FI86440B

FI86440B - Foerfarande foer samtidig framstaellning av xylitol och etanol.

Info

Publication number: FI86440B
Application number: FI900220A
Authority: FI
Inventors: Heikki Heikkilae; Marja-Leena Sarkki; Goeran Hyoeky; Tapio Viljava; Leena Rahkila
Original assignee: Cultor Oy
Priority date: 1990-01-15
Filing date: 1990-01-15
Publication date: 1992-05-15
Also published as: WO1991010740A1; EP0511238B1; US6846657B2; FI86440C; FI900220A0; BR9105939A; FI900220A; ATE136935T1; JPH05503844A; EP0511238A1; JP3041539B2; DE69118869D1; DE69118869T2; US20030235881A1; ES2088482T3; DK0511238T3

Description

1 86440

Menetelmä ksylitolin ja etanolin valmistamiseksi samanaikaisesti

Keksintö koskee menetelmää ksylitolin ja etanolin 5 valmistamiseksi samanaikaisesti. Lähtöaineena käytetään hydrolysoitua lignoselluloosapitoista materiaalia, ja menetelmän mukaisesti lähtöaine fermentoidaan hiivakannan avulla, minkä jälkeen etanoli otetaan talteen ja fermen-toidulle liuokselle suoritetaan kromatografinen erotus 10 puhtaan ksylitolin saamiseksi.

Ksylitoli on luonnossa esiintyvä sokerialkoholi, joka muodostuu ksyloosin pelkistysreaktiossa ja joka makeudeltaan ja kaloripitoisuudeltaan (4 kcal/g) vastaa "tavallista" sokeria. Ksylitoli esiintyy pieninä määrinä mo-15 nissa hedelmissä ja vihanneksissa ja sitä muodostuu myös ihmiskehossa normaalina aineenvaihduntatuotteena. Ksylitoli on tiettyjen aineenvaihdunnallisten, hammaslääketieteellisten ja teknisten ominaisuuksiensa perusteella erittäin hyvä erikoismakeuttaja erilaisissa yhteyksissä. Esi-20 merkkinä voidaan mainita, että ksylitoliaineenvaihdunta on riippumaton insuliiniaineenvaihdunnasta, joten myös diabeetikot voivat käyttää sitä. Ksylitoli vaikuttaa myös hidastavasti suolen toimintaan, joten sillä voi olla käyttöä laihdutusdieeteissä. Lisäksi on haivaittu, että ksyli-·.: 25 toli ei aiheuta hammasmätää, vaan sillä on jopa karios-taattinen vaikutus.

Ksylitolin lukuisista eduista huolimatta sen käyttö on ollut melko rajoittunutta. Syynä tähän on ksylitolin suhteellisen korkea hinta, mikä taas johtuu vaikeuksista . . 30 tuottaa ksylitolia suuremmassa mittakaavassa.

Etanoli on hyvin tunnettu yhdiste, jolla on laaja käyttö.

Ksylitolia on aikaisemmin valmistettu ksylaanipi-toisesta materiaalista hydrolysoimalla, jolloin saadaan .35 monosakkaridiseos, jossa on mm. ksyloosia. Ksyloosi muutetaan sitten ksylitoliksi, yleensä nikkelikatalysaattorin, 2 86440 kuten Raney-nlkkelin läsnäollessa. Lukuisia menetelmiä ksyloosin ja/tai ksylitolin valmistamiseksi ksylaanipitoi-sesta materiaalista on kuvattu alan kirjallisuudessa. Esimerkkeinä voidaan mainita US-patenttijulkaisu 3 784 408 5 (Jaffe et ai.), US-patenttijulkaisu 4 066 711 (Melaja et ai.), US-patenttijulkaisu 4 075 406 (Melaja et ai.), US-patentti julkaisu 4 008 285 (Melaja et ai.) ja US-patentti-julkaisu 3 586 537 (Steiner et ai.).

Nämä tunnetut menetelmät ovat kaikki monivaiheisia, 10 suhteellisen kalliita ja tehokkuudeltaan riittämättömiä prosesseja. Suurimpina ongelmina ovat ksyloosin ja/tai ksylitolin tehokas ja täydellinen eristäminen polyoleista ja muista hydrolyysisivutuotteista ja prosessissa runsaasti syntyvien sivutuotteiden käyttö. Puhdistus on erittäin 15 vaativaa mm. sen takia, että ksyloosin pelkistysreaktiossa käytettävät katalyytit ovat hyvin herkkiä. Lopputuotteen puhtaus taas riippuu suuresti siitä, että ksylitoli saadaan erilleen muista pelkistysreaktiossa syntyneistä tuotteista.

20 On tunnettua, että useat hiivakannat tuottavat re- duktaasientsyymejä, jotka katalysoivat sokerien pelkistämisen vastaaviksi sokerialkoholeiksi. Tiettyjen Candida-kantojen on esitetty tuottavan ksylitolia ksyloosista (Ditzelmuller, G, et ai.: FEMS Microbiology Letters 25 25 (1985) 195 - 198, Kitpreechavanich, M. et ai.: Biotechno logy Letters voi 6 (1984) 651 - 656, Gong, C-S. et ai.: Biotechnology Letters voi 3 (1981) 125 - 130). Nämä tutkimukset on kuitenkin tehty vain laboratoriomittakaavassa, eikä alan kirjallisuudessa ole esitetty menetelmiä, joissa . . 30 kiteinen puhdas ksylitoli eristetään fermentaatiotuottees-; · ta.

