PL203512B1

PL203512B1 - Sposób ekstrakcji ß-amylazy

Info

Publication number: PL203512B1
Application number: PL363346A
Authority: PL
Inventors: Kekki Pekka
Original assignee: Danisco A/S
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2009-10-30

Description

Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest technologia enzymów, a dok ladniej przedmiotem wy- nalazku jest sposób ekstrakcji ß-amylazy z produktu zbo zowego oraz zastosowanie enzymu w wymie- nionej ekstrakcji. Tlo wynalazku ß-Amylaza jest enzymem rozk ladaj acym skrobi e, który hydrolizuje wi azania alfa-1,4. Enzym wyst e- puje na przyk lad w bakteriach i ro slinach i rozrywa skrobi e g lównie na maltoz e i nieredukuj acy koniec la n- cucha skrobiowego, ß-Amylaza jest rozpowszechniona na przyk lad w ziarnach, w których przekszta lca ona zapasy od zywcze produktu zbo zowego, to jest skrobi e, w cukry, je zeli jest to konieczne. W zbo zach skro- bia jest magazynowana g lównie w postaci amylozy i amylopektyny. ß-Amylaza przekszta lca ca la amyloz e w maltoz e, natomiast oko lo 60% amylopektyny przekszta lca si e w maltoz e, a reszta w dekstryn e. ß-Amylaza jest handlowo wa znym enzymem, który stosuje si e na przyk lad w przemy sle skro- biowym do produkcji maltozy. Produkty zawieraj ace du ze ilo sci maltozy stosuje si e na przyk lad w cu- kiernictwie i przemy sle spo zywczym. ß-Amylaza zosta la wydzielona zarówno z bakterii, jak i z ro slin. Na przyk lad otrzymano j a z bakterii Bacillus (US 4 970 158 i JP 60 126 080) i z trwa lych termicznie bakterii Clostridium (US 4 647 538). Oprócz maltozy ß-amylazy pochodz ace z bakterii wytwarzaj a znaczne ilo sci maltotriozy, natomiast ß-amylazy oparte na ro slinach wytwarzaj a stosunkowo wi ecej maltozy i st ad nadaj a si e one do procesów, których celem jest otrzymanie mo zliwie s lodkich i fermen- tuj acych produktów. Poza tym produkcja na wielk a skal e ß-amylazy z bakterii jest trudna. ß-Amylaza stosowana w przemy sle jest oparta na ro slinach, w takim przypadku zwykle na zbo zach, a zw laszcza na jeczmieniu albo pszenicy, przy czym jako zród lo enzymu mo zna wykorzysta c ziarna soi. W czasie hodowli ß-amylaza tworzy si e w ziarnach, w których jest ona magazynowana. Ziarno sk lada si e z kie lka i bielma zawieraj acego skrobi e, to jest j adra, które s a od siebie oddzielone przez tarczk e. Bielmo jest otoczone warstw a aleuronu, a ca le ziarno jest otoczone warstw a owocni, warstw a luski i lusk a w la sciw a. Pszenica nie ma w lasnej luski, lecz warstwa owocni i j adrowa tworz a tward a lupin e zewn etrzn a. ß-Amylaza gromadzi si e g lównie w bielmie i w tarczce. Najwi eksze ilo sci ß-amylazy znajduj a si e w najbardziej zewn etrznych czesciach bielma, bezpo srednio pod warstw a aleuronow a. ß-Amylaz e z j eczmienia zbadano bardzo dok ladnie i t e ß-amylaz e i jej produkcj e opisano na przyk lad w nast epuj acych publikacjach: D.E. Briggs, Barley, Chapman & Hall, London, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, London, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Science, Academic Press, London, 1979. Systematyczn a nazw a enzymu jest 1,4-alfa-D-glukanomaltohydrolaza (EC 3.2.1.2). W przesz lo sci ß-amylaz e zbo zow a oddzielano najpierw przez rozdrabnianie albo mielenie ziarna, a nast epnie przez ekstrakcj e ß-amylazy wod a albo buforem. Oczyszczanie enzymu z wyci agu tego rodzaju jest oczywi scie trudne i uciazliwe, poniewa z oprócz omawianego enzymu wyci ag zawiera szereg innych rozpuszczalnych sk ladników ziarna. Wysi lki skierowano na polepszenie wydzielania ß-amylazy z zawieraj acego j a roztworu, na przyk lad drog a adsorbcji enzymu za pomoc a polimeru w obecno sci siarczanu amonowego (US 5 294 