ20）の最適濃度は、脂質混合物の30モル％であることが見出された。DOPE／DODAC／PEG−セラミド（Ｃ20）リポソームの循環時間が２種の脂質組成物、すなわちDODAC及びPEG−セラミドの相対濃度により決定され、リポソームは生物分布に対して反対の効果を示すと思われる。両親媒性PEG誘導体は血液におけるリポソームの循環時間を延長することにおいて活性を示し、そしてカチオン性脂質、すなわちDODACは、血液からリポソームクリアランスを促進する能力を示す。従って、血液における最大の循環時間のためには、適切な濃度の両親媒性PEG誘導体及び最少濃度のDODACが使用されるべきである。しかしながら、血液における延長された循環時間のための最適なリポソーム配合物が、ある治療剤の供給においての意図された適用のために適切な配合物であることは必ずしも必要でないことが注目されるべきである。フソゲン性リポソームの薬物動力学及び薬力学の両者が、異なった治療剤を用いて異なった適用のために試験された。
例12.
この例は、PEG₂₀₀₀−セラミド（Ｃ14：０）及びPEG₂₀₀₀−DMPEによるトランスメンブランキャリヤーシステム（TCS）融合の阻害を示す。
１，２−ジオレオイル−３−ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、螢光団Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）−１，２−ジオレオイル−sn−ホスファチジルエタノールアミン（NBD−PE）及びＮ−（リサミンロダミンＢスルホニル）−１，２−ジオレオイル−sn−ホスファチジルエタノールアミン（Rh−PE）、並びにPEG₂₀₀₀−セラミド（Ｃ14：０）又はPEG₂₀₀₀−DMPEのいづれかから成るTCSを、100nmの直径のポリカーボネートフィルターを通しての押出しにより調製した（Hope, M.J.,など、Biochem, Biophys. Acts. 812, 55-65（1985））。TCSは、0.5モル％のNBD−PE及び0.5モル％のRh−PE、並びにDOPE：DODAC：PEG₂₀₀₀-DMPE（80：15：５、モル％）又はDOPE：DODAC：PEG₂₀₀₀−セラミド（Ｃ14：０）（80：15：５、モル％）のいづれかを含んだ。螢光ラベルされたリポソームを、37℃で、DOPE：POPS（85：15、モル％）から成る３倍過剰量のリポソームと共に、20mMのHEPES，150mMのNaCl，pH7.4（HBS）においてインキュベートした。POPCリポソームを、螢光ラベルされたリポソームの濃度の10倍で添加し、そして脂質混合物を、Slrnck, D.K.,など、（Biochemistry 20, 4093-4099（1981））の方法によりアッセイした。使用される励起波長は465nmであり、そして530nmで配置された発光フィルターは、散乱光のために強さを最小にした。融合の割合及び程度を測定し、続いて、535nmの波長でNBD螢光強度の上昇を時間にわたってモニターした。％最大融合を、関連融合（％max）（ｔ）＝（Ｆ（ｔ）−Fo）／（Fw−Fo）から決定し、ここでFoはゼロ時点での初期NB口螢光強度であり、Ｆ（ｔ）は時点ｔでの強度であり、そしてFwは螢光ラベルされたDOPC：POPSリポソームの完全な脂質混合の条件下での達成できる最大の螢光強度である（Bailey, A.L.,など、Biochemistry 33, 12573-12580（1994））。図９は、DOPC：DOPSとDOPE／DODAC／PEG₂₀₀₀−DMPEとの融合に比較してのDOPC：DOPSとDOPE／DODAC／PEG₂₀₀₀−セラミド（Ｃ14：０）との考慮すべき混合を示し、これは、PEG₂₀₀₀−DMPEがTCSから単に最小限度、除去されることを示す。この結果は、アニオン性PEG₂₀₀₀−DMPEとキャリヤーシステム上にPEG₂₀₀₀−DMPEを効果的に保持するカチオン性DODACとの間の静電相互作用に寄与し、そして従って、立体安定化効果を維持し、それにより、受容体小胞との融合を阻害する。中性のPEG−変性されたセラミド脂質は、DODACとのそのような静電相互作用を有さず、そして従って、そのような脂質は、アニオン性標的（DOPE−POPS）との融合を受けることができるシステムから交換することができる。
本明細書におけるすべての出版物及び他の文献又は特許は、引用により組込まれている。上記の記載は例示的であって、限定的ではないことが理解されるべきである。多くの態様が、上記の記載のレビューに基づいて当業者に明らかであろう、従って、本発明の範囲は、上記の記載に対して決定されるべきではなく、しかし代わりに、付随す請求の範囲に対して決定されるべきである。

Claims (35)

1. 下記式：
   

   

