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La présenta in-vention se rap:porte à -U'O. -p-roee-d8 de traitement de préparations enzymiques à activité al1lylasique et à un procédé perfectionné de préparation d'hydrolysats
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dU amidon contenant une concentration exceptionnellement élevée de dextrose au moyen de ces préparations.
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Les préparations d'amylase provenant de mioroorganimes des groupes WUft.l1ig et Aspergillug flavus-o ryz ae
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sont abondamment utilisées dans l'industrie, par exemple Pour la saccharification enzymique de l'amidon partiellement hydrolysé de manière à former des sirops contenant:du dextrose.
Toutefois,l'expérience a montré que.la formation de polymères de dextrose non,fermentescibles était suffisante pour limiter l'intérêt de ces pr.prations, en particulier dans la production de dextrose pur cristallisé. C'est ce qui ressortira de la discussion qui suit.
Les préparations d'amylase d'origine mierobiologique, en particulier celles qui proviennent des microorganismes des espèces Aspergillus niger et Aspergillus flavus-oryzae du genre Aspergillus contiennent trois types principaux d'activité enzymique en rapport avec l'hydrolyse des polymères de glucose à liaison alpha-1.4. Ces trois types d'activité peuvent être classés en activité alpha-amylase, activité gluc-amylase (maltase) et activité transglucosidase.
L'action de l'alpha-amylase sur les empois d'amidon provoque une réduction considérable de la viscosité. En l'absence de quantités appréciables d'activité gluc-amylase'(maltase), l'action de l'alpha-amylase produit des quantités considérables de maltose.
L'action de la gluc-amylase sur l'amidon et/ou le maltose a pour résultat la formation de dextrose. Ce type d'action a été également dénommé activité maltase, activité amyloglucosidase, activité- glucogène ou activité amidon-glucogénase.
L'activité de la transglucosidase a pour résultat la formation, particulièrement à partir du maltose, de polymères infermentescibles du dextrose contenant des liaisons alpha-1.6- Biophys. glucosidiques. Pan et autres [Arch. Biochem./42, 421-434 (1953) ont essayé l'activité de la transglucosidase provenant de diver-
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ses préparations enzymiques de laboratoire et industrielles et ont constaté que ces préparations d'amylase fongique manifestaient une activité transglucosidase considérable.
Pazur et
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French [J.Biol.0hem, 196, 265-272 ( 19: ) ont montré que l'ac- tion la plus probable de la transglucosidase était le transfert d'un radical glucosyle du maltose à la position 6 d'une molécule de gluose ou à la position 6 de l'extrémité non-réductrice d'une molécule de maltose, ce qui donne respectivement de l'iso-
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maltse (6-{alpha-D-gluc.opyranosyl) -D-glucose) et du panose AI' (4-(6-(alpha-D-glucopyranosyl)-alpha-D-glucopyranosyl)-D-glucose,
De la description ci-avant de l'action de la transglucosidase, il est facile de voir que parmi les facteurs qui limitent le rendement en dextrose, que l'on peut obtenir par
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saccharification,au moyen d'amylase fongioue.,
des matières amylacé.esfigure la re-synthèse enzymique d'hydrates de carbone non- fermentescibles et qui ne sont pas hydrolysés en dextrose à un taux appréciable par les enzymes présentes dans la préparation enzymique.
Dans les procédés antérieurs d'obtention du dextrose cristallisé à partir des matières amylacées, le rendement en
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dextrose-,pur susceptible d'être obtenu par évaporation; et cristallisations successives des liqueurs contenant du dextrose pro- venant de l'hydrolyse, enzymique ou acide, de l'amidon, est limité par l'accumulation d'impuretés dans les liqueurs-mères'. Dans les liqueurs provenant d'hydrolyse par les acides, ce sont essentiellement des produits de réversion et des cendres, Dans les liqueurs provenant d'hydrolyse au moyen de préparations d'amylase,
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leg impuretés comprennent les polymères synthétiques du dextrose provenant de l'action de la transglucosidase et de l'hydrolyse
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incomplète des matières amylaoéee.
La présente invention se propose d'éliminer l'activité transglucosidase des préparations d'amylase de manière augmente;
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l'efficacité et l'utilité de ces préparations. Elle se propose aussi de fournir un procédé perfectionné d'hydrolyse de l'amidon ou de ses produits de conversion en liqueurs contenant du dextrose possédant une concentration exceptionnellement élevée de dextrose au moyen de préparationsperfectionnées d'amylase de ce type. D'autres buts apparaitront au cours de la description qui suit. '
La présente invention fournit un procédé d'élimina- tion de l'activité transglucosidase des préparations d'amylase fongique, comprenant le traitement de ladite préparation en milieu aqueux au moyen d'un minéral argileux et la séparation dudit milieu du minéral argileux.
La présente invention fournit en outre un procédé d'hydrolyse de l'amidon en dextrose, comprenant la dilution de l'amidon, puis sa soumission à l'action d'une préparation d'amylase fongique dont l'activité transglucosidase a été éliminée par traitement à l'aide d'un minéral argileux.
Toutes les préparations d'amylase fongique examinées par la demanderesse contiennent d'appréciables quantités d'ac- tivité-transglucosidase, mesurée par l'importance de la synthèse de sucres non fermentescibles provenant du maltose. Il a été en outre constaté que le rapport transglucosidase/gluc-amylase dans la préparation enzymique, mesuré comme il est dit dans la suite, affecte fortement la quantité de dextrose que l'on peut obtenir à partir de l'amidon partiellement hydrolysé par hydro- lyse au moyen de la préparation enzymique.
Détermination de l'activité gluc-amylase.
Le substratum est un hydrolysat acide d'amidon-de mais, séché par pulvérisation, ayant un équivalent en dextrose de 15 à 18. On dissout cette matière dans l'eau et on la dilue à 4 gr de matière sèche pour 100 ml de solution. On prélève à
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l'aide d'une pipette exactement 50 ml de la solution qu'on pla- ce dans une fiole jaugée de 100 ml. On y introduit 5 ml d'un tampon 1,0 molaire d'acétate de sodium-acide acétique de pH 4,3.
On place la fiole dans un bain-marie , 60 C et, au bout de dix minutes, on ajoute la quantité appropriée de préparation enzymi- que. Exactement deux heures après l'addition.de la préparation enzymique,on règle la solution au virage de la phénol-phtaléine à l'aide d'hydroxyde de sodium normal. On refroidit alors la solution à la température ambiante et on étend au trait de repère. On détermine le taux des sucres réducteurs} calculé . en dextrose, sur un échantillon dilué et sur un témoin ne con- tenant pas de préparation enzymique.
L'activité gluc-amylase se calcule comme suit :
A = S - B/2 x E
Dans cette équation, A est l'activité glud-amylase en unités par ml ou par gramme de préparation enzymique, S est la quan- tité de sucres réducteurs présente dans l'échantillon converti, en grammes pour 100 ml, B est la quantité de sucres réducteurs dans le témoin, en g/100 ml, et 3 est la quantité de préparation enzymique utilisée, en ml ou grammes -La concentration en sucres réducteurs dans l'échantillon d'hydrolysat enzymique converti ne doit pas dépasser 1 gr pour 100 ml.
Détermination de l'activité transglucosidase.
On prépare une solution de maltose en dissolvant
200 gr de maltose Pfanstiehl chimiquement pur dans de l'eau et en diluant à 500 ml. On prélève exactement 50 ml de la solution qu'on place dans une fiole jaugée de 100 ml. On ajoute au ballon
5 ml de tampon 1,0 molaire d'acétate de sodium-acide acétique de pH 4,3.Après mélange) on ajoute une quantité de préparation enzymique contenant 2,8 unités d'activité gluo-amylase. On place la fiole dans un bain-marie à 60 C. Au bout de soixante-douze heures; on place la.fiole-,-dans un bain-marie bouillant pendant un
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quart d'heure, puis on refroidit et on transfère quantitative- ment le contenu dans un bécher de 150 ml.