341). Wydzielanie ß-amylazy z glutenu przeprowadzo- no do swiadczalnie za pomoc a proteazy (JP 63 079 590). ß-Amylaz e wydzielono tak ze z odpadowej cieczy z produkcji skrobi pszenicznej drog a dodawa- nia alginianu sodowego i odzyskiwania skoagulowanego enzymu (JP 60 027 383) albo drog a tworze- nia zelu fosforanu wapniowego, na którym adsorbuje si e enzym i z którego mo zna go nast epnie odzy- ska c (JP 63 248 389). Ciecz odpadowa z produkcji skrobi nie jest dobrym zród lem ß-amylazy, ponie- wa z jest ona bardzo rozcie nczona i zawiera du ze ilo sci innych sk ladników, które utrudniaj a oczysz- czanie i zat ezanie, wskutek czego wydajno sc jest niska. W celu otrzymania bardziej czystego surowego wyci agu i unikni ecia trudnego przetwarzania wspó lpr adowego zasugerowano, aby ekstrahowa c ß-amylaz e z ziarna ca lkowicie albo cz esciowo lu- skanego. Gdy na przyk lad ziarno j eczmienne luska si e w taki sposób, ze jego endosperma nie lamie sie, to najbardziej zewn etrzne warstwy endospermy funkcjonuj a jak swego rodzaju filtr, który zapobie- ga dost epowi nierozpuszczalnych substancji do wody namokowej i ogranicza dost ep substancji roz- puszczalnych. Korzystne jest prowadzenie ekstrakcji w obecno sci substancji redukuj acej, która wy- dziela ß-amylaz e z innych protein ziarna (FI 61 516 i US 4 675 296). Aktualnie wynaleziono sposób ekstrahowania ß-amylazy ze zbó z, który skraca czas ekstrakcji zbó z i polepsza wydajno sc enzymu. Sposób jest prosty do realizacji i nadaje si e zw laszcza do prze- twarzania luskanych zbó z, co u latwia tak ze dalsze oczyszczanie enzymu.PL 203 512 B1 3 Krótki opis wynalazku Sposób ekstrakcji ß-amylazy wed lug wynalazku charakteryzuje si e tym, ze produkt zbo zowy eks- trahuje si e w obecno sci celulazy w srodowisku wodnym z uzyskaniem wyci agu zawieraj acego ß-amy- laz e. Przedmiotem wynalazku jest ponadto stosowanie celulazy przy ekstrakcji ß-amylazy z produktu zbo zowego. Celulaz e stosuje si e na przyk lad w produkcji skrobi ze zmielonego produktu zbo zowego ze zmniejszeniem lepko sci zawiesiny i oddzieleniem skrobi od protein. Aktualnie nieoczekiwanie odkryto, ze dodatek celulazy do wody ekstrakcyjnej ß-amylazy zwi eksza wydajnosc ß-amylazy i umo zliwia skrócenie czasu ekstrakcji. Korzystne rozwi azania wynalazku s a opisane w zastrze zeniach zale znych. Krótki opis rysunków Na fig. 1 przedstawiono wp lyw temperatury na wydajno sc ß-amylazy w funkcji czasu. Szczegó lowy opis wynalazku Sposób wed lug wynalazku mo zna stosowa c do ekstrakcji ró znych produktów zbo zowych zawie- rajacych ß-amylaz e, na przyk lad do przetwarzania pszenicy, j eczmienia, ry zu i soi. Sposób stosuje si e korzystnie do ekstrakcji pszenicy i ry zu, a zw laszcza j eczmienia. Nieskie lkowane ziarna nie zawieraj a znacz acych ilo sci enzymów innych ni z ß-amylaza i st ad celowa jest ekstrakcja ß-amylazy z takich ziaren. Enzym mozna ekstrahowa c z nie luszczonych ziaren, przy czym korzystna jest jednak ekstrak- cja z ziaren luszczonych, zmielonych, rozdrobnionych albo polerowanych i st ad zaleca si e luszczenie ry zu i j eczmienia. Najlepsze wyniki uzyskuje si e drog a ekstrakcji luszczonych ziaren j eczmienia. W celu zapobie zenia dost epu skrobi z bielma do wyci agu luszczenie musi by c prowadzone w taki sposób, aby nie przerwa c aktualnie zywego ziarna, przy czym jednak w la sciwa luska musi by c usuni eta mo zliwie ostro znie. Przyczyn a tego jest to, ze luska jest tak g esta, ze zapobiega wnikaniu ß-amylazy. Luszczony j eczmie n oznacza taki jeczmie n, z którego zosta la usuni eta istniej aca luska ziarna, lecz pozosta lo nietkni ete bielmo. W praktyce oznacza to, ze drog a luszczenia usuwa si e, co najwy zej oko lo 20% ciezaru nie luszczonego