   〔式中、Ｒ¹，Ｒ²、及びＲ³は独立して、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり；
   Ｒ⁴は水素、Ｃ₁−Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₂−Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₃₀アルキニル又はアリールであり；
   Ｒ⁵は水素、アルキル、アシル、アリール又はPEGであり；
   Ｘ¹は−Ｏ−，−Ｓ−、又は−NR⁶−であり、ここでＲ⁶は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり；又はＲ⁵がPEGであり、そしてｂが１である場合、Ｘ¹はさらに、-Y¹-alk-Y²-であり；
   Ｙは−NR⁷−であり、ここでＲ⁷は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アシル又はアリールであり、あるいはＹは−Ｏ−，−Ｓ−又は-Y¹-alk-Y²-であり、ここでＹ¹及びＹ²は独立して、アミノ、アミド、カルボキシル、カルバメート、カルボニル、カルボネート、ウレア又はホスホロであり；そしてalkはＣ₁−Ｃ₆アルキレンであり；
   PEGはＣ₁−Ｃ₃アルキル、アルコキシ、アシル又はアリールにより場合によっては置換されている約550〜約8,500ドルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールであり；ここで、ａは０又は１であり；そしてｂは０又は１であるが、Ｒ⁵がPEGでない場合、ｂは１である〕で表わされる脂質化合物。
2. Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³、及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がアルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙがスクシネートであり；そしてPEGが約2,000又は約5,000ドルトンの平均分子量を有し、そして末端のヒドロキシル位置でメチルにより置換されている請求の範囲第１項記載の脂質。
3. Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³、及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がアルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙが−NH−であり；そしてPEGが約2,000又は約5,000の平均分子量を有し、そして末端のヒドロキシル位置でメチルにより置換されている請求の範囲第１項記載の脂質。
4. 請求の範囲第１項記載の脂質を含んで成るリポソーム。
5. さらに、１又は複数の生物活性剤を含んで成る請求の範囲第４項記載のリポソーム。
6. 生体外で、細胞に生物活性剤を供給するための方法であって、リポソーム−生物活性複合体を形成するために請求の範囲第４項記載のリポソームに前記剤を封入し、そして前記細胞と前記複合体とを接触せしめることを含んで成る方法。
7. 前記生物活性剤が、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫改良剤、抗炎症薬物及び中枢神経系に対して作用する薬物から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の方法。
8. 前記生物活性剤がタンパク質又はペプチドである請求の範囲第６項記載の方法。
9. 請求の範囲第４項記載のリポソームに封入された１又は複数の生物活性剤を含む適切な医薬組成物。
10. 請求の範囲第４項記載のリポソームにワクチンのための生物活性剤を封入して成るリポソーム被覆されたワクチン。
11. 請求の範囲第４項記載のリポソームに抗原を封入して成る免疫化剤。
12. 請求の範囲第５項記載のリポソーム及び生理学的に許容できるそれらのためのアジュバントを含んで成る医薬製剤。
13. 前記活性剤がビンクリスチンである請求の範囲第12項記載の製剤。
14. 少なくとも２つの区画を有する容器を含んで成る、ラベルされたリポソームを調製するのに有用なキットであって、前記第１区画がラベルを調製するための材料を含んで成り、そして前記第２区画が請求の範囲第５項記載のリポソームを含んで成ることを特徴とするキット。
15. 請求の範囲第１項記載の脂質を含んで成る脂質複合体。
16. 治療使用のために遺伝子構造体を含んで成る請求の範囲第５項記載のリポソーム。
17. 治療使用のためにオリゴヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第５項記載のリポソーム。
18. Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁵が水素であり；Ｒ⁴がＣ₇−Ｃ₂₃アルキルであり；Ｘ¹が０であり；Ｙがスクシネートであり；そしてPEGが約2,000の平均分子量を有し、そしてモノメトキシにより置換されている請求の範囲第１項記載の脂質。
19. Ｒ⁴がＣ₁₃−Ｃ₁₉アルキルである請求の範囲第18項記載の脂質。
20. Ｒ⁴がＣ₁₉アルキルである請求の範囲第19項記載の脂質。
21. Ｒ⁴がＣ₁₃アルキルである請求の範囲第19項記載の脂質。
22. 請求の範囲第18項記載の脂質を含んで成るリポソーム。
23. １又は複数の生物活性剤をさらに含んで成る請求の範囲第22項記載のリポソーム。
24. 前記脂質のモル％割合が約0.01〜約60である請求の範囲第22項又は23項記載のリポソーム。
25. Ｒ⁴がＣ₁₃−Ｃ₁₉アルキルである請求の範囲第22項〜第24項のいずれか１項に記載のリポソーム。
26. 生体外で、細胞に生物活性剤を供給するための方法であって、リポソーム−生物活性複合体を形成するために前記剤を請求の範囲第22項〜第25項のいずれか１項に記載のリポソームにより封入し、そして前記細胞と前記複合体とを接触せしめることを含んで成る方法。
27. Ｒ⁴がＣ₁₃−Ｃ₁₉アルキルである請求の範囲第26項記載の方法。
28. 前記リポソームがさらに、DOPE及びDODACを含んで成る請求の範囲第27項記載の方法。
29. 請求の範囲第22項〜25項のいずれか１項に記載のリポソーム及び生理学的に許容できるそのためのアジュバントを含んで成る医薬製剤。
30. 請求の範囲第４項記載のリポソームに生物活性剤を封入して成るリポソーム−生物活性複合体。
31. 前記生物活性剤が、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫改良剤、抗炎症薬物及び中枢神経に対して作用する薬物から成る群から選択される請求の範囲第30項記載の複合体。
32. 前記生物活性剤がタンパク質又はペプチドである請求の範囲第30項又は第31に項記載の複合体。
33. 請求の範囲第22項〜第25項のいずれか１項に記載のリポソームにより封入された生物活性剤を含んで成るリポソーム−生物活性複合体。
34. Ｒ⁴がＣ₁₃−Ｃ₁₉アルキルである請求の範囲第33項記載の複合体。
35. 前記リポソームがさらに、DOPE及びDODACを含んで成る請求の範囲第33項又は34項に記載の複合体。

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