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Page 13, ligne 25, il faut lire "la matière sèche soluble de l'hydrolysat indique..., " au lieu de "les solides solubles de l'hydrolysat indiquent.."
Page 16, ligne 19, il faut lire "sirop original d'amidon hydrolysé par un acide seul... Il au lieu de "sirop d'amidon hydrolysé par un-acide original seul..Il
Page 19, ligne 5, il faut remplacer le mot "converties" par le mot "hydro- lysées".
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La présente invention se rapporte à des procédés nou- veaux de purification d'une préparation enzymique d'amyloglucosi- dase et d'hydrolyse de l'amidon au moyen d'enzymes dans lesquels le rendement en dextrose dans l'hydrolysat est supérieur à celui donné par les procédés antérieurs.
La présente invention se propose principalement de fournir un procédé de purification d'une préparation contenant une enzyme du type des amyloglucosidases et un procédé perfectionné de
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production de dextrose ou de sirops contenant du dextrose, procé- dés comportant l'hydrolyse enzymique de l'amidon ou de produits amylacés au moyen de préparations contenant de l'amyloglucosidase.
Les améliorations principales qui en résultent sont la teneur beau- coup plus faible en composés indésirables ou impuretés des hydroly- sats d'amidon, qui grèvent le procédé de raffinage, que celle des hydrolysats d'amidon obtenus par les procédés enzymiques antérieurs et, dans les hydrolyses prolongées, les rendements potentiels plus élevés en dextrose des hydrolysats et le'rendement réel en dextrose plus grand quand on procède au raffinage, à la concentration et à la cristallisation des hydrolysats et à la séparation du dextrose cristallisé des liqueurs-mères que dans le cas des hydrolysats pro- duits par les procédés antébieurs. Ainsi, l'invention se propose plus particulièrement de fournir un procédé industriel de production de dextrose cristallisé par hydrolyse enzymique,
donnant des ren- dements plus élevés en sucre que les procédés antérieurs. D'autres buts apparaîtront dans la suite.
L'existence d'une enzyme susceptible d'hydrolyser les mo- lécules d'amidon, ou les molécules d'amidon ayant subi la conversion acide, directement en dextrose monomère est connue depuis au moins quinze ans,
Dès 1941 Kerr et Schink (Ind.Eng.Chem. 33, 1418 (1941 et plus tard ibid. 34, 1232 (1943)) ont montré la présence, dans certains extraits cryptogamiques, d'une alphaglucosidase qui paraît provoquer le clivage des motifs de dextrose directement à partir des grosses molécules de polysaccharide présentes dans l'amidon pré-hy- drolysé au moyen d'un acide et indiqué qu'il semblait qu'il n'y ait pas de limite à l'action jusqu'en un point très proche de l'hydroly- se complète en dextrose. En dépit de certains désaccords,cette con- ception est maintenant acceptée.
Depuis ces premières recherches cette enzyme hypothéti- que a été désignée par des noms variés par différents chercheurs.
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On l'a dénommée alpha-glucosidase, amyloglucosidase, gluco-amylase, amidon-glucogénase et maitase. Ce dernier nom a été utilisé par certains des chercheurs antérieurs en raison de cette conc,eption, qui n'a pas été démontrée erronée, que l'enzyme produisantle glu- cose à partir de l'amidon n'était pas différente d'une enzyme déjà connue, dénommée maltase, laquelle produit le dextrose à partir du maltose mais est spécifique pour ce disamcharide. Dans ce qui suit, cette enzyme hydrolysant l'amidon sera désignée sous lp nom d'amy- loglucosidase.
Cette enzyme se trouve dans des extraits aqqeux, cul- tures ou filtrats de microorganismes, en particulier de mycètes.
Certaines souches de .1. niger par exemple constituent une très bon- ne source. Naturellement, d'autres enzymes provenant des cellules vi: vantes figurent dans ces extraits et la séparation de l'amylogluco- sidase, même d'autres carbohydrases comme les alpha-amylases, les transglucosidases et les dextrinases limites, a été récemment pré- sentée comme un problème insurmontable', En fait, l'amyloglucosida- se est une des carbohydrases restant en très.faible nombre qu'on n'a pu encore séparer sous une forme suffisamment pure pour Être cristallisée.
En dépit des brillantes prédictions de certains des chercheurs antérieurs en cette matière, qu'il n'y a pas de limite à l'hydrolyse de l'amidon jusqu'à hydrolyse presque complète en dextrose, et qu'un procédé enzymique de production de dextrose se- rait très supérieur au procédé classique d'hydrolyse aide pour ce qui concerne le rendement en dextrose et les problèmes de raffinage les résultats fournis par les procédés antérieurs produisant enzy- miquement le dextrose n'ont pas rempli ces espoirs, et il est ap- paru que le procédé enzymique comportait des problèmes analogues
1' à hydrolyse acide.