ziarna, przy czym zwykle w postaci materia lu luskowego usuwa si e od 10 do 20%. W takim przypadku najbardziej zewn etrzne warstwy (perikarp, warstwa j a- drowa i aleuronowa) endospermy dzia la jak swego rodzaju ultrafiltr, który zapobiega dost epowi nie- rozpuszczalnych substancji i w zasadzie tak ze dost epowi rozpuszczalnych substancji do wody eks- trakcyjnej. Wyci ag otrzymany z ziarna i przetworzony w ten sposób jest stosunkowo czysty, co u latwia dalsze przetwarzanie, takie jak oczyszczanie i koncentracj e enzymu. Przy dalszym przetwarzaniu stosowa c mo zna procesy znane w przemy sle enzymów, takie jak filtracja ci snieniowa i ultrafiltracja. Produkt zbo zowy ekstrahuje si e w srodowisku wodnym, takim jak woda, albo ewentualnie w roztworze buforowym. W czasie ekstrakcji warto sc pH wynosi zwykle od 6,0 do 6,5. Ekstrakcj e pro- wadzi si e korzystnie w warunkach redukuj acych, przy czym wykorzystuje si e tak duza aktywno sc re- dukuj ac a, aby wydziela la si e ß-amylaza zwi azana ze strukturaln a protein a ziarna. Warunki redukuj ace nastawia si e w znany sposób, w praktyce cz esto za pomoc a SO 2 , na przyk lad drog a dodawania roz- tworu metawodorosiarczynu sodowego i ewentualnie siarczynu sodowego. Stosunek luszczonych ziaren do srodowiska wodnego wynosi korzystnie od 5:8 do 2:3 (ciezar/obj etosc). Sposób wed lug wynalazku nadaje si e do stosowania w procesach na skal e przemys low a, w których ekstrakcj e prowa- dzi si e w stalowym silosie, do którego wprowadza si e na przyk lad 19 ton luszczonego j eczmienia i 29 m 3 wody zawieraj acej 0,5% metawodorosiarczynu sodowego i 0,5% siarczynu sodowego. Przez ekstrahowanie j eczmienia w wy zej opisany sposób mo zna uzyska c wydajno sc ekstrakcji wynosz ac a oko lo 45 do 50% ca lkowitej zawarto sci ß-amylazy w j eczmieniu bez oddzielania wody, która pozostaje wewn atrz ziarna. W takim przypadku czas ekstrakcji wynosi oko lo 72 godziny. Gdy do wody ekstrakcyjnej dodaje si e celulaz e, to mo zna wyekstrahowa c 65% ca lkowitej ilo sci ß-amylazy w produkcie zbo zowym, a czas ekstrakcji skraca si e do oko lo 60 godzin. Celuloza jest liniowym polisacharydem glukozowym, którego jednostki glukozowe s a po laczone ze sob a wi azaniami ß-1,4-glukozydowymi. Celuloza znajduje si e w sciankach komórek ro slinnych, w których jest ona cz esto obecna razem z lignin a i hemiceluloz a. Enzymy, które uczestnicz a w reak- cjach rozk ladu celulozy okre sla si e jako celulazy. Celulazy stosuje si e w przemy sle, na przyk lad przy produkcji skrobi, przetwarzaniu masy papierniczej, przetwarzaniu tekstyliów, rozk ladzie ß-glukanu w browarniach oraz przy polepszaniu jako sci m aki w piekarniach. W sposobie wed lug niniejszego wynalazku celulaza rozrywa struktury powierzchniowe pod wszelkimi luskami zywego ziarna. Dost epne w handlu produkty celulazowe pochodz a albo z bakterii, takich jak rodzaj Bacillus, albo z grzybów, takich jak dro zd ze (na przyk lad Saccharomyces) albo z ple sni. Du ze ilo sci celulaz wydzielono zw laszcza z grzybów ple sniowych. Najpowszechniej stosowane ple snie wytwarzaj ace celulaz e nale zaPL 203 512 B1 4 do rodzajów Humicola, Fusarium, Meceliopthora, Aspergillus, Penicillium i Trichoderma. Niektóre szczepy produkcyjne poddano modyfikacji genetycznej. