FR2820433A1

FR2820433A1 - Procede d'extraction de beta-amylase de cereale et utilisation d'une cellulase dans un tel procede

Info

Publication number: FR2820433A1
Application number: FR0201125A
Authority: FR
Inventors: Pekka Kekki
Original assignee: Danisco Sugar Finland Oy
Current assignee: Nordic Sugar Oy
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2002-08-09
Also published as: DK1363999T3; US20040067570A1; DE60210586D1; EE05410B1; WO2002062980A8; ZA200305605B; CN1228444C; RU2290440C2; CA2370336A1; ES2261644T3; RU2003127065A; JP4092689B2; CN1491279A; DE60210586T2; EP1363999A1; WO2002062980A1; ATE323155T1; CA2370336C; EE200300354A; PT1363999E

Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction de beta-amylase de céréale, dans lequel c'est en présence d'une cellulase (enzyme dégradant la cellulose), de préférence tirée d'une moisissure, qu'on opère l'extraction de la beta-amylase d'une céréale. En particulier, ce procédé peut servir à extraire de la beta-amylase d'orge mondé, au moyen d'eau sulfitée. La présence d'une cellulase dans l'eau employée pour l'extraction a notamment pour effets d'augmenter les rendements en beta-amylase et d'accélérer les opérations d'extraction. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une cellulase, de préférence tirée d'une moisissure, dans un procédé d'extraction de beta-amylase de céréale.

Description

Procédé d'extraction de P-amylase de céréale et utilisation d'une cellulase dans un tel procédé

La présente invention appartient au domaine de la technologie enzymatique, et elle concerne en particulier un procédé d'extraction de ss- amylase de céréale, ainsi que l'utilisation d'une cellulase dans la mise en oeuvre d'un tel procédé d'extraction de (3-amylase de céréale.

La P-amylase est une enzyme de dégradation de l'amidon, qui hydrolyse les liaisons oc-1, 4 des molécules d'amidon. On en trouve par exemple chez les bactéries et les plantes, et son action consiste à dégrader l'amidon, principalement en maltose, au niveau des extrémités non-réductrices des chaînes moléculaires de l'amidon. On trouve par exemple de la ss-amylase en abondance dans les grains des céréales, où elle convertit au besoin en sucres les réserves nutritives de la plante, c'est-à-dire son amidon. Chez les céréales, l'amidon est stocké principalement sous forme d'amylose et d'amylopectine, et la (3-amylase convertit en maltose la totalité de l'amylose ainsi qu'environ 60 % de l'amylopectine, le reste étant converti en dextrines.

La ss-amylase possède une valeur commerciale intéressante, car cette enzyme est par exemple employée dans l'industrie de l'amidon, pour la production de maltose. En confiserie et pâtisserie, comme dans d'autres industries alimentaires, on utilise des produits qui contiennent du maltose en fortes proportions. On a isolé des ss-amylases aussi bien à partir de vé- gétaux qu'à partir de bactéries, par exemple de bactéries du genre Bacillus

(US 4 970 158 et JP 60/126080) ou de bactéries thermostables du genre Clostridium (US 4647538). Mais les ss-amylases d'origine bactérienne

produisent, en plus du maltose, de grandes quantités de maltotriose, alors que les ss-amylases d'origine végétale donnent du maltose en quantités re- lativement plus importantes et conviennent donc mieux pour des procédés dont le but est d'obtenir autant que possible de produits sucrés et/ou fermentescibles. Il est de plus difficile de produire à grande échelle des ss- amylases à partir de bactéries. C'est pourquoi les ss-amylases employées dans l'industrie sont d'origine végétale, les sources habituelles de ces enzymes étant des céréales, en particulier l'orge et le blé, ainsi que le soja.

Pendant la croissance de la plante, de la P-amylase se forme dans les grains où elle est stockée. Un grain de céréale est constitué du germe et de l'endosperme ou albumen amylacé, séparés l'un de l'autre par l'hypoblaste. L'endosperme est entouré par l'assise protéique, et le grain dans son ensemble est entouré du péricarpe, du tégument, et d'une enveloppe adhérente. Chez le grain de blé, il n'y a pas d'enveloppe adhérente proprement dite, mais le péricarpe et le tégument constituent une tunique externe dure. C'est essentiellement dans l'albumen et dans l'hypoblaste que la ss- amylase s'accumule, et c'est dans les parties le plus externes de l'albumen, juste sous l'assise protéique, qu'on la trouve en les plus grandes quantités.

