"Hydrolyse enzymatique de l'amidon granulaire"
au brevet principal n[deg.] 813 518 déposé le 10 avril 1974.
Priorité des deux demandes de brevet déposées aux Etats-Unis d'Amérique, respectivement le 8 octobre 1974 sous le
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John HOLIK, dont CPC INTERNATIONAL, INC. est l'ayant droit.
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don granulaire par des enzymes, et elle a plus particulièrement trait à la transformation d'amidon granulaire en hydrolysats suivant le brevet principal.
L'amidon est un glucide polymère de très haut poids moléculaire. Ses motifs monomères, appelés motifs d'anhydroglucose, sont des motifs dérivés du dextrose, et l'hydrolyse totale de l'amidon donne du dextrose. Aux Etats-Unis d'Amérique, le dextrose est produit à partir d'amidon de mais; en Europe, on le tire de l'amidon de mais et de la fécule de pomme de terre; au Japon, on le produit à partir d'amidon de mais et de fécule de patate douce.
Jusqu'à 1960, le dextrose a été préparé par hydrolyse acide de l'amidon. Le procédé de préparation impliquait le chauffage d'amidon en présence d'acide chlorhydrique ou sulfuri-
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carbonate de sodium du mélange obtenu par hydrolyse, une clarification et enfin la cristallisation du dextrose. Malheureusement, le rendement en dextrose est abaissé par la formation de quantités relativement grandes de produits de réversion, c'est-à-dire des produits qui sont formés par une recombinaison de molécules
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conduite à température élevée et à un faible pH, un peu de l'amidon est transformé en hydroxyméthylfurfural, en acide lévulinique et en corps colorés. La formation de ces produits de dégradation est irréversible, et, dans la mesure où ils sont formés, c'est évidemment au détriment du rendement en dextrose désiré.
De plus, l'utilisation d'acide chlorhydrique, ou parfois d'acide sulfurique, et la neutralisation subséquente de cet acide avec une base alcaline entraîne la formation de sels minéraux qui perturbent la cristallisation du dextrose obtenu comme produit final. Plus tard, l'hydrolyse de l'amidon en dextrose a été effectuée au moyen d'enzymes. Le principal enzyme utilisé
à cette fin a été et continue d'être la gluco-amylase. Cet enzyme a pour effet d'hydrolyser l'amidon par un clivage
de sa molécule, qui libère à chaque fois une molécule de dextrose. Toutefois, en pratique, il est nécessaire de commencer par fluidifier l'amidon avant de le soumettre à l'action de la gluco-amylase. Cette fluidification peut être effectuée soit par un acide, soit par un enzyme. L'amidon est fluidifié jusqu'à un équivalent de dextrose (E.D.) d'environ 10-20, puis
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est appelé procédé acide-enzyme, ou procédé enzyme-enzyme, selon la nature de la fluidification que l'on effectue.
Dans le cas du procédé acide-enzyme, l'étape initiale de fluidification à l'acide requiert également une température assez haute, à savoir de l'ordre de 120[deg.]C. Naturellement, cette opération donne des fragments d'amidon qui sont enclins à rétrograder, et donne aussi des produits de réversion. Comme on doit s'y attendre, ces phénomènes ont lieu aux dépens de la formation désirée de dextrose.
Il en est de même du procédé enzyme-enzyme, qui requiert, lui aussi, une température relativement haute pour
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De plus. la pratique usuelle consiste à chauffer l'amidon fluidifié à des températures encore plus hautes, à savoir de l'ordre de 120 à 160[deg.]C, pour achever la gélatinisation de l'amidon et pour en faciliter la filtration. De plus, il se forme certains complexes de matière grasse et d'amylose, qui sont très insolubles et qui compliquent la filtration.
Aucun de ces procédés n'est totalement dépourvu de difficultés de traitement, à cause de la présence inévitable de produits de rétrogradation, de complexes d'amidon et de matière grasse et de produits de réversion. Dans la mesure où tous ces produits sont formés, on se heurte à des difficultés de traitement, notamment dans la filtration du mélange obtenu comme produit, et le rendement en dextrose est réduit.
Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 2 583 451 décrit un procédé d'hydrolyse enzymatique qui n'implique pas
de gélatinisation à température élevée, mais dont les rendements en dextrose sont très faibles. Leach et Collaborateurs proposent de même dans "Cereal Chemistry", volume 38, n[deg.] 1 de Janvier 1961, pages 34-46, l'hydrolyse enzymatique d'amidon granulaire avec diverses alpha-amylases, mais à basses températures.
L'invention concerne un procédé de solubilisation d'amidon, qui consiste à mélanger un amidon granulaire, de l'eau et une alpha-amylase bactérienne, et à chauffer le mélange à une température comprise entre la température normale de gélatinisation commençante et la température de gélatinisation réelle de l'amidon et à un pH avantageusement compris entre 5 et environ 7. Un enzyme saccharifiant peut être ajouté en même temps que l'alpha-amylase bactérienne ou pendant la solubilisation, ou lorsque l'amidon granulaire a atteint un degré sensible de solubilisation. L'enzyme saccharifiant peut être
la gluco-amylase ou un enzyme maltogénique, par exemple la bêta-amylase. L'enzyme saccharifiant est avantageusement ajouté après que l'amidon granulaire a atteint un degré sensible
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de solubilisation, ou à une température plus basse, c'est-àdire à une température comprise entre environ 50 et environ
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t don granulaire à l'action d'alpha-amylase bactérienne seule, c'est-à-dire en l'absence d'un enzyme saccharifiant. De l'ami- don granulaire, de l'eau et une alpha-amylase bactérienne sont alors mélangés dans les conditions indiquées ci-dessus pour produire un hydrolysat soluble d'amidon.
L'amidon utilisé peut être l'un quelconque de ceux dont on dispose ordinairement, à savoir l'amidon de mais, l'amidon de mais cireux, la fécule de manioc, la fécule de pomme de terre, la fécule de patate douce, l'amidon de blé, la fécule de sagou, l'amidon de sorgho, un amidon ou une fécule à haute teneur en amylose, etc. On peut utiliser les formes cireuses et non cireuses de l'amidon. Comme on l'a indiqué, l'amidon est sous la forme granulaire.
On obtient aussi de bons résultats en utilisant un gruau de mais et d'autres matières premières à forte teneur en amidon. On préfère l'amidcn de mais non cireux.
Le procédé de l'invention offre L'avantage important de pouvoir être appliqué à une suspension aqueuse dont les concentrations sont relativement fortes. La teneur en matières solides de la suspension d'amidon se situe généralement entre environ 5 et environ 40% et notamment entre 10 et 30%. On peut naturellement utiliser des concentrations plus faibles et, d'une façon générale, le degré de solubilisation de l'amidon est d'autant plus grand et, par conséquent, le rendement en dextrose est d'autant plus fort que la concentration est réduite, lorsqu'on utilise la gluco-amylase: comme enzyme saccharifiant. Cependant, il est très désirable dans la plupart des cas pratiques, d'utiliser des volumes réduits, c'està-dire des concentrations élevées en amidon.
Cela a pour effet d'éviter, ou tout au moins de réduire les frais considérables qu'entraîne la concentration du mélange hydrolysé, avant de
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fois, il arrive que l'avantage de la présente addition puisse être suffisant pour compenser cet inconvénient, et une concen-tration en matières solides d'environ 10% peut alors être recommandable.
Le procédé de l'invention permet de solubiliser pratiquement tout l'amidon d'une suspension aqueuse à 25% en une période de 24 heures. De plus, aux concentrations élevées, tout amidon non dissous peut être recyclé, ce qui améliore donc le rendement total, en portant le taux de solubilisation de l'amidon à plus de 90%.
On choisit de préférence une alpha-amylase bactérienne qui est active dans la plage de pH d'environ 4,0 à environ 7,0 et qui déploie une activité appréciable à des températures relativement basses, c'est-à-dire au-dessous de la température à laquelle l'amidon que l'on traite se gélatinise. Des sources avantageuses de ces alpha-amylases comprennent certaines espèces de micro-organismes du genre
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décrites dans la demande de brevet de la République Fédérale
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nique n[deg.] 1 296 839 et dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3 697 378. Il est très avantageux d'utiliser des amylases
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demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne
n[deg.] 2 025 748 précitée. On recommande particulièrement d�utiliser l'alpha-amylase provenant de la souche NCIB 8061 de
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souches NCIB 8059, ATCC 6598, ATCC 6634, ATCC8480, ATCC 9945A et ATCC 11945 de B. licheniformis. Ces micro-organismes sont d'une efficacité exceptionnelle dans la liquéfaction de l'amidon granulaire. L'un de ces enzymes est le produit de marque déposée. "Thermamyl", de la tirme Novo Enzyme Corporation, Mamaroneck, New York. Pour une telle application, l'alpha-amylase doit être utilisée à une concentration d'environ 0,1 à environ 25 unités par gramme d'amidon (sur base sèche) dans les conditions de pH et de température indiquées précédemment. Le produit "Thermamyl", est caractérisé par les propriétés suivantes:
(a) il est stable à la chaleur;
(b) il est actif dans une large plage de pH; et
(c) son activité et sa stabilité à la chaleur dépendent moins de l'addition d'ion calcium que celles des autres alpha-amylases.
On indique ci-après des compositions représentatives de trois préparations différentes de "Thermamyl":
"Thermarnyl" "Thermamyl" "Thermamyl"
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D'autres formes convenables d'alpha-amylases, dont
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TABLEAU 1
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unités d'activité par millilitre de solution d'enzyme.
La quantité d'alpha-amylase bactérienne que l'on utilise va d'environ 0,1 à environ 25 unités par gramme d'amidon (sur base sèche). L'utilisation de quantités plus grandes n'offre aucun avantage pratique; le gain de solubilisation de l'amidon qui résulte de l'utilisation de plus de 25 unités par gramme ne compense pas la dépense additionnelle d'enzyme. La quantité optimale d'alpha-amylase dépend de la quantité d'enzyme saccharifiant tel que la gluco-amylase et/ou la bêta-
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d'alpha-amylase va d'environ 1,0 à environ 10 unités par gramme d'amidon (sur base sèche).
L'activité d'alpha-amylase d'un enzyme se détermine par la méthode suivante:
On fait réagir l'enzyme avec une solution d'amidon
de titre connu, dans des conditions bien définies. On détermine l'activité enzymatique d'après le degré d'hydrolyse de l'amidon, qui se traduit par une réduction de la capacité de coloration par l'iode, que l'on mesure par spectrophotométrie. L'unité d'activité d'alpha-amylase bactérienne est la quantité d'enzyme nécessaire pour hydrolyser 10 mg d'amidon par minute dans les conditions de l'essai. La méthode est applicable à des alphaamylases bactériennes, y compris les préparations industrielles et excepté les matières à grand pouvoir saccharifiant.
On dissout 0,3 à 0,5 g d'échantillon solide ou
0,3 à 1,0 ml d'échantillon liquide dans une quantité suffisante de solution aqueuse de chlorure de calcium 0,0025 M pour obtenir une solution d'enzyme dont l'activité est d'environ 0,25 unité par millilitre.