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stosuje si e celulaz e pochodz ac a z grzybów ple sniowych, a zw laszcza z ple sni Trichoderma. Handlowe preparaty enzymatyczne zawieraj a kilka aktywnych enzymów, a ich ilo sci i stosunki mog a zmienia c si e nieznacznie od jednego producenta do drugiego. Dla wynalazku jest istotne, aby produkt zawiera l przynajmniej aktywn a celulaz e, hemicelulaz e i ß-glukanaz e. Mówiac inaczej, w tym kontek scie celulaza dotyczy preparatu enzymatycznego, który rozk lada przynajmniej celuloz e, hemi- celuloz e i ß-glukan. Wszystkie handlowe produkty celulazowe badane przez zg laszaj acego (produko- wane przez Genencor International, Rohm Enzymer GmbH i Novo Nordisk) zwi eksza ly wydajno sc ß-amylazy. Aktywna celulaza, hemi-celulaza i p-glukanaza s a opisane na przyk lad w Novo's Handbo- ok of Practical Biotechnology, 1986. Celulazy mo zna podzieli c na przyk lad na endocelulazy, egzocelulazy, egzocellobiohydrolazy i cellobiazy. Endocelulazy, to jest 1,4- ß-D-glukanoglukanohydrolazy rozszczepiaj a losowo wi azania 1,4- ß celulozy wewn atrz cz asteczki i tworz a oligosacharydy. Egzocelulazy, to jest 1,4- ß-glukano- glukohydrolazy rozszczepiaj a wi azania 1,4- ß na ko ncu cz asteczki, wydzielaj ac glukoz e. Ich wp lyw na celobioz e jest powolny. Egzocellobiohydrolazy, to jest 1,4- ß-D-glukanocellobiohydrolazy, rozszczepia- ja wy zej wspomniane wi azania na nieredukuj acym ko ncu cz asteczki tworz ac cellobioz e, natomiast cellobiazy, to jest ß-D-glukozydoglukohydrolazy, rozszczepiaj a cellobioz e na glukoz e. Poddawanie cellobiozy hydrolizie na glukoz e wymaga endoglukanazy (1,4- ß-D-glukanoglukanohydrolazy, EC 3.2.1.4), która rozszczepia wn etrze cz asteczki, a tak ze podstawione substraty, lecz nie rozk lada kry- stalicznej celulozy, cellobiohydrolazy (1,4- ß-D-glukanocellobiohydrolazy, EC 3.2.1.91), która rozsz- czepia krystaliczn a celuloz e, i ß-glukozydazy ( ß-D-glukozydoglukohydrolazy, EC 3.2.1.21), która jest cellobiaz a, która rozszczepia cellobioz e i cellooligosacharydy do glukozy. Grupa enzymów, która rozrywa hemiceluloz e, to jest polisacharydy, które wyst epuj a w przyro- dzie i zawieraj a pentozy, na przyk lad arabinany, galaktany, mannany i ksylany, nazywaj a si e hemice- lulazami. ß-Glukanazy rozrywaj a ß-D-glukany, to jest polimery glukozowe, które mog a by c rozga lezio- ne i maj a zarówno wi azania ß-1,3, jak i ß-1,4. ß-Glukan znajduje si e na przyk lad w sciankach komórek bielma w ziarnach. Lichenaza jest endo- ß-glukanaz a (1,3.1,4- ß-D-glukano-4-glukanohydrolaz a),która rozszczepia wi azania ß-1,4 ß-glukanu, który zawiera wi azania ß-1,3 i ß-1,4. Laminarynaza (1,3- ß-D- glukano-3-glukanohydrolaza) rozszczepia ß-glukan, który zawiera tylko wi azania ß-1,3, takie jak wi a- zania ß-1,3 w eglowodanów typu laminaryny, a egzoglukanaza (1,3- ß-D-glukanoglukohydrolaza) roz- szczepia wi azania ß-1,3 ß-1,3-glukanów tworz ac g lównie glukoz e. Przy ekstrakcji ß-amylazy obiecuj ace wyniki uzyskano na przyk lad z preparatami celulazowymi Spezyme CE i GC 440, produkowanymi przez Genencor International. Ten ostatni pochodzi z gene- tycznie modyfikowanego szczepu Trichoderma longibrachatium i rozrywa szczególnie skutecznie celu- loz e, hemiceluloz e i ß-glukan. Jego aktywnosc wyra za si e jako wp lyw na karboksymetyloceluloz e (RBB-CMC) i w takim przypadku aktywno sc RBB-CMC wynosi co najmniej 1400 IU/g. Oprócz aktyw- no sci celulazowej GC 400 wykazuje aktywno sc ß-glukanazow a, ß-glukozydazow a, ß-ksylozydazow a, ksylanazow a i acetyloesterazow a. Typowa porcja GC 400 zawiera srednio w przybli zeniu od 7000 do 9000 U/ml DNS-CMC, w przyli zeniu od 6000 do 8000 U/ml ß-glukanazy, w przybli zeniu od 80 do 90 U/ml ß-aglukozydazy, w przybli zeniu od 500 do 600 nkat/ml ß-ksylozydazy, w przybli zeniu od 1700 do 2000 nkat/ml acetyloesterazy, w przybli zeniu od 700 do 1400 U/ml RBB ksylanazy i w przybli zeniu 1900 do 2100 U/ml DNS ksylanazy. Bardzo dobre wyniki uzyskano tak ze stosuj ac celulaz e produko- wan a przez Rohm Enzyme GmbH, któr a sprzedaje si e pod nazw a bran zow a Rohalase®Sep. Preparat pochodzi ze szczepu Trichoderma reesei i zawiera znaczne ilo sci