Les problèmes posés par le procédé acide ordinaire ont été décrits pas Kerr( Chemistry and Industry of Starch, 2 ed., chap-
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ter XIV). Il y/a d'abord le problème posé par une hydrolyse incom- plète en raison de la plus grande résistance à1'hydrolise de la liaison anormale 1-6-alpha-glucoside présente dans l'amidon. Il y a l'action de synthèse, ou réversion, produite par l'acide en vertu de laquelle le dextrose et les sucres inférieurs se recom- binent en donnant des dimères ou des polymères plus stables aux acides.
Ces deux résultats seuls altèrent non seulement sensible- ment le rendement potentiel en dextrose de l'hydrolysat mais, quand on fait cristalliser et sépare le dextrose de ces hydrolysats, ré- duisent fortement le rendement réel en sucre obtenu (Chem. and Ind. of Starch., p. 385). Quand on hydrolyse l'amidon au moyen d'extraits de mycètes, l'examen des hydrolysats montre la présence de quanti- tés substantielles de dimères et de polymères du dextrose avec des . liaisons irrégulières, ce qui indique une hydrolyse incomplète, une aotion de synthèse, ou les deux.
Dans le procédé d'hydrolyse acide, il se produit des réactions "destructrices" dans lesquelles les impuretés protéiques ou azotées jouent un rôle. Ces réactions et la présence de sels con pliquent le raffinage de l'hydrolysat et contribuent à réduire les rendements en sucre fini. 'Evidemment, quand on ajoute délibérément des protéines et des sels étrangers aux ligueurs amylacées au moyen d'extraits de mycètes ou de filtrats de leur culture, il n'est pas surprenant que les problèmes ci-avant, pour ce qui concerne le ren- dement en dextrose et le raffinage, s'en trouvent aggravés dans les procédés enzymiques antérieurs.
pris Divers brevets ont été/récemment aux Etats-Unis d'Amé- rique sur des procédés perfectionnés d'hydrolyse de l'amidon au moyen d'enzymes, à savoir les N 2.305.168 du 15 décembre 1942, 2.531.999 du 28 novembre 1952,Ne 2.583.431 du 22 janvier 1952 et
2.717.852 du 13 septembre 1955.
Quand on applique les procédés enzymiques antérieurs de fabrication du dextrose à l'hydrolyse de l'amidon ou des produits
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amylacés, on obtient des hydrolysats ne contenant pas plus de 85 environ de dextrose, en poids sec, même dans les conditions opé- ratoires les meilleures. L'analyse de ces hydrolysats pour ce qui concerne les sucres totaux, ou substances réductrices totales, ay moyen de l'essai bien connu de Fehling modifié par Lane et Eynon et le calcul des résultats en équivalent de dextrose (E. D.) mon- trent qu'il y a 5% ou plus supplémentaires de sucres non-dextrose ainsi que des polysaccharides et des substances qui ne sont pas des hydrates de carbone à titre d'impuretés pour un total de 100.
Quand on raffine ces hydrolysats par passage sur du noir animal, filtration'et concentration et quand on fait cristalliser par les procédés classiques, les rendements en dextrose cristalli- sé ne dépassent pas 60% en produit sec. C'est sensiblement le même rendement que'celui obtenu dans une conversion classique de l'ami- don par un acide et par l'application de procédés comparables de raffinage et de cristallisation. Dans les deux cas, les solides non- dextrose présente dans les hydrolats empêchent la cristallisation de 25 à 30% environ du dextrose (poids sec) qu'on sait figurer dans l'hydrolysat..
Quand on re-concentre et fait cristalliser les liqueurs- mères provenant des procédés enzymiques, on peut obtenir un rende- ment en sucre de seconde qualité atteignant 20%, en produit sec, des matières sèches originales de l'hydrolysat. On obtient ainsi un rendement total en sucre atteignant 80%. Quand on raffine, rehydro- lyse par un acide, concentre et cristallise des liqueurs-mères pro- venant du procédé de conversion par un acide, on obtient également un rendement supplémentaire de sucre de seconde qualité pouvant at- teindre 20%, ce qui donne un rendement global en sucre de première et de deuxième qualité de 80µce
On peut évidemment répéter un grand nombre de fois les opérations de reconversion,
de raffinage et de cristallisation pour augmenter le rendement au-delà de 80% aussi bien dans les procédés
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acides que dans les procédés enzymiques, mais le coût augmente proportionnellement avec chaque renouvellement d'opération.
Un examen critique des techniques antérieures fait manifestement ressortir que ces.chercheurs pensaient que les ren- dements d'une faiblesse décourageante en dextrose trouvé dans les hydrolysats provenant des conversions enzymiques, et le fait que les rendements réels en produit cristallisé ne dépassaient pas ceux fournis par des procédés d'hydrolyse acide comparables, étaient dus à un ou deux ou plusieurs des facteurs suivants:
1. Que l'enzyme produisant le dextrose est incapable par elle-même de porter la conversion à un niveau quelconque plus élevée, c'est-à-dire qu'il existe une "limite de conversion" ana- logue à la limite obtenue avec l'enzyme produisant le maltose, la bêta-amylase.
2. Que la limite de conversion varie avec la source de la glucosidase et qu'on pourrait peut-être obtenir des rendements plus élevés en dextrose en recherchant un extrait cryptogamique présentant une limite de conversion plus élevée.