On agite un mélange de 10 ml de solution d'amidon
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litre de l'échantillon d'enzyme à titrer et on maintient le mélange pendant exactement 10 minutes dans un bain réglé à
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d'un millilitre et on l'ajoute à un mélange d'un millilitre
de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1M et d'environ 50 ml d'eau distillée. La capacité de coloration par l'iode de cet échantillon acidifié est ensuite déterminée par addition de 3,0 ml de solution aqueuse d'iode à 0,05%, dilution à 100 ml avec de l'eau distillée, puis agitation correcte. L'absorption de la solution, par rapport à celle de l'eau distillée, est mesurée à 620 nm dans une cellule de deux centimètres ("nm" est le symbole du nanomètre, un nanomètre étant égal à 1 millimicron, ce qui fait une longueur d'onde de 10 �9 mètre).
On effectue une mesure identique sur la solution d'amidon de titre connu (à laquelle de l'eau est ajoutée au lieu de la solution d'enzyme) pour déterminer l'absorption d'un blanc.
L'activité enzymatique, en unités/gramme ou en unités/ml, est donnée par la relation:
(Absorption du blanc - absorption de l'échantillon) x facteur
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peut être l'une quelconque des préparations bien connues d'amylase fongique, notamment celles que l'on obtient à partir de représentants des genres Aspergillus, Endomyces et Rhizopus. Une gluco-amylase très recommandable est celle que
l'on obtient par le procédé décrit dans le brevet des
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tion d'amylase fongique est débarrassée de l'activité indésirable de trans-glucosidase par traitement avec une matière
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viron 5, 0 unités par gramme d'amidon (sur base sèche). De préférence, sur la base d'un équilibre entre le coût et le comportement de l'enzyme, on utilise environ 0,1 à environ 0,3 unité de gluco-amylase par gramme d'amidon (sur base sèche).
L'activité de gluco-amylase est déterminée comme suit:
Le substrat est un hydrolysat acide d'amidon de mais, d'équivalent de dextrose égal à 15-18, dissous dans l'eau et dilué à 4,0 g de matière sèche par 100 ml de solution. On introduit à la pipette, exactement 50 ml de solution
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de tampon acétate de sodium-acide acétique 1,0 M (pH 4,3).
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bout de 10 minutes, on ajoute la quantité correcte de préparation d'enzyme. Exactement 120 minutes après l'addition de la préparation d'enzyme, on ajuste la solution au point de virage à la phtaléine du phénol avec une solution normale d'hydroxyde de sodium. On laisse ensuite refroidir la solution à la température ambiante et on ajuste le volume au trait de jauge. Le titre en sucres réducteurs, exprimé en dextrose,est déterminé sur l'échantillon dilué et sur un témoin non additionné de préparation d'enzyme. L'activité de gluco-amylase est calculée d'après la relation suivante:
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dans laquelle:
A désigne l'activité de gluco-amylase en unités par millilitre (ou par gramme) de préparation d'enzyme;
S désigne le titre en sucres réducteurs de l'échantillon hydrolysé par l'enzyme, en grammes par 100 ml;
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en grammes par 100 ml;
E désigne la quantité utilisée de préparation d'enzyme en millilitres (ou en grammes).
La valeur de "S" ne doit pas dépasser 1,0 g par
100 ml.
Pour effectuer la saccharification en vue de produire des sirops à forte teneur en maltose et/ou des sirops contenant des disaccharides et des trisaccharides, on utilise comme enzyme saccharifiant un enzyme maltogénique.
L'enzyme maltogénique, c'est-à-dire la bêta-amylase, peut provenir de grains convertis en malt, par exemple orge, sorgho, soja, patate douce ou blé. L'orge maltée peut être obtenue de diverses sources commerciales, sous diverses marques déposées, par exemple "Fromalt 72" et malt-amylase "PF". On peut aussi utiliser le "Biozyme M", qui est un enzyme fongique. La quantité totale de bêta-amylase que l'on doit utiliser dans les opérations de saccharification pour la production d'un sirop à forte teneur en maltose, va d'environ 0,1 à environ 5 unités par gramme d'amidon (sur base sèche).
L'activité (en unités) de bêta-amylase est déterminée par la méthode suivante:
On broie un échantillon de 5,00 g de matière renfermant de la bêta-amylase, en particules traversant un tamis de 0,84 mm d'ouverture de maille; on place la matière broyée dans une fiole jaugée de 100 ml, et on la met en suspension dans 70-80 ml d'eau distillée. On agite ce mélange pendant trois heures à la température ambiante, on le dilue exactement à 100 ml avec de l'eau distillée et on le filtre par gravité sur un papier-filtre "Whatman" n[deg.] 12. On dilue un échantillon de 10 ml de l'extrait d'enzyme (filtrat) à un volume de 100 ml avec de l'eau distillée.
On prépare une solution à environ 8% en poids
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aqueuse d'hydrolysat d'amidon choisie de manière qu'il y ait environ 40,0 g de matière sèche. On transvasa quantitative- ment cette solution pesée dans une fiole jaugée de 500 ml, et on complète le volume au trait de jauge, puis on agite énergiquement. On prélève à la pipette un échantillon de 50,0 ml de cette solution d'hydrolysat d'amidon, que l'on introduit dans une fiole jaugée de 100 ml et on y ajoute 5 ml de solution tampon à l'acétate de sodium. On élève à 50[deg.]C la température de la solution résultante, puis on introduit à la pipette, dans la fiole, une portion aliquote de l'extrait d'enzyme dilué indiqué ci-dessus. On prépare un blanc identique, c'est-à-dire que de l'eau distillée y remplace l'extrait
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Au bout de 55-57 minutes, on ajoute dans chaque fiole 3 gouttes de phénol-phtaléine, comme indicateur coloré. Après un laps de temps de 60 minutes exactement, on retire les fioles du bain réglé à 50[deg.]C et on neutralise immédiatement leur
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l'addition d'une solution aqueuse à 1% d'hydroxyde de sodium, plus un excès de 0,5 millilitre. On laisse refroidir le contenu 1
de la fiole à la température ambiante, puis on le dilue au trait de jauge avec de l'eau distillée, et on agite correctement. La teneur en sucres réducteurs de portions aliquotes de S,0 ml est déterminée par la méthode Schoorl.Le calcul de l'activité enzymatique, exprimée en unités par gramme d'amidon sec, s'effectue comme indiqué ci-après:
A. Teneurs en sucres réducteurs (S.R.):
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Il arrive que l'on doive incorporer un enzyme du type iso-amylase tel la pullulanase dans l'étape de solu-
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deux étapes du procédé. La quantité d'iso-amylase peut aller d'environ 0,10 à environ 0,5 unité par gramme d'amidon. L'utilisation de pullulanase, par exemple, est efficace pour accroître la solubilisation et pour faciliter la filtration de l'hydrolysat final .
Le mode le plus avantageux de mise en oeuvre du procédé de l'invention implique la préparation d'une suspension aqueuse d'amidon granulaire et d'une alpha-amylase. La
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peut aussi renfermer un ou plusieurs enzymes saccharifiants du type défini ci-dessus. La présence de gluco-amylase ou de bêta-amylase dans la suspension accélère la dissolution de l'amidon granulaire et réduit par conséquent la durée de cette
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enzymes saccharifiants dans la suspension aqueuse à ce stade
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plémentaires occasionnés par les enzymes et l'influence bénéfique qui est exercée. Ainsi, lorsqu'un ou plusieurs enzymes saccharifiants sont utilisés dans l'étape de solubilisation, leur quantité va d'environ 0,01 à environ 0,30 unité de gluco-amylase par gramme d'amidon (sur base sèche) ou d'environ 0,1 à environ 5 unités de bêta-amylase par gramme d'amidon (sur base sèche) suivant le cas.
Le choix du pH est régi par le pH optimal de l'alpha-amylase particulière que l'on utilise. Le produit "Thermamyl" déploie son activité optimale à un pH de 5-7; l'activité optimale du produit "Rapidase" correspond à un pH d'environ 6,0; etc. Dans les cas, décrits plus loin, où un enzyme saccharifiant coopère avec l'alpha-amylase, le pH plus faible auquel les enzymes saccharifiants suceptibles
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ils sont stables) requiert une modification du pH optimal lorsque l'alpha-amylase est utilisée seule. La gluco-amylase par exemple, déploie son activité optimale à un pH de 4,0 à
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un peu plus haut, mais encore inférieur au pH d'activité maximale de l'alpha-amylase. Il est donc nécessaire de choisir un pH auquel l'alpha-amylase, utilisée seule, a son maximum d'activité, ou un pH auquel les divers enzymes, lorsqu'ils sont utilisés en association, déploient leur activité optimale combinée. La température du mélange réactionnel utilisé dans le procédé de solubilisation, doit se situer, comme on l'a mentionné, entre la température normale de gélatinisation commençante et la température de gélatinisation réelle de l'amidon. Ordinairement, la température se trouve à la limite supérieure de cette gaame. Un avantage particulier du procédé réside dans le fait que de hautes températures sont évitées.
Cela permet de réduire considérablement les frais de chauffage dans ce procédé, et de minimiser la formation de corps colorés, d'où l'économie réalisée sur les frais de raffinage. Il est intéressant de remarquer que le procédé peut être mis en oeuvre à des températures supérieures à la température normale de gélatinisation commençante d'un amidon, sans gélatinisation appréciable se traduisant par une élévation de la viscosité.Bien que l'amidon de mais, par exemple,
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gélatinisation de 62-72[deg.]C, ce qui représente sa gamme "normale" de températures de gélatinisation, le procédé de la présente invention peut être appliqué à un amidon de mais à
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appréciable de la viscosité. En fait, il est habituellement désirable de mettre le procédé en oeuvre à ces températures élevées, parce que cela accélère la solubilisation de l'amidon, et en améliore le degré.
La température de solubilisation de l'amidon granulaire doit aller d'environ 40[deg.]C à un maximum correspondant à la température de gélatinisation réelle de l'amidon, c'est-à-dire une température d'environ 80[deg.]C. De préférence, la température de solubilisation se situe dans la plage
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procédé d'hydrolyse réside dans 1* fait que l'action prolongée de hautes températures est évité, avec les avantages déjà indiqués qui en résultent.
Lorsque la réaction est conduite à des températures dépassant la température normale de gélatinisation commençante de l'amidon, il est désirable que des produits d'hydrolyse soient présents pendant la réaction. On peut
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température égale ou inférieure à la température de gélatinisation commençante, et chauffer ensuite le mélange jusqu'à la température désirée. Ainsi, les produits d'hydrolyse inhibent la gélatinisation de l'amidon granulaire aux températures élevées et l'amidon insolubilisé reste sous la forme granulaire. Par conséquent, l'amidon résiduel peut
être aisément filtré.
Le choix du pH dépend des enzymes particuliers
que l'on utilise dans le procédé. Théoriquement, l'enzyme fluidifiant et l'enzyme saccharifiant doivent déployer leurs activités optimales aux mêmes pH, mais en pratique, cela est peu probable. La gluco-amylase est, bien sûr, l'enzyme saccharifiant que l'on utilise pour la production de sirops de glucose et pour la production de dextrose, et son activité optimale est déployée à un pH d'environ 4,5.