Hakijan rinnakkaishakemuksessa US 297 791, jätetty 17.1.1989, kuvataan menetelmä puhtaan kiteisen ksylitolin valmistamiseksi kasvimateriaalista käyttäen hydrolyysin ja . 35 fermentoinnin jälkeen kromatografista erottamista. Tässä 3 86440 menetelmässä kuitenkin suurin osa raaka-aineesta menetetään arvottomana jätemateriaalina. Mikäli suurempi osa raaka-aineista voitaisiin muuttaa kaupallisiksi tuotteiksi, tämä oleellisesti parantaisi kokonaismenetelmän talou-5 dellisuutta.

Tiedetään, että etanolia voidaan valmistaa selluloosasta ja hemiselluloosasta fermentoimalla sopivan hii-vakannan avulla. Etanolin valmistusta D-ksyloosista on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 368 268 (C-S. 10 Gong), joka erityisesti kohdistuu mutanttien aikaansaami seen, jotka tuottavat etanolia suurin saannoin, ja julkaisussa Biotechnology and Bioengineering Symp. 12 (1982) 91 - 102, McCracken, L. & Gong, C-S., jossa fermentointi suoritetaan termotoleranttien hiivojen avulla.

15 Nyt on havaittu, että ksylitolia ja etanolia voi daan tuottaa samanaikaisesti käyttäen keksinnön mukaista menetelmää, jossa ksyloosi muutetaan ksylitoliksi, kun taas suurin osa raaka-aineessa olevista muista heksooseis-ta muutetaan etanoliksi. Näin raaka-ainetta käytetään te-20 hokkaasti hyödyksi, ja saadaan kahta kaupallisesti erittäin tärkeätä tuotetta puhtaina ja korkealla saannolla. Menetelmä on yksinkertainen ja tehokas.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että hydrolysoitu lähtöaine fermentoidaan hiivakannan 25 avulla, muodostunut etanoli otetaan talteen, jäljelle jääneelle ksylitoliliuokselle suoritetaan kromatografinen erotus ja puhdas ksylitoli kiteytetään. Lähtöaineena käytetään ksyloosipitoisia materiaaleja, jotka keksinnön mukaisesti fermentoidaan hiivakannan avulla, joka pystyy . . 30 muuttamaan ksyloosin ksylitoliksi ja useimmat heksoosit etanoliksi. Fermentoinnin avulla saadaan runsaasti ksylitolia sisältävä liuos, josta ksylitoli otetaan talteen yksinkertaisella tavalla. Työläitä ja monimutkaisia ero-tusvaiheita (kuten perinteistä ioninvaihtoa, deminerali-. 35 sointia, saostuksia tms) ei tarvita, vaan yleensä ksylito- 4 86440 li voidaan puhdistaa yhdessä vaiheessa kromatografisesti, minkä jälkeen se kiteytetään puhtaan ksylitolin saamiseksi. Etanoli on helppo poistaa fermentointiliuoksesta esimerkiksi haihduttamalla. Näin vältetään tarve erottaa ksy-5 litoli heksitoleista ja muista sokereista, jotka ovat muodostuneet hydrolyysi- ja pelkistysvaiheissa. Keksinnön mukaisesti suoritettu hydrolyysi tarjoaa myös ratkaisun muissa menetelmissä jätemassana poistetun sulpun käytölle, joten keksinnön mukaisessa menetelmässä oleellisesti koko 10 lähtömateriaali hyödynnetään.

Lähtömateriaalina keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää melkein mitä tahansa ksylaanipitoista materiaalia. Mahdollisia lähtöaineita ovat mm. lehtipuut, kuten koivu, pyökki, poppeli, leppä ym. ja kasvit tai kas-15 vien aineosat, kuten vehnän, maissin, kauran tai ohran oljet tai kuoriosat, maissintähkät ja -varret, pähkinänkuoret, sokeriruohon murskausjäte (bagassi) ja puuvilla-siementen kuoret. Käytettäessä puuta lähtömateriaalina, se edullisesti pienennetään tai käytetään hakkeena, sahapuru-20 na ym. ja käsitellään hydrolysoimalla tai höyryräjäytysme- netelmällä ja jälkihydrolysoimalla, jolloin saadaan keksinnössä käyttökelpoista hiilihydraattimateriaalia.