3. Que l'enzyme produisant le dextrose est un substra- tum de maltase spécifique pour le maltose ou un polysaccharide in- férieur, de sorte que le rendement en dextrose à partir de l'amidon dépendrait entièrement de la présence dans les extraits cryptoga- miques d'autres enzymes connues pour produire du maltose, par exem- ple l'alpha-amylase. es
4. Que par suite des conditions nécessairement appliqué dans la pratique pour des raisons d'économie ou toute autre raison, dans un ou plusieurs stades du procédé de production du dextrose,on ne bourrait obtenir des rendements en dextrose supérieurs à ceux ac- tuellement trouvés.
Les conditions-envisagées sont par exemple la concentration en amidon ou produit amylacé utilisé dans l'hydrolyse enzymique, le degré ou la manière dont l'amidon est pré-traité avant - l'hydrolyse enzymique, par exemple au moyen d'un acide, le pH, la
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température et d'autres variables de l'hydrolyse enzymique et la manière dont la fermentation donnant l'extrait cryptogamique a été effectuée.
5. Que, bien qu'une des fonctions de la molécule d'amy- loglucosidase soit d'hydrolyser l'amidon en dextrose, cette action s' est celle d'une transférase, de sorte qu'on pourrait attendre à ce que cette même molécule d'enzyme manifeste une activité de trans- glucosidase à titre de fonction secondaire, ce qui réduirait le rendement en dextrose.
Toutes ces théories et autres théories similaires sont en opposition avec les découvertes qui sont à l'origine de la pré- sente invention.
Il a été découvert que la molécule d'amyloglucosidase ne possède qu'une fonction, qui est d'hydrolyser les liaisons des molécules d'amidon de manière à produire du dextrose et que toutes . les autres enzymes présentes dans les extraits cryptogamiques (ou ' toute autre activité enzymique) peuvent être séparées de cette mo- lécule d'amyloglucosidase. Il a été découvert que l'amyloglucosida- se attaque les extrémités terminales non-réductrices des molécules d'amidon, sépare le dextrose directement de ces extrémités, et pro- cède ainsi le long dé la molécule d'amidon jusqu'à ce qu'elle soit hydrolysée de manière sensiblement complète en dextrose.
Les ren- dements inférieurs en hydrolysats d'amidon obtenus à l'aide des ex- traits cryptogamiques bruts contenant de l'amyloglucosidase sont en conséquence dûs à d'autres enzymes interférentes, comprenant les transglucosidaees, qui donnent des produits finals autres que le dextrose, Quand on hydrolyse l'amidon ou des produits amylacés à ,l'aide d'extraits "purifiés" ne contenant que l'activité de l'amy- loglucosidase, on obtient des rendements inférieurs à 100% et des hydrolysats qui posent certains problèmes de raffinage, ce résul- tat étant dû principalement aux protéines et sels étrangers ajoutés avec l'extrait "purifié" et qui finalement passent dans l'hydrolysat,
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@
La présente invention fournit un procédé de purifica- tion des préparations contenant de l'amyloglucosidase, consitant à traiter une solution aqueuse de ladite préparation au moyen d'en- vion 2 à 5 % d'un silicate de magnésium hydraté synthétique inso- luble dans l'eau, à un pH d'environ 3,8 à 4,5, puis à centrifuger le mélange et à recueillir la phase liquide contenant l'amyloglu- cosidase.
La présente invention fournit en outre un procédé de production de dextrose à partir d'amidon dans lequel on hydrolyse l'amidon en système aqueux au moyen d'une préparation enzymique contenant de l'amyglucosidase jusqu'à des teneurs maximum en E.D. et en dextrose vrai, on clarifie l'hydrolysat, on le concentre par évaporation et on le laisse cristalliser, puis on sépare le dextro- se cristallisé de la liqueur-mère, ce procédé étant caractérisé par l'hydrolyse de l'amidon au moyen d'une préparation enzymique con- / tenant de l'amyloglucosidase purifiée par le procédé défini ci- avant, ladite hydrolyse donnant un hydrolysat final d'une teneur maximum en E.D. d'environ 95 à 96% et une teneur en dextrose vrai d'environ 93 à 94 en produit sec.
Plus particulièrement, l'invention fournit un procédé enzymique pratique perfectionné de production du dextrose avec des rendements exceptionnellement élevés à partir d'amidon et de pro- duits amylacés, dans lequel on utilise une préparation contenant la de l'amyloglucosidase préalablement traitée de manière à,'purifier en éliminant les enzymes interférentes telles que par exemple la transglucosidase, qui donne des sucres autres que le dextrose. Il est également préférable que l'amyloglucosidase soit débarrasée deµ protéines et sels étrangers qui, en passant dans les liqueurs, com- pliquent le raffinage de ces liqueurs, cette purification permettant d'obtenir finalement du dextrose pur cristallisé.