Le produit "Thermamyl", quant à lui, exerce son activité optimale à un pH de 5,5 à 7 et il n'est pas suffisam- ment actif à un pH inférieur à 5 pour- favoriser- la solubili- sation désirée de l'amidon. Généralement, il en est de même en ce qui concerne les autres alpha-amylases.
Par conséquent, pour la production de glucose ou de dextrose, le pH doit avantageusement être compris dans la plage d'environ 5,0 à environ 7,0, c'est-à-dire dans les Usités entre lesquelles la gluco-amylase et l'alpha-amylase ont une activité efficace.
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tion se prête à la solubilisation de l'amidon granulaire
avec une préparation enzymatique d'alpha-amylase bactérienne dans une première étape qui peut impliquer, à titre de variante, un enzyme saccharifiant tel que gluco-amylase ou bêtaamylase; cette première étape est donc suivie d'une étape de saccharification ou d'hydrolyse. Dans ce procédé, la température qui règne pendant la solubilisation se situe de préférence entre environ 55 et environ 75[deg.]C. Après la solubilisa-tion, la température peut être abaissée à environ 50-65[deg.]C
et cette température peut être maintenue pendant environ
40 à environ 120 heures. De même, le pH est avantageusement ajusté de manière à créer les conditions optimales de saccha-
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le pH est alors abaissé entre environ 4,0 et environ 4,5.
Si l'enzyme saccharifiant consiste en bêta-amylase, le pH
est dans ce cas ajusté entre environ 4,0 et environ 6,0. Parfois, il peut être avantageux que le pH soit le même dans toutes les opérations.
Une forme avantageuse de mise en oeuvre de l'invention implique une opération d'ultra-filtration. Par le choix d'une membrane semi-perméable convenable, l'enzyme et l'amidon qui n'a pas réagi peuvent être totalement retenus par cette membrane, tandis que le dextrose obtenu comme produit passe à travers la membrane à mesure de sa formation, attendu que son poids moléculaire est plus bas. L'ultr.a-filtration est décrite dans "New Separation Technique for the CPI", Chemical
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Dans une autre forme avantageuse de mise en oeuvre,
de l'invention, le mélange contenant l'amidon à hydrolyser renferme un agent tensio-actif anionogène. A certaines con- centrations, l'agent tensio-actif améliore le degré de solu- bilisation et le rendement en dextrose, et cela est vrai à des concentrations allant d'environ 0,01 à environ 1,0%. On obtient les meilleurs résultats en utilisant une concentra- tion en agent tensio-actif anionogène d'environ 0,05 à envi- ron 0,50%. Des exemples représentatifs d'agents tensio-actifs
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nent le laurylsulfate de sodium, le dodécylbenzène-sulfonate de sodium, le naphtalène-sulfonate de sodium à substituant <EMI ID=51.1>
de triéthanolamine, dont le groupe alkyle provient d'alcools produits par réduction des glycérides du suif ou de l'huile
de noix de coco. Généralement les dispersifs anionogènes utilisés dans le procédé de l'addition sont des sels hydrosolubles porteurs d'un groupe alkyle contenant environ 8 à environ 20 atomes de carbone, d'un radical ester d'acide sulfonique ou sulfurique ou d'un cation sodium, potassium, ammonium ou amine aliphatique ayant moins de dix atomes de carbone.
Dans une autre variante avantageuse, le procédé est mis en oeuvre en deux étapes, en ce qui concerne le pH du mélange contenant l'amidon à hydrolyser. La première étape est conforme à celle qui a été décrite ci-dessus, c'est-à-dire
que le pH y est maintenu entre environ 5,0 et environ 7,0 jusqu'à ce qu'au moins environ 10% de l'amidon ait été solubilisé et de préférence jusqu'à ce que la solubilisation de l'amidon commence à se stabiliser. Dans le cas ordinaire, il en est ainsi au bout d'environ 16 heures. Le mélange hydrolysé peut être filtré à ce stade, le cas échéant. Le pH est ramené dans la plage d'environ 4,0 à environ 5,0. Dans cette plage de pH, l'activité de la gluco-amylase est plus forte qu'à des pH élevés et, en fin de compte, le rendement en dextrose est un peu amélioré.
Une variante particulièrement avantageuse, aboutissant à la formation de dextrose en proportions importantes, implique une étape (1) d'agitation d'un mélange d'un amidon granulaire, d'eau, et d'une alpha-amylase bactérienne, à une température comprise entre la température normale de gélatinisation commençante de l'amidon et la température de gélatinisation réelle de l'amidon et à un pH d'environ 5,0 à environ 7,0 pour transformer au moins 10% de l'amidon en un hydrolysat soluble; et une étape (2) de réglage de la tempé-rature à 50-65[deg.]C et du pH à 4,0-4,8, et d'addition de glucoamylase pour saccharifier l'hydrolysat soluble. L'étape (1) dure généralement 12 heures environ; au contraire, l'étape
(2) prend ordinairement beaucoup plus de temps, à savoir environ 24 à environ 120 heures. Parfois, il est recommandable d'ajouter de la gluco-amylase au mélange dans l'étape (1). Les quantités d'alpha-amylase et de gluco-amylase utilisées dans l'étape (1) sont les mêmes que celles qui ont été indiquées ci-dessus à propos de la transformation directe de l'amidon granulaire en hydrolysat soluble.
Le supplément de gluco-amylase mentionné ci-dessus, que l'on utilise dans la seconde étape, va d'environ 0,1 à environ 1,0 unité d'activité par gramme d'amidon sur base sèche.
L'hydrolysat d'amidon peut être traité de la manière usuelle, c'est-à-dire par concentration et cristallisation.
Un exemple représentatif d'une hydrolyse enzymatique du type défini ci-dessus est donné ci-après:
Exemple 1
On prépare une suspension contenant 125 parties d'amidon (sur base sèche) et 350 parties d'eau distillée, dans un bêcher en acier inoxydable d'un litre de capacité.
Le cas échéant, on ajoute du calcium (par exemple dans le cas de l'utilisation d'alpha-amylases autres que le produit "Thermamyl") sous la forme d'une solution aqueuse de chlorure de calcium à 40 mg de calcium par millilitre, pour accroître de 100 mg/kg la quantité de calcium présente dans la suspension (l'amidon contient un peu de calcium, et il en est de même de l'alpha-amylase). On ajuste le pH à 5,5 par l'addition d'une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium; on ajoute de l'alpha-amylase bactérienne et de la gluco-amylase et on ajuste le poids total de la suspension à 500 parties par l'addition d'eau distillée.
On place le bécher dans un bainmarie, on agite son contenu et on le chauffe à 60-75[deg.]C, puis on le maintient à cette température pendant la période indiquée de réaction; on contrôle périodiquement le pH et, au besoin, on le réajuste à 5,5. On filtre ensuite le produit et on lave le résidu du filtre, on le sèche et on le pèse pour déterminer la portion de l'amidon qui reste insolubilisée. Le tableau II suivant illustre les résultats que l'on obtient en suivant
ce mode opératoire. Dans chaque cas, les résultats sont basés sur l'utilisation d'une suspension aqueuse à 25-30% d'amidon de mats granulaire, à un pH de 5,5 et à une température de 6S-75[deg.]C.
<EMI ID=52.1>
qui est bien au-dessus de la température de gélatinisation commençante que l'on attribue à l'amidon de maïs), l'amidon non solubilisé conserve sa nature granulaire pendant toute la durée de l'hydrolyse.
I TABLEAU II
i Numéro Concen- Dose (a) Durée Tempéra- Solubili- de l'es- tration d'enzyme heures ture sation(d)
<EMI ID=53.1>
%
<EMI ID=54.1>
(a) unités par gramme d'amidon
(b) alpha-amylase bactérienne
(c) gluco -amylase
(d) pourcentage d'amidon solubilisé
(e) "Thermamyl"
(f) 60-75[deg.]C pendant deux heures,
75[deg.]C pendant 24 heures
(g) 60[deg.]C pendant 24 heures, puis comme en (f)
(h) enzyme élaboré par un micro-organisme de l'espèce
<EMI ID=55.1>
(i) 60[deg.]C pendant 24 heures,
65[deg.]C pendant 24 heures.
Exemple 2
L'influence solubilisante exercée par les alphaamylases seules sur l'amidon granulaire, aux températures élevées de la présente invention, est mise en évidence par les résultats reproduits sur le tableau in suivant. Dans chaque cas, une suspension à 25 ou 30% d'amidon granulaire est agitée avec une alpha-amylase à 60-750C, à un pH de 5,5 pendant 25 heures.
TABLEAU III
<EMI ID=56.1>
(a) Unités par gramme d'amidon
(b) Pourcentage d'amidon solubilisé
(c) 60-75[deg.]C pendant deux heures,
75[deg.]C pendant 24 heures.
Exemple 3
Comme indiqué ci-dessus, une forme très avantageuse de mise en oeuvre de l'addition implique la préparation de dextrose par un procédé à deux étapes: dans la première étape l'amidon granulaire est transformé en un hydrolysat d'amidon par traitement avec une alpha-amylase, seule ou en association avec la gluco-amylase, à une température comprise entre la température normale de gélatinisation commençante et
la température réelle de gélatinisation de l'amidon et à
un pH de 5,7; ensuite, dans la seconde étape, la température est abaissée à 50-65[deg.]C, le pH est abaissé à 4,0-4,8 et un supplément de gluco-amylase est ajouté. Ces conditions sont maintenues pendant 24-120 heures. Les résultats obtenus dans ce procédé à deux étapes, dont la première utilise en association l'alpha-amylase et la gluco-amylase (GA), sont reproduits sur le tableau IV. Dans chaquecas,la suspension contient
25% d'amidon, et dans la seconde étape, un supplément de 0,14 unité de gluco-amylase est ajouté après que la température a été réglée à 60[deg.]C et que le pH, de 5,5 dans la première étape, a été ramené à 4,3.
TABLEAU IV
<EMI ID=57.1>
(a) 0,14 unité de GA à 60[deg.]C
(b) sur la base de matières solides contenues dans le filtrat.
Exemple 4
D'autres résultats obtenus dans des essais similaires, dans lesquels l'alpha-amylase a été utilisée seule dans la première étape, sont donnés sur le tableau V.
Dans chaque cas, la suspension contient 30% d'amidon.
TABLEAU V
<EMI ID=58.1>
(a) Sur la base des matières solides contenues dans le filtrat.
Lorsque de l'amidon granulaire est hydrolysé par l'action d'alpha-amylase bactérienne et saccharifié par l'action d'un enzyme maltogénique tel que la bêta-amylase, seule ou en association avec une iso-amylase telle que la pullulanase, on obtient un hydrolysat il forte teneur en disaccharides
(maltose) et en trisaccharides (maltotriose). La composition exacte de l'hydrolysat varie en fonction des conditions réelles dans lesquelles le procédé a été mis en oeuvre, c'est-à-dire la quantité d'enzymes que l'on a utilisée et la présence d'une. pullulanase.