aktywnej ß-1,4-endo-glukanazy (co najmniej 4700 CU/g) i ksylanaz e (co najmniej 3000 Xy1H/g) oraz pomniejsze ilo sci aktywnej cellobio- hydrolazy. Preparat zawiera tak ze aktywn a ß-1,3-glukanaz e, to jest laminarynaz e. Gdy stosuje si e wy zej wymienione preparaty enzymatyczne, to odpowiednia ilo sc celulazy wynosi, co najmniej 0,015%, korzystnie, co najmniej 0,020%, na przyk lad od 0,018 do 0, 040%, a zw laszcza od 0,024 do 0,030% ciezaru produktu zbozowego. ß-Amylaz e mo zna ekstrahowa c w obecno sci celulazy w temperaturze od 20° do 45°C. Tempe- ratura wynosi korzystnie od 25° do 32°C, na przyk lad od 29° do 31°C. Czas ekstrakcji mo ze wynosi c od 30 do 72 godzin, zwykle, co najmniej 48 godzin, na przyk lad od 48 do 66 godzin, a zw laszcza od 55 do 62 godzin. Odpowiedni czas ekstrakcji w temperaturze 30°C wynosi oko lo 60 godzin. Po zako n- czeniu ekstrakcji ziarna, kasz e albo m ak e oddziela si e od wody ekstrakcyjnej stosuj ac na przyk ladPL 203 512 B1 5 sito, a ß-amylaz e odzyskuje si e z wody ekstrakcyjnej, od której si e j a oczyszcza i ewentualnie zateza, je zeli jest to konieczne. Po ekstrakcji wyekstrahowany i oddzielony w ten sposób produkt zbo zowy mo zna wykorzysta c na przyk lad do wytwarzania skrobi. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ß-amylaz e ekstrahuje si e, a wyci ag oddziela od produktu zbo zowego przed frakcjonowaniem skrobi i oddzieleniem jej od produktu zbo zo- wego. Je zeli enzym wyekstrahowano z ziaren niepo lamanych, to wyekstrahowane ziarna najpierw miele si e, a nast epnie prowadzi proces w znany sposób, to jest zmielone ziarna miesza si e z wod a, a produkt zbo zowy frakcjonuje drog a przesiewania i wykorzystania si ly od srodkowej. W czasie mielenia celulaz e dodaje si e zwykle razem z ß-glukanaz a w celu zmniejszenia lepko sci i oddzielenia skrobi od proteiny. Nast epuj ace przyk lady ilustruj a wynalazek bez ograniczenia go do przedstawionych tu rozwi aza n. P r z y k l a d 1 Oznaczanie ß-amylazy Przed oznaczeniem ca lkowitej ilo sci ß-amylazy z produktu zbo zowego usuwano wszystkie luski, a analizowany produkt zbo zowy mielono na sucho na drobn a m ak e i 10 g umieszczano w 100 ml kolbie sto zkowej. Nast epnie dodawano 100 ml 0,5% (ci ezar/obj eto sc) roztworu siarczynu sodowego i substan- cje starannie mieszano. Z kolei mieszanin e pozostawiono w kolbie na 24 godziny i od czasu do czasu wstrz asano. Po tym czasie ca lo sc mieszano dok ladnie i filtrowano przez cienk a bibu le filtracyjn a (MN 640 W). Przes acz rozcie nczono w stosunku 1:50 wod a destylowan a i oznaczano aktywno sc opisanym ni zej sposobem. T e prób e enzymatyczn a stosowano tak ze jako tak a do oznaczania zawarto sci ß-amy- lazy w roztworach ekstrakcyjnych w opisanych ni zej przyk ladach. ß-Amylaz e oznaczano w zasadzie w sposób opisany w Food Chemical Codex IV, General Test and Apparatus, 485. Jednostk e DP (si la diastatyczna) okre sla si e tu jako ilosc enzymu w 0,1 ml 5% rozcie nczonej próbki, która wytwarza ilo sc cukrów redukuj acych, wystarczaj ac a do zredukowania 5 ml roztworu Fehlinga ze 100 ml substratu w temperaturze 20°C w ci agu 1 godziny (sposób oznaczania nie odpo- wiada okre sleniu DP). Aktywno sc enzymatyczn a oznaczano drog a hydrolizowania skrobi w temperaturze 20°C, pH 4,6, w ci agu 30 minut. Otrzymane cukry redukuj ace oznaczano miareczkowo za pomoc a zelazicyjanku metalu alkalicznego. W celu otrzymania substratu skrobiowego 20 g (sucha substancja) skrobi (Baker 1130) mieszano w przybli zeniu z 50 ml wody. Nast epnie dodawano w przybli zeniu 500 ml wrz acej wody i mieszanin e gotowano dok ladnie w ci agu 2 minut. Nast epnie do och lodzonego roztworu skrobi dodawano 20 ml buforu octanowego (0,5M, pH 4,6) i