On règle la solution à pH 4,8 au moyen d'une solution normale d'hydroxyde de sodium, on transfère dans un Erlenmeyer de 500 ml et on étend à environ 200 ml. On ajoute alors 10 gr de levure sèche active de Fléis- chmann et on secoue la fiole de manière continue pendant cinq heures à 30 C. On transfère alors le contenu dans une fiole jau- gée de 250 ml et on étend au repère. On centrifuge ensuite 200 ml du liquide à 2000 tours/minute pendant quinze minutes et on décante la liqueur surnageante dans une fiole sèche. On prélève à l'aide d'une pipette 50 ml de cette liqueur qu'on place dans un tube à essais, on ajoute 5 ml d'acide chlorhydrique normal,- on bouche non hermétiquement le tube et on le chauffe au bain- marie bouillant pendant trois heures; puis on le refroidit au bain de glace.
On transfère le contenu du tube dans une fiole jaugée de 100 ml et on ajoute de l'hydroxyde de sodium normal jusqu'au virage de la phénolphtaléine. On détermine la valeur en sucres réducteurs,calculée en dextrose, sur une partie aliquo te de la solution finale. Pour obtenir une correction pour les sucres réducteurs contenus dans la levure, on fait une opération témoin sur 20 gr de dextrose pur au lieu de maltose, sans ajou- ter d'enzyme. La valeur en sucres réducteurs de l'échantillon hydrolysé par l'enzyme, corrigée pour les sucres réducteurs dus à la levure, représente la matière non fermentescible dont la synthèse a été faite par la préparation enzymique. On calcule les résultats en grammes de sucres non fermentescibles synthé- tisés à partir de 100 gr d'hydrate de maltose ajoutés.
Attendu que les deux enzymes, la gluc-amylase et la transglucosidase, agissent sur le même substratum (maltose), les résultats ci-avant peuvent être exprimés comme le rapport de l'activité gluc-amylase à l'activité transgluoosidase. On ob- tient ce rapport en divisant le nombre de grammes de sucres' non- fermentescibles dont¯la synthèse a été opérée pour-cent grammes
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d'hydrate de maltose par 100, moins cette valeur.
Il a été découvert que,dans l'hydrolyse enzymioue des matières amylacées dans des conditions pratiquer la quantité de dextrose finalement formée est régie par ce rapport de l'ac-
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tivité transglucosidase à l'activité gluc-anjylase/.Il a en. outre été découvert que toutes les prépârations enzymiques d'origine fongique examinées par la demanderesse manifestaient des rapports. transglucosidase/gluc-amylase de l'ordre de 0,2-0,1
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environ.
Ces préparations enzymiques fongiques,,utilis6es dans les conditions pratiques de concentration de substratum, de quantité d'enzyme et de durée d'actioconvertss@rit les hydro- lysats partiels d'amidon en hydrolysats contenant de l'ordre de 84 à 90% de dextrose, rapportés à la teneur en.manière sèche
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de 3'hydrolysat.
Les inconvénients des procédés antérieurement propos sés en vue de production du dextrose comportant une hydrolyse enzymique des matières amylacées sont multiples. Pour obtenir un degré élevé. de transformation, des matières, amylacées en
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dextrose,, on utilisait des: concent-i-atîons, s5; faibles, de matière amylacée que le coût de 11évaporation, Tendait ces; procêâês: dépourvus de valeur- économique, Di'autres procédés faisaient appel à des préparations enzymique. très; pures.. Dans ce cas le coût de la purification de la matière enzymiques et la perte d'activité enzymique survenant au cours du processus.de. puri- fication amèneraient à un prix de revient prohibitif de¯ la préparation enzymique.
La demanderesse a fait cette découverte surprenante qu'il était possible d'éliminer Inactivité transglucosidase des préparations d'amylase fongique, de manière sensiblement
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complète, ce qui diminue considérablement le rapport transgluoo"' sidase g3.ucamylase, par traitement de ) la préparation damylase
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au moyen d'un minéral argileux. Il a été également découvert que les préparations d'amylase traitées de cette manière pro- duisaient des rendements exceptionnellement élevés en dextrose quand on les appliquait à l'hydrolyse des matières amylacées dans les conditions pratiques.
Les préparations enzymiques qui convertissent les matières amylacées en hydrolysats.ne conte- nant que 85 à 86% de dextrose (en produit sec) donnent,, après traitement au moyen d'un.minéral argileux;des hydrolysats con- tenant jusqu'à 93 à 94% de dextrose, à l'état sec.
L'importance de ce perfectionnement est manifeste si l'on se rend compte que le rendement en dextrose pur cristallisé ' susceptible d'être obtenu à partir d'hydrolysatsde matières amylacées,est en général régi par la quantité de matières non-, dextrose présentes dans l'hydrolysat. Chaque partie d'impureté non-dextrose présente dans l'hydrolysat empêche la récupéra- tion d'un poids sensiblement égal de dextrose.
C'est ainsi que le rendement en dextrose cristallisé pur, exprimé en produit anhydre, que l'on peut obtenir économiquement par cristallisa- ts tion à partir d'hydrolysa' de teneur variée en dextrose est le suivant :
Teneur en-dextrose de l'hydrolysat, pour cent en produit sec 86 88 90 92 94
Dextrose récupérable, anhydre, % matière sèche de l'hydrolysat 72 76 80 84 '88
Pour chaque unité pour cent d'augmentation de la te- neur en dextrose de l'hydrolysat on observe une augmentation de
2% du rendement en dextrose. L'importance de l'augmentation de la teneur en dextrose de l'hydrolysat enzymique est manifeste.
Le fait de traiter des préparations enzymiques ou de tenter de séparer des enzymes à l'aide de minéraux argileux n'est pas nouveau. Toutefois, aucune des pratiques antérieures n'a cherché directement à résoudre le présent problème. Les
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techniques antérieures ont visé à utiliser les minéraux argileux pour enlever les protéines extérieures ou ont consisté à les utiliser au laboratoire pour isoler des enzymes pures.
Aucune des techniques antérieures ne s'est préoccupé de l'élimination de la transglucosidase des préparations d'amylase à . l'aide des minéraux argileux, non plus qu'elles ne signalent la possiblité d'élimination de la transglucosidase des préparations d'amylase par traitement au moyen d'un minéral argileux,.
Aucune des techniques antérieures ne s'est proposé d'éliminer la transglucosidase des préparations enzymiques pour augmenter le rendement en dextrose obtenu à l'aide de la préparation enzymique dans 1 'hydrolyse des matières amylacées. En tout cas, la demanderesse ne connaît aucun cas où l'activité transglucosidase ait été éliminée de manière sensiblement quantitative des préparations enzymiques sans perte d'activité enzymique désirable,, comme celle de la glue-amylase et de l'alpha-amylase.
Dans la mise en oeuvre de l'invention, on commence par traiter la préparation enzymique en ajoutant .un minéral argileux à une solution ou suspension de la préparation enzymi- que. Il est toutefois préférable, mais non indispensable, d'en- lever d'abord les solides insolubles éventuellement présents. dans la suspension de préparation enzymique.
La préparation en- zyraique peut consister en la liqueur de culture entière -obtenue par culture submergée d'un microorganisme producteur d'amylase, en la liqueur clarifiée obtenue à l'aide de la culture submergée, en la suspension d'une préparation séchée ou partiellement séchée pouvant contenir du son, de l'amidon ou divers autres adultérants utilisés pour la standardisation de la préparation d'amylase ou en la solution d'une préparation enzymique complètement soluble. Après l'addition du minéral argileux à la solution ou suspension'de la préparation enzymique, le mélange est agité, mzuis les phases solide et liquide sont séparées.
L'activité transglu-
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cosidase reste dans la phase solide alors que les carbo-hydrases désirables, comprenant par exemple la gluc-amylase et l'alpha- amylase, restent dans la phase liquide.
La préparation enzymique liquide ainsi obtenue, dans laquelle l'activité originale de la gluo-amylase et de l'alpha- amylase est conservée, peut alors être utilisée directement pour l'hydrolyse des matières amylacées ou peut être traitée d'une manière connue pour obtenir une préparation enzymique solide.
D'une manière générale, on peut utiliser un minéral' argileux quelconque pour l'élimination de l'activité transgluco-' sidase. En tant que groupe, les minéraux argileux sont des "si- - licates d'alumine". Les minéraux argileux principaux sont clas- sés en Montmorillonite, Attapulgite, Kaolinite et Illite..; D'autres sont la terre à foulon, la floridine, la bentonite, la. sous-bentonite, l'argile réfractaire, le. kaolin et la figuline.- Pour les détails, voir la feuille de renseignements- n 204, American Collold Company (1945); Industriel Minerais and Rocks, Amer. Inst. Mining and Mat, Eng. (éd. 1949). La quantité de mi- néral argileux utilisée dans le traitement de l'enzyme doit être d'au moins 0,5 gr pour 100 ml de préparation enzymique.