Le présent traitement de purification de l'enzyme consis te à traiter une solution ou suspension contenant l'enzyme au moyen
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d'une petite quantité d'un silicate de magnésium hydraté synthé- tique insoluble dans l'eau à titre d'agent,absorbant, lequel est vendu dans le commerce sous le nom de "Magnesol". Ce traitement est fondé sur la découverte, très surprenante que ce silicate de magnésium synthétique enlève très efficacement par adsorption des liqueurs brutes cryptogamiques de culture, les enzymes,'en parti- culier la transglucosidase, et d'autres impuretés qui gênent la pro- duction enzymique du dextrose à partir de l'amidon, mais n'enlève pas l'enzyme produisant,le dextrose, à savoir l'amyloglucosidase.
Il est préférable, mais non indispensable, d'enlever d'abord les solides insolubles présents dans la suspension de préparation en- zymique. La préparation enzymique peut être constituée de la liqueur entière de culture provenant du développement en milieu submergé d'un micrroorganisme producteur d'amylase, de la liqueur clarifiée ob- tenue à partir de la culture submergée, d'une suspension d'une pré- paration sèche ou partiellement sèche pouvant contenir du son, de l'amidon ou diverses autres impuretés utilisées dans la normalisa- tion de la préparation d'amylase, ou d'une solution de préparation enzymique complètement soluble. En général, le traitement de la pré- paration enzymique doit être effectué à un pH. auquel l'enzyme dési- rée est stable, c'est-à-dire un p H acide.
Attendu que le silicate de magnésium synthetique modifie le pH du côté alcalin, il est dési- rable de régler celui-ci du côté acide et de poursuivre le traite- ment dans des conditions acides: Après addition de l'agent adsor- bant et réglage du pH de la solution ou suspension de préparation enzymique, on agite le mélange,puis on sépare la phase liquide de la phase solide. L'activité de transglucosidase de la liqueur de culture, la substance protéique étrangère, les composés colorés et les autres impuretés sont retenus dans la phase solide cependant que les carbohydrases désirables, en particulier l'amyglucosidase, restent dans la phase liquide.
D'une manière générale, il a été trouve que la plupart
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des extr&its cryptogamiques bruts donnent l'amyloglucosidase la plus pure quand on ajoute environ 2 à 5% en poids/volume de " Magnesol" à titre d'agent absorbant aux liqueurs butes et quand on maintient ces liqueurs dans Une gamme de pH d'environ 3,8 à 4,5 au cours du traitement.
Des quantités inférieures de "Mange- sol" n'enlèvent généralement pas la totalité des enzymes qui di- minuent le rendement en dextrose au cours de l'hydrolyse enzymi- que de l'amidon, et des quantités plus élevées peuvent enlever, par simple absorption mécanique, des quantités appréciables de l'en- zyme désirée, à savoir l'amyloglucosidase. Les températures pré- férées pour le traitement sont de 5 à 30 C. environ et les du- rées de traitement préférées de trente à soixante minutes environ.
Les unités d'activité d'amyloglucosidase se déterminent de la manière suivante. Le substratum est un hydrolysat acide à 15-18 E.D. d'amidon de mais dissous dans l'eau et étendu à 4 g de substance sèche pour 100 ml de solution. On prélève à l'aide d'une pipette exactement 50 ml de solution qu'on place dans une fiole jaugée de 100 ml. On ajoute dans le ballon 5 ml de tampon acétate de sodium-acide acétique 1 M de pH 4,5. On place le ballon dans un bain-marie à 60 C. et,au bout de dix minutes,on ajoute la quantité appropriée d'enzyme. Exactement deux heures après l'addition de la préparation enzymique,on règle la solution au virage de la phénol- phtaléine au moyen d'hydroxyde de sodium normal. On refroidit alors la solution à la température ambiante et on l'amène au volume.
On détermine la valeur des sucres réducteurs, calculés en dextrose, sur l'échantillon étendu et sur un témoin auquel on n'a pas ajouté de préparation enzymique. L'activité d'amyloglucosidase se calcule comme suit :
A= S-B/2xE où A représente les unités d'activité d'amyloglncosidase par ml ou gramme de préparation enzymique, S représente les sucres ré- ducteurs dans l'échantillon converti par l'enzyme en grammes pour
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100 ml, B représente les sucres réducteurs dans le témoin en gram- mes pour 100 ml, et E est la quantité de préparation enzymique utilisée, en ml ou en grammes.
La concentration des- sucres réducteurs dans l'échan- tillon converti par l'enzyme ne doit pasêtre supérieure à 1 g pour 100 ml.
On peut utiliser toutes les variétés d'amidon ou de produits amylacés dans le présent procédé appliquant l'hydrolyse au moyen d'amlucosidase. Il est toutefois préférable, pour ob- tenir le dextrose, d'utiliser un amidon pur et de préférence, pour des raisons économiques,un amidon pur ayant été déjà partiellement hydrolysé ou converti par quelque autre moyen de manière à réduire la viscosité très élevée de l'amidon natif quand il est dispersé ou dissous dans l'eau.
