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La présenta in-vention se rap:porte à -U'O. -p-roee-d8 de traitement de préparations enzymiques à activité al1lylasique et à un procédé perfectionné de préparation d'hydrolysats
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dU amidon contenant une concentration exceptionnellement élevée de dextrose au moyen de ces préparations.
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Les préparations d'amylase provenant de mioroorganimes des groupes WUft.l1ig et Aspergillug flavus-o ryz ae
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sont abondamment utilisées dans l'industrie, par exemple Pour la saccharification enzymique de l'amidon partiellement hydrolysé de manière à former des sirops contenant:du dextrose.
Toutefois,l'expérience a montré que.la formation de polymères de dextrose non,fermentescibles était suffisante pour limiter l'intérêt de ces pr.prations, en particulier dans la production de dextrose pur cristallisé. C'est ce qui ressortira de la discussion qui suit.
Les préparations d'amylase d'origine mierobiologique, en particulier celles qui proviennent des microorganismes des espèces Aspergillus niger et Aspergillus flavus-oryzae du genre Aspergillus contiennent trois types principaux d'activité enzymique en rapport avec l'hydrolyse des polymères de glucose à liaison alpha-1.4. Ces trois types d'activité peuvent être classés en activité alpha-amylase, activité gluc-amylase (maltase) et activité transglucosidase.
L'action de l'alpha-amylase sur les empois d'amidon provoque une réduction considérable de la viscosité. En l'absence de quantités appréciables d'activité gluc-amylase'(maltase), l'action de l'alpha-amylase produit des quantités considérables de maltose.
L'action de la gluc-amylase sur l'amidon et/ou le maltose a pour résultat la formation de dextrose. Ce type d'action a été également dénommé activité maltase, activité amyloglucosidase, activité- glucogène ou activité amidon-glucogénase.
L'activité de la transglucosidase a pour résultat la formation, particulièrement à partir du maltose, de polymères infermentescibles du dextrose contenant des liaisons alpha-1.6- Biophys. glucosidiques. Pan et autres [Arch. Biochem./42, 421-434 (1953) ont essayé l'activité de la transglucosidase provenant de diver-
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ses préparations enzymiques de laboratoire et industrielles et ont constaté que ces préparations d'amylase fongique manifestaient une activité transglucosidase considérable.
Pazur et
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French [J.Biol.0hem, 196, 265-272 ( 19: ) ont montré que l'ac- tion la plus probable de la transglucosidase était le transfert d'un radical glucosyle du maltose à la position 6 d'une molécule de gluose ou à la position 6 de l'extrémité non-réductrice d'une molécule de maltose, ce qui donne respectivement de l'iso-
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maltse (6-{alpha-D-gluc.opyranosyl) -D-glucose) et du panose AI' (4-(6-(alpha-D-glucopyranosyl)-alpha-D-glucopyranosyl)-D-glucose,
De la description ci-avant de l'action de la transglucosidase, il est facile de voir que parmi les facteurs qui limitent le rendement en dextrose, que l'on peut obtenir par
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saccharification,au moyen d'amylase fongioue.,
des matières amylacé.esfigure la re-synthèse enzymique d'hydrates de carbone non- fermentescibles et qui ne sont pas hydrolysés en dextrose à un taux appréciable par les enzymes présentes dans la préparation enzymique.
Dans les procédés antérieurs d'obtention du dextrose cristallisé à partir des matières amylacées, le rendement en
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dextrose-,pur susceptible d'être obtenu par évaporation; et cristallisations successives des liqueurs contenant du dextrose pro- venant de l'hydrolyse, enzymique ou acide, de l'amidon, est limité par l'accumulation d'impuretés dans les liqueurs-mères'. Dans les liqueurs provenant d'hydrolyse par les acides, ce sont essentiellement des produits de réversion et des cendres, Dans les liqueurs provenant d'hydrolyse au moyen de préparations d'amylase,
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leg impuretés comprennent les polymères synthétiques du dextrose provenant de l'action de la transglucosidase et de l'hydrolyse
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incomplète des matières amylaoéee.
La présente invention se propose d'éliminer l'activité transglucosidase des préparations d'amylase de manière augmente;
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l'efficacité et l'utilité de ces préparations. Elle se propose aussi de fournir un procédé perfectionné d'hydrolyse de l'amidon ou de ses produits de conversion en liqueurs contenant du dextrose possédant une concentration exceptionnellement élevée de dextrose au moyen de préparationsperfectionnées d'amylase de ce type. D'autres buts apparaitront au cours de la description qui suit. '
La présente invention fournit un procédé d'élimina- tion de l'activité transglucosidase des préparations d'amylase fongique, comprenant le traitement de ladite préparation en milieu aqueux au moyen d'un minéral argileux et la séparation dudit milieu du minéral argileux.