Edellä mainittujen lisäksi voidaan käyttää esimerkiksi puumassan käsittely- ja valmistusprosesseissa muo-25 dostuneita runsaasti ksylaania tai ksyloosia sisältäviä sivutuotteita. Esimerkkinä mainittakoon puumassan valmistuksessa sulfiittiprosessin avulla syntyvä hapan sulfIitti jäteliemi, joka sisältää pieniä määriä liukenemattomia puun kiintoaineita, sekä liukoisia aineita, kuten ligno-30 sulfonaatteja, heksooseja ja pentooseja, mukaan lukien ksyloosi, ja on hyvä raaka-aine käytettäväksi ksylitolin valmistuksessa. Paperin ja puumassan prosessoinnissa syntyneitä muita sivutuotteita ja jätetuotteita, kuten esimerkiksi esihydrolysaatteja viskoosimassan valmistuksesta 35 ja ns. neutraalisulfiittiprosessin jätelientä, jotka sisältävät paljon ksylaania ja/tai ksyloosia voidaan myös käyttää.

s 86440

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään vesi-liuosta, joka sisältää vapaata ksyloosia. Näin ollen saattaa olla tarpeen suorittaa lähtömateriaalille happo- ja/ tai entsyymihydrolyysi ksylaanin hajottamiseksi ksyloosik-5 si. Menetelmiä ksylaanipitoisten materiaalien hydrolysoi-miseksi ksyloosipitoisten liuosten saamiseksi on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 3 784 408 (Jaffe et ai.) ja 3 586 537 (Steiner et ai.).

Lähtömateriaali voidaan haluttaessa esikäsitellä 10 ennen fermentointia sellaisten aineosien poistamiseksi, jotka saattavat olla hiivalle myrkyllisiä tai muilla tavoin haitallisia. Esikäsittelyvaiheen tarpeellisuus riippuu käytetystä lähtömateriaalista ja fermentoinnissa käytetystä hiivasta. Lähtömateriaalin esikäsittely voi käsit-15 tää esimerkiksi jälkihydrolyysin, kromatografisen erotuksen, ioninvaihtopuhdistuksen, saostuksen tms.

Prosessikaavio on esitetty seuraavassa: hydrolyysi 20 fermentointi 25 tislaus -♦ etanoli kromatografia . . 30 kiteytys ▼ . 35 ksylitoli 6 86440

Hydrolyysi voi käsittää kaksi vaihetta, selluloo-sapitoisen raaka-aineen esihydrolyysin, joka voidaan suorittaa käyttäen ns. höyryräjäytysmenetelmää, sekä poly- ja oligosakkaridien entsymaattisen hydrolyysin vastaavien 5 monosakkaridien muodostamiseksi. Tämä vaihe suoritetaan entsyymien avulla, joilla on korkea sellulolyyttinen ja ksylanolyyttinen aktiivisuus.

Jäljelle jääneet kiinteät aineet, koostuen suurilta osin ligniinistä, erotetaan sitten saadusta liuoksesta. 10 Vaihtoehtoisesti mainitut kiinteät aineet ja fermentoin-nissa synytyvät kiinteät aineet, kuten hiiva, voidaan erottaa tai ottaa talteen seuraavan tislauksen jälkeen.

Kun raaka-aineena käytetään suhteellisen epäpuhtaita liuoksia, saattaa liuosten esikäsittely joissakin ta-15 pauksissa olla tarpeen. Esikäsittely voi olla esimerkiksi jälkihydrolyysi ja/tai aineosien erottaminen, jotka aineosat voivat olla käytetylle hiivalle myrkyllisiä ja/tai haitallisia tai joilla on haitallinen vaikutus fermentoin-tiin tai erotusvaiheisiin. Esikäsittelyyn voi myös liittyä 20 kromatografinen erotus, ioninvaihtopuhdistus, saostus tms.

Seuraavaksi liuos fermentoidaan sopivan hiivakannan avulla. Keksinnössä käytetään hiivoja, jotka pystyvät pelkistämään ksyloosin ksylitoliksi ja heksoosit etanoliksi ja/tai käyttävät heksooseja kasvuun. Tällaisia hiivoja ·.: 25 ovat mm. Candida-, Pichia-, Pachysolen- ja Debaryomyces-sukuihin kuuluvat hiivat. Edullisina pidetään Candida- ja Debaryomyces -lajeja, erityisesti Candida tropicalis ja Debaryomyces hansenii. Hyvänä esimerkkinä voidaan mainita Candida tropicalis -kanta, joka on talletettu talletuslai-.30 tokseen the American Type Culture Collection numerolla ATCC 9968.

Fermentoitavan vesiliuoksen ksyloosipitoisuus riippuu käytetystä lähtömateriaalista ja prosessivaiheista, mutta on edullisesti noin 50 - 300 g/1.

.35 Fermentointi voidaan suorittaa useimmissa kaupal lisesti saatavissa fermenttoreissa, jotka on varustettu 7 86440 ilmastusvälineillä ja sekoitus- ja pH-säätelyvälineillä. Lämpötila on edullisesti noin 20 - 40 °C, erityisen edullisesti noin 30 eC. Hiivasolut lisätään korkean ksyloosi-pitoisuuden liuokseen. Yleisesti voidaan sanoa, että mitä 5 suurempi on hiivakonsentraatio, sitä nopeampi on fermen-tointivaihe. On havaittu, että hiivakonsentraatio on edullisesti noin 1 - 20 g kuivaa hiivaa/1 substraattia (kuiva-painoa) kun ksyloosipitoisuus on noin 50 - 300 g/1.

Fermentointia voidaan tehostaa lisäämällä ravin-10 teitä ja sitä jatketaan kunnes suurin osa ksyloosista on muutettu ksylitoliksi ja olennaisesti kaikki heksoosit on muutettu etanoliksi ja/tai käytetty hiivan kasvuun. Fer-mentointi kestää yleensä noin 24 - 144 tuntia, edullisesti 24 - 72 tuntia. Keksinnön mukaisella menetelmällä jopa 90 15 % ksyloosista voidaan muuttaa ksylitoliksi.