rozcie nczono go do 1 litra destylowan a wod a. 200 ml substratu skrobiowego o temperaturze 20°C odpipetowano do 250 ml kolby miarowej, dodano 10 ml rozcie nczonej próbki enzymatycznej i starannie mieszano substancje. Próbk e poddawano inku- bacji dok ladnie w ci agu 30 minut na la zni wodnej w temperaturze 20°C i dodano 20 ml 0,5N NaOH. Substancje starannie wymieszano i rozcie nczono do 250 ml. 10 ml rozcie nczonego enzymu i 20 ml 0,5N NaOH odpipetowano do 250 ml kolby miarowej jako próbk e 0. Nast epnie substancje wymiesza- no starannie, dodano 200 ml substratu skrobiowego i rozcie nczono do 250 ml. 0,05N odczynnik zelazicyjankowy przygotowano drog a rozpuszczania 16,5 g zelazicyjanku pota- sowego (K 3 Fe(CN) 6 ) i 22 g w eglanu sodowego (Na 2 CO 3 ) w wodzie i rozcie nczania ich do jednego litra. Roztwór A-P-Z przygotowano drog a rozpuszczania 70 g chlorku potasowego (KCl) i 20 g siarczanu cyn- kowego (ZnSO 4 x 7H 2 O) w 700 ml destylowanej wody, dodawania 200 ml st ezonego kwasu octowego i rozcie nczania ich do jednego litra. Roztwór jodku potasowego przygotowano drog a rozpuszczania 50 g jodku potasowego (KJ) w 100 ml destylowanej wody i dodawania 2 kropli 50% wodorotlenku sodowego (NaOH). 10 ml odczynnika zelazicyjankowego i 5 ml próbki odpipetowano do 250 ml kolby miarowej, a nast epnie wymieszano je starannie i ogrzewano na la zni z wrz ac a wod a dok ladnie w ci agu 20 minut. Nast epnie roztwór och lodzono i dodano 25 ml odczynnika A-P-Z i 1 ml roztworu KJ. Mieszanin e mia- reczkowano za pomoc a 0,05N siarczanu sodowego a z do znikni ecia b lekitnego zabarwienia (ciemny b lekit ? barwa bia la). Aktywno sc ß-amylazow a obliczano ze wzoru: ( ) /ml DP 100 x23xK V1 V0 aktywnosc o - = w którym V0 = zu zycie w czasie miareczkowania przez próbk e 0 (ml) V1 = zu zycie w czasie miareczkowania przez próbk e (ml)PL 203 512 B1 6 K = wspó lczynnik rozcie nczenia. P r z y k l a d 2 Badano wp lyw celulazy na czas ekstrakcji ß-amylazy. ß-Amylaz e ekstrahowano z j eczmienia bez celulazy i z celulaza. 10 kg j eczmienia luszczonego za pomoc a luszczarki ekstrahowano w 15 l wody zawieraj acej 0,5% metawodorosiarczynu sodowego i 0,5% siarczynu sodowego. Nast epnie do drugiej partii dodano celulaz e GC440 wyprodukowan a przez Genencor, przy czym ilo sc celulazy wy- nosi la 0,029% ci ezaru luszczonego j eczmienia. Ekstrakcj e prowadzono w temperaturze 30°C. Aktyw- nosc ziarna stosowanego w ekstrakcji, któr a oznaczano zgodnie z przyk ladem 1, wynosi la 155 DP°/g. Wyniki s a przedstawione w tabeli 1 i 2. T a b e l a 1. Ekstrakcja bez celulazy Czas, godziny Aktywno sc ß-amylazowa roztworu ekstrakcyjnego w DP°/ml 10 20 24 47 30 55 48 83 60 92 66 98 72 102 96 86 T a b e l a 1. Ekstrakcja z celulaz a Czas, godziny Aktywno sc ß-amylazowa roztworu ekstrakcyjnego w DP°/ml 10 23 24 55 30 70 48 92 60 104 66 104 72 100 96 90 Wyniki wskazuj a, ze dodatek celulazy do wody ekstrakcyjnej skraca czas ekstrakcji ß-amylazy. P r z y k l a d 3 Badano wp lyw celulazy na wydajno sc ekstrakcji. 10 kg luszczonego j eczmienia o aktywno sci ß-amy- lazowej 155 DP°/g ekstrahowano w 15 litrach wody zawieraj acej 0,5% meta-wodorosiarczynu sodo- wego i 0,5% siarczynu sodowego. Ekstrakcj e prowadzono w temperaturze 30°C albo bez celulazy albo w obecno sci celulazy. Czas ekstrakcji bez celulazy wynosi l 72 godziny. Ca lkowita aktywno sc stosowanej ilo sci j ecz- mienia wynosi la 1550 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomoc a sita otrzymano 8175 ml wyci agu o aktywno sci 95° DP/ml. Ca lkowita aktywno sc otrzymanego wyci agu wynosi la zatem 776,6 kDP°/ml, a wydajno sc wyci agu wynosi la 50,1%. Odpowiedni a ekstrakcj e prowadzono w obecno sci celulazy drog a dodawania ilo sci GC440 