La présente invention fournit en outre un procédé d'hydrolyse de l'amidon en dextrose, comprenant la dilution de l'amidon, puis sa soumission à l'action d'une préparation d'amylase fongique dont l'activité transglucosidase a été éliminée par traitement à l'aide d'un minéral argileux.
Toutes les préparations d'amylase fongique examinées par la demanderesse contiennent d'appréciables quantités d'ac- tivité-transglucosidase, mesurée par l'importance de la synthèse de sucres non fermentescibles provenant du maltose. Il a été en outre constaté que le rapport transglucosidase/gluc-amylase dans la préparation enzymique, mesuré comme il est dit dans la suite, affecte fortement la quantité de dextrose que l'on peut obtenir à partir de l'amidon partiellement hydrolysé par hydro- lyse au moyen de la préparation enzymique.
Détermination de l'activité gluc-amylase.
Le substratum est un hydrolysat acide d'amidon-de mais, séché par pulvérisation, ayant un équivalent en dextrose de 15 à 18. On dissout cette matière dans l'eau et on la dilue à 4 gr de matière sèche pour 100 ml de solution. On prélève à
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l'aide d'une pipette exactement 50 ml de la solution qu'on pla- ce dans une fiole jaugée de 100 ml. On y introduit 5 ml d'un tampon 1,0 molaire d'acétate de sodium-acide acétique de pH 4,3.
On place la fiole dans un bain-marie , 60 C et, au bout de dix minutes, on ajoute la quantité appropriée de préparation enzymi- que. Exactement deux heures après l'addition.de la préparation enzymique,on règle la solution au virage de la phénol-phtaléine à l'aide d'hydroxyde de sodium normal. On refroidit alors la solution à la température ambiante et on étend au trait de repère. On détermine le taux des sucres réducteurs} calculé . en dextrose, sur un échantillon dilué et sur un témoin ne con- tenant pas de préparation enzymique.
L'activité gluc-amylase se calcule comme suit :
A = S - B/2 x E
Dans cette équation, A est l'activité glud-amylase en unités par ml ou par gramme de préparation enzymique, S est la quan- tité de sucres réducteurs présente dans l'échantillon converti, en grammes pour 100 ml, B est la quantité de sucres réducteurs dans le témoin, en g/100 ml, et 3 est la quantité de préparation enzymique utilisée, en ml ou grammes -La concentration en sucres réducteurs dans l'échantillon d'hydrolysat enzymique converti ne doit pas dépasser 1 gr pour 100 ml.
Détermination de l'activité transglucosidase.
On prépare une solution de maltose en dissolvant
200 gr de maltose Pfanstiehl chimiquement pur dans de l'eau et en diluant à 500 ml. On prélève exactement 50 ml de la solution qu'on place dans une fiole jaugée de 100 ml. On ajoute au ballon
5 ml de tampon 1,0 molaire d'acétate de sodium-acide acétique de pH 4,3.Après mélange) on ajoute une quantité de préparation enzymique contenant 2,8 unités d'activité gluo-amylase. On place la fiole dans un bain-marie à 60 C. Au bout de soixante-douze heures; on place la.fiole-,-dans un bain-marie bouillant pendant un
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quart d'heure, puis on refroidit et on transfère quantitative- ment le contenu dans un bécher de 150 ml.
On règle la solution à pH 4,8 au moyen d'une solution normale d'hydroxyde de sodium, on transfère dans un Erlenmeyer de 500 ml et on étend à environ 200 ml. On ajoute alors 10 gr de levure sèche active de Fléis- chmann et on secoue la fiole de manière continue pendant cinq heures à 30 C. On transfère alors le contenu dans une fiole jau- gée de 250 ml et on étend au repère. On centrifuge ensuite 200 ml du liquide à 2000 tours/minute pendant quinze minutes et on décante la liqueur surnageante dans une fiole sèche. On prélève à l'aide d'une pipette 50 ml de cette liqueur qu'on place dans un tube à essais, on ajoute 5 ml d'acide chlorhydrique normal,- on bouche non hermétiquement le tube et on le chauffe au bain- marie bouillant pendant trois heures; puis on le refroidit au bain de glace.