Le tableau VIsuivant fait apparaître les caractéristiques essentielles des nouveaux hydrolysats à forte teneur
en maltose et malto-triose produits par le procédé de la présente addition.
TABLEAU VI
Caractéristiques de produits à forte teneur
<EMI ID=59.1>
sur base sèche
<EMI ID=60.1>
(a) Dextrose
(b) Maltose
(c) Malto-triose
(d) Polysaccharides, par exemple maltotétrose et homologues supérieurs (�) DP = degré de polymérisation
Les exemples suivants, donnes à titre non limitatif, font mieux ressortir la nature de la présente invention, de la préparation et des caractéristiques des hydrolysats remarquables décrits ci-dessus.
Exemple 5
Cet exemple illustre la préparation d'hydrolysats
à forte concentration en maltose et malto-triose. L'hydrolysat remarquable est obtenu en utilisant une association d'alpha- <EMI ID=61.1>
améliore la quantité formée de maltose et de malto-triose.
Pour préparer les produits remarquables à forte teneur en maltose et malto-triose de l'addition: -, on opère par exemple comme suit:
Une suspension contenant, sur base sèche, 125 g d'amidon de maïs dans 300-350 ml d'eau est préparée dans un bécher taré. La température de la suspension est stabilisée dans un bain-marie à 60[deg.]C et le pH est ajusté à 5,5 par addition d'hy-
<EMI ID=62.1>
poids connus d'alpha-amylase bactérienne "Novo" et d'orge maltée broyée ("Froedtert", qualité 72-H) en quantités équivalant à 2-20 unités d'alpha-amylase et à 0,1-1,0% de malt (sur base sèche), par rapport à l'amidon considéré sur la base de la substance sèche. L'addition d'une unité de pullulanase par gramme de substance sèche exerce également un effet bénéfique. Si l'alpha-amylase utilisée est sous la dépendance du calcium, la phase digérée doit contenir 100 à 200 parties par million d'ions calcium. Le calcium peut être ajouté sous la forme d'une solution aqueuse de son chlorure. Le poids de suspension est ensuite ajusté à 500 g par l'addition d'eau en quantité suffisante pour que la concentration d'amidon soit d'environ 25% en poids.
La suspension en cours de digestion est ensuite placée de nouveau dans le bain-marie réglé à 60[deg.]C et elle est agitée lentement pendant 24 heures. Le pH est contrôlé périodiquement et, au besoin, réajusté à 5,5. A la fin de la durée présumée de réaction, l'eau perdue par évaporation est remplacée et le liquide est filtré (filtration sous vide sur entonnoir Buchner N[deg.] 4, papier "Whatman" N[deg.] 1). Une portion de 200 ml du filtrat est transvasée dans une fiole d'Erlenmeyer fermée à l'aide d'un bouchon Bunsen et chauffée pendant 15 minutes au bain-marie bouillant pour désactiver les enzymes présents. Une analyse du filtrat indique la quantité de substance sèche, l'équivalent de dextrose et la composition des glucides.
L'amidon retenu sur le filtre est lavé avec environ
500 ml d'eau, séché pendant environ 16 heures dans une étuve à air à 50[deg.]C, pesé et analysé (détermination du taux d'humidité). Le pourcentage d'amiaon solubilisé pendant la digestion est calculé d'après la relation suivante:
<EMI ID=63.1>
Amidon % x 100
125 g
On a conduit plusieurs digestions d'amidon de maîs granulaire, en suivant le mode opératoire décrit ci-dessus et en utilisant diverses associations d'alpha-amylase bactérienne, d'orge maltée broyée et de pullulanase. Le produit "Thermamyl"
60 (alpha-amylase bactérienne liquide de la firme Novo Enzyme Corporation) est l'une des préparations enzymatiques d'alphaamylase qui ont été utilisées, et le produit B-221 est une alpha-amylase préparée par l'action du micro-organisme Bacillus subtilis, par la firme CPC International Inc.
La pullulanase est un enzyme déramif iant produit par des micro-organismes de l'espèce Aerobacter aerogenes par incubation dans des conditions convenables de culture aérobie.
Les résultats obtenus sont indiqués ci-après.
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
Conditions:
25% en poids d'amidon de mats, 60[deg.]C, 24 heures, pH 5,5, addition de 100 parties par million de calcium
Les résultats et les informations donnés ci-dessus démontrent que le procédé de l'addition est capable de solubiliser plus de 56% de l'amidon de mais granulaire (à savoir environ
56 à environ 67% sur base sèche) en utilisant le système bi-enzymatique comprenant une alpha-amylase bactérienne et l'enzyme maltogénique (orge maltée). Il ressort de ces informations que les hydrolysats ont un équivalent de dextrose d'environ 40 à environ 60, de préférence d'environ 40 à environ 55 et notamment d'environ 40 à environ 50. L'une des caractéristiques remarqua-
<EMI ID=66.1>
d'environ 10% de dextrose. Les hydrolysats remarquables peuvent être caractérisés par une teneur combinée en maltose et malto-
<EMI ID=67.1>
environ 90% en poids sur base sèche et une teneur en dextrose de préférence inférieure à environ 5%, sur base sèche.
<EMI ID=68.1>
des produits à forte teneur en maltose et maltotriose de la présente addition est la présence d'une grande quantité (à savoir au moins environ 25% en poids sur base sèche:) de maltotriose et d'une faible proportion de dextrose. Les hydro- lysats à forte teneur en maltose de l'art antérieur contien- nent généralement, au maximum, environ 20% en poids de malto- triose sur base sèche.
Les informations données ci-dessus démontrent aussi que l'addition d'une isoamylase telle que la pullulanase au mélange traité par digestion élève la concentration en malto- triose de la composition.
Exemple 6
<EMI ID=69.1>
obtenu par digestion d'un substrat d'amidon soluble, sous l'action combinée d'alpha-amylase bactérienne et d'un enzyme maltogénique, a été déterminée en vue de comparer les résul- tats obtenus dans les mêmes conditions pour un substrat con- sistant en un amidon granulaire.
Les digestions d'une préparation à 25% en poids
d'un hydrolysat d'amidon de mais cireux d'équivalent de dex- trose égal à 4,8 (l'hydrolysat d'amidon cireux liquéfié est préparé par liquéfaction enzymatique à l'alpha-amylase bac-
<EMI ID=70.1>
ou "B-221" de CPC), de malt et de pullulanase à 60[deg.]C et à un pH de 5,5. Le mode opératoire utilisé dans cet exemple est le même que celui de l'exemple 5. Les teneurs en saccharides de l'hydrolysat ont été comparées avec les résultats obtenus
<EMI ID=71.1>
Les données comparatives sont illustrées sur le tabler*.: VIII suivant:
TABLEAU VIII
Digestion d'amidon liquéfié et d'amidon granulaire, sous l'action combinée d'une alpha-amylase bactérienne et d'un enzyme
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
(a) Doses d'enzymes:
<EMI ID=74.1>
de substance sèche, excepté dans le cas de l'amidon granulaire traité à l'alpha-amylase "B-221", pour lequel on utilise 20 unités/g de substance sèche; une unité de pullulanase/g de substance sèche; et 0,5% de malt sur base sèche.
<EMI ID=75.1>
(ci Degré de solubilisation de 57 à 61%.
Les résultats reproduits ci-dessus démontrent que, en opérant dans des conditions identiques, on obtient à partir d'amidon granulaire, de plus grandes quantités de maltotriose que si l'on utilise l'amidon liquéfié comme substrat. Il y a lieu de remarquer que l'addition de pullulanase augmente les teneurs en disaccharides et en trisaccharides et que le produit "Therma:nyl 60" donne davantage de maltotriose que l'alpha-amylase bactérienne "B-221".
Exemple 7
On répète le mode opératoire de l'exemple précédent, mais on fait agir en association le produit "Thermamyl L-60" et du soja (utilisé comme préparation d'enzyme maltogénique). On conduit les digestions (au nombre de deux) à un pH de 5,5 à 6,5. Les résultats de ces opérations ont été comparés avec ceux de l'exemple précédent, dans lequel du malt est utilisé comme enzyme maltogénique. Ces résultats sont reproduits sur le tableau IX suivant:
TABLEAU IX
<EMI ID=76.1>
(a) Les conditions sont les suivantes:
25% en poids d'amidon de mais, 60[deg.]C, 24 heures;
5 unités de "Thermamyl L-60" par gramme de substance sèche; 0,5% de malt ou de soja broyé.
Exemple 8
Dans cet exemple, on a étudié l'effet exerce Par un agent tensio-actif tel que le dodêcylsulfate de sodium en préparant des hydrolysats à forte teneur en maltose et maltotriose par le procédé de digestion de la présente addition.
On prépare des suspensions d'amidon de mais à 25%
en poids, contenant 0,1% de dodécylsulfate de sodium par rapport à l'amidon sur base sèche. On conduit les digestions sous l'action combinée de 5 unités de "Thermamyl" par g de substance sèche et de 0,5%, sur base sèche, d'orge maltée broyée, avec et sans pullulanase (1 unité/g de substance sèche) à 60[deg.]C et à un pH de 5,5 pendant 24 heures. Les résultats des essais
ont été comparés avec ceux qui ont été obtenus dans l'exemple
5. Ces résultats sont reproduits sur le tableau X suivant:
TABLEAU X
<EMI ID=77.1>
<EMI ID=78.1>
(b) Conditions:
<EMI ID=79.1>
24 heures; 5 unités de "Thermamyl L-60"/g de substance sèche; 0,5% de malt sur base sèche; une unité
de pullulanase par g de substance sèche;
0,1% de DSS sur base sèche
Ces résultats démontrent que l'addition d'un agent tensio-actif améliore la solubilisation de l'amidon d'environ 9% et réduit l'équivalent de dextrose (ce qui est vraisemblable-
<EMI ID=80.1>
Exemple 9
Cet exemple illustre la production d'hydrolysats à
<EMI ID=81.1> étapes de chauffage, conforme à Invention.
De l'amidon de mais est mis en suspension dans l'eau à une concentration de 25% en poids et la suspension est additionnée sous agitation de "Thermamyl 60-L" en quanti-
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
sucres solubles, de manière à inhiber la gélatinisation, puis il est chauffé de 60[deg.]C à 75[deg.]C en deux heures. La suspension est maintenue à 75[deg.]C sous agitation pendant 22 heures, de
<EMI ID=84.1>
Des parties de la phase digérée non filtrée sont ensuite hydrolysées (saccharifiées) avec divers enzymes. Les résultats sont reproduits sur le tableau XIsuivant:
TABLEAU XI
Hydrolysats obtenus par saccharification d'amidon de mais
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
Exemple 10
Dans cet exemple, on a conduit des digestions d'ami-
<EMI ID=88.1>
que l'on obtient par solubilisation avec de l'alpha-amylase <EMI ID=89.1>
On fait digérer un mélange d'amidon granulaire et d'eau à une concentration en matières solides de 30% en
<EMI ID=90.1>
obtenus au bout de 24 et 48 heures de digestion, sont respectivement égaux à 35,0% et à 38,6%. Les résultats obtenus en ce qui concerne la distribution des saccharides dans les fil-
<EMI ID=91.1>
TABLEAU XII
<EMI ID=92.1>
Les résultats indiqués ci-dessus démontrent que le
<EMI ID=93.1>
heures n'entraîne pas de modification appréciable de la composition des saccharides, ni de variation notable de l'équivalent de dextrose de l'hydrolysat. Ces résultats démontrent en outre que le procédé de l'addition, mis en oeuvre en utilisant l'alpha-amylase seule, donne une grande quantité du polysaccharide DP-5, à savoir plus de 25% en poids sur base sèche, et généralement au moins 30% en poids sur base sèche.