Il n'y a pas de limite supérieure, mais il n'est pas avantageux d'utiliser plus de 5 gr de minéral argileux pour 100 ml de pré- paration enzymique.
D'une manière générale, le traitement de la prépara- tion enzymique conformément à l'invention doit être effectué à un pH auquel l'enzyme désirée est stable. Comme certains miné- raux argileux peuvent modifier le pH, il peut être nécessaire de le régler. Dans le cas d'Aspergillus niger, il est préférable de traiter les filtrats de culture (exemples I à VI) au moyen - de l'argile à un pH compris entre 3,5 et 4,5.
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La durée du traitement à l'aide du minéral argileux n'est. pas critique, à la condition que l'argile soit bien dispersée dans la préparation enzymique.
Quand on effectue l'hydrolyse de l'amidon au moyen -le la préparation enzymique traitée, il est usuellement préférable de fluidifier d'abord l'amidon par un procédé' connu,, 0' est.. à-dire par l'hydrolyse acide partielle ou à l'aide d'une enzyme luiquéfiante,telle que l'alpha-amylase bactérienne. L'hydrolyse de l'amidon ainsi réduit de viscosité par la préparation enzymique traitée doit être effectuée dans des conditions de pH et de température conduisant à la formation des produits désirés. Dans le cas d'hydrolyse de l'amidon fluidifié, des valeurs de pH de 3,5 à 5,5 sont satisfaisantes. L'hydrolyse terminée, la liqueur de dextrose peut être raffinée, concentrée et cristallisée de la manière usuelle.
Le traitement de l'enzyme est particulièrement avantageux quand on l'applique aux liqueurs entières ou aux filtrats des liqueurs de culture obtenues à l'aide de microorganismes du genre Aspergillus en culture aérobie submergée. Ces liqueurs de culture sont des sources très économiques des enzymes désirées et, après traitement au moyen d'un minéral argileux,peuvent être utilisées directement pour la conversion des matières amylacées avec des rendements élevé s en dextrose sans avoir recours à desprocédés' de purification compliqués ou coûteux ou à l'usage de faibles concentrations en amidon.
Il est particulièrement avantageux en ce que lehoix de la souche de microorganisme, des constituants du milieu et des conditions de développement peut être effectué en fonction de la production maximum de gluc-amylase, indépendamment de la quantité d'activité de transglucosidase produite.
Il résulte de ce qui précède et des exemples qui
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suivent que la présente invention apporte un perfectionnement net à la technique à l'aide d'un moyen simple, peu coûteux et toutefois très efficace. Le rendement en dextrose est augmenté sensiblement, pratiquement sans augmentation de prix et' sans opé- rations compliquées.
Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ils ne sont nullement limitatifs.
EXEMPLE I
On soumet une culture d'Aspergillus niger de la Corn Products Refining Company, Res.earch, and Development Départment, Culture n 11-370, isolée d'un échantillon de terre de la Louisiane, à la fermentation dans des conditions aérobies submergées au sein d'un milieu composé de 14% de mais broyé et 1% d'extrait soluble du maïs, (base sèche). La fermentation terminée, on filtre la liqueur pour enlever le mycélium et autres matières en suspension. On divise le filtrat en plusieurs parties.
A des portions de 100 ml du filtrat de culture, on ajoute, en agitant, 5 gr de minéral argileux finement divisé. Au bout de trente minutes d'agitation/on sépare l'argile par filtration. On évalue l'activité gluc-amylase dés filtrats ainsi obtenus ainsi que l'activité alpha-amylase et l'activité transglucosidase. Il n'y a pas de diminution de l'activité alphaamylase.
Cet exemple montre que les minéraux argileux en tant que groupe éliminent efficacement et sélectivement l'activité transglucosidase sans enlever de quantités appréciables d'acti- 'vité gluc-amylase. On doit noter que, bien que la préparation traitée à l'argile manifeste un léger-degré d'activité transglucosidase selon le procédé utilisé, cette valeur peut être due au moins partiellement à des impuretés non fermentescibles: présentes dans le maltose plutôt qu'à une activité de transglucosidase.
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TABLEAU I
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<tb> Activité <SEP> enzymique <SEP> du <SEP> filtrat
<tb> Argile <SEP> minérale <SEP> Composant <SEP> minéral <SEP> Traitement <SEP> Gluc-amylase <SEP> Transglucosidase/
<tb> (Dénomination <SEP> principal <SEP> Type <SEP> de <SEP> u/ml. <SEP> glue-amylase
<tb> commerciale) <SEP> l'argile <SEP> Avant <SEP> Apres <SEP> Avant <SEP> Après
<tb> trai- <SEP> trai- <SEP> trai- <SEP> trai-
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement
<tb> 1. <SEP> Dontonite <SEP> Volclay <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> gonflante <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 2. <SEP> Panther <SEP> Creek <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> non-gonflante <SEP> " <SEP> 2,08 <SEP> 2,01 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 3.
<SEP> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> Montmorillonite <SEP> -- <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 4. <SEP> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> Montmorillonite <SEP> -- <SEP> Imprégné <SEP> 2,08 <SEP> 1,89 <SEP> 0,16 <SEP> 0,03
<tb> 5. <SEP> Filtrol <SEP> 105 <SEP> Montmorillonite <SEP> Sous-bentonite <SEP> Activité <SEP> 2,08 <SEP> 2,04 <SEP> 0,16 <SEP> 0,06
<tb> par <SEP> acide
<tb> 6. <SEP> Pikes' <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> Montmorillonite <SEP> Terre <SEP> à <SEP> foulon <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1,91 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 7. <SEP> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> Montmorillonite <SEP> d <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 1,93 <SEP> 0,16 <SEP> 0,07
<tb> 8. <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> Floridine <SEP> -- <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1 <SEP> ,96 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 9.
<SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> calciné <SEP> Floridine <SEP> -- <SEP> Calciné <SEP> 2,08 <SEP> 1,89 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 10. <SEP> Attapulgite <SEP> Attapulgite <SEP> Terre <SEP> à <SEP> foulon <SEP> Néant <SEP> 2,08 <SEP> 1,91 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 11. <SEP> Bandy <SEP> Tan <SEP> Kaolinite <SEP> Figuline <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,97 <SEP> 0,16 <SEP> 0,05
<tb> 12. <SEP> Argile <SEP> réfractaire <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP>
<tb> d'Illinois <SEP> Kaolinite <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,98 <SEP> 0,16 <SEP> 0,13
<tb> 13. <SEP> Grundite <SEP> Illite <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 2,08 <SEP> 1,92 <SEP> 0,16 <SEP> 0,07
<tb>
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EXEMPLE II
On utilise les filtrats traités provenant de l'exemple ±. pour hydrolyser un hydrolysat partiel d'amidon de la manière suivante.
On soumet à l'hydrolyse acide une suspension à 55% en poids d'amidon de mais jusqu'à un équivalent dextrose de 16.
(L'équivalent dextrose est la teneur en sucre réducteur de l'hydrolysat calculé en dextrose et exprimé en pourcentage en' poids de la substance sèche présente). L'amidon fluidifié est réglée à pH 4,5, amené à 60 C. et additionné d'une quantité de préparation enzymique calculée pour contenir 14 unités d'activité gluc-amylase pai 100 gr d'amidon fluidifié sec. Au bout de soixante-douze heures d'incubation à 60 C, on :titre l'équivalent en dextrose des liqueurs et la teneur en dex- trose. On obtient les résultats ci-après.
Cet exemple montre l'amélioration obtenue dans le de- gré de conversion en dextrose de l'amidon fluidifié au moyen de filtrats de culture d'Aspergillus niger après élimination de l'activité transglucosidase par traitement du filtrat de cul- ture à l'aide d'un minéral argileux.
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<tb>
<tb> composition'de <SEP> la <SEP> liqueur <SEP> après
<tb> conversion <SEP> enzymique
<tb> Argile <SEP> minérale <SEP> utilisée <SEP> E.D.