On transfère le contenu du tube dans une fiole jaugée de 100 ml et on ajoute de l'hydroxyde de sodium normal jusqu'au virage de la phénolphtaléine. On détermine la valeur en sucres réducteurs,calculée en dextrose, sur une partie aliquo te de la solution finale. Pour obtenir une correction pour les sucres réducteurs contenus dans la levure, on fait une opération témoin sur 20 gr de dextrose pur au lieu de maltose, sans ajou- ter d'enzyme. La valeur en sucres réducteurs de l'échantillon hydrolysé par l'enzyme, corrigée pour les sucres réducteurs dus à la levure, représente la matière non fermentescible dont la synthèse a été faite par la préparation enzymique. On calcule les résultats en grammes de sucres non fermentescibles synthé- tisés à partir de 100 gr d'hydrate de maltose ajoutés.
Attendu que les deux enzymes, la gluc-amylase et la transglucosidase, agissent sur le même substratum (maltose), les résultats ci-avant peuvent être exprimés comme le rapport de l'activité gluc-amylase à l'activité transgluoosidase. On ob- tient ce rapport en divisant le nombre de grammes de sucres' non- fermentescibles dont¯la synthèse a été opérée pour-cent grammes
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d'hydrate de maltose par 100, moins cette valeur.
Il a été découvert que,dans l'hydrolyse enzymioue des matières amylacées dans des conditions pratiquer la quantité de dextrose finalement formée est régie par ce rapport de l'ac-
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tivité transglucosidase à l'activité gluc-anjylase/.Il a en. outre été découvert que toutes les prépârations enzymiques d'origine fongique examinées par la demanderesse manifestaient des rapports. transglucosidase/gluc-amylase de l'ordre de 0,2-0,1
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environ.
Ces préparations enzymiques fongiques,,utilis6es dans les conditions pratiques de concentration de substratum, de quantité d'enzyme et de durée d'actioconvertss@rit les hydro- lysats partiels d'amidon en hydrolysats contenant de l'ordre de 84 à 90% de dextrose, rapportés à la teneur en.manière sèche
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de 3'hydrolysat.
Les inconvénients des procédés antérieurement propos sés en vue de production du dextrose comportant une hydrolyse enzymique des matières amylacées sont multiples. Pour obtenir un degré élevé. de transformation, des matières, amylacées en
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dextrose,, on utilisait des: concent-i-atîons, s5; faibles, de matière amylacée que le coût de 11évaporation, Tendait ces; procêâês: dépourvus de valeur- économique, Di'autres procédés faisaient appel à des préparations enzymique. très; pures.. Dans ce cas le coût de la purification de la matière enzymiques et la perte d'activité enzymique survenant au cours du processus.de. puri- fication amèneraient à un prix de revient prohibitif de¯ la préparation enzymique.
La demanderesse a fait cette découverte surprenante qu'il était possible d'éliminer Inactivité transglucosidase des préparations d'amylase fongique, de manière sensiblement
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complète, ce qui diminue considérablement le rapport transgluoo"' sidase g3.ucamylase, par traitement de ) la préparation damylase
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au moyen d'un minéral argileux. Il a été également découvert que les préparations d'amylase traitées de cette manière pro- duisaient des rendements exceptionnellement élevés en dextrose quand on les appliquait à l'hydrolyse des matières amylacées dans les conditions pratiques.
Les préparations enzymiques qui convertissent les matières amylacées en hydrolysats.ne conte- nant que 85 à 86% de dextrose (en produit sec) donnent,, après traitement au moyen d'un.minéral argileux;des hydrolysats con- tenant jusqu'à 93 à 94% de dextrose, à l'état sec.
L'importance de ce perfectionnement est manifeste si l'on se rend compte que le rendement en dextrose pur cristallisé ' susceptible d'être obtenu à partir d'hydrolysatsde matières amylacées,est en général régi par la quantité de matières non-, dextrose présentes dans l'hydrolysat. Chaque partie d'impureté non-dextrose présente dans l'hydrolysat empêche la récupéra- tion d'un poids sensiblement égal de dextrose.