La réduction de la viscosité facilite luxa- ge de teneurs plus élevées en solides de la substance amylacée dans l'hydrolyse par l'amyloglucosidase. Le prétraitement de l'amidon peut être effectué d'un certain nombre de manieras connues, par exem ple hydrolyse acide préliminaire, prétraitement au moyen d'une alpha-amylase purifiée qui se comporte d'une manière très analogue à celle de l'acide sur l'amidon au moins dans les phases initiales de l'hydrolyse, ou prétraitement par un moyen physique, par exem- ple passage dans une machine " Votator" ou un homogénéiseur. Le prétraitement peut être une combinaison de deux ou/plusieurs pro- cédés, par exemple un traitement acide sous pression ou un trai- tement à l'alpha-amylase associé au passage dans un "Votator".
En tout cas,le prétraitement doit être tel qu'il réduise la visco- sité du substratum à un niveau tel qu'on obtienne des fluides mani- pulables ayant une concentration en solides de 25 à 50,= en pois et de préférence environ 35% en poids quand la température de la li- queur est de l'ordre de 45 à 60 C. Toutefois.ce prétraitement ne doit pas être prolongé au-delà du niveau indiqué sous peine que des caractères quelconques indésirables d'hydrolyse ou de coner-
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sion préliminaire se superposent aux résultats obtenus dans l'hy- drolyse par l'amyloglucosidase qui suit.
Ainsi, par exemple, dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on convertit l'amidon au moyen d'acide très étendu sous pression de la manière classique dont on fabrique un sirop d'amidon et on hydrolyse le sirop à 35% de solides en dex- trose au moyen d'amyloglucosidase purifiée.
Quand l'amidon est denviron ainsi converti en dispersions relativement fluides à un taux,/10 à 20 E.D., le produit peut être ajusté pour l'hydrolyse par l'amy- loglucosidase à la concentration préférée et peut donner des hydro- lysatà ayant une teneur en dextrose exceptionnellement élevée de 90 à 98% en produit sec. Toutefois, si le traitement acide est beaucoup plus poussé, bien qu'on puisse utiliser des solutions plus concentres, l'hydrolyse par l'amyloglucosidase ne paraît pas être complète parce que le traitement acide a produit une certaine quan- tité de produits de réversion résistant aux enzymes dans les pha- ses plus prolongées du traitement acide.
En tout cas, le substratum amylacé doit être dispersé dans l'eau et la solution doit être ajustée à un taux d'acidité et une température tels que l'amyloglucosidase puisse achever l'hydro- lyse dans le temps le plus court possible et avec la meilleure éco- nomie pour ce qui concerne la quantité d'enzyme utilisée. L'acidité et la température sont des variables interdépendantes, Le carbona- te de sodium, l'hydroxyde de sodium, etc., sont des mmatières alca- lines appropriées et l'acide chlorhydrique constitue un acide appro- prié pour le réglage du pH des liqueurs en vue de l'hydrolyse par l'amyloglucosidase.
La température optimum, d'hydrolyse au moyen d'amylo- glucosidase pure est comprise entre 35 eb 60 0. bien qu'elle dé- pende du pH, comme c'est le cas pour beaucoup d'autres enzymes. Ré- ciproquement, la gamme optimum de pli, qui est en général de 4 à 6,5', dépend de la température. En général, on obtient les taux optimum
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pure d'hydrolyse pour l'amyloglucosidase/dans la gamme inférieure de pH de 4 à 5 quand la température utilisée est dans la gamme infé- rieure de 55 à 45 C. et, la température augmentant, on obtient les taux optimum en augmentant en conséquence la valeur du pH.
Dans l'hydrolyse de l'amidon ou des produits amylacés au moyen d'amyloglucosidase de manière à produire le dextrose, il existe une autre limitation pour ce qui concerne le taux de pH et la température en raison de ce que le produit, le dextrose, est moins stable aux pH et aux températures supérieurs. Ainsi, dans 1'application de l'invention, les gammes opératoires préférées pour l'hydrolyse au moyen d'amyloglucosidase sont un pH de 4 à 4,8 et une température de 45 à 60 C.
La durée de l'hydrolyse de l'amidon dépend de diverses variables opératoires. Les plus importantes sont le rapport de l'a- myloglucosidase au substratum, le prétraitement de l'amidon, l'ad- dition d'enzymes assistantes, la température et le pH utilisés et la concentration du substratum. Toutefois, et en tout cas, l'hydro- lyse peut être suivie dans la pratique par les déterminations ana- lytiques bien connues, par exemple par la méthode de Sichert-Bleyer en vue de la détermin@ation du dextrose et l'hydrolyse est pour- suivie jusqu'à ce que l'analyse montre que l'action de l'amybgluco- sidase est sensiblement terminée dans les conditions opératoires choisies, c'est-à-dire que la concentration en dextrose de l'hydro- lysat à atteint la valeur optimum.
L'optimum pratique est en.géné- ral atteint quand les solides solubles de l'hydrolysat indiquent à l'analyse une teneur de 90 à 98% en dextrose. Le temps nécessaire pour arriver à cette valeur optimum varie entre dix et quatre-vingt- dix heures selon les variables opératoires, telles que celles dont on a parlé.