Fermentoinnin jälkeen liuos kirkastetaan ennen ksylitolin ja etanolin erottamista siitä. Hiivasolut poistetaan fermentoinnin jälkeen. Tämä voidaan suorittaa sentri-fugoimalla, suodattamalla tai muulla samankaltaisella me-20 nettelyllä. Kun hiivasolut on poistettu ja liuos on kirkas otetaan fermentoinnissa syntynyt etanoli talteen haihduttamalla, tislaamalla tai muulla samankaltaisella menettelyllä. Hiivasolujen poisto voidaan vaihtoehtoisesti suo-rittaa tislauksen jälkeen.

-/:25 Ksylitolin talteenottamiseksi suoritetaan ensin : kromatografinen erotus. Tämä tehdään edullisesti kolonnis sa, joka on täytetty divinyylibentseenillä ristisidotulla sulfonoidulla polystyreenihartsilla alkali/maa-alkalimuo-dossa. Tarkoitukseen sopivaa suuren mittakaavan kromato-- 30 grafiamenetelmää on kuvattu US-patenttijulkaisussa 3 928 193 (Melaja et ai.). Kromatografinen erotus voidaan suorittaa myös käyttäen simuloitua liikkuvaa petiä, kuten on kuvattu US-patenttijulkaisussa 2 985 589. Kolonnin täytteenä käytetään DVB-ristisidottua sulfonoitua polysty-35 reenihartsia.

β 86440

Kromatografiavaiheessa saadusta runsaasti ksylitolia sisältävästä fraktiosta ksylitoli voidaan kiteyttää hyvällä saannolla käyttäen tavanomaisia kiteytysmenetel-miä, kuten jäähdytys- tai haihdutuskiteytystä. Käytettäes-5 sä jäähdytyskiteytystä konsentroituun ksylitoliliuokseen lisätään siemenkiteiksi ksylitolikiteitä, joiden keskimääräinen läpimitta on noin 30 mikronia, minkä jälkeen liuoksen lämpötilaa alennetaan hitaasti. Saadut kiteet, joiden keskimääräinen läpimitta on noin 250 - 600 mikronia, ero-10 tetaan esimerkiksi sentrifugoimalla ja pestään vedellä oleellisesti puhtaan kiteisen ksylitolin saamiseksi.

Menetelmä voidaan vaihtoehtoisesti suorittaa siten, että lähtöaineelle suoritetaan osittainen hydrolyysi ja uutto. Uutosta saatu esihydrolysaatti fermentoidaan sitten 15 ksyloosin muuttamiseksi ksylitoliksi, joka erotetaan kro-matografisesti ja kiteytetään edellä kuvatulla tavalla. Uutetulle massalle suoritetaan loppuhydrolyysi, hydrolyy-situote fermentoidaan heksoosien muuttamiseksi etanoliksi ja etanoli otetaan talteen edellä kuvatulla tavalla.

20 Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla, joiden tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä.

Esimerkki 1 V '25 Etanolin ja ksylitolin valmistus koivulastuista

Koivulastuille suoritettiin höyryräjäytyskäsittely 215 °C:ssa viiveajalla 4,5 min. Käytetty laitteisto on kaupallisesti saatavissa (Stake Technology, Canada).

30 kg höyryräjäyttämällä esikäsiteltyjä lastuja :30 suspendoitiin 400 l:aan vettä 50 °C:ssa sekoitusvälineillä varustetussa reaktorissa. Suspension pH säädettiin arvoon 4,8 NaOH-liuoksella. Seuraavat entsyymit lisättiin reaktoriin: 9 86440

Cellulase Multifect L 250 4 FPU/g k.a.

(Cultor) beta-Glucosidase Novozyme 188 5 IU/g k.a.

5 (Novo)

Hemicellulase Multifect K, (Cultor) sisältäen ksylanaasia 18 U/g ka 10 β-ksylosidaasia 9 nkat/g ka esteraasia 2 nkat/g ka

Reaktio aloitettiin ja 3 ja 6 tunnin jälkeen seok-15 seen lisättiin esikäsiteltyjä koivulastuja kiinteiden aineiden pitoisuuden nostamiseksi 14 paino-%:iin. Hydrolyy-siä jatkettiin 3 vrk 50 °C:ssa ja pH-arvossa 4,8. Saanto hydrolyysin jälkeen oli 16 % glukoosia ja 12 % ksyloosia laskettuna esikäsiteltyjen lastujen kuivapainosta.

20 Liuos erotettiin kuiva-aineesta dekantointisentri- fuugissa (Sharpies P 600). Hienojakoinen aine poistettiin Westfalia Na7-06-076 -separaattorissa ja ksyloosi-glukoo-siliuos konsentroitiin haihduttamalla. Konsentraatin pH oli 5,1 ja koostumus oli seuraava: 25 glukoosi 10,3 % ksyloosi 7,6 % muita monosakkarideja 3,1 % V oligosakkarideja 5,5 % : Kiinteiden aineiden kokonaismäärä oli noin 32 %.