La ss-amylase de l'orge a fait l'objet d'études approfondies. Cette
5-amylase et son obtention sont décrites par exemple dans les livres sui- vants :"Barley"de D. E. Briggs, éditions Chapman & Hall, Londres, 1978 ; "Barley and Malt"de Cook, Academic Press, Londres, 1962 ;"Brewing
Science"de J. R. A. Pollock, Academic Press, Londres, 1979. Le nom systé-

matique de cette enzyme est le suivant : 1, 4-Ct-D-glucane maltohydrolase (EC 3. 2. 1. 2). Autrefois, pour isoler les ss-amylases de céréales, on com- mençait par moudre ou broyer les grains, puis on en extrayait la ss-amylase avec de l'eau ou une solution tampon. Il est évidemment difficile et laborieux d'obtenir une enzyme purifiée à partir d'un extrait préparé de cette manière, car un tel extrait contient, en plus de l'enzyme voulue, plusieurs autres composants solubles des grains. On a essayé d'améliorer l'isolement d'une ss-amylase à partir d'une solution qui en contient, en opérant par exemple par adsorption de l'enzyme sur un polymère en présence de sulfate d'ammonium (US 5 294 341). On a aussi tenté d'isoler de la ss-amy- lase de gluten à l'aide d'une protéase (JP 63/79590).

On a également isolé une P-amylase à partir des rejets liquides de la production d'amidon de blé, en y ajoutant de l'alginate de sodium et en récupérant ensuite l'enzyme coagulée (JP 60/27383), ou en préparant un gel de phosphate de calcium sur lequel on fait s'adsorber l'enzyme, pour la récupérer ensuite à partir de là (JP 63/248389). Mais les rejets liquides

de production d'amidon ne constituent pas une source satisfaisante de ssamylase, puisque celle-ci s'y trouve en très faible concentration et parmi d'autres composants présents en grandes quantités, ce qui fait que les opérations de concentration et de purification de l'enzyme sont difficiles et que les rendements obtenus sont faibles.

Afin d'obtenir un extrait brut plus pur et d'éviter de devoir effectuer ultérieurement un traitement malaisé, on a suggéré d'extraire la P- amylase de grains débarrassés de tout ou partie de leur enveloppe adhérente. Quand par exemple des grains d'orge sont mondés de telle manière que leur albumen reste intact, les couches externes de l'albumen jouent en quelque sorte le rôle d'un filtre qui empêche les substances insolubles de passer dans l'eau de trempage et qui limite le passage des substances solubles dans cette eau. Il est préférable d'effectuer l'extraction en présence d'une substance réductrice qui sépare la p-amylase des autres protéines contenues dans les grains (FI 61 516 et US 4 675 296).

La Demanderesse a découvert un nouveau procédé d'extraction de p-amylase de céréales, procédé où l'extraction prend moins de temps et qui permet d'obtenir de meilleurs rendements en enzyme. Ce procédé est simple à mettre en oeuvre et convient particulièrement bien au traitement de céréales mondées, et il a également pour effet de faciliter la purification ultérieure de l'enzyme.

Le procédé d'extraction de p-amylase qui fait l'objet de la pré- sente invention est caractérisé par le fait que c'est en présence d'une cellulase que l'on soumet un produit céréalier à une opération d'extraction en milieu aqueux pour obtenir un extrait contenant de la (3-amylase. Le fait d'utiliser une cellulase dans l'extraction de ss-amylase de céréales consti- tue un autre objet de la présente invention.

On se sert de cellulases dans la production d'amidon à partir de moutures de céréales, par exemple pour faire baisser la viscosité de la sus- pension ou pour séparer l'amidon des protéines. On a eu la surprise de découvrir que, si l'on ajoute une cellulase à de l'eau servant à extraire une P- amylase, le rendement en (3-amylase augmente et l'opération d'extraction prend moins de temps.

La figure 1 montre l'influence de la température sur la quantité de P-amylase produite au cours du temps.