<SEP> % <SEP> dextrose <SEP> (Base
<tb> @@ <SEP> @ <SEP> sèche)
<tb> Néant <SEP> 92,0 <SEP> 86,4
<tb> Bentonite <SEP> Vololay <SEP> 95,5 <SEP> 93,0
<tb> Panther <SEP> Creek <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> 95,5 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> 96,2 <SEP> 94,2
<tb> Filtrol <SEP> 105 <SEP> 95,0 <SEP> 92,1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> 95,6 <SEP> 93,1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> 94,8 <SEP> 91,8
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> 95,5 <SEP> 93,0
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> calciné <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Attapulgite <SEP> 95,7 <SEP> 93,3
<tb> Bandy <SEP> Tan <SEP> 95,6 <SEP> 93,1
<tb> Argile <SEP> réfractaire <SEP> de <SEP> l'Illinois <SEP> 92,9 <SEP> 88,7
<tb> Grundite <SEP> 94,9 <SEP> 92,0
<tb>
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'''.
'.E , III On cultive de l'àspersillug ni er yJL-30 dans une cuve-,,de fermentation comme il est décrit dans l'exemple I. La fermenta- tion terminée)on enlève la liqueur totale de culture de la cuve et on la divise en quatre portions de 100 ml. La première por- tion est laissée aans traitement. La seconde portion est agitée et additionnée de deux grammes: de l'argile de marque déposée "Volclay Bentonite". On filtre le mélange contenant le mycélium et l'argile et on rejette le gâteau de filtre. On filtre la troisième partie sans traitement argileux. On filtre la quatriè me partie, on agite le filtrat et on l'additionne de 2 gr de bentonite Volclay. On filtre alors la suspension.
On effectue , l'aide de ces quatre préparationsdes conversions à une valeur E.D. e 16 d'amidon fluidifié, comme il est dit dans l'exemple
EMI15.2
lle i²J;' exemple, illustre l'application de l'invention à une li- queur de culture, ;non filtrée.
EMI15.3
<tb>
<tb>
Filtration <SEP> de <SEP> Traitement <SEP> 'Activité <SEP> Composition <SEP> de <SEP> la <SEP> lila <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> par <SEP> glu-c <SEP> queur <SEP> après <SEP> hydrolyse
<tb>
EMI15.4
culture l'argile amylase, enzymique¯¯¯¯¯¯¯¯ u/ml E.D. % dextrose ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ sec.
Non filtrée 2,30 91,1 .8;,7 3 a,z4 95,3 92,3
EMI15.5
<tb>
<tb> Filtrée <SEP> 0 <SEP> 2,30 <SEP> 92,1 <SEP> 86,,1
<tb> 2,35 <SEP> 95,5 <SEP> 92,8
<tb>
EXEMPLE IV
Cet exemple illustre l'effet exercé par différentes quantités d'argile. La préparation enzymique utilisée est un
EMI15.6
filtrat d'une culture submergée â As.¯T erillus ni er lL-3'7 Le traitement par l'argile est effectué comme dans l'exemple 1
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> d'argile <SEP> utilisée, <SEP> gr <SEP> pour <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> de <SEP> préparation <SEP> enzymique
<tb> 5,0 <SEP> 2,0 <SEP> 1,0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,2 <SEP> 0,0
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> de <SEP> la <SEP> liqueur-après
<tb> Argile <SEP> utilisée <SEP> hydrolyse <SEP> enzymique, <SEP> @ <SEP> (base <SEP> sèche)
<tb> Bentonite <SEP> Volclay <SEP> 94,0 <SEP> 93,
.3 <SEP> 93,1 <SEP> 93,0 <SEP> 88,5 <SEP> 86,5
<tb> Attapulgite <SEP> 93,3 <SEP> 92,0 <SEP> 92,1 <SEP> - <SEP> - <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> 93,0 <SEP> 93,6 <SEP> 91,6
<tb> Panther <SEP> Oreek <SEP> 93,3 <SEP> 93,6 <SEP> 89,1 <SEP> 86,9
<tb>
EXEMPLE V
Cet exemple montre l'effet exercé par le pH sur le trai- tement des enzymes au moyen des minéraux argileux. On règle le pH aux valeurs données ci-après-de portions séparées d'un filtrat de culture provenant d'une culture submergée d'Asper- de gillus niger,au moyen d'acide .chlorhydrique ou d'hydroxy de a sodium. A chqueportion de 100 ml, on ajoute 2 gr de bentonite Volclay.
On agite les mélanges pendant trente minutes et on les filtre.i les résultats des hydrolyses effectuées au moyan des préparations enzymiques traitées. pH avant addition de l'argile 5,0 4,5 '4,0 3,0 2,4 2,0 pH du filtrat après traitement 5,2 4,6- 4,0 3,1 2,5 2,2 Activité gluc-amylase du filtrat, u/ml 2,17 2,24 2,33 1,76 1,03 0,62 Composition de la liqueur après hydrolyse enzymique E.D. 92,5 95,0 95,5 95,6 95,3 94,8 Dextrose (base sèche) 87,9 92,1 93,0 93,2 92,7 91,9 La composition de l'amidon fluidifié après hydrolyse au moyen de la préparation enzymique non traitée est de 91,4 E.D. et de 85,9 de dextrose (base sèche) .
EXEMPLE VI
Cet exemple montre l'application de l'invention à d'au- tres "souches d'Aspergillus niger et à d'autres membres de l'ex pèce Aspergillus niger. Les préparations enzymiques utilisées
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sont .des filtrats de cultures préparées par fermentation submergée comme il est décrit dans l'exemple I. On traite une portion de chaque filtrat de culture au moyen de 2% de Bentonite Volelay comme il est décrit dans l'exemple I. L'hydrolyse de 1-'amidon fluidifié est effectuée comme il est décrit dans l'exemple II.
Les cultures décrites sous NRRL 330 et NRRL 337 ont été étudiées d'une manière très poussée en vue de la produc- tion de l'amylase [Tsuchiya et autres, Cereal Chem. 27, 322 (1950)).
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<tb>
<tb>
Activité <SEP> glue-amylase <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose
<tb> du <SEP> filtrat, <SEP> de <SEP> la <SEP> liqueur <SEP> après,
<tb> u/ml <SEP> hydrolyse <SEP> enzymique,
<tb>
EMI17.2
¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ % base sèche '
EMI17.3
<tb>
<tb> Trmitement <SEP> à <SEP> l'argile <SEP> Avec <SEP> Avec
<tb> Avant <SEP> Après <SEP> enzyme <SEP> enzyme
<tb> Culture <SEP> Avant <SEP> Apres <SEP> traitée <SEP> non <SEP> traitée
<tb>
EMI17.4
Aspergillus nioei 11-570 2,30 233 86,1 92,8 àspeSliRs. niger 1liU 330 1,85 ?,&0 86,3 9a,7 Aspergillus ±Qg NRRL 53'? 2,04 2,&7 87,3 92 po
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<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> phoenieis
<tb> M-381 <SEP> . <SEP> 1,70 <SEP> 2,03 <SEP> 88,8 <SEP> 91,5
<tb>
EMI17.6
1.JLL7:
a'il.C3.9 VII
Les préparations industrielles d'enzymes de moisissures destinées à la saccharification de l'amidon sont ordinairement obtenues par développement d'un membre de l'espèce Aspergillus flavus-oryzae du genre Aspergillus sur du son humide. La culture est épuisée à l'aide d'eau ou d'une solution salée. La matière à activité enzymique est précipitée de l'extrait par addition d'un solvant miscible à l'eau, le précipité est séché puis mélangé avec un ingrédient inerte de manière à obtenir une préparation d'activité standard. La préparation est vendue ou utilisée sous cette forme. Ces préparations enzymiques sont mises séparément en suspension dans l'eau, les suspensions,. .1
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sont réglées à pH 4 et filtrées.