: 30 Liuos sisälsi lisäksi orgaanisten happojen suoloja ja pieniä määriä ligniinin hajoamistuotteita, furfuraalia, fenoleja ja muita orgaanisia aineita.

Hydrolysoitu tuote fermentoitiin hiivalla Candida tropicalis ATCC 9968. Fermenttorina käytettiin New Bruns-... 35 wick Scientific Co If 250 -fermenttoria johon oli liitetty kaasuanalyysi- ja massaspektrometrilaitteistot.

10 86440

Fermentointiliuoksessa oli: 60 1 esihydrolysaattia (kuiva-ainepitoisuus noin 32 %) 5 1,5 kg Gistex-hiivauutetta (höyrysteriloitu 121 °C, 15 min) 29 1 vettä 10

Siirrostusviljelmät kasvatettiin kahdessa vaiheessa, ensin 2 1 erlenmeyerpullossa Orbital Shaker -ravisteli jassa 30 °C:ssa, 2 vrk ja sitten Microgen SF 116 -la-boratoriofermenttorissa, jonka käyttötilavuus oli 11 1. 15 Fermenttoria ilmastettiin nopeudella 5,5 Nl/min (0,5 WM) ja sekoitettiin nopeudella 500 rpm. Kasvatus kesti 1 vrk.

Varsinainen fermentointi suoritettiin pilot -mittakaavassa käyttötilavuuden ollessa 100 1. Fermenttoria ilmastettiin nopeudella 20N1/ min (0,2 WM) ja sekoitettiin 20 nopeudella 100 rpm. Lämpötila pidettiin 30 °C:ssa ja pH-arvo 6:ssa. Vaahtoamisen säätelyaineena käytettiin Plurio-ria R.

Fermentointitulokset on esitetty taulukossa 1.

li B 6 4 4G

rl

N

σι

H

rH

0 do^r^vooviico (¾ *******

ΡΗώΛΐη^ηΐΝ Q) N « N N N M

rH

N

01 •rl id in ^ <y\ 0 - '

O CO N rH

X m 3

rH

o

H

s.

o

•H

H

O

•POOtvOCOfSvO

•r^ ^ v s v k v v

HON^uiinrHO

>1 H (N (N

m

X

• rH

o X ~ - - X o 3 a: H \

3 O

(0 W

Ei

(0 O rH O rH

> * * * * * rl [Ί IO f» OS lö

H

£ 2" w in o o in K V K *

(OOlOOOrHinrHVO X rH (M M· VO en CO

•H <-1 <0 i2 86440

Fermentoinnin Jälkeen oleellisesti kalkki sokerit olivat muuttuneet ksylitoliksi tai etanoliksi.

Etanoli otettiin talteen liuoksesta tislaamalla fermentoitu liuos tavanomaisella tavalla. Tislauslaitteis-5 to koottiin vakiorakenneosista (Corning Process Systems), jotka olivat borosilikaattilasia ja laitteisto käsitti välineet 15 erotusvaihetta varten seuraavasti: kiehutin, 13 kellopohjaa ja syöttöpohja 4. ja 5. kellopohjan välissä ylhäältä lukien. Kolonnin halkaisija oli 10 cm.

10 Tislaus suoritettiin paineessa 110 mbar syöttöno- peudella 10 1/h ja palautussuhteella 3:1. 110 l:sta fer-mentointiliuosta saatiin 7,0 kg tislettä, joka sisälsi 27,1 paino-% etanolia. Pöhjatuotteen etanolipitoisuus oli 0,02 paino-%.

15 Ksylitolin erotus ja kiteytys tapahtui esimerkeissä 2 ja 3 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 2

Etanolin ja ksylitolin valmistus sulfiittijätelie-20 mestä Lähtöaineena käytettiin sulfiittijäteliemestä kro-matografisesti erotettua sokerijaetta (FI 862273, US 4 631 129), joka sisälsi huomattavan määrän heksooseja, pääasiassa glukoosia. Liuoksen koostumus ennen fermentoin-25 tia ja sen jälkeen on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 aineosa_ennen fermentointia_fermentoinnin jälkeen 30 kuiva-aine paino-% 19,0 oligosakk. % k.a. 14,8 10,3 glukoosi 90,0 1,4 ksyloosi 42,0 3,5 arabinoosi 5,0 2,3 35 ksylitoli - 25,4 . etanoli - 42,0 arabinitoli - 2,8 i3 86440

Fermentointi suoritettiin Debaryomyces hansenii -kannalla ja väliaineeseen lisättiin 3 g/1 hiivauutetta, 3 g/1 mallasuutetta ja 5 g/1 peptonia. Fermentoitavan liuoksen pH oli alussa noin 6,0, lämpötila oli noin 30 °C 5 ja fermentointi suoritettiin Orbital Shaker -ravistelijässä (200 rpm).