Une gamme opératoire commode d'addition d'amyloglucosi- dase purifiée est de 10 à 20 unités d'activités d'amyloglucosidase pour 100 g de substratum amylacé, soit environ 100 à 200 unités par kilogramme,
Le stade d'hydrolyse du procédé terminé, l'hydrolysat
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est raffiné, concentré, cristallisé et centrifugé de manière à récupérer le dextrose cristallisé à l'état pur au moyen de l'in- stallation et des procédés généraux bien connus dans l'industrie du raffinage de glucose, compte 'tenu de ce que les hydrolysats pro- duits conformément à l'invention contiennent moins de corps colo- et rés, d'électrolytes et autres impuretés/sont ainsi plus concentrés en dextrose, de sorte qu'ils cristallisent plus facilement et plus complètement que les hydrolysats obtenus pas les techniques anté- rieures.
Les exemples caractéristiques suivants illustrent la présente invention mais ne sont pas limitatifs.
Exemple I.
On ajoute un échantillon de liqueur de culture de A.ni- ger à une solution aqueuse d'amidon de mais converti par un acide, ayant un équivalent de dextrose E.D. de 17 (poids sec), un pH de 4 et une teneur en matière sèche de 35% en poids. Le rapport de la liqueur de culture brute aux matières sèches de l'hydrolysat est de 10 ml pour 100 g. Chaque mililitre contient 1,5 unité d'activi- té d'amyloglucosidase. On laisse l'hydrolyse enzymique se pour- suivre pendant soixante-douze heures à 60 C. On filtre alors la li- queur et on analyse. Le tcbleau ci-après donne les résultats obte- nus.
On traite un autre échantillon de la susdite liqueur brute de culture de A. niger en lui ajoutant un silicate de magné- sium synthétique insoluble dans l'eau vendu sous le nom déposé de "Magnesol" par la Westvaco Chlor-Alkali Division of the Food and Machin@ery Chemical Corporation". On ajoute l'agent absorbant dans la proportion de 4 g pour 100 ml avec une quantité d'acide chlorhy- drique suffisante pour maintenir un pH de 4 à 4,5 au cours du trai- tement, On agite le mélange à la température ambiante pendant envi- ron une heure et on filtre.
On ajoute le filtrat à un échantillon de l'hydrolysat
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d'amidon susdit selon un rapport de la ml de filtrat pour 100 g de matière sèche d'hydrolysat. Chaque millilitre contient 1,5 uni- té d'activité d'amyloglucosidase. On laisse l'hydrolyse se pour- suivre pendant soixante-douze heures à 60. C. On filt.re alors la liqueur et on la titre. Le tableau donne les résultats obtenus.
TABLEAU ---------
EMI17.1
<tb> Hydrolysat <SEP> pro- <SEP> Concentration <SEP> Densité <SEP> E.D. <SEP> Dextrose
<tb>
EMI17.2
venant de l'8c- en mat,sèche Optique vrai
EMI17.3
<tb> tion <SEP> de: <SEP> de <SEP> l'hydrolysat <SEP> à <SEP> #= <SEP> sec <SEP> sec
<tb>
EMI17.4
pds. 390nr' 36SK
EMI17.5
<tb> Liqueur <SEP> brute <SEP> A.
<tb> nier <SEP> - <SEP> 35.56 <SEP> 0,208 <SEP> 90,2 <SEP> 84,0
<tb>
<tb> Liq.brute <SEP> A.niger
<tb> + <SEP> traitement <SEP> absor- <SEP>
<tb> bant <SEP> 35,50 <SEP> 0,126 <SEP> 95,2 <SEP> 92,7
<tb>
* avec de Coleman modèle 14 @ essai de Fehling modifié par lane-Eynon.
@ méthode de fermentation par la levure de Smogyi.
On notera qu'il y a une augmentation de 8,7% de ren- dement en dextrose dans la matière sèche de l'hydrolysat quand la liqueur brute de culture est traitée conformément à l'invention de manière à enlever les substances nuisant au rendement en dextrose et les enzymes produisant des sucres autres que le dextrose. La te- neur en sucres autres que le dextrose beaucoup plus élevée produits au moyen de la liqueur cryptogamique brute est mànifeste si. l'on compare les valeurs des sucres totaux indiquées sous E.D. avec les valeurs de la teneur en dextrose vrai. Dans le cas de l'hydrolysat produit par la liqueur cryptogamique brute, on obtient 6,2% de su- cres différents du dextrose alors que dans le cas de l'hydrolysat produit par la liqueur cryptogamique traitée, on n'obtient que 2,5% de sucres différents du dextrose.
Ainsi, il y a presque 4% de plus de sucres différents du dextrose produits dans l'hydrolysat obtenu à l'aide de la liqueur cryptogamique brute. Le gain supplémentaire
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de rendement en dextrose au-dessus de ces 4% de sucres différents du dextrose jusqu'à 8,7% de plus de conversion en dextrose peut être expliqué par l'élimination par le traitement des matières pro- téiques et autres étrangères qui'agissent sur les hydrates de car- bone au cours de l'hydrolyse. Les valeurs de densité optique du tableau montrent que la couleur de l'hydrolysat d'amidon est ré- duite de 40% par l'utilisation de l'enzyme purifiée.