Le procédé de la présente invention peut s'appliquer à l'extrac-

tion de P-amylase de diverses céréales comme le blé, l'orge et le riz, ainsi que du soja. C'est de préférence pour extraire de la {3-amylase de blé ou de riz, et plus particulièrement d'orge, qu'on met en oeuvre le procédé de l'invention. Des grains n'ayant pas encore germé ne contiennent pas en quantités significatives d'autres enzymes que la ss-amylase, et c'est pourquoi il vaut mieux extraire la ss-amylase de tels grains. On peut extraire cette enzyme de grains non mondés, mais il est préférable de l'extraire de grains mondés, moulus, broyés ou polis. Il est notamment judicieux de monder les grains d'orge ou de riz, et c'est en extrayant la p-amylase de grains d'orge mondés que l'on obtient les meilleurs résultats.

Pour empêcher l'amidon contenu dans l'albumen des grains de passer dans l'extrait, il faut ôter l'enveloppe adhérente des grains le plus soigneusement possible, tout en veillant à ne pas briser les grains proprement dits. La raison en est que cette enveloppe est si dense que la ss-amy- lase ne peut pas y pénétrer et moins encore la traverser. L'orge mondé est ainsi de l'orge dont on a enlevé l'enveloppe adhérente des grains tout en laissant intact l'albumen de ceux-ci. En pratique, l'enveloppe ôtée à un grain lors de cette opération représente au plus 20 %, et d'habitude de 10 à 20 %, du poids du grain non mondé. En ce cas, les couches le plus externes de l'endosperme, c'est-à-dire le péricarpe, le tégument et l'assise protéique, jouent le rôle d'une sorte d'ultrafiltre qui empêchent les substances insolubles, ainsi que l'essentiel des substances solubles, de passer dans l'eau employée pour l'extraction. A partir de grains traités de cette façon, on obtient un extrait qui est relativement pur, ce qui facilite les opérations

ultérieures comme la concentration et la purification de l'enzyme. Dans ces opérations ultérieures, on peut avoir recours à des procédés générale- ment connus dans le domaine de l'industrie des enzymes, comme la filtration sous pression et l'ultrafiltration.

On opère sur un produit céréalier une extraction en milieu aqueux, comme de l'eau ou éventuellement une solution tampon. Pendant cette opération d'extraction, le pH de ce milieu vaut généralement de 6,0 à 6,5.

Il est préférable d'opérer cette extraction dans des conditions réductrices, c'est-à-dire dans un milieu réducteur, dont l'activité réductrice doit être telle que la P-amylase liée aux protéines de structure des grains soit libérée. On sait bien comment établir de telles conditions réductrices, et dans la pratique, on se sert souvent d'eau"sulfitée", autrement dit, contenant du dioxyde de soufre SO2, et obtenue par exemple par addition de métabisulfite de sodium et/ou de sulfite de sodium. Si le produit céréalier est un lot de céréale mondée, la proportion des grains mondés au milieu aqueux, en poids/volume, vaut de préférence de 5/8 à 2/3. Ceci vaut notamment dans un mode préféré de réalisation de l'invention, où l'on extrait de la ss-amy- lase d'orge mondé au moyen d'eau sulfitée, employée en une proportion (de l'orge mondé à l'eau sulfitée) qui vaut effectivement de 5/8 à 2/3. Le procédé de l'invention se prête bien à une mise en oeuvre dans des installa-

tions industrielles, par exemple dans un silo en acier où l'on opère une extraction sur 19 tonnes d'orge mondé, avec 29 m3 d'eau contenant 0, 5 % de métabisulfite de sodium et 0,5 % de sulfite de sodium.

Quand on extrait de la ss-amylase d'orge de la manière indiquée ci-dessus, on peut en extraire à peu près 45 à 50 % de la quantité totale de ss-amylase contenue dans les grains d'orge, sans séparer l'eau qui reste dans les grains. En ce cas, l'opération d'extraction prend 72 heures. Si l'on ajoute de la cellulase à l'eau employée pour l'extraction, on peut extraire jusqu'à 65 % de la quantité totale de p-amylase contenue dans les grains de céréale, et le temps que prend l'opération d'extraction diminue jusque environ 60 heures.

La cellulose est un polysaccharide linéaire constitué de motifs de glucose raccordés par des liaisons osidiques ss-l, 4. On en trouve dans les parois cellulaires des végétaux, où elle est souvent accompagnée par de la lignine et de l'hémicellulose. On appelle"cellulases"les enzymes

qui participent aux réactions de dégradation de la cellulose. Des cellulases sont employées dans l'industrie, par exemple dans la production d'ami- don, dans la fabrication de papier, dans l'industrie textile, pour la dégradation des ss-glucanes dans les brasseries, et pour améliorer la qualité des farines dans les boulangeries. Dans le procédé de la présente invention, la cellulase employée sert à dégrader les structures superficielles situées juste sous l'enveloppe des grains.