Fermentoinnissa syntynyt etanoli otettiin talteen tislaamaalla (50 °C, 200 mbar) ja jäljelle jääneelle liuokselle suoritettiin kromatografinen erotus divinyyli-10 bentseeni-ristisidotulla polystyreenirunkoisella kationin- vaihtajalla täytetyssä kolonnissa, jolloin käytettiin seu-raavia olosuhteita: kolonnin korkeus 4,0 m kolonnin läpimitta 22,5 cm

15 lämpötila 65 eC

virtausnopeus (H20) 30 1/h syöttöpitoisuus 30 paino-% syöttökoko 6 kg kuiva-ainetta hartsi: Finex C 09 20 palloskoko 0,37 mm ionimuoto Na+

Tulokset on esitetty graafisesti kuviossa. Ksylito-li erotettiin ksyloosista ja muista epäpuhtauksista ja .·. : 25 otettiin talteen korkean ksylitolipitoisuuden omaavasta ; fraktiosta, josta puhdas ksylitoli kiteytettiin esimerkis- I.." sä 3 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 3 30 Ksylitolin kiteytys

Kromatograf isesti rikastetusta ksylitoliliuoksesta, joka sisälsi 82,5 % ksylitolia kuiva-aineesta, ksylitoli kiteytettiin haihduttamalla liuos 92 p-% kuiva-ainetta .- sisältäväksi 65 °C:ssa. Liuokseen, jota oli 2 200 g luon- 35 nonpainoa, ympättiin 0,03 p-% kuiva-aineesta noin 0,04 mm kokoisia ksylitolikiteitä, ja liuos jäähdytettiin 55 tun nissa 45 °C:een seuraavan empiirisen yhtälön mukaisesti: T = Tl - (t/tl)**2 * (Tl - T2), missä

i4 B 6 4 4 O

5 T = liuoksen lämpötila, °C

Tl = siemennyslämpötila (65 °C) T2 = loppulämpötila (45 °C) t = aika siemennyksestä, h tl = kiteytysaika (55 h) 10

Kiteytys suoritettiin vertikaalisella sekoittajalla varustetussa 2 litran pilot -kiteyttimessä. Liuoksessa olevasta ksylitolista kiteytyi 65 % raakakiteinä, jotka erotettiin emäliuoksesta korisentrifugilla (Hettich, Roto 15 Silenta II).

Linkouksen aikana kiteitä pestiin vedellä (4 % vettä kiteiden painosta). Linkousaika oli 5 min ja käytettiin 2 000 g:n keskipakovoimaa. Kidesuspensiota lingottiin 1 510 g luonnonpainoa, mistä saatiin 705 g kuiva-ainetta 20 kidettä, jonka ksylitolipitoisuus oli 99,4 % kuiva-ainees ta. Kiteiden keskikoko oli 0,37 mm ja standardipoikkeama 24 %.

Raakakiteet voidaan uudelleenkiteyttää tuotekiteik-si FI-patenttijulkaisussa 69296 esitetyllä tavalla.

O-: 25 : Esimerkki 4

Etanolin ja ksylitolin valmistus ohrankuorista Lähtöaineena käytettiin ohrankuorimassaa, jonka hiilihydraattikoostumus oli seuraava: 30 ksylaani 21,6 % k.a.

- . glukaani 33,4 arabinaan! 5,7 galaktaani 1,4 mannaani 0,6 35 ramnaani 0,2 is 86440

Ohrankuorimassa hydrolysoitiin paineessa 350 psi 235° C:ssa ja viiveaika oli 2,0 min. Hydrolysoitu materiaali sisälsi 46,6 % kuiva-ainetta ja liuenneiden kiinteiden aineiden pitoisuus oli 34,2 % kuiva-aineesta. Suo-5 dos sisälsi kuiva-aineesta laskettuna monosakkarideja 12,7 %, etikkahappoa 16,9 % ja furfuraalia 0,5 %. Suodok-selle suoritettiin jälkihydrolyysi säätämällä pH arvoon 1 rikkihapolla ja hydrolysoimalla liuosta 4 h yhden ilmakehän paineessa 100 °C:ssa. Jälkihydrolysaatin koos- 10 tumus oli seuraava: oligosakkarideja 1,3 % k.a.

monosakkarideja 45,2 % - ksyloosi 67,3 % monosak- - arabinoosi 11,4 % kari- - glukoosi 16,0 % deista 15 - galaktoosi 3,3 % - mannoosi 1,5 % - ramnoosi 0,5 % muita 3,3 % k.a.

(mm. furfuraalia) 20 Jälkihydrolysaatin fermentointi, etanolin talteenotto ja ksylitolin kiteytys tapahtui edellisissä esimerkeissä kuvatulla tavalla.

... 25 Esimerkki 5

Etanolin ja ksylitolin valmistus kaurankuorista ; ; Lähtöaineena käytettiin kaurankuorimassaa, jonka hiilihydraattikoosumus oli seuraava: ksylaani 26,5 % k.a.