L'une des principales particularités du procédé
de la présente invention est que do l'amidon granulaire est solubilisé sans aucune gélatinisation sensible de l'amidon insoluble. En d'autres termes, tout amidon insoluble résiduel est sous une forme essentiellement granulaire et non
<EMI ID=94.1>
de vue économique, parce que l'hydrolysat d'amidon peut être aisément filtré pour le débarrasser du résidu éventuel d'amidon granulaire, et parce qu'il n'y a pas d'élévation notable de la viscosité due à une gélatinisation de l'amidon. L'amidon granulaire insoluble peut être facilement récupéré et, le cas échéant, recyclé.
Le procédé de l'invention, tel qu'il est décrit ci-dessus, peut être mis en oeuvre de diverses façons. Par exemple, comme illustré dans le présent mémoire, l'amidon granulaire peut être traité par digestion avec l'alpha-amylase seule, pourvu que les conditions soient choisies de manière qu'il n'y ait pas de gélatinisation sensible de l'amidon. Dans le procédé de l'invention la gélatinisation est évitée par agitation de l'amidon granulaire et de l'eau avec l'alpha-amylase, à une température allant d'environ 40 et,
<EMI ID=95.1>
latinisation de l'amidon. Par mélange de l'amidon granulaire et de l'eau avec l'alpha-amylase à ces températures peu élevées, c'est-à-dire de 40[deg.]C à la température de gélatinisation réelle de l'amidon, il se forme des hydrolysats solubles qui tendent à inhiber la gélatinisation des granules restants d'amidon. A mesure que la digestion progresse, il se forme des hydrolysats d'amidon plus solubles, ce qui permet d'élever la température du mélange, à savoir jusqu'à un maximum d'environ 80[deg.]C. On évite généralement les températures supérieures à environ 80[deg.]C, attendu qu'une gélatinisation de l'amidon granulaire se produit à ces températures, même en présence des hydrolysats solubles d'amidon.
Ainsi, le procédé de la présente invention est différent des procédés antérieurs tels que les procédés décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3 720 583, qui implique une opération de liquéfaction avant le traitement enzymatique de l'amidon avec l'alpha-amylase.
Comme le démontrent les exemples qui précèdent, 1
il est particulièrement avantageux d'utiliser un enzyme saccharifiant, conjointement avec l'alpha-amylase. L'enzyme saccharifiant en association avec l'alpha-amylase donne des résultats très bénéfiques en ce qui concerne la solubilisation de l'amidon granulaire. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on peut utiliser tout enzyme saccharifiant connu. Les enzymes saccharifiants que l'on peut utiliser conformément à l'invention, comprennent ceux qui sont capables d'hydrolyser ou de rompre les liaisons dans La molécule d'amidon. Des exemples d'enzymes saccharifiants avantageux à utiliser dans le procédé de l'invention en association avec l'alpha-amylase comprennent la gluco-amylase, la bêta-amylase, l'iso-amylase
(pullulanase), la maltase, l'isomaltase (transglucosidase), etc.
D'autres enzymes hydrolysant les glucides peuvent être utilisés en association avec l'alpha-amylase et l'enzyme saccharifiant, ou dans un traitement ultérieur de l'hydrolysat d'amidon formé. Ces enzymes comprennent la glucose-isomérase, l'alpha-1,6-glucosidase, etc.
Comme indiqué dans ce qui précède, et comme illustré dans les exemples, on peut mettre en oeuvre le procédé de l'invention en solubilisant tout d'abord une portion de l'amidon granulaire, à savoir, au moins environ 10% en poids et
de préférence au moins environ 50% en poids, par traitement
<EMI ID=96.1>
lase, puis en traitant l'hydrolysat d'amidon solubilisé (qui peut aussi contenir des granules insolubles d'amidon non hydrolysé) avec au moins un enzyme saccharifiant, à une tem-
<EMI ID=97.1>
solubilisé et 1'amidon insoluble resté intact peuvent être soumis à un traitement thermique, par exemple à l'autoclave, à une température d'environ 100 à environ 170[deg.]C pour liquéfier et/ou solubiliser tout résidu de granules d'amidon insolubles
"Enzymatic hydrolysis of granular starch"
to main patent n [deg.] 813 518 filed April 10, 1974.
Priority of the two patent applications filed in the United States of America, respectively on October 8, 1974 under
<EMI ID = 1.1>
<EMI ID = 2.1>
John HOLIK, including CPC INTERNATIONAL, INC. is the beneficiary.
<EMI ID = 3.1>
granular donation by enzymes, and it relates more particularly to the transformation of granular starch into hydrolysates according to the main patent.
Starch is a very high molecular weight polymeric carbohydrate. Its monomeric units, called anhydroglucose units, are units derived from dextrose, and complete hydrolysis of starch results in dextrose. In the United States of America, dextrose is produced from corn starch; in Europe it is obtained from corn starch and potato starch; in Japan it is produced from corn starch and sweet potato starch.
Until 1960, dextrose was prepared by the acid hydrolysis of starch. The preparation process involved heating the starch in the presence of hydrochloric or sulfuric acid.
<EMI ID = 4.1>
sodium carbonate mixture obtained by hydrolysis, clarification and finally crystallization of dextrose. Unfortunately, the dextrose yield is lowered by the formation of relatively large amounts of reversion products, i.e. products which are formed by recombination of molecules.
<EMI ID = 5.1>
carried out at high temperature and low pH, some of the starch is converted into hydroxymethylfurfural, levulinic acid and color bodies. The formation of these degradation products is irreversible, and, to the extent that they are formed, it is obviously to the detriment of the desired dextrose yield.
In addition, the use of hydrochloric acid, or sometimes sulfuric acid, and the subsequent neutralization of this acid with an alkaline base results in the formation of inorganic salts which disturb the crystallization of the dextrose obtained as a final product. Later, the hydrolysis of starch to dextrose was carried out by means of enzymes. The main enzyme used
for this purpose was and continues to be gluco-amylase. This enzyme has the effect of hydrolyzing starch by cleavage
of its molecule, which releases a dextrose molecule each time. However, in practice, it is necessary to first thin the starch before subjecting it to the action of gluco-amylase. This fluidization can be carried out either by an acid or by an enzyme. The starch is thinned down to a dextrose equivalent (E.D.) of about 10-20, then
<EMI ID = 6.1>
is called the acid-enzyme process, or enzyme-enzyme process, depending on the nature of the fluidization that is carried out.
In the case of the acid-enzyme process, the initial acid thinning step also requires a fairly high temperature, namely of the order of 120 [deg.] C. Of course, this operation results in starch fragments which are prone to downshifting, and also results in reversion products. As would be expected, these phenomena take place at the expense of the desired formation of dextrose.
The same is true of the enzyme-enzyme process, which also requires a relatively high temperature for
<EMI ID = 7.1>
Furthermore. the usual practice is to heat the thinned starch to even higher temperatures, namely of the order of 120 to 160 [deg.] C, to complete the gelatinization of the starch and to facilitate filtration. In addition, certain complexes of fat and amylose are formed, which are very insoluble and which complicate filtration.
None of these methods is completely free from processing difficulties, because of the inevitable presence of retrogradation products, starch and fat complexes and reversion products. Insofar as all of these products are formed, processing difficulties are encountered, especially in the filtration of the mixture obtained as product, and the yield of dextrose is reduced.
United States Patent No. 2,583,451 describes an enzymatic hydrolysis process which does not involve
high temperature gelatinization, but the dextrose yields are very low. Leach and Collaborators also propose in "Cereal Chemistry", volume 38, n [deg.] 1 of January 1961, pages 34-46, the enzymatic hydrolysis of granular starch with various alpha-amylases, but at low temperatures.
The invention relates to a method for solubilizing starch, which comprises mixing a granular starch, water and a bacterial alpha-amylase, and heating the mixture to a temperature between the normal temperature of starting gelatinization and the temperature. of actual starch gelatinization and at a pH advantageously between 5 and about 7. A saccharifying enzyme can be added at the same time as the bacterial alpha-amylase or during solubilization, or when the granular starch has reached a degree sensitive to solubilization. The saccharifying enzyme can be
gluco-amylase or a maltogenic enzyme, for example beta-amylase. The saccharifying enzyme is advantageously added after the granular starch has reached a substantial degree.
<EMI ID = 8.1>
solubilization, or at a lower temperature, that is to say at a temperature between about 50 and about
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
t donated granular to the action of bacterial alpha-amylase alone, that is to say in the absence of a saccharifying enzyme. Granular starch, water and a bacterial alpha-amylase are then mixed under the conditions indicated above to produce a soluble starch hydrolyzate.
The starch used can be any of those which are ordinarily available, namely corn starch, waxy corn starch, cassava starch, potato starch, sweet potato starch, wheat starch, sago starch, sorghum starch, high amylose starch or starch, etc. Both waxy and non-waxy forms of starch can be used. As noted, the starch is in the granular form.
Good results are also obtained using corn grits and other raw materials with a high starch content. Non-waxy corn starch is preferred.
The process of the invention offers the important advantage of being able to be applied to an aqueous suspension in which the concentrations are relatively high. The solids content of the starch suspension is generally between about 5 and about 40% and especially between 10 and 30%. Of course, lower concentrations can be used and, in general, the degree of starch solubilization is all the greater and, consequently, the yield of dextrose is all the higher as the concentration is reduced. , when using gluco-amylase: as a saccharifying enzyme. However, it is very desirable in most practical cases to use reduced volumes, i.e. high starch concentrations.
This has the effect of avoiding, or at least of reducing the considerable costs incurred by the concentration of the hydrolyzed mixture, before
<EMI ID = 12.1>
Sometimes the advantage of the present addition may be sufficient to compensate for this disadvantage, and a solids concentration of about 10% may then be advisable.
The process of the invention solubilizes substantially all of the starch in a 25% aqueous suspension over a 24 hour period. In addition, at high concentrations, any undissolved starch can be recycled, which therefore improves the total yield, bringing the starch solubilization rate to over 90%.
Preferably a bacterial alpha-amylase is selected which is active in the pH range of from about 4.0 to about 7.0 and which displays appreciable activity at relatively low temperatures, i.e. below. the temperature at which the starch being processed gelatinizes. Advantageous sources of these alpha-amylases include certain species of microorganisms of the genus
<EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1>
described in the patent application of the Federal Republic
<EMI ID = 15.1>
nique n [deg.] 1,296,839 and in US Pat. No. 3,697,378. It is very advantageous to use amylases.