A 100 ml de chacun des fil- trats,on ajoute 5 gr de bentonite de Volclay et on filtre les suspensions au bout de trente minutes d'agitation ..L'hydro- lyse de l'amidon fluidifié est effectuée à 50 C., pH 4,6-4,8 pendant soixante-douze heures. On effectue des conversions séparées à l'aide de préparations enzymiques traitées et non traitées en utilisant une quantité de préparation enzymique équi- valent à 14 unités de gluc-amylase pour 100 gr d'amidon sec fluidifié. Le tableau VII montre les résultats obtenus par application de l'invention à plusieurs préparations enzymiques,.- solides purifiées. Les préparations originales sont remises en suspension avant usage.
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TIBLEAU VII
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<tb> Activité <SEP> gluo <SEP> -amylase <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> dextrose <SEP> d <SEP> la <SEP> liqueur
<tb> à <SEP> 50 C, <SEP> u/g <SEP> de <SEP> prépa- <SEP> après <SEP> hydrolyse <SEP> enzymque
<tb> ration <SEP> enzymioue <SEP> % <SEP> pids <SEP> base <SEP> che
<tb> Après <SEP> trait.
<SEP> Avec <SEP> préparation <SEP> Avec <SEP> préparation
<tb> Préparation <SEP> Source <SEP> Originale <SEP> argile <SEP> originale <SEP> Argile <SEP> traitée <SEP>
<tb> enzymique
<tb> Enzyme <SEP> AW <SEP> Ba) <SEP> 4,54 <SEP> 3,34 <SEP> 80,1 <SEP> 86,9
<tb> Shozyme <SEP> Sb) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 11,8 <SEP> 11,8 <SEP> 86,6 <SEP> 92,1
<tb> Dextrinase <SEP> a) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 15,0 <SEP> 14,7 <SEP> 87,7 <SEP> 91,3
<tb> Diastase <SEP> 32b) <SEP> -.- <SEP> 53,3 <SEP> 51,4 <SEP> 90,8 <SEP> 91,9
<tb> Mylase <SEP> c) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-cryzae <SEP> 13,5 <SEP> 13,2 <SEP> 91,5 <SEP> 92,8
<tb> a) <SEP> marque <SEP> déposée <SEP> d'un <SEP> produit <SEP> vendu <SEP> par <SEP> Takamine <SEP> Laborstories'
<tb> b)
<SEP> marque <SEP> déposée <SEP> d'un <SEP> produit <SEP> vendu <SEP> par <SEP> Rohm <SEP> & <SEP> Haas <SEP> Company
<tb> c) <SEP> marque <SEP> déposée <SEP> vendue <SEP> par <SEP> Wallerstein <SEP> Company.
<tb>
<Desc / Clms Page number 1>
EMI1.1
The present invention is rap: porte à -U'O. -p-roee-d8 for processing enzyme preparations with allyl activity and an improved process for preparing hydrolysates
EMI1.2
starch containing an unusually high concentration of dextrose by means of these preparations.
EMI1.3
Amylase preparations from mioroorganimes of the WUft.l1ig and Aspergillug flavus-o ryz ae groups
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are widely used in industry, for example for the enzymic saccharification of partially hydrolyzed starch so as to form syrups containing: dextrose.
However, experience has shown that the formation of non-fermentable dextrose polymers was sufficient to limit the value of these preparations, in particular in the production of pure crystallized dextrose. This will emerge from the following discussion.
Amylase preparations of mierobiological origin, in particular those derived from microorganisms of the species Aspergillus niger and Aspergillus flavus-oryzae of the genus Aspergillus contain three main types of enzymic activity related to the hydrolysis of alpha-linked glucose polymers -1.4. These three types of activity can be classified into alpha-amylase activity, gluc-amylase (maltase) activity and transglucosidase activity.
The action of alpha-amylase on starch poisons causes a considerable reduction in viscosity. In the absence of appreciable amounts of gluc-amylase (maltase) activity, the action of alpha-amylase produces considerable amounts of maltose.
The action of glucamylase on starch and / or maltose results in the formation of dextrose. This type of action has also been referred to as maltase activity, amyloglucosidase activity, glucogenic activity or starch-glucogenase activity.
Transglucosidase activity results in the formation, particularly from maltose, of dextrose infermentable polymers containing alpha-1.6-Biophys linkages. glucosidic. Pan and others [Arch. Biochem./42, 421-434 (1953) tested the activity of transglucosidase from various
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its laboratory and industrial enzyme preparations and have found that these fungal amylase preparations exhibit considerable transglucosidase activity.
Pazur and
EMI3.1
French [J. Biol.0hem, 196, 265-272 (19:) showed that the most probable action of transglucosidase was the transfer of a glucosyl radical from maltose to position 6 of a molecule of gluose or at position 6 of the non-reducing end of a maltose molecule, resulting in iso-
EMI3.2
maltse (6- {alpha-D-gluc.opyranosyl) -D-glucose) and panose AI '(4- (6- (alpha-D-glucopyranosyl) -alpha-D-glucopyranosyl) -D-glucose,
From the above description of the action of transglucosidase, it is easy to see that among the factors which limit the yield of dextrose, which can be obtained by
EMI3.3
saccharification, using fungal amylase.,
Starchy materials. esfigure the enzymic re-synthesis of non-fermentable carbohydrates which are not hydrolyzed to dextrose at an appreciable level by the enzymes present in the enzyme preparation.
In the prior processes for obtaining crystallized dextrose from starchy materials, the yield of
EMI3.4
dextrose-, pure obtainable by evaporation; and successive crystallizations of liquors containing dextrose derived from the hydrolysis, enzymic or acid, of starch, is limited by the accumulation of impurities in the mother liquors. In liquors resulting from hydrolysis by acids, these are essentially reversion products and ash, In liquors resulting from hydrolysis by means of amylase preparations,
EMI3.5
impurities include synthetic polymers of dextrose from the action of transglucosidase and hydrolysis
EMI3.6
incomplete amylaoeae material.
The present invention proposes to eliminate the transglucosidase activity of amylase preparations in an increased manner;
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the effectiveness and usefulness of these preparations. It also proposes to provide an improved method of hydrolysis of starch or its conversion products into liquors containing dextrose having an exceptionally high concentration of dextrose by means of improved preparations of amylase of this type. Other objects will become apparent from the description which follows. '
The present invention provides a method of removing transglucosidase activity from fungal amylase preparations, comprising treating said preparation in an aqueous medium using a clay mineral and separating said medium from the clay mineral.
The present invention further provides a process for hydrolysis of starch to dextrose, comprising diluting the starch and then subjecting it to the action of a fungal amylase preparation whose transglucosidase activity has been removed by. treatment using a clay mineral.
All of the fungal amylase preparations examined by Applicants contain appreciable amounts of transglucosidase activity as measured by the extent of the synthesis of non-fermentable sugars from maltose. It was further found that the transglucosidase / gluc-amylase ratio in the enzyme preparation, measured as described below, strongly affects the amount of dextrose which can be obtained from the partially hydrolyzed starch by hydrolysis. - lysis by means of the enzymic preparation.
Determination of gluc-amylase activity.
The substratum is an acid hydrolyzate of corn starch, spray dried, having a dextrose equivalent of 15 to 18. This material is dissolved in water and diluted to 4 g of dry material per 100 ml of solution. . We take from
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using a pipette exactly 50 ml of the solution which is placed in a 100 ml volumetric flask. 5 ml of a 1.0 molar sodium acetate-acetic acid buffer of pH 4.3 are introduced into it.
The flask is placed in a water bath, 60 ° C., and after ten minutes, the appropriate amount of enzyme preparation is added. Exactly two hours after the addition of the enzyme preparation, the solution is adjusted to the phenol-phthalein change with normal sodium hydroxide. The solution is then cooled to room temperature and extended to the reference line. The calculated level of reducing sugars is determined. in dextrose, on a diluted sample and on a control containing no enzyme preparation.
Gluc-amylase activity is calculated as follows:
A = S - B / 2 x E
In this equation, A is the glud-amylase activity in units per ml or per gram of enzyme preparation, S is the amount of reducing sugars present in the converted sample, in grams per 100 ml, B is the amount of reducing sugars in the control, in g / 100 ml, and 3 is the amount of enzyme preparation used, in ml or grams - The concentration of reducing sugars in the sample of converted enzymic hydrolyzate must not exceed 1 gr per 100 ml .
Determination of transglucosidase activity.