od- powiadaj acej 0,025% ciezaru luszczonego j eczmienia. Czas ekstrakcji wynosi l 60 godzin. Ca lkowita aktywnosc zastosowanej ilo sci j eczmienia wynosi la 1550 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomo- c a sita otrzymano 9825 ml wyci agu o aktywno sci 102°DP/ml. Ca lkowita aktywno sc otrzymanego wy- ciagu wynosi la zatem 1002,2 kDP°/ml, a wydajno sc wyci agu wynosi la 64,7%.PL 203 512 B1 7 Wyniki wskazuj a, ze dodatek celulazy do wody ekstrakcyjnej zwi eksza l znacznie wydajno sc ß-amylazy. P r z y k l a d 4 Badano wp lyw temperatury na ekstrakcj e ß-amylazy. Luszczony j eczmie n ekstrahowano w spo- sób opisany w poprzednich przyk ladach w obecno sci celulazy, w ró znych temperaturach. Dawka celu- lazy GC440 odpowiada la 0,027% ci ezaru luszczonego j eczmienia, a temperatura ekstrakcji wynosi la 20°C, 25°C, 30°C albo 40°C. Wyniki s a przedstawione na fig. 1, przy czym najlepsze wyniki uzyskano w temperaturze 30°C. P r z y k l a d 5 Badano wp lyw celulazy na wydajno sc ß-amylazy z dro zd zy. 10 kg zmielonej pszenicy o aktyw- no sci ß-amylazowej 128 DP°/g ekstrahowano w 15 litrach wody zawieraj acej 0,5% metawodorosiar- czynu sodowego i 0,5% siarczynu sodowego. Ekstrakcj e prowadzono w temperaturze 30°C albo bez celulazy albo w obecno sci celulazy. Czas ekstrakcji bez celulazy wynosi l 72 godziny. Ca lkowita aktywno sc zastosowanej ilo sci pszenicy wynosi la 1280 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomoc a sita otrzymano 9175 ml wyci agu o aktywno sci 55° DP/ml. Ca lkowita aktywno sc otrzymanego wyci agu wynosi la zatem 504,6 kDP°/ml, a wydajno sc wyci agu wynosi la 39,4%. Odpowiedni a ekstrakcj e prowadzono w obecno sci celulazy drog a dodawania do zmielonej pszenicy ilo sci celulazy GC440 odpowiadaj acej 0,036% ciezaru kaszy. Czas ekstrakcji wynosi l 60 godzin. Ca lkowita aktywnosc zastosowanej ilo sci pszenicy wynosi la 1280 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomoc a sita otrzymano 10080 ml wyci agu o aktywno sci 72° DP/ml. Ca lkowita aktywnosc otrzymanego wyci agu wynosi la, zatem 725,8 kDP°/ml, a wydajno sc wyci agu wynosi la 56,7%. Wyniki wskazuj a, ze dodatek celulazy do ekstrakcyjnej zwi eksza znacznie wydajno sc ß-amylazy. P r z y k l a d 6 Badano wp lyw celulazy na wydajno sc ß-amylazy z polerowanej pszenicy. Pszenic e polerowano za pomoc a maszyny do polerowania ry zu droga lamania powierzchni i usuwania najbardziej ze- wn etrznej cz esci, to jest usuwano wi ekszo sc owocni i uszkadzano nieznacznie lusk e. 10 kg polerowa- nej pszenicy o aktywno sci ß-amylazowej 128 DP°/g ekstrahowano w 15 litrach wody zawieraj acej 0,5% meta-wodorosiarczynu sodowego i 0,5% siarczynu sodowego. Ekstrakcj e prowadzono w tempe- raturze 30°C albo bez celulazy albo w obecno sci celulazy. Czas ekstrakcji bez celulazy wynosi l 72 godziny. Ca lkowita aktywno sc zastosowanej ilo sci pszenicy wynosi la 1280 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomoc a sita otrzymano 9780 ml wyci agu o aktywno sci 15°DP/ml. Ca lkowita aktywnosc otrzymanego wyci agu wynosi la zatem 146,7 kDP°/ml, a wydajno sc wyci agu wynosi la 11,5%. Odpowiedni a ekstrakcj e prowadzono w obecno sci celulazy drog a dodawania do zmielonej pszenicy ilo sci celulazy GC440, odpowiadaj acej 0,036% ci ezaru polerowanej pszenicy. Czas ekstrak- cji wynosi l 60 godzin. Ca lkowita aktywnosc zastosowanej ilo sci pszenicy wynosi la 1280 kDP°. Drog a oddzielania wyci agu za pomoc a sita otrzymano 9250 ml wyci agu o aktywno sci 35° DP/ml. Ca lkowita aktywno sc otrzymanego wyci agu wynosi la zatem 323,8 kDP°/ml, a wydajnosc wyci agu wynosi la 25,3%. Wyniki wskazuj a, ze dodatek celulazy do ekstrakcyjnej zwi eksza znacznie wydajno sc ß-amylazy. PL PL