Les cellulases industrielles que l'on peut trouver sur le marché proviennent soit de bactéries, par exemple du genre Bacillus, soit de champignons inférieurs comme des levures, par exemple du genre Saccharomyces, ou des moisissures. On sait isoler des cellulases en grandes quantités, notamment à partir de moisissures. Les moisissures productrices de cellulases dont on se sert le plus couramment appartiennent aux genres Humicola, Fusarium, Myceliophora, Aspergillus, Penicillium et Trichoderma. Certaines des souches productrices ont subi des modifications génétiques. Dans le cadre de la présente invention, on préfère employer une cellulase provenant d'une moisissure, et en particulier, celle que produisent les moisissures du genre Trichoderma.

Les préparations d'enzymes commercialisées contiennent des enzymes qui ont diverses activités et dont les quantités et proportions peuvent varier un peu d'un fabricant à l'autre. Pour la présente invention, il est essentiel que le produit utilisé présente au moins les activités de cellulase, d'hémicellulase et de ss-glucanase. En d'autres termes, dans le contexte de la présente invention, ce que l'on appelle"cellulase", c'est en fait une pré- paration enzymatique qui dégrade au moins la cellulose, l'hémicellulose et les 5-lucanes. Toutes les cellulases commercialisées testées par la De-

manderesse, c'est-à-dire les produits de Genencor International, de Rôhm Enzymer GmbH et de Novo Nordisk, améliorent les rendements en ss-amy- lase. Les activités de cellulase, d'hémicellulase et de ss-glucanase sont décrites par exemple dans le manuel"Novo's Handbook of Practical Biotechnology", publié en 1986.

On peut classer les cellulases en quatre types, à savoir les endocellulases, les exocellulases, les exocellobiohydrolases et les cellobiases.

Les endocellulases ou 1, 4-p-D-glucanc glucanohydrolascs coupent au hasard les liaisons osidiques ss-1, 4 au sein d'une molécule de cellulose et

dégradent celle-ci en oligosaccharides. Les exocellulases ou 1, 4-ss-Dglucane glucohydrolases coupent les liaisons osidiques ss-l, 4 situées au bout d'une molécule de cellulose et libèrent ainsi du glucose, mais ces enzymes agissent lentement sur le cellobiose. Les exocellobiohydrolases ou l, 4-ss-D-glucane cellobiohydrolases coupent les liaisons du type cité cidessus et situées à l'extrémité non réductrice d'une molécule, libérant ainsi

du cellobiose, et les cellobiases ou l, 4- (3-D-glucoside glucohydrolases coupent le cellobiose en glucose. Pour hydrolyser la cellulose jusqu'au glucose, il faut une endoglucanase (l, 4-ss-D-glucane glucanohydrolase, EC 3.2. 1.4), qui coupe des liaisons au sein des molécules de cellulose et peut aussi dégrader des substrats substitués, mais ne peut pas dégrader la cellulose cristalline, une cellobiohydrolase (l, 4-ss-D-glucane cellobiohydrolase, EC 3.2. 1.91), qui dégrade la cellulose cristalline, ainsi qu'une ss-glucosidase (ss-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2. 1.21), qui est une cellobiase qui coupe le cellobiose et les autres cello-oligosaccharides en donnant du glucose.

On appelle"hémicellulases"des enzymes qui dégradent les hémicelluloses, polysaccharides naturels contenant des motifs de pentoses, comme les arabinanes, galactanes, mannanes et xylanes. Les ss-glucanases dégradent les ss-glucanes, polymères du glucose qui peuvent posséder une structure ramifiée et comporter à la fois des liaisons osidiques ss-1, 3 et ss-
1,4. Dans les grains de céréales, on trouve des ss-glucanes dans les parois des cellules de l'albumen. La lichenase ou 1, 3. 4- (3-D-glucane 4-glucanohydrolase est une endo-ss-glucanase qui coupe les liaisons ss-1, 4 des ss- glucanes comportant des liaisons ss-1, 3 et ss-1, 4. La laminarinase ou 1,3- ss-D-glucane 3-glucanohydrolase dégrade les ss-glucanes qui ne comportent que des liaisons ss-1, 3 ; elle coupe par exemple les liaisons ss-1, 3 des oses du type de la laminarine. Quant à l'exoglucanase ou 1, 3-ss-D-glucane glucohydrolase, elle coupe les liaisons ss-1, 3 des ss-1, 3-glucanes, en don- nant principalement du glucose.