EMI18.1
II TT - Analyses chromatoraphiques des, hydroâ.âts.
Les échantillons d'hydrolysats provenant de l'exemple I prélevés à des temps différents au cours de la conversion enzy- mique sont examinés par chromatographie sur papier. Dans chacun des cas on place sur le papier des portions de 0,025 ml des échantil- lons réglés à une concentration en matières sèches de 12%, on sèche le chromatogramme au.moyen d'un mélange solvant consistant le papier et on développe/en 3 parties de butanol, 5 parties de pro- panol et 2 parties d'eau, en volume. Après un certain intervalle au cours duquel la fraction de dextrose se déplace d'environ 400 mm à partir de l'origine, on sèche les papiers,puis on les asperge d'une solution acétonique d'aniline, de diphénylamine et d'acide phospho- rique.
Le sirop d'amidon hydrolysé par un acide original seul, et le même sirop contenant de l'isomaltose et du panose sont également chromatographiés à titre, de témoins de manière à fournir des points de référence pour des saccharides cannas. Pendant ce temps, le mal- tose se déplace d'environ 190 mm, l'isomaltose de 150 mm, les tri- saceharides d'environ 80 à 90 mm, les tétrasaccharides de 40 mm et les pentasaccharides de 15 mm. Toutes ces taches se voient très fa- cilement dans le chromatogrammes témoins, sont distinctes et bien séparées les unes des autres.
Quand on examine les échantillons d'hydrolysats provenant de l'exemple 1 dans lesquels on utilise seulement le filtrat brut de culture de A.niger pour hydrolyser le sirop d'amidon hydrolysé par un acide, on voit que l'hydrolysat est largement constitué de dextrose. Toutefois, on voit une tache prononcée orrespondant au
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panose, trisaccharide synthétique, des taches plus faibles corres- pondant au maltose et à l'isomaltose et des taches encore plus faibles correspondant aux tétra- et penta-saccharides, toutes pour vingt-quatre heures d'hydrolyse à 60 c. Toutes ces taches, sauf celles du dextrose et de l'isomaltose, s'affaiblissent après soixan- te-douze heures d'hydrolyse, mais la tache correspondant au tri- saccharide synthétique, le panose, reste relativement intense.
On sait que l'isomaltose est un produit normal d'hydro- lyse de l'amidon, même quand l'amidon est hydrolysé par ur. acide et même quand ladite hydrolyse acide est effectuée dans des conditions moins favorables à ia formation de l'isomaltose par recombinaison de deux molécules de dextrose (Cf. Wolfrom et autres, J. Am. Chem.
Soc. 73.4927. (1951)). t
Le panose présent'dans les hydrolysats d'amidon provient en grande partie de la synthèse réunissant le maltose au dextrose avec une liaison 1-. alpha-glucoside par action de la transglucosi- dase (Cf. Pan et autres, Science, 112, 115 (1950) et J.Am.Chem.Soc.
73,4093 (1951)).
Quand on examine des hydrolysats obtenus au moyen d'a- myloglucosidase purifiée par traitement de la liqueur de culture de A. niger au moyen de "Magnesol", après vingt-quatre heures de conversion enzymique les hydrolysats contiennent à peu près la mê- me quantité de trisaccharides et de maltose que le témoin non hydro-, lysé par l'enzyme, plus d'isomaltose et beaucoup plus de dextrose.
Après soixante-douze heures de conversion enzymiques, l'hydrolysat est presque entièrement formé de dextrose, avec des traces d'iso- maltose, et seulement de très faibles traces de maltose et de pa- nose. Les quantités de saccharides supérieurs sont insuffisantes pour être décelables sur le chromotogramme.
Ces résultats montrent que le traitement par le "Ma= gnesol" de l'extrait de A. niger enlève effectivement la transglu-
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cosiduso de sorte qu'il ne se produit pas de diminution des ren- dements en dextrose par synthèse de sucres tels que le panose.
Ces résultats montrent en outre que, après traitement de la li- , queur de culture au moyen de "Magnesol", la préparation enzymique purifiée obtenue ne manifeste sensiblement qu'une action hydroly- sante de l'amidon qui est attribuée à l'enzyme pure, l'amyle-gluco- sidase, c'est-à-dire que l'attaque des extrémités de chaque molé- cule d'amidon (ou molécule d'amidon hydrolysée par un acide) ne provoque que le clivage des motifs de dextrose des extrémités de la molésule, jusqu'à ce quc l'hydrolyse soit pratiquement terminée.
EXEMPLE III.