A maltose solution is prepared by dissolving
200 gr of chemically pure Pfanstiehl maltose in water and diluted to 500 ml. Exactly 50 ml of the solution are taken and placed in a 100 ml volumetric flask. We add to the ball
5 ml of 1.0 molar sodium acetate-acetic acid buffer of pH 4.3. After mixing) a quantity of enzyme preparation containing 2.8 units of gluo-amylase activity is added. The flask is placed in a water bath at 60 C. After seventy-two hours; place the flask -, - in a boiling water bath for one
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quarter of an hour, then cooled and quantitatively transferred the contents to a 150 ml beaker.
The solution is adjusted to pH 4.8 with normal sodium hydroxide solution, transferred to a 500 ml Erlenmeyer flask and diluted to about 200 ml. Then 10 g of active dry Fléischmann yeast are added and the flask is shaken continuously for five hours at 30 ° C. The contents are then transferred to a 250 ml volumetric flask and spread to the mark. Then 200 ml of the liquid is centrifuged at 2000 rpm for fifteen minutes and the supernatant liquor is decanted into a dry flask. 50 ml of this liquor are taken with a pipette and placed in a test tube, 5 ml of normal hydrochloric acid are added, - the tube is not sealed off and heated in a water bath. boiling for three hours; then it is cooled in an ice bath.
The contents of the tube are transferred to a 100 ml volumetric flask and normal sodium hydroxide is added until the change to phenolphthalein. The value of reducing sugars, calculated as dextrose, is determined on an aliquot part of the final solution. To obtain a correction for the reducing sugars contained in the yeast, a control operation is carried out on 20 g of pure dextrose instead of maltose, without adding any enzyme. The reducing sugars value of the sample hydrolyzed by the enzyme, corrected for the reducing sugars due to the yeast, represents the non-fermentable material, the synthesis of which was made by the enzymic preparation. The results are calculated in grams of non-fermentable sugars synthesized from 100 grams of added maltose hydrate.
Whereas the two enzymes, gluc-amylase and transglucosidase, act on the same substratum (maltose), the above results can be expressed as the ratio of gluc-amylase activity to transgluoosidase activity. This ratio is obtained by dividing the number of grams of non-fermentable sugars which have been synthesized per hundred grams
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of maltose hydrate per 100, minus this value.
It has been found that in the enzymic hydrolysis of starchy materials under practical conditions the amount of dextrose eventually formed is governed by this ratio of ac-
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transglucosidase activity to glucanjylase / activity. It has in. In addition, it was found that all of the enzymic pre-preparations of fungal origin examined by the Applicant showed a relationship. transglucosidase / gluc-amylase of the order of 0.2-0.1
EMI7.2
about.
These fungal enzymic preparations, used under the practical conditions of substrate concentration, quantity of enzyme and duration of actioconverting the partial hydrolysates of starch into hydrolysates containing on the order of 84 to 90% of dextrose, referred to the dry content
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of hydrolyzate.
The drawbacks of the previously proposed processes for the production of dextrose comprising enzymic hydrolysis of the starchy materials are manifold. To get a high degree. processing, materials, starches into
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dextrose, we used: concent-i-ations, s5; weak, starchy matter than the cost of evaporation, tended these; Processes: devoid of economic value, other processes called for enzyme preparations. very; pure .. In this case the cost of purification of the enzymic material and the loss of enzymic activity occurring during the process. purification would lead to a prohibitive cost price of the enzyme preparation.
The Applicant has made this surprising discovery that it is possible to eliminate transglucosidase inactivity from fungal amylase preparations, substantially.
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complete, which considerably decreases the transgluoo "'sidase g3.ucamylase ratio, by treatment of) the preparation amylase
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by means of a clay mineral. It has also been found that amylase preparations treated in this way produce exceptionally high yields of dextrose when applied to the hydrolysis of starchy materials under practical conditions.
Enzyme preparations which convert starchy materials into hydrolysates containing only 85-86% dextrose (as dry product) give, after treatment with a clay mineral, hydrolysates containing up to 93% dextrose. 94% dextrose, dry.
The importance of this improvement is evident when one realizes that the yield of pure crystallized dextrose obtainable from hydrolysates of starchy materials is in general governed by the amount of non-dextrose material present. in the hydrolyzate. Each portion of non-dextrose impurity present in the hydrolyzate prevents recovery of a substantially equal weight of dextrose.
Thus, the yield of pure crystallized dextrose, expressed as anhydrous product, which can be obtained economically by crystallization from hydrolysis' of varying dextrose content is as follows:
Hydrolyzate dextrose content, percent dry product 86 88 90 92 94
Recoverable dextrose, anhydrous,% dry matter of the hydrolyzate 72 76 80 84 '88
For every unit per cent increase in the dextrose content of the hydrolyzate there is an increase in
2% of the dextrose yield. The importance of increasing the dextrose content of the enzymic hydrolyzate is evident.
Treating enzyme preparations or attempting to separate enzymes using clay minerals is nothing new. However, none of the prior practices have directly sought to address the present problem. The
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Previous techniques have aimed at using clay minerals to remove exterior proteins or have involved using them in the laboratory to isolate pure enzymes.
None of the prior art has addressed the removal of transglucosidase from α-amylase preparations. using clay minerals, nor do they indicate the possibility of elimination of transglucosidase from amylase preparations by treatment with a clay mineral ,.
None of the prior art has attempted to remove transglucosidase from enzyme preparations to increase the yield of dextrose obtained by using the enzyme preparation in the hydrolysis of starchy materials. In any case, the Applicant does not know of any case where the transglucosidase activity has been eliminated in a substantially quantitative manner from the enzyme preparations without loss of desirable enzyme activity, such as that of glue-amylase and alpha-amylase.
In carrying out the invention, the enzyme preparation is first treated by adding a clay mineral to a solution or suspension of the enzyme preparation. It is, however, preferable, but not essential, to first remove any insoluble solids which may be present. in the suspension of enzyme preparation.
The enzyraic preparation may consist of the whole culture liquor obtained by submerged culture of an amylase-producing microorganism, the clarified liquor obtained by means of the submerged culture, the suspension of a dried preparation or partially dried which may contain bran, starch or various other adulterants used for the standardization of the amylase preparation or in the solution of a completely soluble enzyme preparation. After the addition of the clay mineral to the solution or suspension of the enzyme preparation, the mixture is stirred, and the solid and liquid phases are separated.
The transglu- activity
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cosidase remains in the solid phase while the desirable carbohydrases, including, for example, glucamylase and alpha-amylase, remain in the liquid phase.
The liquid enzyme preparation thus obtained, in which the original activity of gluo-amylase and alpha-amylase is retained, can then be used directly for the hydrolysis of starchy materials or can be treated in a manner known to obtain a solid enzyme preparation.
In general, any clay mineral can be used for the removal of transglucosidase activity. As a group, clay minerals are "alumina silicates". The main clay minerals are classified as Montmorillonite, Attapulgite, Kaolinite and Illite ..; Others are fuller's earth, floridin, bentonite, la. sub-bentonite, refractory clay,. kaolin and figulin. For details see Fact Sheet 204, American Collold Company (1945); Industrial Minerals and Rocks, Amer. Inst. Mining and Mat, Eng. (ed. 1949). The amount of clay mineral used in the treatment of the enzyme should be at least 0.5 g per 100 ml of enzyme preparation.
There is no upper limit, but it is not advantageous to use more than 5 g of clay mineral per 100 ml of enzyme preparation.
Generally, the treatment of the enzyme preparation according to the invention should be carried out at a pH at which the desired enzyme is stable. As some clay minerals can alter the pH, it may be necessary to adjust it. In the case of Aspergillus niger, it is preferable to treat the cultured filtrates (Examples I to VI) with - clay at a pH between 3.5 and 4.5.
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The duration of treatment using the clay mineral is no. not critical, provided the clay is well dispersed in the enzyme preparation.
When hydrolysis of starch is carried out by means of the treated enzyme preparation, it is usually preferable to first thin the starch by a known method, ie by hydrolysis. partial acid or using a liquefying enzyme, such as bacterial alpha-amylase. The hydrolysis of the starch thus reduced in viscosity by the treated enzyme preparation must be carried out under conditions of pH and temperature leading to the formation of the desired products. In the case of hydrolysis of thinned starch, pH values of 3.5 to 5.5 are satisfactory. After hydrolysis is complete, the dextrose liquor can be refined, concentrated and crystallized in the usual manner.