Pour ce qui est de l'extraction de (3-amylase, on a obtenu des ré- sultats prometteurs en utilisant les préparations de cellulase Spezyme CE et GC 440, fabriquées par la firme Genencor International. La dernière dé- rive d'une souche génétiquement modifiée de Trichoderma longibrachia- tum et dégrade très efficacement la cellulose, l'hémicellulose et les (3-glu-

canes. Son activité, exprimée en termes d'effet sur la CMC (test sur RBBCMC : RemazolBrilliantBlue R-carboxyméthylcellulose), vaut au moins 1400 UI/g. Outre son activité de cellulase, cette préparation GC 440 présente des activités de ss-glucanase, de ss-glucosidase, de ss-xylosidase, de xylanase et d'acétylestérase. Un lot typique de GC 440 contient en moyenne à peu près 7000 à 9000 U/ml de cellulase (test à l'acide dinitrosalicylique (DNS) sur CMC), à peu près 6000 à 8000 U/ml de ss-glucanase, à peu près 80 à 90 U/ml de ss-glucosidase, à peu près 500 à 600 nkat/ml de ss-xylosi- dase, à peu près 1700 à 2000 nkat/ml d'acétylestérase, et à peu près 700 à 1400 U/ml (test sur RBB-xylane) ou 1900 à 2100 U/ml (test au DNS) de xylanase.

On a également obtenu de très bons résultats en utilisant une préparation de cellulase produite par la firme Rôhm Enzyme GmbH et commercialisée sous la marque Rohalase Sep. Cette préparation dérive d'une souche de Trichoderma reesei et contient d'importantes quantités de ss-l, 4endoglucanase (activité d'au moins 4700 CU/g) et de xylanase (au moins 3000 XylH/g), et elle présente une activité relativement faible de cellobiohydrolase, ainsi qu'une certaine activité de ss-l, 3-glucanase, c'est-àdire de laminarinase.

Si l'on emploie les préparations d'enzymes dont il est question ci-dessus, il convient d'employer la cellulase en une quantité représentant

au moins 0, 015 % et de préférence au moins 0, 020 % du poids de céréale.

On peut par exemple utiliser une quantité de cellulase représentant de 0, 018 à 0, 040 %, et de préférence de 0, 024 à 0, 030 %, du poids de céréale.

On peut donc extraire de la P-amylase en présence de cellulase, à une température qui vaut de 20 à 45 oC, et de préférence de 25 à 33 oC, par exemple de 29 à 31 oC. L'opération d'extraction peut durer de 30 à 72 heu- res, mais d'habitude, elle dure au moins 48 heures, par exemple de 48 à 66 heures, et en particulier de 55 à 62 heures. Quand on effectue l'extraction à 30 oC, il est judicieux que cette opération dure autour de 60 heures. Une fois l'extraction terminée, on sépare les grains, la semoule ou la farine de l'eau d'extraction, par exemple à l'aide d'un tamis, et l'on récupère la ss- amylase qui se trouve dans cette eau, après quoi l'on peut, si on le souhaite, la concentrer et/ou la purifier.

Après avoir subi cette opération d'extraction, le produit céréalier ainsi séparé peut servir par exemple dans la production d'amidon. On extrait donc la P-amylase et l'on sépare l'extrait d'avec le produit céréalier, selon cette invention, avant d'extraire l'amidon du produit céréalier par fractionnement. Si c'est de grains non concassés qu'on a extrait l'enzyme, on commence par moudre ces grains ayant subi l'extraction, après quoi l'on met en oeuvre un procédé connu de production d'amidon, à savoir, on met la mouture de grains dans de l'eau et l'on brasse le tout, puis on fractionne le mélange ainsi obtenu par tamisage et centrifugation. Pendant l'opération de mouture des grains, on ajoute habituellement de la cellulase, ainsi que de la ss-glucanase, afin de faire baisser la viscosité du mélange et de séparer l'amidon des protéines.

Les exemples suivants ne servent qu'à illustrer l'invention, sans aucunement la limiter.