C'est ainsi que le rendement en dextrose cristallisé pur, exprimé en produit anhydre, que l'on peut obtenir économiquement par cristallisa- ts tion à partir d'hydrolysa' de teneur variée en dextrose est le suivant :
Teneur en-dextrose de l'hydrolysat, pour cent en produit sec 86 88 90 92 94
Dextrose récupérable, anhydre, % matière sèche de l'hydrolysat 72 76 80 84 '88
Pour chaque unité pour cent d'augmentation de la te- neur en dextrose de l'hydrolysat on observe une augmentation de
2% du rendement en dextrose. L'importance de l'augmentation de la teneur en dextrose de l'hydrolysat enzymique est manifeste.
Le fait de traiter des préparations enzymiques ou de tenter de séparer des enzymes à l'aide de minéraux argileux n'est pas nouveau. Toutefois, aucune des pratiques antérieures n'a cherché directement à résoudre le présent problème. Les
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techniques antérieures ont visé à utiliser les minéraux argileux pour enlever les protéines extérieures ou ont consisté à les utiliser au laboratoire pour isoler des enzymes pures.
Aucune des techniques antérieures ne s'est préoccupé de l'élimination de la transglucosidase des préparations d'amylase à . l'aide des minéraux argileux, non plus qu'elles ne signalent la possiblité d'élimination de la transglucosidase des préparations d'amylase par traitement au moyen d'un minéral argileux,.
Aucune des techniques antérieures ne s'est proposé d'éliminer la transglucosidase des préparations enzymiques pour augmenter le rendement en dextrose obtenu à l'aide de la préparation enzymique dans 1 'hydrolyse des matières amylacées. En tout cas, la demanderesse ne connaît aucun cas où l'activité transglucosidase ait été éliminée de manière sensiblement quantitative des préparations enzymiques sans perte d'activité enzymique désirable,, comme celle de la glue-amylase et de l'alpha-amylase.
Dans la mise en oeuvre de l'invention, on commence par traiter la préparation enzymique en ajoutant .un minéral argileux à une solution ou suspension de la préparation enzymi- que. Il est toutefois préférable, mais non indispensable, d'en- lever d'abord les solides insolubles éventuellement présents. dans la suspension de préparation enzymique.
La préparation en- zyraique peut consister en la liqueur de culture entière -obtenue par culture submergée d'un microorganisme producteur d'amylase, en la liqueur clarifiée obtenue à l'aide de la culture submergée, en la suspension d'une préparation séchée ou partiellement séchée pouvant contenir du son, de l'amidon ou divers autres adultérants utilisés pour la standardisation de la préparation d'amylase ou en la solution d'une préparation enzymique complètement soluble. Après l'addition du minéral argileux à la solution ou suspension'de la préparation enzymique, le mélange est agité, mzuis les phases solide et liquide sont séparées.
L'activité transglu-
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cosidase reste dans la phase solide alors que les carbo-hydrases désirables, comprenant par exemple la gluc-amylase et l'alpha- amylase, restent dans la phase liquide.
La préparation enzymique liquide ainsi obtenue, dans laquelle l'activité originale de la gluo-amylase et de l'alpha- amylase est conservée, peut alors être utilisée directement pour l'hydrolyse des matières amylacées ou peut être traitée d'une manière connue pour obtenir une préparation enzymique solide.
D'une manière générale, on peut utiliser un minéral' argileux quelconque pour l'élimination de l'activité transgluco-' sidase. En tant que groupe, les minéraux argileux sont des "si- - licates d'alumine". Les minéraux argileux principaux sont clas- sés en Montmorillonite, Attapulgite, Kaolinite et Illite..; D'autres sont la terre à foulon, la floridine, la bentonite, la. sous-bentonite, l'argile réfractaire, le. kaolin et la figuline.- Pour les détails, voir la feuille de renseignements- n 204, American Collold Company (1945); Industriel Minerais and Rocks, Amer. Inst. Mining and Mat, Eng. (éd. 1949). La quantité de mi- néral argileux utilisée dans le traitement de l'enzyme doit être d'au moins 0,5 gr pour 100 ml de préparation enzymique.
Il n'y a pas de limite supérieure, mais il n'est pas avantageux d'utiliser plus de 5 gr de minéral argileux pour 100 ml de pré- paration enzymique.
D'une manière générale, le traitement de la prépara- tion enzymique conformément à l'invention doit être effectué à un pH auquel l'enzyme désirée est stable. Comme certains miné- raux argileux peuvent modifier le pH, il peut être nécessaire de le régler. Dans le cas d'Aspergillus niger, il est préférable de traiter les filtrats de culture (exemples I à VI) au moyen - de l'argile à un pH compris entre 3,5 et 4,5.