Treatment of the enzyme is particularly advantageous when applied to whole liquors or to filtrates of cultured liquors obtained using microorganisms of the genus Aspergillus in submerged aerobic culture. These cultured liquors are very economical sources of the desired enzymes and, after treatment with a clay mineral, can be used directly for the conversion of starchy materials in high yields to dextrose without resorting to complicated purification procedures. or expensive or using low starch concentrations.
It is particularly advantageous in that the choice of the strain of microorganism, the constituents of the medium and the conditions of development can be made according to the maximum production of gluc-amylase, independent of the amount of transglucosidase activity produced.
It follows from the above and the examples which
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It follows that the present invention provides a distinct improvement in the art by means of a simple, inexpensive and yet very effective means. The yield of dextrose is increased substantially, with virtually no increase in price and no complicated operations.
The following examples illustrate the present invention, but they are in no way limiting.
EXAMPLE I
A culture of Aspergillus niger from the Corn Products Refining Company, Res.earch, and Development Department, Culture No. 11-370, isolated from a sample of Louisiana soil, was subjected to fermentation under aerobic conditions submerged within of a medium composed of 14% ground corn and 1% soluble corn extract (dry basis). When fermentation is complete, the liquor is filtered to remove the mycelium and other suspended matter. The filtrate is divided into several parts.
To 100 ml portions of the culture filtrate is added, with stirring, 5 g of finely divided clay mineral. After 30 minutes of stirring, the clay is separated by filtration. The gluc-amylase activity of the filtrates thus obtained as well as the alpha-amylase activity and the transglucosidase activity are evaluated. There is no decrease in alphaamylase activity.
This example shows that clay minerals as a group efficiently and selectively remove transglucosidase activity without removing appreciable amounts of gluc-amylase activity. It should be noted that although the clay-treated preparation exhibits a slight degree of transglucosidase activity depending on the process used, this value may be due at least in part to non-fermentable impurities: present in maltose rather than transglucosidase activity.
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TABLE I
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<tb> Enzymic <SEP> activity <SEP> of the <SEP> filtrate
<tb> Clay <SEP> mineral <SEP> Component <SEP> mineral <SEP> Treatment <SEP> Gluc-amylase <SEP> Transglucosidase /
<tb> (Name <SEP> principal <SEP> Type <SEP> of <SEP> u / ml. <SEP> glue-amylase
<tb> commercial) <SEP> clay <SEP> Before <SEP> After <SEP> Before <SEP> After
<tb> trai- <SEP> trai- <SEP> trai- <SEP> trai-
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement <SEP> tement
<tb> 1. <SEP> Dontonite <SEP> Volclay <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> swelling <SEP> None <SEP> 2.08 <SEP> 2.04 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 2. <SEP> Panther <SEP> Creek <SEP> Montmorillonite <SEP> Bentonite <SEP> non-swelling <SEP> "<SEP> 2.08 <SEP> 2.01 <SEP> 0.16 < SEP> 0.05
<tb> 3.
<SEP> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> Montmorillonite <SEP> - <SEP> Calciné <SEP> 2.08 <SEP> 2.04 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 4. <SEP> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> Montmorillonite <SEP> - <SEP> Impregnated <SEP> 2.08 <SEP> 1.89 <SEP> 0.16 <SEP> 0 , 03
<tb> 5. <SEP> Filtrol <SEP> 105 <SEP> Montmorillonite <SEP> Sub-bentonite <SEP> Activity <SEP> 2.08 <SEP> 2.04 <SEP> 0.16 <SEP> 0, 06
<tb> by <SEP> acid
<tb> 6. <SEP> Pikes' <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> Montmorillonite <SEP> Earth <SEP> to <SEP> fuller <SEP> Nil <SEP> 2.08 <SEP> 1.91 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 7. <SEP> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> Montmorillonite <SEP> d <SEP> Calciné <SEP> 2.08 <SEP> 1.93 <SEP> 0.16 <SEP> 0.07
<tb> 8. <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> Floridine <SEP> - <SEP> None <SEP> 2.08 <SEP> 1 <SEP>, 96 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 9.
<SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> calcined <SEP> Floridine <SEP> - <SEP> Calcined <SEP> 2.08 <SEP> 1.89 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 10. <SEP> Attapulgite <SEP> Attapulgite <SEP> Earth <SEP> to <SEP> fuller <SEP> None <SEP> 2.08 <SEP> 1.91 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 11. <SEP> Bandy <SEP> Tan <SEP> Kaolinite <SEP> Figuline <SEP> - <SEP> 2.08 <SEP> 1.97 <SEP> 0.16 <SEP> 0.05
<tb> 12. <SEP> Refractory <SEP> clay <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP>
Illinois <tb> <SEP> Kaolinite <SEP> - <SEP> - <SEP> 2.08 <SEP> 1.98 <SEP> 0.16 <SEP> 0.13
<tb> 13. <SEP> Grundite <SEP> Illite <SEP> - <SEP> - <SEP> 2.08 <SEP> 1.92 <SEP> 0.16 <SEP> 0.07
<tb>
<Desc / Clms Page number 14>
EXAMPLE II
The treated filtrates from Example ± are used. to hydrolyze a partial starch hydrolyzate as follows.
A 55% by weight suspension of corn starch was subjected to acid hydrolysis to a dextrose equivalent of 16.
(The dextrose equivalent is the reducing sugar content of the hydrolyzate calculated as dextrose and expressed as a percentage by weight of the dry substance present). The fluidized starch is adjusted to pH 4.5, brought to 60 ° C. and added with an amount of enzyme preparation calculated to contain 14 units of gluc-amylase activity per 100 grams of dry fluidized starch. After seventy-two hours of incubation at 60 ° C., the dextrose equivalent of the liquors and the dextrose content are titrated. The following results are obtained.
This example shows the improvement obtained in the degree of dextrose conversion of starch thinned using cultured filtrates of Aspergillus niger after removal of the transglucosidase activity by treatment of the culture filtrate with the aid of of a clay mineral.
EMI14.1
<tb>
<tb> composition 'of <SEP> the <SEP> liquor <SEP> after
<tb> enzymic <SEP> conversion
<tb> Clay <SEP> mineral <SEP> used <SEP> E.D.
<SEP>% <SEP> dextrose <SEP> (Base
<tb> @@ <SEP> @ <SEP> dry)
<tb> None <SEP> 92.0 <SEP> 86.4
<tb> Bentonite <SEP> Vololay <SEP> 95.5 <SEP> 93.0
<tb> Panther <SEP> Creek <SEP> 95.7 <SEP> 93.3
<tb> Adsorbol <SEP> A-565 <SEP> 95.5 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Adsorbol <SEP> A-46 <SEP> 96.2 <SEP> 94.2
<tb> Filtrol <SEP> 105 <SEP> 95.0 <SEP> 92.1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9S77 <SEP> 95.6 <SEP> 93.1
<tb> Pikes <SEP> Peak <SEP> 9T77 <SEP> 94.8 <SEP> 91.8
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> 95.5 <SEP> 93.0
<tb> Florex <SEP> XXF <SEP> calcined <SEP> 95.7 <SEP> 93.3
<tb> Attapulgite <SEP> 95.7 <SEP> 93.3
<tb> Bandy <SEP> Tan <SEP> 95.6 <SEP> 93.1
<tb> Refractory <SEP> Clay <SEP> from <SEP> Illinois <SEP> 92.9 <SEP> 88.7
<tb> Grundite <SEP> 94.9 <SEP> 92.0
<tb>
<Desc / Clms Page number 15>
EMI15.1
'' '.
E, III Aspersillug ni er yJL-30 is grown in a fermentation tank as described in Example I. When the fermentation is complete, the total culture liquor is removed from the tank. and divided into four 100 ml portions. The first portion is left untreated. The second portion is stirred and added with two grams: "Volclay Bentonite" trademark clay. The mixture containing mycelium and clay is filtered and the filter cake discarded. The third part is filtered without clay treatment. The fourth part is filtered, the filtrate is stirred and 2 g of Volclay bentonite are added. The suspension is then filtered.
Using these four preparations, conversions are carried out to an E.D. e 16 value of fluidized starch, as it is stated in the example
EMI15.2
lle i²J; ' example illustrates the application of the invention to an unfiltered culture liquor.