Exemple 1 : Dosage de p-amylase
Pour déterminer la quantité totale de ss-amylase contenue dans un échantillon de céréale, on commence par enlever aux grains leur enveloppe adhérente, puis on les moud à sec en une fine farine et l'on met 10 g de celle-ci dans un erlenmeyer de 100 ml. On y ajoute 100 ml d'une solution à 0,5 % (pds/vol) de sulfite de sodium et l'on brasse convenablement le tout. On laisse le mélange séjourner 24 heures dans l'erlenmeyer, tout en l'agitant de temps en temps. Ensuite, on brasse le mélange et on le filtre en le faisant passer sur du papier-filtre mince (MN 640 W). On dilue le filtrat au 50ème avec de l'eau distillée, et l'on détermine l'activité enzymatique en suivant la méthode indiquée ci-dessous, que l'on a aussi suivie pour doser la P-amylase contenue dans les solutions issues des opérations d'extraction relatées dans les exemples suivants.

On dose la ss-amylase en suivant globalement la méthode décrite dans le document"FoodChemical Codex IV, Général Test and Apparatus", 485.

L'unité de pouvoir diastatique UPD employée ici est définie comme étant la quantité d'enzyme, dans 0,1 ml d'un échantillon dilué à 5 %, qui produit en 1 heure et à 20 C, à partir de 100 ml de substrat, assez

de sucres réducteurs pour réduire 5 ml de liqueur de Fehling. Il faut cependant noter que la méthode de dosage appliquée ne correspond pas à cette définition de l'UPD.

On détermine l'activité enzymatique en opérant une hydrolyse d'amidon à 20 oC et à pH 4,6 durant 30 minutes. On dose ensuite les sucres réducteurs qui résultent de cette hydrolyse, par titrage avec un ferricyanure de métal alcalin. Pour obtenir le substrat amylacé, on commence par mélanger 20 g (poids à sec) d'amidon (Baker 1130) avec à peu près 50 ml d'eau, puis on y ajoute environ 500 ml d'eau bouillante et l'on fait bouillir ce mélange pendant exactement 2 minutes. Après avoir laissé la solution d'amidon refroidir, on y ajoute 20 ml de solution tampon à 0,5 M d'acétate (pH 4,6), puis on la dilue avec de l'eau distillée jusqu'à un volume final de
1 litre. On laisse la température du substrat amylacé ainsi préparé s'équilibrer à 20 C, puis on prélève, à l'aide d'une pipette, 200 ml de ce substrat que l'on introduit dans une fiole jaugée de 250 ml. On y ajoute 10 ml de la solution diluée d'enzyme, et l'on brasse bien le tout. On fait incuber le mélange exactement 30 minutes dans un bain d'eau à 20 C, puis on y ajoute 20 ml de solution à 0,5 N de NaOH. On brasse bien le mélange, puis on en ajuste le volume à 250 ml.

Pour faire un essai à l'instant zéro, on introduit dans une fiole jaugée de 250 ml, à l'aide de pipettes, 10 ml de la solution diluée d'enzyme et 20 ml de solution à 0,5 N de NaOH. On brasse bien le tout, on y ajoute
200 ml de substrat amylacé, et l'on ajuste à 250 ml le volume du mélange.

On prépare une solution à 0,05 N de réactif ferricyanure en dis- solvant, dans de l'eau, 16,5 g de ferricyanure de potassium K3Fe (CN) 6 et
22 g de carbonate de sodium NaCOg, et en ajustant à 1 litre le volume de la solution ainsi obtenue. On prépare une solution de réactif APZ (acétate- potassium-zinc) en dissolvant 70 g de chlorure de potassium KCI et 20 g de sulfate de zinc ZnS07HO dans 700 ml d'eau distillée, en y ajoutant ensuite 200 ml d'acide acétique concentré, et en ajustant à 1 litre le volume du mélange ainsi obtenu. On prépare une solution d'iodure de potassium en dissolvant 50 g d'iodure de potassium KI dans 100 ml d'eau distillée, et en y ajoutant 2 gouttes d'une solution à 50 % d'hydroxyde de sodium
NaOH.

Au moyen de pipettes, on introduit 10 ml de solution de réactif ferricyanure et 5 ml d'échantillon dans un erlenmeyer de 150 ml. On brasse bien le tout, puis on chauffe le mélange durant exactement 20 minutes au bain-marie bouillant. On fait ensuite refroidir la solution, puis on y ajoute 25 ml de solution de réactif APZ et 1 ml de solution de KI. On titre alors le mélange, en y ajoutant une solution à 0,05 N de sulfate de sodium jusqu'à

la disparition de la couleur bleue, c'est-à-dire jusqu'au virage du bleu foncé au blanc.