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La durée du traitement à l'aide du minéral argileux n'est. pas critique, à la condition que l'argile soit bien dispersée dans la préparation enzymique.
Quand on effectue l'hydrolyse de l'amidon au moyen -le la préparation enzymique traitée, il est usuellement préférable de fluidifier d'abord l'amidon par un procédé' connu,, 0' est.. à-dire par l'hydrolyse acide partielle ou à l'aide d'une enzyme luiquéfiante,telle que l'alpha-amylase bactérienne. L'hydrolyse de l'amidon ainsi réduit de viscosité par la préparation enzymique traitée doit être effectuée dans des conditions de pH et de température conduisant à la formation des produits désirés. Dans le cas d'hydrolyse de l'amidon fluidifié, des valeurs de pH de 3,5 à 5,5 sont satisfaisantes. L'hydrolyse terminée, la liqueur de dextrose peut être raffinée, concentrée et cristallisée de la manière usuelle.
Le traitement de l'enzyme est particulièrement avantageux quand on l'applique aux liqueurs entières ou aux filtrats des liqueurs de culture obtenues à l'aide de microorganismes du genre Aspergillus en culture aérobie submergée. Ces liqueurs de culture sont des sources très économiques des enzymes désirées et, après traitement au moyen d'un minéral argileux,peuvent être utilisées directement pour la conversion des matières amylacées avec des rendements élevé s en dextrose sans avoir recours à desprocédés' de purification compliqués ou coûteux ou à l'usage de faibles concentrations en amidon.
Il est particulièrement avantageux en ce que lehoix de la souche de microorganisme, des constituants du milieu et des conditions de développement peut être effectué en fonction de la production maximum de gluc-amylase, indépendamment de la quantité d'activité de transglucosidase produite.
Il résulte de ce qui précède et des exemples qui
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suivent que la présente invention apporte un perfectionnement net à la technique à l'aide d'un moyen simple, peu coûteux et toutefois très efficace. Le rendement en dextrose est augmenté sensiblement, pratiquement sans augmentation de prix et' sans opé- rations compliquées.
Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ils ne sont nullement limitatifs.
EXEMPLE I
On soumet une culture d'Aspergillus niger de la Corn Products Refining Company, Res.earch, and Development Départment, Culture n 11-370, isolée d'un échantillon de terre de la Louisiane, à la fermentation dans des conditions aérobies submergées au sein d'un milieu composé de 14% de mais broyé et 1% d'extrait soluble du maïs, (base sèche). La fermentation terminée, on filtre la liqueur pour enlever le mycélium et autres matières en suspension. On divise le filtrat en plusieurs parties.
A des portions de 100 ml du filtrat de culture, on ajoute, en agitant, 5 gr de minéral argileux finement divisé. Au bout de trente minutes d'agitation/on sépare l'argile par filtration. On évalue l'activité gluc-amylase dés filtrats ainsi obtenus ainsi que l'activité alpha-amylase et l'activité transglucosidase. Il n'y a pas de diminution de l'activité alphaamylase.
Cet exemple montre que les minéraux argileux en tant que groupe éliminent efficacement et sélectivement l'activité transglucosidase sans enlever de quantités appréciables d'acti- 'vité gluc-amylase. On doit noter que, bien que la préparation traitée à l'argile manifeste un léger-degré d'activité transglucosidase selon le procédé utilisé, cette valeur peut être due au moins partiellement à des impuretés non fermentescibles: présentes dans le maltose plutôt qu'à une activité de transglucosidase.
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TABLEAU I
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<tb> Activité <SEP> enzymique <SEP> du <SEP> filtrat
<tb> Argile <SEP> minérale <SEP> Composant <SEP> minéral <SEP> Traitement <SEP> Gluc-amylase <SEP> Transglucosidase/
<tb> (Dénomination <SEP> principal <SEP> Type <SEP> de <SEP> u/ml. <SEP> glue-amylase
<tb> commerciale) <SEP> l'argile <SEP> Avant <SEP> Apres <SEP> Avant <SEP> Après
<tb> trai- <SEP> trai- <SEP> trai- <SEP> trai-
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement
<tb> 1. <SEP> Dontonite <SEP> Volclay <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> gonflante <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 2. <SEP> Panther <SEP> Creek <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> non-gonflante <SEP> " <SEP> 2,08 <SEP> 2,01 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 3.