<EMI ID = 16.1>
patent application of the Federal Republic of Germany
n [deg.] 2,025,748 cited above. It is particularly recommended to use the alpha-amylase from strain NCIB 8061 of
<EMI ID = 17.1>
B. licheniformis strains NCIB 8059, ATCC 6598, ATCC 6634, ATCC8480, ATCC 9945A and ATCC 11945. These microorganisms are exceptionally efficient in liquefying granular starch. One of these enzymes is the trademarked product. "Thermamyl", from the Novo Enzyme Corporation, Mamaroneck, New York. For such application, alpha-amylase should be used at a concentration of about 0.1 to about 25 units per gram of starch (on a dry basis) under the pH and temperature conditions indicated above. The "Thermamyl" product is characterized by the following properties:
(a) it is heat stable;
(b) it is active over a wide pH range; and
(c) its activity and heat stability are less dependent on the addition of calcium ion than those of other alpha-amylases.
Compositions representative of three different preparations of "Thermamyl" are indicated below:
"Thermarnyl" "Thermamyl" "Thermamyl"
<EMI ID = 18.1>
Other suitable forms of alpha-amylases, including
<EMI ID = 19.1>
TABLE 1
<EMI ID = 20.1>
units of activity per milliliter of enzyme solution.
The amount of bacterial alpha-amylase used ranges from about 0.1 to about 25 units per gram of starch (on a dry basis). The use of larger quantities offers no practical advantage; the gain in starch solubilization which results from the use of more than 25 units per gram does not compensate for the additional expenditure of enzyme. The optimum amount of alpha-amylase depends on the amount of saccharifying enzyme such as gluco-amylase and / or beta-
<EMI ID = 21.1>
alpha-amylase ranges from about 1.0 to about 10 units per gram of starch (on a dry basis).
The alpha-amylase activity of an enzyme is determined by the following method:
The enzyme is reacted with a starch solution
of known title, under well-defined conditions. The enzymatic activity is determined from the degree of hydrolysis of the starch, which results in a reduction in the staining capacity with iodine, which is measured spectrophotometrically. The unit of bacterial alpha-amylase activity is the amount of enzyme required to hydrolyze 10 mg of starch per minute under the conditions of the test. The method is applicable to bacterial alphaamylases, including industrial preparations and except materials with great saccharifying power.
0.3 to 0.5 g of solid sample is dissolved or
0.3 to 1.0 ml of the liquid sample in a sufficient amount of 0.0025 M aqueous calcium chloride solution to obtain an enzyme solution whose activity is about 0.25 units per milliliter.
A mixture of 10 ml of starch solution is stirred
<EMI ID = 22.1>
liter of the enzyme sample to be titrated and the mixture is kept for exactly 10 minutes in a bath set at
<EMI ID = 23.1>
of one milliliter and added to a mixture of one milliliter
of 1M aqueous hydrochloric acid solution and about 50 ml of distilled water. The iodine staining capacity of this acidified sample is then determined by adding 3.0 ml of 0.05% aqueous iodine solution, diluting to 100 ml with distilled water, and then stirring properly. The absorption of the solution, relative to that of distilled water, is measured at 620 nm in a two-centimeter cell ("nm" is the symbol for the nanometer, a nanometer being equal to 1 millimicron, which makes a wavelength of 10 (9meter).
An identical measurement is carried out on the starch solution of known titer (to which water is added instead of the enzyme solution) to determine the absorption of a blank.
The enzymatic activity, in units / gram or in units / ml, is given by the relation:
(Blank absorption - sample absorption) x factor
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
may be any of the well known fungal amylase preparations, especially those obtained from representatives of the genera Aspergillus, Endomyces and Rhizopus. A highly recommendable gluco-amylase is that which
is obtained by the process described in the patent of
<EMI ID = 26.1>
tion of fungal amylase is freed from unwanted trans-glucosidase activity by treatment with a material
<EMI ID = 27.1>
about 5.0 units per gram of starch (on a dry basis). Preferably, based on a balance between cost and enzyme behavior, about 0.1 to about 0.3 units of glucoamylase per gram of starch (on a dry basis) is used.
The gluco-amylase activity is determined as follows:
The substrate is an acid hydrolyzate of corn starch, of dextrose equivalent equal to 15-18, dissolved in water and diluted to 4.0 g of dry matter per 100 ml of solution. Exactly 50 ml of solution are introduced with a pipette
<EMI ID = 28.1>
1.0 M sodium acetate-acetic acid buffer (pH 4.3).
<EMI ID = 29.1>
After 10 minutes, the correct amount of enzyme preparation is added. Exactly 120 minutes after addition of the enzyme preparation, the solution is adjusted to the phthalein endpoint of the phenol with normal sodium hydroxide solution. The solution is then allowed to cool to room temperature and the volume is adjusted to the gauge line. The titer of reducing sugars, expressed as dextrose, is determined on the diluted sample and on a control not supplemented with enzyme preparation. Gluco-amylase activity is calculated from the following relationship:
<EMI ID = 30.1>
in which:
A denotes gluco-amylase activity in units per milliliter (or per gram) of enzyme preparation;
S denotes the reducing sugars titer of the sample hydrolyzed by the enzyme, in grams per 100 ml;
<EMI ID = 31.1>
in grams per 100 ml;
E denotes the amount of enzyme preparation used in milliliters (or grams).
The value of "S" must not exceed 1.0 g per
100 ml.
In order to carry out the saccharification in order to produce syrups with a high maltose content and / or syrups containing disaccharides and trisaccharides, a maltogenic enzyme is used as the saccharifying enzyme.
The maltogenic enzyme, i.e. beta-amylase, can come from grains converted to malt, for example barley, sorghum, soybean, sweet potato or wheat. Malted barley can be obtained from various commercial sources, under various trademarks, for example "Fromalt 72" and malt-amylase "PF". One can also use "Biozyme M", which is a fungal enzyme. The total amount of beta-amylase which should be used in the saccharification operations for the production of a high maltose syrup ranges from about 0.1 to about 5 units per gram of starch (based on dried).
The activity (in units) of beta-amylase is determined by the following method:
A 5.00 g sample of beta-amylase-containing material is ground into particles passing through a 0.84 mm mesh size sieve; the ground material is placed in a 100 ml volumetric flask, and suspended in 70-80 ml of distilled water. This mixture is stirred for three hours at room temperature, diluted to exactly 100 ml with distilled water and filtered by gravity through "Whatman" filter paper n [deg.] 12. A sample is diluted. of 10 ml of the enzyme extract (filtrate) to a volume of 100 ml with distilled water.
A solution of about 8% by weight is prepared
<EMI ID = 32.1>
<EMI ID = 33.1>
aqueous starch hydrolyzate selected so that there is about 40.0 g of dry matter. This weighed solution was transferred quantitatively into a 500 ml volumetric flask, and the volume was made up to the mark, followed by vigorous shaking. A 50.0 ml sample of this starch hydrolyzate solution is taken with a pipette, which is introduced into a 100 ml volumetric flask and 5 ml of sodium acetate buffer solution is added thereto. The temperature of the resulting solution is raised to 50 ° C., and then an aliquot of the diluted enzyme extract indicated above is pipetted into the flask. We prepare an identical blank, i.e. distilled water replaces the extract
<EMI ID = 34.1>
After 55-57 minutes, 3 drops of phenol-phthalein are added to each vial as a color indicator. After a period of exactly 60 minutes, the flasks are removed from the bath set at 50 [deg.] C and their immediately neutralized.
<EMI ID = 35.1>
the addition of a 1% aqueous solution of sodium hydroxide, plus an excess of 0.5 milliliter. The contents are left to cool 1
of the flask at room temperature, then diluted to the mark with distilled water, and stirred well. The content of reducing sugars in aliquots of S.0 ml is determined by the Schoorl method. Calculation of the enzymatic activity, expressed in units per gram of dry starch, is carried out as indicated below:
A. Reducing sugars content (S.R.):
<EMI ID = 36.1>
Sometimes an iso-amylase-type enzyme such as pullulanase must be incorporated in the solu-
<EMI ID = 37.1>
two stages of the process. The amount of iso-amylase can range from about 0.10 to about 0.5 units per gram of starch. The use of pullulanase, for example, is effective in increasing solubilization and in facilitating filtration of the final hydrolyzate.
The most advantageous mode of carrying out the process of the invention involves the preparation of an aqueous suspension of granular starch and of an alpha-amylase. The
<EMI ID = 38.1>
can also contain one or more saccharifying enzymes of the type defined above. The presence of gluco-amylase or beta-amylase in the suspension accelerates the dissolution of the granular starch and consequently reduces the duration of this
<EMI ID = 39.1>
saccharifying enzymes in the aqueous suspension at this stage
<EMI ID = 40.1>
additional effects caused by enzymes and the beneficial influence exerted. Thus, when one or more saccharifying enzymes are used in the solubilization step, their amount ranges from about 0.01 to about 0.30 units of gluco-amylase per gram of starch (on a dry basis) or of about 0.1 to about 5 units of beta-amylase per gram of starch (on a dry basis) as appropriate.
The choice of pH is governed by the optimum pH of the particular alpha-amylase being used. The "Thermamyl" product displays its optimum activity at a pH of 5-7; the optimal activity of the product "Rapidase" corresponds to a pH of approximately 6.0; etc. In the cases, described later, where a saccharifying enzyme cooperates with alpha-amylase, the lower pH at which the saccharifying enzymes are susceptible
<EMI ID = 41.1>
they are stable) requires an optimum pH change when alpha-amylase is used alone. Gluco-amylase, for example, displays its optimal activity at a pH of 4.0 to
<EMI ID = 42.1>
slightly higher, but still lower than the pH of maximum alpha-amylase activity. It is therefore necessary to choose a pH at which alpha-amylase, used alone, has its maximum activity, or a pH at which the various enzymes, when used in combination, display their optimum combined activity. The temperature of the reaction mixture used in the solubilization process should be, as mentioned, between the normal starting gelatinization temperature and the actual starch gelatinization temperature. Usually, the temperature is at the upper limit of this range. A particular advantage of the process is that high temperatures are avoided.
This makes it possible to considerably reduce the heating costs in this process, and to minimize the formation of colored bodies, hence the savings made on refining costs. It is interesting to note that the process can be carried out at temperatures above the normal temperature for starting gelatinization of a starch, without appreciable gelatinization resulting in an increase in viscosity. Although corn starch, by example,
<EMI ID = 43.1>
gelatinization of 62-72 [deg.] C, which represents its "normal" range of gelatinization temperatures, the process of the present invention can be applied to corn starch at
<EMI ID = 44.1>
appreciable viscosity. In fact, it is usually desirable to carry out the process at these elevated temperatures, because this accelerates the solubilization of starch, and improves the degree thereof.