30 glukaani 30,7 % arabinaani 3,0 % galaktaani 1,3 % mannaani 0,2 % i6 86 4 40

Kaurankuorimassa hydrolysoitiin paineessa 350 psi 235° C:ssa ja viiveaika oli 2,0 min. Hydrolysoitu materiaali sisälsi 39,1 % kuiva-ainetta ja liuenneiden kiinteiden aineiden pitoisuus oli 36,4 % kuiva-aineesta. Suo-5 dos sisälsi kuiva-aineesta laskettuna monosakkarideja 12,0 %, etikkahappoa 12,9 % ja furfuraalia 0,5 %. Suodokselle suoritettiin jälkihydrolyysi säätämällä pH arvoon 1 rikkihapolla ja hydrolysoimalla liuosta 4 h yhden ilmakehän paineessa 100 °C:ssa. Jälkihydrolysaatin koostumus oli 10 seuraava: oligosakkarideja 1,3 % k.a.

monosakkarideja 63,1 % - ksyloosi 69,0 % monosak- - arabinoosi 6,9 % kari- 15 - glukoosi 19,1 % deista - galaktoosi 3,1 % - mannoosi 0,8 % - ramnoosi 1,1 % muita 2,8 % k.a.

20 (mm. furfuraalia) Jälkihydrolysaatin fermentointi, etanolin talteenotto ja ksylitolin kiteytys tapahtui edellisissä esimerkeissä kuvatulla tavalla.

25 .···. Esimerkki 6 ,·. · Koivulastujen höyryräjäytys ja uutto I Koivulastuille suoritettiin höyryräjäytyskäsittely

tehdasmittakaavaisella laitteistolla lämpötilassa 215 °C

;·; 30 viiveajalla 4,5 min. Käytetyn laitteiston valmistaja on

Technip, laitetyyppi Stakell system.

Höyryräjäytystuote lietettiin kuumaan prosessiveteen sekoitussäiliössä n. 3,5 % kuitususpensioksi. Sieltä ‘•J liete ohjattiin ylijuoksun kautta tasaiseksi kerrokseksi • * : 35 vastavirtaperiaatteella toimivalle 5-vaiheiselle nauhasuo-timelle (tyyppi A 40-B25; valmistaja Filters Philippe; i7 86440 kangasviiran leveys oli 2,7 m, viira oli laitteen valmistajan toimittama). Viiralla kiinteää massaa uutettiin edelleen kuumalla vedellä.

Saadussa vesiliuoksessa oli: 5 kuiva-ainepitoisuus 8,7 paino-% ksyloosimonomeerej a 1,1% luonnonpainosta ksyloosioligomeereja 3,7 % " glukoosia 0,04 % ” 10 Esimerkki 7 Höyryräjäytetyn vesipestyn koivulastumassan entsy- maattinen hajottaminen

Hydrolyysin raaka-aineena käytetyn höyryräjäytetyn (215 °C/4,5 min) koivulastumassan (valmistettu esimerkin 6 15 mukaisesti) koostumus oli seuraava: kuiva-ainetta 32 % selluloosaa 60 % k.a.:sta ksylaania 3,6 % " ligniiniä 25 % " 20 (asetoniin uuttuva)

Klason ligniini 12,3 % "

Edellä kuvattua massaa punnittiin 90 kg sekoitta-• jalla ja lämmitysvaipalla varustettuun reaktiosäiliöön, - 25 jossa oli 370 litraa vettä. Seos lämmitettiin 50 °C:een, : pH säädettiin arvoon 4,8 - 5,0, minkä jälkeen lisättiin .··. entsyymiliuokset (1,24 1 Multifect L 250, 0,11 1 Novozyme 188 ja 0,09 1 Multifect K). Lisäysmäärät vastaavat aktii-visuusyksikköinä sellulaasia 6 FPU/g, S-glukosidaasia 5 30 IU/g ja hemisellulaasia (ksylanaasia 18 U/G k.a., 8-ksylo-sidaasia 9 nkat/g k.a., esteraasia 2 nkat/g k.a.) 0,02 ml kasvuliuosta/g massan kuiva-ainetta. Reaktion annettiin jatkua edellä kuvatuissa olosuhteissa 18 tunnin ajan. Tällöin lisättiin massaa ja entsyymejä samat määrät kuin 35 aloitusvaiheessa. Vastaava massan ja entsyymin lisäys ie 8 6 440 toistettiin 21 tunnin kuluttua aloituksesta. Tämän jälkeen hydrolyysireaktion annettiin jatkua niin että kokonaisaika oli 40 tuntia. Entsyymien toiminta pysäytettiin tällöin lämmittämällä massaseos 80 °C:een 10 - 20 minuutin ajaksi.

5 Samalla myös jäljelle jäänyt kiintoaines kiinteytyy ja on helpommin erotettavissa. Kiintoaine ja liuos erotettiin toisistaan sentrifugoimalla (Pennvalt Sharpies P 600 -malli). Liuos kirkastettiin vielä erottamalla jäljelle jäänyt hieno sakka separaattorilla (Westfalia malli NA7-06-076).

10 Liuos konsentroitiin 33 %:iin fermentointia varten haihduttamalla Luwa -haihduttejalla vakuumissa 40 - 50 °C:een lämpötilassa.

Höyryräjäytetyn vesipestyn koivulastumassan hydro- lyysisaannot entsyymikäsittelyssä: 15 % liuoksessa saanto konversio % k.a:sta % glukoosi 3,3 24,5 40,8 ksyloosi 0,4 2,6 72,0 oligosakkaridit 0,7 20 Kirkastetun ja haihdutetun entsyymihydrolysaattiliuoksen koostumus: glukoosia 22,7 % luonnonpainosta ksyloosia 2,7 % " oligosakkaridit 4,7 % " 25

Esimerkki 8 Höyryräj äytetyn vesipestyn koivulastumassan entsy- maattisen hydrolysaatin fermentointi etanoliksi

Hydrolysoitu selluloosa fermentoitiin hiivalla 30 Candida tropicalis ATCC 9968. Fermenttorina käytettiin New Brunswick Scientific IF-250 -fermenttoria.