<SEP> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> Montmorillonite <SEP> -- <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 4. <SEP> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> Montmorillonite <SEP> -- <SEP> Imprégné <SEP> 2,08 <SEP> 1,89 <SEP> 0,16 <SEP> 0,03
<tb> 5. <SEP> Filtrol <SEP> 105 <SEP> Montmorillonite <SEP> Sous-bentonite <SEP> Activité <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,06
<tb> par <SEP> acide
<tb> 6. <SEP> Pikes' <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> Montmorillonite <SEP> Terre <SEP> à <SEP> foulon <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1,91 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 7. <SEP> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> Montmorillonite <SEP> d <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 1,93 <SEP> 0,16 <SEP> 0,07
<tb> 8. <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> Floridine <SEP> -- <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1 <SEP> ,96 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 9.
<SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> calciné <SEP> Floridine <SEP> -- <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 1,89 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 10. <SEP> Attapulgite <SEP> Attapulgite <SEP> Terre <SEP> à <SEP> foulon <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1,91 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 11. <SEP> Bandy <SEP> Tan <SEP> Kaolinite <SEP> Figuline <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,97 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 12. <SEP> Argile <SEP> réfractaire <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP>
<tb> d'Illinois <SEP> Kaolinite <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,98 <SEP> 0,16 <SEP> 0,13
<tb> 13. <SEP> Grundite <SEP> Illite <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,92 <SEP> 0,16 <SEP> 0,07
<tb>
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EXEMPLE II
On utilise les filtrats traités provenant de l'exemple ±. pour hydrolyser un hydrolysat partiel d'amidon de la manière suivante.
On soumet à l'hydrolyse acide une suspension à 55% en poids d'amidon de mais jusqu'à un équivalent dextrose de 16.
(L'équivalent dextrose est la teneur en sucre réducteur de l'hydrolysat calculé en dextrose et exprimé en pourcentage en' poids de la substance sèche présente). L'amidon fluidifié est réglée à pH 4,5, amené à 60 C. et additionné d'une quantité de préparation enzymique calculée pour contenir 14 unités d'activité gluc-amylase pai 100 gr d'amidon fluidifié sec. Au bout de soixante-douze heures d'incubation à 60 C, on :titre l'équivalent en dextrose des liqueurs et la teneur en dex- trose. On obtient les résultats ci-après.
Cet exemple montre l'amélioration obtenue dans le de- gré de conversion en dextrose de l'amidon fluidifié au moyen de filtrats de culture d'Aspergillus niger après élimination de l'activité transglucosidase par traitement du filtrat de cul- ture à l'aide d'un minéral argileux.
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<tb>
<tb> composition'de <SEP> la <SEP> liqueur <SEP> après
<tb> conversion <SEP> enzymique
<tb> Argile <SEP> minérale <SEP> utilisée <SEP> E.D.
<SEP> % <SEP> dextrose <SEP> (Base
<tb> @@ <SEP> @ <SEP> sèche)
<tb> Néant <SEP> 92,0 <SEP> 86,4
<tb> Bentonite <SEP> Vololay <SEP> 95,5 <SEP> 93,0
<tb> Panther <SEP> Creek <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> 95,5 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> 96,2 <SEP> 94,2
<tb> Filtrol <SEP> 105 <SEP> 95,0 <SEP> 92,1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> 95,6 <SEP> 93,1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> 94,8 <SEP> 91,8
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> 95,5 <SEP> 93,0
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> calciné <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Attapulgite <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Bandy <SEP> Tan <SEP> 95,6 <SEP> 93,1
<tb> Argile <SEP> réfractaire <SEP> de <SEP> l'Illinois <SEP> 92,9 <SEP> 88,7
<tb> Grundite <SEP> 94,9 <SEP> 92,0
<tb>
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'''.
'.E , III On cultive de l'àspersillug ni er yJL-30 dans une cuve-,,de fermentation comme il est décrit dans l'exemple I. La fermenta- tion terminée)on enlève la liqueur totale de culture de la cuve et on la divise en quatre portions de 100 ml. La première por- tion est laissée aans traitement. La seconde portion est agitée et additionnée de deux grammes: de l'argile de marque déposée "Volclay Bentonite". On filtre le mélange contenant le mycélium et l'argile et on rejette le gâteau de filtre. On filtre la troisième partie sans traitement argileux. On filtre la quatriè me partie, on agite le filtrat et on l'additionne de 2 gr de bentonite Volclay. On filtre alors la suspension.