The solubilization temperature of the granular starch should range from about 40 [deg.] C to a maximum corresponding to the actual gelatinization temperature of the starch, that is to say a temperature of about 80 [deg. .]VS. Preferably, the solubilization temperature is in the range
<EMI ID = 45.1>
hydrolysis process lies in the fact that the prolonged action of high temperatures is avoided, with the resulting advantages already stated.
When the reaction is carried out at temperatures above the normal temperature for the onset of starch gelatinization, it is desirable that hydrolysis products be present during the reaction. We can
<EMI ID = 46.1>
temperature equal to or lower than the starting gelatinization temperature, and then heat the mixture to the desired temperature. Thus, the hydrolysis products inhibit the gelatinization of granular starch at elevated temperatures and the insolubilized starch remains in the granular form. Therefore, the residual starch can
be easily filtered.
The choice of pH depends on the particular enzymes
that is used in the process. Theoretically, the thinning enzyme and the saccharifying enzyme should perform their optimal activities at the same pH, but in practice this is unlikely. Gluco-amylase is, of course, the saccharifying enzyme that is used for the production of glucose syrups and for the production of dextrose, and its optimum activity is displayed at a pH of around 4.5.
The product "Thermamyl", on the other hand, exerts its optimal activity at a pH of 5.5 to 7 and it is not sufficiently active at a pH below 5 to promote the desired solubilization of the product. 'starch. Generally, it is the same with the other alpha-amylases.
Therefore, for the production of glucose or dextrose, the pH should preferably be in the range of about 5.0 to about 7.0, that is, in those uses between which glucoamylase and alpha-amylase have effective activity.
<EMI ID = 47.1>
tion lends itself to the solubilization of granular starch
with an enzymatic preparation of bacterial alpha-amylase in a first step which may alternatively involve a saccharifying enzyme such as gluco-amylase or betaamylase; this first step is therefore followed by a saccharification or hydrolysis step. In this process, the temperature prevailing during solubilization is preferably between about 55 and about 75 [deg.] C. After solubilization, the temperature can be lowered to about 50-65 [deg.] C
and this temperature can be maintained for about
40 to about 120 hours. Likewise, the pH is advantageously adjusted so as to create the optimum conditions for saccha-
<EMI ID = 48.1>
the pH is then lowered to between about 4.0 and about 4.5.
If the saccharifying enzyme is beta-amylase, the pH
is in this case adjusted between about 4.0 and about 6.0. Sometimes it can be beneficial if the pH is the same in all operations.
An advantageous embodiment of the invention involves an ultrafiltration operation. By choosing a suitable semi-permeable membrane, the enzyme and unreacted starch can be completely retained by this membrane, while the dextrose obtained as product passes through the membrane as it is formed. , since its molecular weight is lower. Ultr.a-filtration is described in "New Separation Technique for the CPI", Chemical
<EMI ID = 49.1>
In another advantageous form of implementation,
of the invention, the mixture containing the starch to be hydrolyzed contains an anionogenic surfactant. At certain concentrations the surfactant improves the degree of solubilization and the yield of dextrose, and this is true at concentrations ranging from about 0.01 to about 1.0%. Best results are obtained using an anionogenic surfactant concentration of about 0.05 to about 0.50%. Representative examples of surfactants
<EMI ID = 50.1>
nent sodium laurylsulfate, sodium dodecylbenzenesulphonate, sodium substituted naphthalenesulphonate <EMI ID = 51.1>
triethanolamine, the alkyl group of which is derived from alcohols produced by reduction of glycerides in tallow or oil
of coconut. Generally, the anionogenic dispersants used in the addition process are water-soluble salts carrying an alkyl group containing about 8 to about 20 carbon atoms, a sulfonic or sulfuric acid ester radical or a sodium cation, potassium, ammonium or aliphatic amine having less than ten carbon atoms.
In another advantageous variant, the process is carried out in two stages, as regards the pH of the mixture containing the starch to be hydrolyzed. The first step is in accordance with that which has been described above, that is to say
that the pH therein is maintained between about 5.0 and about 7.0 until at least about 10% of the starch has been solubilized and preferably until solubilization of the starch begins to stabilize. In the ordinary case, this is the case after about 16 hours. The hydrolyzed mixture can be filtered at this stage, if desired. The pH is reduced to the range of about 4.0 to about 5.0. In this pH range, the activity of glucoamylase is stronger than at high pHs, and ultimately the yield of dextrose is improved somewhat.
A particularly advantageous variant, resulting in the formation of dextrose in large proportions, involves a step (1) of stirring a mixture of a granular starch, water, and a bacterial alpha-amylase, at a temperature between the normal starting gelatinization temperature of the starch and the actual gelatinization temperature of the starch and at a pH of from about 5.0 to about 7.0 to convert at least 10% of the starch to a hydrolyzate soluble; and a step (2) of adjusting the temperature to 50-65 [deg.] C and the pH to 4.0-4.8, and adding glucoamylase to saccharify the soluble hydrolyzate. Step (1) generally lasts about 12 hours; on the contrary, the step
(2) Usually takes much longer, i.e. about 24 to about 120 hours. Sometimes it is advisable to add gluco-amylase to the mixture in step (1). The amounts of alpha-amylase and gluco-amylase used in step (1) are the same as those indicated above with regard to the direct transformation of granular starch into soluble hydrolyzate.
The supplement of gluco-amylase mentioned above, which is used in the second step, ranges from about 0.1 to about 1.0 unit activity per gram of starch on a dry basis.
The starch hydrolyzate can be processed in the usual manner, that is to say by concentration and crystallization.
A representative example of an enzymatic hydrolysis of the type defined above is given below:
Example 1
A suspension containing 125 parts of starch (on a dry basis) and 350 parts of distilled water is prepared in a stainless steel beaker of one liter capacity.
If necessary, calcium is added (for example in the case of the use of alpha-amylases other than the product "Thermamyl") in the form of an aqueous solution of calcium chloride at 40 mg of calcium per milliliter. , to increase the quantity of calcium present in the suspension by 100 mg / kg (starch contains a little calcium, and the same is true of alpha-amylase). The pH is adjusted to 5.5 by the addition of a dilute aqueous solution of sodium hydroxide; bacterial alpha-amylase and gluco-amylase are added and the total weight of the suspension is adjusted to 500 parts by the addition of distilled water.
The beaker is placed in a water bath, its contents stirred and heated to 60-75 [deg.] C, then maintained at that temperature for the indicated reaction period; the pH is checked periodically and, if necessary, it is readjusted to 5.5. The product is then filtered and the filter residue washed, dried and weighed to determine the portion of the starch which remains insolubilized. Table II below illustrates the results obtained by following
this operating mode. In each case, the results are based on the use of a 25-30% aqueous suspension of granular mate starch, at a pH of 5.5 and a temperature of 6S-75 [deg.] C.
<EMI ID = 52.1>
which is well above the onset gelatinization temperature assigned to corn starch), the unsolubilized starch retains its granular nature throughout the hydrolysis period.
I TABLE II
i Number Concen- Dose (a) Time Tempera- Solubili- tion of the enzyme est- tration hours ture (d)
<EMI ID = 53.1>
%
<EMI ID = 54.1>
(a) units per gram of starch
(b) bacterial alpha-amylase
(c) gluco -amylase
(d) percentage of solubilized starch
(e) "Thermamyl"
(f) 60-75 [deg.] C for two hours,
75 [deg.] C for 24 hours
(g) 60 [deg.] C for 24 hours, then as in (f)
(h) enzyme produced by a microorganism of the species
<EMI ID = 55.1>
(i) 60 [deg.] C for 24 hours,
65 [deg.] C for 24 hours.
Example 2
The solubilizing influence exerted by alphaamylases alone on granular starch, at the high temperatures of the present invention, is demonstrated by the results reproduced in the following table in. In each case, a 25 or 30% granular starch suspension is stirred with alpha-amylase at 60-750C, pH 5.5 for 25 hours.
TABLE III
<EMI ID = 56.1>
(a) Units per gram of starch
(b) Percentage of solubilized starch
(c) 60-75 [deg.] C for two hours,
75 [deg.] C for 24 hours.
Example 3
As indicated above, a very advantageous form of carrying out the addition involves the preparation of dextrose by a two-step process: in the first step the granular starch is converted into a starch hydrolyzate by treatment with a alpha-amylase, alone or in combination with gluco-amylase, at a temperature between the normal temperature of starting gelatinization and
the actual starch gelatinization temperature and at
a pH of 5.7; then, in the second step, the temperature is lowered to 50-65 [deg.] C, the pH is lowered to 4.0-4.8 and more gluco-amylase is added. These conditions are maintained for 24-120 hours. The results obtained in this two-step process, the first of which uses alpha-amylase and gluco-amylase (GA) in combination, are shown in Table IV. In each case, the suspension contains
25% starch, and in the second step an additional 0.14 units of gluco-amylase is added after the temperature has been set to 60 [deg.] C and the pH, 5.5 in the first stage, has been reduced to 4.3.
TABLE IV
<EMI ID = 57.1>
(a) 0.14 GA units at 60 [deg.] C
(b) based on the solids contained in the filtrate.
Example 4
Further results obtained in similar tests, in which alpha-amylase was used alone in the first step, are given in Table V.
In each case, the suspension contains 30% starch.
TABLE V
<EMI ID = 58.1>
(a) Based on the solids contained in the filtrate.
When granular starch is hydrolyzed by the action of bacterial alpha-amylase and saccharified by the action of a maltogenic enzyme such as beta-amylase, alone or in combination with an iso-amylase such as pullulanase, a hydrolyzate with a high disaccharide content is obtained
(maltose) and trisaccharides (maltotriose). The exact composition of the hydrolyzate varies depending on the actual conditions under which the process has been carried out, that is to say the quantity of enzymes which has been used and the presence of one. pullulanase.
Table VI below shows the essential characteristics of the new high-content hydrolysates
to maltose and malto-triose produced by the process of the present addition.
TABLE VI
Characteristics of high-grade products
<EMI ID = 59.1>
on a dry basis
<EMI ID = 60.1>
(a) Dextrose
(b) Maltose
(c) Malto-triose
(d) Polysaccharides, e.g. maltotetrose and higher homologs (�) DP = degree of polymerization
The following examples, given without limitation, better demonstrate the nature of the present invention, the preparation and the characteristics of the remarkable hydrolysates described above.
Example 5
This example illustrates the preparation of hydrolysates
with a high concentration of maltose and malto-triose. The remarkable hydrolyzate is obtained by using a combination of alpha- <EMI ID = 61.1>
improves the amount formed of maltose and malto-triose.
To prepare the remarkable products with a high maltose and maltotriose content of the addition: -, the procedure is for example as follows:
A suspension containing, on a dry basis, 125 g of corn starch in 300-350 ml of water is prepared in a tared beaker. The temperature of the suspension is stabilized in a water bath at 60 [deg.] C and the pH is adjusted to 5.5 by adding hy-
<EMI ID = 62.1>
known weights of bacterial "Novo" alpha-amylase and ground malted barley ("Froedtert", grade 72-H) in amounts equivalent to 2-20 units of alpha-amylase and 0.1-1.0% malt (on a dry basis), compared to the starch considered on the basis of the dry substance. The addition of one unit of pullulanase per gram of dry substance also has a beneficial effect. If the alpha-amylase used is calcium dependent, the digested phase should contain 100 to 200 parts per million calcium ions. Calcium can be added in the form of an aqueous solution of its chloride. The weight of the suspension is then adjusted to 500 g by the addition of water in an amount sufficient so that the starch concentration is about 25% by weight.