Fermentointiliuoksessa oli: 45 1 hydrolysaattia 1,5 kg Gistex-hiivauutetta 35 40 1 vettä i9 864 40

Siirrostusviljelmät kasvatettiin kahdessa vaiheessa, ensin 2 1 erlenmeyerpuliossa Orbital Shaker -ravis-telijassa 30 °C:ssa 2 vrk, sitten New Brunswick Scientific SF-116 -laboratoriofermenttorissa, jonka käyttötila-5 vuus oli 11 1. Fermenttoria ilmastettiin 5,5 Nl/min (0,5 vvm) ja sekoitettiin nopeudella 500 rpm. Kasvatus kesti 1 vrk.

Varsinainen fermentointi tehtiin pilot -mittakaavassa käyttötilavuuden ollessa 100 1. Fermenttoria 10 ilmastettiin 25 Nl/min (0,25 vvm) ja sekoitettiin nopeu della 100 rpm. Lämpötila säädettiin 30 °C:een ja vaah-toamista kontrolloitiin Pluriol -vaahdonestoaineella.

Fermentoinnin tulokset on esitetty taulukossa 4.

15 Taulukko 4 aika (h) solumassa (g/1)_glukoosi (g/1)_etanoli (g/1) 0 1,8 105,0 1,9 19,5 11,3 0 51,2 20 52 - 0 48,1 66 0 45,0

Hiiva kulutti 29,5 h aikana kaiken alustassa olevan : glukoosin tehden siitä etanolia 48 % saannolla.

25 Fermentoinnin jälkeen hiivasolut erotettiin liuok- sesta sentrifugoimalla (Westfalia NA7-06-076). Kirkastet tu liuos tislattiin etanolin talteenottoa varten.

Esimerkki 9 . . 30 Etanolin talteenotto höyryräjäytetyn, vesipestyn koivulastumassan entsymaattisen hydrolysaatin fer- mentointituotteesta

Tislattavana oli 100 litraa fermentoitua selluloo-sahydrolysaattia. Fermentointi oli tehty esimerkissä 8 . 35 kuvatulla tavalla ja kirkastettu sentrifugoimalla Westfa- 20 86440 lia NA7-06-076 -separaattorilla. Liuoksen etanolipitoi-suus oli 3,4 %.

Tislauslaitteisto oli koottu Corning Process Systemsin vakiorakenneosista, jotka olivat borosilikaatti-5 lasia. Kolonnin halkaisija oli 10 cm. Laitteistossa oli 15 erotusvaihetta: kiehutin, 13 kellopohjaa ja syöttöpoh-ja 4. ja 5. kellopohjan välissä ylhäältä lukien. Tislaus tehtiin paineessa 100 mbar, syöttönopeudella 10 1/h ja palautussuhteella 3:1. Talteen saatiin 8,5 kg tislettä, 10 jonka etanolipitoisuus oli 36,0 %. Pöhjatuotteen etanoli-pitoisuus oli 0,1 %.

Claims

21 86440

1. Menetelmä ksylitolin ja etanolin valmistamiseksi samanaikaisesti hydrolysoidusta lignoselluloosapitoisesta 5 materiaalista, tunnettu siitä, että lähtöaine fermentoidaan hiivakannan avulla, joka pystyy muuttamaan vapaan kysloosin ksylitoliksi ja läsnäolevat vapaat hek-soosit etanoliksi, muodostunut etanoli otetaan talteen, jäljelle jääneelle ksylitoliliuokselle suoritetaan kroma-10 tografinen erotus ja puhdas ksylitoli kiteytetään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun ne ttu siitä, että lähtöaineelle suoritettu hydrolyysi on laimea esihydrolyysi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että esihydrolyysistä saatu jään nös täysihydrolysoidaan ja fermentoidaan heksoosien muuttamiseksi etanoliksi, jonka jälkeen etanoli otetaan talteen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään ksy- laania sisältävää lignoselluloosaa, kuten koivua tai viljankuorta.

···’ 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään sul-25 fiittijätelientä.

' 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, :: tunnettu siitä, että hiivakanta kuuluu Candida- tai Debaryomyces -sukuun.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen menetelmä, .-..-30 tunnettu siitä, että hiiva on Candida tropicalis -laji, ja on edullisesti Candida tropicalis ATCC 9968.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva on Debaryomyces han-senii -laji. 22 8 6 44 O

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli otetaan talteen tislaamalla.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että hydrolyysi suoritetaan höy- ryräjäytyksellä ja entsymaattisella loppuhydrolyysillä.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografinen erotus tehdään käyttäen stationäärisenä faasina vahvaa kationin- 10 vaihtohartsia.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan pH-arvossa noin 4-7, edullisesti noin 5,7 ja lämpötilassa noin 10 - 45 °C, edullisesti noin 25 - 35 °C.

13. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jäännöksen loppuhydrolyysi tehdään entsymaattisesti. 23 86440