On effectue , l'aide de ces quatre préparationsdes conversions à une valeur E.D. e 16 d'amidon fluidifié, comme il est dit dans l'exemple
EMI15.2
lle i²J;' exemple, illustre l'application de l'invention à une li- queur de culture, ;non filtrée.
EMI15.3
<tb>
<tb>
Filtration <SEP> de <SEP> Traitement <SEP> 'Activité <SEP> Composition <SEP> de <SEP> la <SEP> lila <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> par <SEP> glu-c <SEP> queur <SEP> après <SEP> hydrolyse
<tb>
EMI15.4
culture l'argile amylase, enzymique¯¯¯¯¯¯¯¯ u/ml E.D. % dextrose ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ sec.
Non filtrée 2,30 91,1 .8;,7 3 a,z4 95,3 92,3
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<tb>
<tb> Filtrée <SEP> 0 <SEP> 2,30 <SEP> 92,1 <SEP> 86,,1
<tb> 2,35 <SEP> 95,5 <SEP> 92,8
<tb>
EXEMPLE IV
Cet exemple illustre l'effet exercé par différentes quantités d'argile. La préparation enzymique utilisée est un
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filtrat d'une culture submergée â As.¯T erillus ni er lL-3'7 Le traitement par l'argile est effectué comme dans l'exemple 1
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<tb>
<tb> Quantité <SEP> d'argile <SEP> utilisée, <SEP> gr <SEP> pour <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> de <SEP> préparation <SEP> enzymique
<tb> 5,0 <SEP> 2,0 <SEP> 1,0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,2 <SEP> 0,0
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> de <SEP> la <SEP> liqueur-après
<tb> Argile <SEP> utilisée <SEP> hydrolyse <SEP> enzymique, <SEP> @ <SEP> (base <SEP> sèche)
<tb> Bentonite <SEP> Volclay <SEP> 94,0 <SEP> 93,
.3 <SEP> 93,1 <SEP> 93,0 <SEP> 88,5 <SEP> 86,5
<tb> Attapulgite <SEP> 93,3 <SEP> 92,0 <SEP> 92,1 <SEP> - <SEP> - <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> 93,0 <SEP> 93,6 <SEP> 91,6
<tb> Panther <SEP> Oreek <SEP> 93,3 <SEP> 93,6 <SEP> 89,1 <SEP> 86,9
<tb>
EXEMPLE V
Cet exemple montre l'effet exercé par le pH sur le trai- tement des enzymes au moyen des minéraux argileux. On règle le pH aux valeurs données ci-après-de portions séparées d'un filtrat de culture provenant d'une culture submergée d'Asper- de gillus niger,au moyen d'acide .chlorhydrique ou d'hydroxy de a sodium. A chqueportion de 100 ml, on ajoute 2 gr de bentonite Volclay.
On agite les mélanges pendant trente minutes et on les filtre.i les résultats des hydrolyses effectuées au moyan des préparations enzymiques traitées. pH avant addition de l'argile 5,0 4,5 '4,0 3,0 2,4 2,0 pH du filtrat après traitement 5,2 4,6- 4,0 3,1 2,5 2,2 Activité gluc-amylase du filtrat, u/ml 2,17 2,24 2,33 1,76 1,03 0,62 Composition de la liqueur après hydrolyse enzymique E.D. 92,5 95,0 95,5 95,6 95,3 94,8 Dextrose (base sèche) 87,9 92,1 93,0 93,2 92,7 91,9 La composition de l'amidon fluidifié après hydrolyse au moyen de la préparation enzymique non traitée est de 91,4 E.D. et de 85,9 de dextrose (base sèche) .
EXEMPLE VI
Cet exemple montre l'application de l'invention à d'au- tres "souches d'Aspergillus niger et à d'autres membres de l'ex pèce Aspergillus niger. Les préparations enzymiques utilisées
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sont .des filtrats de cultures préparées par fermentation submergée comme il est décrit dans l'exemple I. On traite une portion de chaque filtrat de culture au moyen de 2% de Bentonite Volelay comme il est décrit dans l'exemple I. L'hydrolyse de 1-'amidon fluidifié est effectuée comme il est décrit dans l'exemple II.
Les cultures décrites sous NRRL 330 et NRRL 337 ont été étudiées d'une manière très poussée en vue de la produc- tion de l'amylase [Tsuchiya et autres, Cereal Chem. 27, 322 (1950)).