On calcule alors l'activité de 5-amylase au moyen de la formule suivante :
Activité (en UPD/ml) = (Vo-Vi) x 23 x K/100 dans laquelle :

Vo représente le volume (en ml) de solution consommé lors du titrage par l'échantillon d'essai à l'instant zéro ; V représente le volume (en ml) de solution consommé lors du titrage par l'échantillon d'essai ; K représente le facteur de dilution.

Exemple 2
Dans cet exemple, on étudie l'effet d'une cellulase sur le temps que prend l'extraction de ss-amylase, dans le cas de l'extraction de ss-amy- lase d'orge effectuée en l'absence ou en présence de cellulase.

On soumet un premier lot de 10 kg d'orge, mondé au moyen d'une machine de mondage, à une extraction effectuée avec 15 litres d'eau contenant 0, 5 % de métabisulfite de sodium et 0,5 % de sulfite de sodium. Pour l'extraction d'un deuxième lot, on ajoute de la cellulase GC440 (produit de la société Genencor), en une quantité représentant 0,029 % du poids de l'orge mondé. On opère l'extraction à la température de 30 oC. Chez les grains soumis à l'extraction, l'activité enzymatique, déterminée selon la méthode indiquée dans l'exemple 1, vaut 155 UPD/g. Les résultats des essais sont donnés ci-dessous dans le tableau 1.

Tableau 1 Activité de {3-amylase dans la solution d'extraction, en UPD/ml
Extraction Extraction
Temps en l'absence en présence (h) de cellulase de cellulase
10 20 23
24 47 55
30 55 70
48 83 92
60 92 104
66 98 104
72 102 100
96 86 90
Ces résultats montrent bien que l'addition de cellulase à l'eau employée pour l'extraction accélère le processus et raccourcit le laps de temps nécessaire pour l'extraction de la 5-amylase.

Exemple 3
Dans cet exemple, on étudie l'effet d'une cellulase sur le rendement de l'opération d'extraction.

On soumet 10 kg d'orge mondé, dont l'activité de (3-amylase vaut 155 UPD/g, à une extraction effectuée avec 15 litres d'eau contenant 0,5 % de métabisulfite de sodium et 0, 5 % de sulfite de sodium, à la température de 30 C, en l'absence ou en présence de cellulase.

On fait durer pendant 72 heures l'opération d'extraction effectuée en l'absence de cellulase. L'activité totale de p-amylase contenue dans la quantité d'orge employée vaut 1550. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 8175 ml d'extrait dont l'activité vaut 95 UPD/ml, soit une activité totale de 776,6. 103 UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en l'absence de cellulase vaut donc
50,1 %.

On effectue une opération similaire d'extraction, mais en présence de cellulase, c'est-à-dire après avoir ajouté de la cellulase GC440 en une quantité représentant 0,025 % du poids de l'orge mondé, et l'on fait durer cette extraction pendant 60 heures. L'activité totale de ss-amylase contenue dans la quantité d'orge employée vaut 1550. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 9825 ml d'extrait dont l'activité vaut 102 UPD/ml, soit une activité totale de 1002,2. 103 UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en présence de cellulase vaut donc 64,7 %.

Ces résultats montrent que le fait d'ajouter de la cellulase à l'eau employée pour l'extraction provoque une augmentation très nette du rendement de l'opération d'extraction de (3-amylase.

Exemple 4
Dans cet exemple, on étudie l'effet de la température sur l'extraction de ss-amylase.

On soumet de l'orge mondé à des opérations d'extraction, réalisées de la façon décrite dans les exemples précédents et en présence de cellulase, mais à différentes températures. La quantité de cellulase GC440 ajoutée représente 0,027 % du poids de l'orge mondé, et la température vaut 20 C, 25 C, 30 C ou 40 C. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1, où l'on peut voir que c'est à la température de 30 oC que l'on obtient les meilleurs résultats.

Exemple 5
Dans cet exemple, on étudie l'effet d'une cellulase sur le rende- ment de l'extraction de p-amylase de blé.