On lave de l'amidon à l'eau, on le met.en milieu auqueux à la Bé et on règle à une acidité d'environ 0,02 N d'cide chlorhydrique, et on effectue la conversion à l'autoclave sous une pression manométrique de 1,4 kg/cm2 de vapeur d'eau jusqu'à ce que la liqueur de conversion ait une valeur E.D.
de 17 environ, c'est- à-dire que la valeur réductrice des solides dissous dans la liqueur telle que mesurée par l'essai de Fehling modifié (Fet zer W.J.,Ana- lytical Ohem. 24, 1129-1137 (1952), références 37 à 41) et les ré- sultats calculés en dextrose sont de 17 pour cent, en poids sec.Le sirop d'amidon est alors traité au moyen d'environ 0,5%, poids sec, de betonite, et filtré sur un filtre préalablement enduit de "Dica- lite" comme adjuvant de filtration. On règle les liqueurs à pH 4,5 par l'addition de carbonate de sodium et on concentre par évapora- tion sous pression réduite jusqu'à environ 35% de substance sèche.
On règle alors les liqueurs à un pH d'environ 4 à 4,2 à 60 C., et on ajoute environ 200 unités d'activité d'une préparation purifiée d'amyloglucosidase par kilogramme de matière sèche.
On purifie l'amyloglucosidase pur traitement d'un ex- trait de culture cite,. niger au moyen de "Magnesol "à titre d'agent absorbant do la manière décrite dans l'exemple I, paragraphe 2. On
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laie se l'hydrolyse enzymique se poursuivre à 60 C, pendant soixan- te-douse heures su bout desquelles on obtient des valeurs maximum d'environ 95 à 96 6 de E.D. et d'environ 93, compté sec, de dextro- se vrai par la méthode de fermentation à la levure de Smogyi.
On traite les liqueurs converties au moyen d'environ 1' de carbone, on filtre et on évapore à environ 70 à 75 .' de ma- tière sèche avant de faire passer dans l'appareil de cristallisa- tion. En raison de la pureté plus élevée de ces liqueurs compara- tivement aux liqueurs à cristalliser obtenues par les procédés an- térieurs, le dextrose tend à cristalliser plus facilement, carac- téristique qui nécessité l'usage d'une liqueur légèrement moins concentrée qu'il n'est courant dans les procédés ordinaires de cristallisation du dextrose. On utilise une température initiale de 42 C. dans l'appareil de cristallisation avec l'addition usuel- le de cristaux de dextrose d'ensemencement, et on refroidit les li- queurs en agitanten l'espace de deux jours, à environ 16 à 18 C.
On centrifuge alors les liqueurs pour récupérer les cristaux de dextrose et on fait recristalliser les liqueurs par évaporation à environ 75 à 80 % de matière sèche en agitant et refroidissant de 42 à 18 C. en quatre jours.
On obtient par ce procédé du dextrose cristallisé très pur de première qualité avec un rendement de 85%, déduction faite des cristaux de dextrose ajoutés pour l'ensemencement dans la oris- tallisation de l'hydrolysat concentre. Ce rendement en dextrose est d'environ 20% supérieur à celui obtenu à partir de l'amidon par les procédés classiques de conversion par un acide en utilisant un seul qtade de conversion par un acido et des procédés de raffinage comparables, et de 5 à 1.0 ' supérieur à celui des procédés de con- version enzymiques antérieurs, en ayant recours à Lui seul stade de conversion enzymique d'un amidon ayant' subi utle hydrolyse acide,
à des opérations comparables de raffinage et ù un procédé de cristal- lisation comparable en deux stades.
REVENDICATIONS.
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1. Procédé de purification d'une préparation enzymique d'amyloglucosiidase, consistant à traiter une solution aqueuse de ladite préparation au moyen de 2 à 5% environ d'un silicate de magnésium hydraté synthétique insoluble dans l'eau, à un pH d'en- viron 3,8 à 4,5, à centrifuger le mélange et à récupérer la phase liquide contenant l'amyloglucosidase.
2. Procédé de fabrication de dextrose à partir d'ami- don, consistant à hydrolyser l'amidon en système aqueux au moyen d'une préparation d'enzyme d'amyloglucosidase jusqu'à une teneur en dextrose vrai et une valeur E.D. maximum, à clarifier l'hydrolysat, à le concentrer par évaporation et à le laisser cristalliser, puis à séparer le dextrose cristallisé de la liqueur-mère, ce procédé étant caractérisé par l'hydrolyse de l'amidon avec une prépara- tion d'enzyme d'amyloglucosidas qui a été purifiée par le procédé suivant la revendicationl, cette hydrolyse ayant pour résultat un hydrolysat final ayant des valeurs maximum de 95 à 96 % de E.D. et une teneur maximum en dextrose vrai de 93 à 94 %, en produit sec:
3.
Un procédé de purification d'une préparation enzymi- que d'amyloglucosidase, tel que décrit ci-avant avec référence spé- ciale à l'un quelconque des exemples.
4. Le procédé amélioré de production de dextrose à par- tir d'amidon, tel que décrit ci-avant avec référence spéciale à l'un quelconque des exemples particuliers.
5. Amyloglucosidase sensiblement pure lorsqu'elle est préparée par le procédé des revendications 1 ou 3.
6. Dextrose, lorsqu'il est préparé par le procéda des revendications 2 ou 4.