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<tb>
<tb>
Activité <SEP> glue-amylase <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose
<tb> du <SEP> filtrat, <SEP> de <SEP> la <SEP> liqueur <SEP> après,
<tb> u/ml <SEP> hydrolyse <SEP> enzymique,
<tb>
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¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ % base sèche '
EMI17.3
<tb>
<tb> Trmitement <SEP> à <SEP> l'argile <SEP> Avec <SEP> Avec
<tb> Avant <SEP> Après <SEP> enzyme <SEP> enzyme
<tb> Culture <SEP> Avant <SEP> Apres <SEP> traitée <SEP> non <SEP> traitée
<tb>
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Aspergillus nioei 11-570 2,30 233 86,1 92,8 àspeSliRs. niger 1liU 330 1,85 ?,&0 86,3 9a,7 Aspergillus ±Qg NRRL 53'? 2,04 2,&7 87,3 92 po
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<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> phoenieis
<tb> M-381 <SEP> . <SEP> 1,70 <SEP> 2,03 <SEP> 88,8 <SEP> 91,5
<tb>
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1.JLL7:
a'il.C3.9 VII
Les préparations industrielles d'enzymes de moisissures destinées à la saccharification de l'amidon sont ordinairement obtenues par développement d'un membre de l'espèce Aspergillus flavus-oryzae du genre Aspergillus sur du son humide. La culture est épuisée à l'aide d'eau ou d'une solution salée. La matière à activité enzymique est précipitée de l'extrait par addition d'un solvant miscible à l'eau, le précipité est séché puis mélangé avec un ingrédient inerte de manière à obtenir une préparation d'activité standard. La préparation est vendue ou utilisée sous cette forme. Ces préparations enzymiques sont mises séparément en suspension dans l'eau, les suspensions,. .1
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sont réglées à pH 4 et filtrées.
A 100 ml de chacun des fil- trats,on ajoute 5 gr de bentonite de Volclay et on filtre les suspensions au bout de trente minutes d'agitation ..L'hydro- lyse de l'amidon fluidifié est effectuée à 50 C., pH 4,6-4,8 pendant soixante-douze heures. On effectue des conversions séparées à l'aide de préparations enzymiques traitées et non traitées en utilisant une quantité de préparation enzymique équi- valent à 14 unités de gluc-amylase pour 100 gr d'amidon sec fluidifié. Le tableau VII montre les résultats obtenus par application de l'invention à plusieurs préparations enzymiques,.- solides purifiées. Les préparations originales sont remises en suspension avant usage.
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TIBLEAU VII
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<tb> Activité <SEP> gluo <SEP> -amylase <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> d <SEP> la <SEP> liqueur
<tb> à <SEP> 50 C, <SEP> u/g <SEP> de <SEP> prépa- <SEP> après <SEP> hydrolyse <SEP> enzymque
<tb> ration <SEP> enzymioue <SEP> % <SEP> pids <SEP> base <SEP> che
<tb> Après <SEP> trait.
<SEP> Avec <SEP> préparation <SEP> Avec <SEP> préparation
<tb> Préparation <SEP> Source <SEP> Originale <SEP> argile <SEP> originale <SEP> Argile <SEP> traitée <SEP>
<tb> enzymique
<tb> Enzyme <SEP> AW <SEP> Ba) <SEP> 4,54 <SEP> 3,34 <SEP> 80,1 <SEP> 86,9
<tb> Shozyme <SEP> Sb) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 11,8 <SEP> 11,8 <SEP> 86,6 <SEP> 92,1
<tb> Dextrinase <SEP> a) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 15,0 <SEP> 14,7 <SEP> 87,7 <SEP> 91,3
<tb> Diastase <SEP> 32b) <SEP> -.- <SEP> 53,3 <SEP> 51,4 <SEP> 90,8 <SEP> 91,9
<tb> Mylase <SEP> c) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-cryzae <SEP> 13,5 <SEP> 13,2 <SEP> 91,5 <SEP> 92,8
<tb> a) <SEP> marque <SEP> déposée <SEP> d'un <SEP> produit <SEP> vendu <SEP> par <SEP> Takamine <SEP> Laborstories'
<tb> b)
<SEP> marque <SEP> déposée <SEP> d'un <SEP> produit <SEP> vendu <SEP> par <SEP> Rohm <SEP> & <SEP> Haas <SEP> Company
<tb> c) <SEP> marque <SEP> déposée <SEP> vendue <SEP> par <SEP> Wallerstein <SEP> Company.
<tb>