On soumet 10 kg de semoule de blé, dont l'activité de P-amylase vaut 128 UPD/g, à une extraction effectuée avec 15 litres d'eau contenant
0,5 % de métabisulfite de sodium et 0,5 % de sulfite de sodium, à la tempé- rature de 30 C, en l'absence ou en présence de cellulase.

On fait durer pendant 72 heures l'opération d'extraction effectuée

en l'absence de cellulase. L'activité totale de ss-amylase contenue dans la quantité de blé employée vaut 1280. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 9175 ml d'extrait dont l'activité

vaut 55 UPD/ml, soit une activité totale de 504, 6. 103 UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en l'absence de cellulase vaut donc 39, 4 %.

On effectue une opération similaire d'extraction, mais en présence de cellulase, c'est-à-dire après avoir ajouté de la cellulase GC440 en une quantité représentant 0,036 % du poids de semoule de blé, et l'on fait durer cette extraction pendant 60 heures. L'activité totale de p-amylase contenue dans la quantité de blé employée vaut 1280. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 10080 ml d'extrait dont l'activité vaut 72 UPD/ml, soit une activité totale de 725,8. 103UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en présence de cellulase vaut donc 56,7 %.

Ces résultats montrent que le fait d'ajouter de la cellulase à l'eau employée pour l'extraction provoque une augmentation très nette du rendement de l'opération d'extraction de 3-amylase.

Exemple 6
Dans cet exemple, on étudie l'effet d'une cellulase sur le rendement de l'extraction de {3-amylase de blé poli.

A l'aide d'une machine de polissage de riz, on polit du blé en brisant la surface des grains et en en enlevant la partie le plus externe, c'est-àdire qu'on enlève la majeure partie du péricarpe des grains tout en laissant presque intact leur tégument. On soumet 10 kg de blé poli, dont l'activité de P-amylase vaut 128 UPD/g, à une extraction effectuée avec 15 litres d'eau contenant 0,5 % de métabisulfite de sodium et 0,5 % de sulfite de so-

dium, à la température de 30 C, en l'absence ou en présence de cellulase.

On fait durer pendant 72 heures l'opération d'extraction effectuée en l'absence de cellulase. L'activité totale de p-amylase contenue dans la quantité de blé employée vaut 1280. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 9780 ml d'extrait dont l'activité vaut 15 UPD/ml, soit une activité totale de 146,7. 103 UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en l'absence de cellulase vaut donc 11, 5%.

On effectue une opération similaire d'extraction, mais en présence de cellulase, c'est-à-dire après avoir ajouté de la cellulase GC440 en une quantité représentant 0,036% du poids de blé poli, et l'on fait durer cette extraction pendant 60 heures. L'activité totale de ss-amylase contenue dans la quantité de blé employée vaut 1280. 103 UPD. En séparant l'extrait par filtration à l'aide d'un tamis, on récupère 9250 ml d'extrait dont l'activité vaut 35 UPD/ml, soit une activité totale de 323,8. 103 UPD pour l'extrait obtenu. Le rendement d'extraction en présence de cellulase vaut donc 25, 3 %.

Ces résultats montrent que le fait d'ajouter de la cellulase à l'eau employée pour l'extraction provoque une augmentation très nette du rendement de l'opération d'extraction de ss-amylase.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'extraction de P-amylase de céréale, caractérisé en ce que l'on soumet un produit céréalier à une opération d'extraction en milieu aqueux, en présence d'une cellulase, pour obtenir un extrait contenant de la (3-amylase.

2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait de la p-amylase d'orge ou de blé.

3. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on extrait de la P-amylase d'orge mondé.

4. Procédé conforme à l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'opération d'extraction est effectuée dans des conditions réductrices.

5. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que l'on extrait de la {3-amylase d'orge mondé au moyen d'eau sulfitée, employée en une proportion (de l'orge mondé à l'eau sulfitée) valant de 5/8 à 2/3.

6. Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue l'opération d'extraction à une température qui vaut de 25 à 33 oC, et de préférence, de 29 à 31 oC.

7. Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'opération d'extraction dure de 48 à 66 heures, et de préférence, de 55 à 62 heures.

8. Procédé conforme à l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on y emploie une cellulase issue d'une moisissure.

9. Procédé conforme à la revendication 8, caractérisé en ce que l'on y emploie une cellulase issue d'une moisissure du genre Trichoderma.

10. Utilisation d'une cellulase dans l'extraction de {3-amylase de céréale.