Claims

1. Zastrze zenia patentowe 1. Sposób ekstrakcji ß-amylazy z produktu zbo zowego, znamienny tym, ze produkt zbo zowy poddaje si e ekstrakcji si e w obecno sci preparatu enzymatycznego zawieraj acego aktywn a celulaz e, hemicelulaz e i ß-glukanaz e w srodowisku wodnym z uzyskaniem wyci agu zawieraj acego ß-amylaz e, a nast epnie odzyskuje wymienion a ß-amylaz e z wymienionego srodowiska.

2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ß-amylaz e ekstrahuje si e z j eczmienia, pszeni- cy albo zyta.

3. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ß-amylaz e ekstrahuje si e z luszczonego j ecz- mienia.

4. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ß-amylaz e ekstrahuje si e z ziaren zbo za, które poddano obróbce wybranej spo sród luszczenia, mielenia, rozdrabniania, polerowania albo ich polacze n.PL 203 512 B1 8

5. Sposób wed lug zastrz. 1 do 4, znamienny tym, ze ekstrakcj e prowadzi si e w warunkach redukuj acych.

6. Sposób wed lug zastrz. 5, znamienny tym, ze wymienione warunki redukuj ace s a tak do- stosowane, aby zapewni c aktywnosc redukuj ac a zdoln a do wydzielania ß-amylazy zwi azanej ze struk- turaln a protein a ziarna.

7. Sposób wed lug zastrz. 5, znamienny tym, ze wymienione warunki redukuj ace zapewnia si e za pomoc a wody zawieraj acej SO 2 .

8. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze luszczony j eczmie n poddaje si e ekstrakcji wod a zawieraj ac a SO 2 w stosunku od 5:8 do 2:3 ( luszczony j eczmie n: woda zawieraj aca SO 2 ).

9. Sposób wed lug jednego z poprzedzaj acych zastrz. 1 do 8, znamienny tym, ze ekstrakcj e prowadzi si e w temperaturze od 25°C do 33°C, a zw laszcza od 29°C do 31°C.

10. Sposób wed lug jednego z poprzedzaj acych zastrz. 1 do 9, znamienny tym, ze czas eks- trakcji wynosi od 48 do 66 godzin, a zw laszcza od 55 do 62 godzin.

11. Sposób wed lug jednego z poprzedzaj acych zastrz. 1 do 10, znamienny tym, ze stosuje si e celulaz e z ple sni.

12. Sposób wed lug jednego z poprzedzaj acych zastrz. 1 do 11, znamienny tym, ze stosuje si e celulaz e z ple sni Trichoderma.

13. Sposób wed lug jednego z poprzedzaj acych zastrz. 1 do 12, znamienny tym, ze celulaza jest celulaza z rodzajów wybranych spo sród Humicola, Fusarium, Myceliopthora, Aspergillus, Penicil- lium, Trichoderma i ich mieszanin.

14. Sposób wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze ß-amylaz e ekstrahuje si e ze zmielo- nych ziaren.

15. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze wymienion a odzyskan a ß-amylaz e poddaje sie obróbce wybranej spo sród oczyszczania, zatezania i ich kombinacji.

16. Zastosowanie preparatu enzymatycznego zawieraj acego aktywn a celulaz e, hemicelulaz e i ß-glukanaz e do ekstrakcji ß-amylazy z produktu zbo zowego.PL 203 512 B1 9 RysunekPL 203 512 B1 10 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 z l (w tym 23% VAT) PL PL