EMI15.3
<tb>
<tb>
Filtration <SEP> of <SEP> Treatment <SEP> 'Activity <SEP> Composition <SEP> of <SEP> the <SEP> lila <SEP> liquor <SEP> of <SEP> by <SEP> glu-c <SEP > queur <SEP> after <SEP> hydrolysis
<tb>
EMI15.4
culture amylase clay, enzymicē¯¯¯¯¯¯¯ u / ml E.D.% dextrose ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯ Dry.
Unfiltered 2.30 91.1 .8;, 7 3 a, z4 95.3 92.3
EMI15.5
<tb>
<tb> Filtered <SEP> 0 <SEP> 2.30 <SEP> 92.1 <SEP> 86,, 1
<tb> 2.35 <SEP> 95.5 <SEP> 92.8
<tb>
EXAMPLE IV
This example illustrates the effect exerted by different amounts of clay. The enzyme preparation used is a
EMI15.6
filtrate from a submerged culture â As.¯T erillus ni er lL-3'7 The treatment with clay is carried out as in Example 1
<Desc / Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb>
<tb> Quantity <SEP> of clay <SEP> used, <SEP> gr <SEP> for <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> of <SEP> enzymic <SEP> preparation
<tb> 5.0 <SEP> 2.0 <SEP> 1.0 <SEP> 0.5 <SEP> 0.2 <SEP> 0.0
<tb> <SEP> content in <SEP> dextrose <SEP> of <SEP> the <SEP> liqueur-after
<tb> Clay <SEP> used <SEP> enzymic <SEP> hydrolysis, <SEP> @ <SEP> (dry <SEP> base)
<tb> Bentonite <SEP> Volclay <SEP> 94.0 <SEP> 93,
.3 <SEP> 93.1 <SEP> 93.0 <SEP> 88.5 <SEP> 86.5
<tb> Attapulgite <SEP> 93.3 <SEP> 92.0 <SEP> 92.1 <SEP> - <SEP> - <SEP> Florex <SEP> XXF <SEP> 93.0 <SEP> 93.6 <SEP> 91.6
<tb> Panther <SEP> Oreek <SEP> 93.3 <SEP> 93.6 <SEP> 89.1 <SEP> 86.9
<tb>
EXAMPLE V
This example shows the effect of pH on the processing of enzymes with clay minerals. The pH was adjusted to the values given below of separate portions of a culture filtrate from a submerged culture of Asper from gillus niger, using hydrochloric acid or sodium hydroxy. In each 100 ml portion, 2 g of Volclay bentonite are added.
The mixtures were stirred for thirty minutes and filtered. The results of the hydrolyses carried out using the treated enzyme preparations were obtained. pH before addition of clay 5.0 4.5 '4.0 3.0 2.4 2.0 pH of filtrate after treatment 5.2 4.6- 4.0 3.1 2.5 2.2 Gluc-amylase activity of the filtrate, u / ml 2.17 2.24 2.33 1.76 1.03 0.62 Composition of the liquor after enzymic hydrolysis ED 92.5 95.0 95.5 95.6 95, 3 94.8 Dextrose (dry base) 87.9 92.1 93.0 93.2 92.7 91.9 The composition of the thinned starch after hydrolysis by means of the untreated enzyme preparation is 91.4 ED and 85.9 dextrose (dry basis).
EXAMPLE VI
This example shows the application of the invention to other "strains of Aspergillus niger and to other members of the species Aspergillus niger. The enzyme preparations used
<Desc / Clms Page number 17>
are filtrates of cultures prepared by submerged fermentation as described in Example I. A portion of each culture filtrate is treated with 2% Bentonite Volelay as described in Example I. Hydrolysis of the fluidized starch is carried out as described in Example II.
The cultures described under NRRL 330 and NRRL 337 have been studied extensively for the production of amylase [Tsuchiya et al., Cereal Chem. 27, 322 (1950)).
EMI17.1
<tb>
<tb>
<SEP> glue-amylase <SEP> activity <SEP> content in <SEP> dextrose
<tb> of the <SEP> filtrate, <SEP> of <SEP> the <SEP> liquor <SEP> after,
<tb> u / ml <SEP> enzymic <SEP> hydrolysis,
<tb>
EMI17.2
¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯% dry basis'
EMI17.3
<tb>
<tb> Trmitement <SEP> to <SEP> the clay <SEP> With <SEP> With
<tb> Before <SEP> After <SEP> enzyme <SEP> enzyme
<tb> Culture <SEP> Before <SEP> After <SEP> processed <SEP> not <SEP> processed
<tb>
EMI17.4
Aspergillus nioei 11-570 2.30 233 86.1 92.8 àspeSliRs. niger 1liU 330 1.85?, & 0 86.3 9a, 7 Aspergillus ± Qg NRRL 53 '? 2.04 2, & 7 87.3 92 in
EMI17.5
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> phoenieis
<tb> M-381 <SEP>. <SEP> 1.70 <SEP> 2.03 <SEP> 88.8 <SEP> 91.5
<tb>
EMI17.6
1.JLL7:
a'il.C3.9 VII
Commercial preparations of mold enzymes for the saccharification of starch are usually obtained by growing a member of the species Aspergillus flavus-oryzae of the genus Aspergillus on wet bran. The culture is depleted with the help of water or a salt solution. The enzymically active material is precipitated from the extract by adding a water miscible solvent, the precipitate is dried and then mixed with an inert ingredient to obtain a standard activity preparation. The preparation is sold or used in this form. These enzymic preparations are separately suspended in water, suspensions ,. .1
<Desc / Clms Page number 18>
are adjusted to pH 4 and filtered.
To 100 ml of each of the filters, 5 g of Volclay's bentonite are added and the suspensions are filtered after 30 minutes of stirring. The hydrolysis of the fluidized starch is carried out at 50 ° C., pH 4.6-4.8 for seventy-two hours. Separate conversions are carried out using treated and untreated enzyme preparations using an amount of enzyme preparation equivalent to 14 units of gluc-amylase per 100 grams of fluidized dry starch. Table VII shows the results obtained by applying the invention to several enzymic preparations, .- purified solids. The original preparations are resuspended before use.
<Desc / Clms Page number 19>
TIBLE VII
EMI19.1
<tb> Activity <SEP> gluo <SEP> -amylase <SEP> Content <SEP> in <SEP> dextrose <SEP> d <SEP> the <SEP> liquor
<tb> at <SEP> 50 C, <SEP> u / g <SEP> of <SEP> prepa- <SEP> after <SEP> hydrolysis <SEP> enzymic
<tb> enzymic <SEP> ration <SEP>% <SEP> pids <SEP> base <SEP> che
<tb> After <SEP> trait.
<SEP> With <SEP> preparation <SEP> With <SEP> preparation
<tb> Preparation <SEP> Source <SEP> Original <SEP> clay <SEP> original <SEP> Clay <SEP> treated <SEP>
<tb> enzymic
<tb> Enzyme <SEP> AW <SEP> Ba) <SEP> 4.54 <SEP> 3.34 <SEP> 80.1 <SEP> 86.9
<tb> Shozyme <SEP> Sb) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 11.8 <SEP> 11.8 <SEP> 86.6 <SEP> 92.1
<tb> Dextrinase <SEP> a) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae <SEP> 15.0 <SEP> 14.7 <SEP> 87.7 <SEP> 91.3
<tb> Diastase <SEP> 32b) <SEP> -.- <SEP> 53.3 <SEP> 51.4 <SEP> 90.8 <SEP> 91.9
<tb> Mylase <SEP> c) <SEP> Aspergillus <SEP> flavus-cryzae <SEP> 13.5 <SEP> 13.2 <SEP> 91.5 <SEP> 92.8
<tb> a) <SEP> trademark <SEP> registered <SEP> of a <SEP> product <SEP> sold <SEP> by <SEP> Takamine <SEP> Laborstories'
<tb> b)
<SEP> registered <SEP> trademark <SEP> of a <SEP> product <SEP> sold <SEP> by <SEP> Rohm <SEP> & <SEP> Haas <SEP> Company
<tb> c) <SEP> trademark <SEP> registered <SEP> sold <SEP> by <SEP> Wallerstein <SEP> Company.
<tb>