The suspension during digestion is then placed again in the water bath set at 60 [deg.] C and it is stirred slowly for 24 hours. The pH is checked periodically and, if necessary, readjusted to 5.5. At the end of the presumed reaction time, the water lost by evaporation is replaced and the liquid is filtered (vacuum filtration on a Buchner N [deg.] 4 funnel, "Whatman" N [deg.] 1 paper). A 200 ml portion of the filtrate is transferred to an Erlenmeyer flask closed with a Bunsen stopper and heated for 15 minutes in a boiling water bath to deactivate the enzymes present. Analysis of the filtrate indicates the amount of dry substance, the dextrose equivalent and the carbohydrate composition.
The starch retained on the filter is washed with approximately
500 ml of water, dried for about 16 hours in an air oven at 50 [deg.] C, weighed and analyzed (determination of the humidity level). The percentage of amiaon solubilized during digestion is calculated from the following relationship:
<EMI ID = 63.1>
Starch% x 100
125 g
Several digestions of granular corn starch were carried out, following the procedure described above and using various combinations of bacterial alpha-amylase, crushed malted barley and pullulanase. The product "Thermamyl"
60 (liquid bacterial alpha-amylase from Novo Enzyme Corporation) is one of the alphaamylase enzyme preparations that have been used, and product B-221 is an alpha-amylase prepared by the action of the microorganism Bacillus subtilis, by the firm CPC International Inc.
Pullulanase is a delaminating enzyme produced by microorganisms of the species Aerobacter aerogenes by incubation under suitable conditions of aerobic culture.
The results obtained are shown below.
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
Conditions:
25% by weight of mate starch, 60 [deg.] C, 24 hours, pH 5.5, addition of 100 parts per million of calcium
The results and information given above demonstrate that the addition process is capable of solubilizing more than 56% of the granular corn starch (i.e. approximately
56 to about 67% on a dry basis) using the bi-enzymatic system comprising a bacterial alpha-amylase and the maltogenic enzyme (malted barley). From this information it appears that the hydrolysates have a dextrose equivalent of about 40 to about 60, preferably about 40 to about 55 and especially about 40 to about 50. One of the features noted
<EMI ID = 66.1>
about 10% dextrose. Outstanding hydrolysates can be characterized by a combined content of maltose and malto-
<EMI ID = 67.1>
about 90% by weight on a dry basis and a dextrose content preferably less than about 5% on a dry basis.
<EMI ID = 68.1>
of the high maltose and maltotriose products of the present addition is the presence of a large amount (ie at least about 25% by weight on a dry basis :) of maltotriose and a small proportion of dextrose. Prior art high maltose hydrolysates generally contain at most about 20% by weight maltotriose on a dry basis.
The information given above also demonstrates that adding an isoamylase such as pullulanase to the digest treated mixture increases the maltotriose concentration of the composition.
Example 6
<EMI ID = 69.1>
obtained by digestion of a soluble starch substrate, under the combined action of bacterial alpha-amylase and a maltogenic enzyme, was determined with a view to comparing the results obtained under the same conditions for a suitable substrate. - resistant to granular starch.
The digestions of a 25% by weight preparation
of a waxy corn starch hydrolyzate of dextrose equivalent equal to 4.8 (the liquefied waxy starch hydrolyzate is prepared by enzymatic liquefaction with bac- alpha-amylase
<EMI ID = 70.1>
or "B-221" from CPC), malt and pullulanase at 60 [deg.] C and at pH 5.5. The procedure used in this example is the same as that of Example 5. The saccharide contents of the hydrolyzate were compared with the results obtained.
<EMI ID = 71.1>
The comparative data are shown in the following table * .: VIII:
TABLE VIII
Digestion of liquefied starch and granular starch, under the combined action of a bacterial alpha-amylase and an enzyme
<EMI ID = 72.1>
<EMI ID = 73.1>
(a) Doses of enzymes:
<EMI ID = 74.1>
of dry substance, except in the case of granular starch treated with alpha-amylase "B-221", for which 20 units / g of dry substance are used; one unit of pullulanase / g of dry substance; and 0.5% malt on a dry basis.
<EMI ID = 75.1>
(ci Degree of solubilization from 57 to 61%.
The results reproduced above demonstrate that, by operating under identical conditions, greater quantities of maltotriose are obtained from granular starch than if liquefied starch is used as substrate. It should be noted that the addition of pullulanase increases the content of disaccharides and trisaccharides and that the product "Therma: nyl 60" gives more maltotriose than the bacterial alpha-amylase "B-221".
Example 7
The procedure of the previous example is repeated, but the product "Thermamyl L-60" and soybean (used as a maltogenic enzyme preparation) are made to act in combination. The digestions (two in number) are carried out at a pH of 5.5 to 6.5. The results of these operations were compared with those of the previous example, in which malt is used as the maltogenic enzyme. These results are reproduced in the following Table IX:
TABLE IX
<EMI ID = 76.1>
(a) The conditions are as follows:
25% by weight of corn starch, 60 [deg.] C, 24 hours;
5 units of "Thermamyl L-60" per gram of dry substance; 0.5% crushed malt or soy.
Example 8
In this example, the effect of a surfactant such as sodium dodecyl sulphate was investigated in preparing hydrolysates with a high maltose and maltotriose content by the digestion process of the present addition.
25% corn starch suspensions are prepared
by weight, containing 0.1% sodium dodecylsulfate based on starch on a dry basis. The digestions are carried out under the combined action of 5 units of "Thermamyl" per g of dry substance and of 0.5%, on a dry basis, of crushed malted barley, with and without pullulanase (1 unit / g of dry substance ) at 60 [deg.] C and pH 5.5 for 24 hours. Test results
were compared with those obtained in the example
5. These results are reproduced in the following Table X:
PAINTINGS
<EMI ID = 77.1>
<EMI ID = 78.1>
(b) Conditions:
<EMI ID = 79.1>
24 hours; 5 units of "Thermamyl L-60" / g of dry substance; 0.5% malt on a dry basis; a unit
of pullulanase per g of dry substance;
0.1% DSS on a dry basis
These results demonstrate that the addition of a surfactant improves starch solubilization by about 9% and reduces the dextrose equivalent (which is likely-
<EMI ID = 80.1>
Example 9
This example illustrates the production of hydrolysates at
<EMI ID = 81.1> heating stages, according to Invention.
Corn starch is suspended in water at a concentration of 25% by weight and the suspension is added with stirring with "Thermamyl 60-L" in quantity.
<EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
soluble sugars, so as to inhibit gelatinization, then it is heated from 60 [deg.] C to 75 [deg.] C in two hours. The suspension is maintained at 75 [deg.] C with stirring for 22 hours,
<EMI ID = 84.1>
Parts of the unfiltered digested phase are then hydrolyzed (saccharified) with various enzymes. The results are reproduced in the following Table XI:
TABLE XI
Hydrolysates obtained by saccharification of corn starch
<EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
Example 10
In this example, friendly digestions were carried out.
<EMI ID = 88.1>
which is obtained by solubilization with alpha-amylase <EMI ID = 89.1>
A mixture of granular starch and water is digested at a solids concentration of 30% by weight.
<EMI ID = 90.1>
obtained after 24 and 48 hours of digestion, are respectively equal to 35.0% and 38.6%. The results obtained with regard to the distribution of saccharides in the threads
<EMI ID = 91.1>
TABLE XII
<EMI ID = 92.1>
The results shown above demonstrate that the
<EMI ID = 93.1>
hours does not lead to any appreciable change in the composition of the saccharides, nor to any appreciable variation in the dextrose equivalent of the hydrolyzate. These results further demonstrate that the addition process, carried out using alpha-amylase alone, gives a large amount of the DP-5 polysaccharide, namely more than 25% by weight on a dry basis, and generally at less 30% by weight on a dry basis.
One of the main features of the process
of the present invention is that the granular starch is solubilized without any substantial gelatinization of the insoluble starch. In other words, any residual insoluble starch is in an essentially granular form and not
<EMI ID = 94.1>
economically, because the starch hydrolyzate can be easily filtered to rid it of any residue of granular starch, and because there is no noticeable increase in viscosity due to gelatinization of the starch. 'starch. Insoluble granular starch can be easily recovered and, if necessary, recycled.
The method of the invention, as described above, can be implemented in various ways. For example, as illustrated herein, granular starch can be processed by digestion with alpha-amylase alone, provided the conditions are chosen such that there is no substantial gelatinization of the starch. . In the process of the invention gelatinization is avoided by stirring the granular starch and water with the alpha-amylase, at a temperature ranging from about 40 and,
<EMI ID = 95.1>
latinization of starch. By mixing the granular starch and water with the alpha-amylase at these low temperatures, ie from 40 [deg.] C to the actual gelatinization temperature of the starch, it soluble hydrolysates form which tend to inhibit gelatinization of the remaining starch granules. As digestion progresses more soluble starch hydrolysates are formed which allows the temperature of the mixture to be raised to a maximum of about 80 [deg.] C. Temperatures above about 80 ° C are generally avoided, as gelatinization of the granular starch occurs at these temperatures, even in the presence of the soluble starch hydrolysates.
Thus, the process of the present invention is different from prior processes such as the processes described in US Pat. No. 3,720,583, which involves a liquefaction operation prior to the enzymatic treatment of the. starch with alpha-amylase.
As the above examples demonstrate, 1
it is particularly advantageous to use a saccharifying enzyme together with alpha-amylase. The saccharifying enzyme in association with alpha-amylase gives very beneficial results with regard to the solubilization of granular starch. In carrying out the process of the invention, any known saccharifying enzyme can be used. Saccharifying enzymes which can be used in accordance with the invention include those which are capable of hydrolyzing or breaking bonds in the starch molecule. Examples of advantageous saccharifying enzymes for use in the process of the invention in combination with alpha-amylase include gluco-amylase, beta-amylase, iso-amylase
(pullulanase), maltase, isomaltase (transglucosidase), etc.
Other carbohydrate hydrolyzing enzymes can be used in combination with alpha-amylase and saccharifying enzyme, or in further processing of the starch hydrolyzate formed. These enzymes include glucose isomerase, alpha-1,6-glucosidase, etc.
As indicated in the foregoing, and as illustrated in the examples, the process of the invention can be carried out by first dissolving a portion of the granular starch, namely at least about 10% by weight and
preferably at least about 50% by weight, per treatment
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lase, then treating the solubilized starch hydrolyzate (which may also contain insoluble granules of unhydrolyzed starch) with at least one saccharifying enzyme, at a temperature
<EMI ID = 97.1>
solubilized and the insoluble starch which has remained intact can be subjected to heat treatment, for example in an autoclave, at a temperature of about 100 to about 170 [deg.] C to liquefy and / or solubilize any residue of granules of. insoluble starch