DE60210586T2

DE60210586T2 - Verfahren zur extraktion von beta-amylase

Info

Publication number: DE60210586T2
Application number: DE60210586T
Authority: DE
Inventors: Pekka Kekki
Original assignee: Danisco Sugar Finland Oy
Current assignee: Nordic Sugar Oy
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: RU2290440C2; PT1363999E; EE200300354A; US7399622B2; EP1363999B1; EP1363999A1; AU783947B2; DK1363999T3; PL363346A1; FI109358B; CZ303447B6; CZ20032036A3; CA2370336C; EE05410B1; JP2004520830A; WO2002062980A8; WO2002062980A1; CA2370336A1; AR035221A1; UA75632C2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Enzymtechnologie. Genauer ausgedrückt, die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase aus Getreide und die Verwendung eines Enzyms bei dieser Extraktion.
Hintergrund der Erfindung
β-Amylase ist ein Stärke-abbauendes Enzym, das alpha-1,4-Bindungen hydrolysiert. Es wird zum Beispiel in Bakterien und Pflanzen gefunden und zerlegt Stärke hauptsächlich in Maltose am nicht-reduzierenden Ende der Stärkekette. β-Amylase kommt zum Beispiel in Körnern, reichlich vor, wo es den Nährstoffspeicher des Getreides, das heißt Stärke, in Zucker, wenn erforderlich, umwandelt. In Getreiden wird Stärke hauptsächlich in Form von Amylose und Amylopectin gespeichert. β-Amylase wandelt die gesamte Amylose in Maltose um, wohingegen etwa 60% des Amylopectins in Maltose und der Rest in Dextrin umgewandelt werden.
β-Amylase ist ein kommerziell bedeutendes Enzym, das z.B. in der Stärkeindustrie zur Herstellung von Maltose eingesetzt wird. Produkte, die große Mengen an Maltose enthalten, werden zum Beispiel in der Konfekt- und Nahrungsmittelindustrie verwendet. β-Amylase wird sowohl aus Bakterien als auch aus Pflanzen isoliert. Es wird zum Beispiel aus Bacillus-Bakterien ( US 4 970 158 und JP 60 126 080 ) und aus thermostabilen Clostridium-Bakterien ( US 4 647 538 ) erhalten. Zusätzlich zu Maltose produzieren β-Amylasen, die aus Bakterien stammen, beträchtliche Mengen an Maltotriose, wohingegen β-Amylasen aus Pflanzen vergleichsweise mehr Maltose produzieren, und daher sind sie für Verfahren, bei denen der Zweck ist, möglichst süße und/oder fermentierbare Produkte zu erhalten, geeigneter. Außerdem ist eine Produktion von β-Amylase aus Bakterien in großem Maßstab schwierig. Die in der Industrie verwendete β-Amylase stammt von Pflanzen, wobei üblicherweise Getreide, insbesondere Gerste oder Weizen aber auch Sojabohnen als die Enzymquelle verwendet werden.
Während des Wachstums wird β-Amylase in den Körnern gebildet, wo sie gespeichert wird. Ein Korn besteht aus einem Keim und einem stärkehaltigen Endosperm, d.h. einem Kern, die durch ein Scuellum voneinander getrennt sind. Das Endosperm wird von einer Aleuron-Schicht umgeben und das gesamte Korn wird von einer Pericarp-Schicht, einer Testa-Schicht und der tatsächlichen Schale umgeben. Weizen hat keine geeignete Schale, aber das Pericarp und die Testa bilden eine harte äußere Schale. β-Amylase akkumuliert hauptsächlich im Endosperm und Scutellum. Die größten Mengen an β-Amylase werden in den äußersten Teilen des Endosperms unmittelbar unter der Aleuron-Schicht gefunden.
β-Amylase von Gerste wurde gründlich untersucht. Diese β-Amylase und ihre Produktion werden z.B. in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: D. E. Briggs, Barley, Chapman & Hall, London, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, London, 1962; J. R. A. Pollock, Brewing Science, Academic Press, London, 1979. Der systematische Name des Enzyms ist 1,4-alpha-D-Glucanmaltohydrolase (EC 3.2.1.2). In der Vergangenheit wurde die β-Amylase von Getreide abgetrennt, indem das Korn zuerst geschrotet oder gemahlen wurde und dann die β-Amylase mit Wasser oder einem Puffer extrahiert wurde. Eine Reinigung von Enzym aus einem Extrakt dieser Art ist natürlich schwierig und mühsam, da der Extrakt zusätzlich zu dem betreffenden Enzym mehrere andere lösliche Komponenten des Korns enthält. Es wurden Anstrengungen unternommen, um eine Trennung von β-Amylase aus einer dieser enthaltenden Lösung zu verbessern, zum Beispiel durch Absorbieren des Enzyms mit Polymer in Gegenwart von Ammoniumsulfat ( US 5 294 341 ). Eine Freisetzung ein β-Amylase aus Gluten wurde mit Protease experimentell durchgeführt ( JP 63 079 590 ).
β-Amylase wurde auch aus der Abfallflüssigkeit der Weizenstärkeproduktion isoliert, indem Natriumalginat zugesetzt wurde und das koagulierte Enzym ( JP 60 027 383 ) isoliert wurde oder indem ein Calciumphosphatgel gebildet wurde, an dem das Enzym adsorbiert und von dem es dann isoliert wird ( JP 63 248 389 ). Abfallflüssigkeit aus der Stärkeproduktion ist keine gute Quelle für β-Amylase, da sie sehr verdünnt ist und große Mengen an anderen Komponente enthält, die eine Reinigung und Konzentrierung schwierig machen, und als Resultat ist die Ausbeute niedrig.
Um einen reineren Rohextrakt zu erhalten und um eine schwierige "Down-Stream"-Bearbeitung zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, daß β-Amylase aus ganzen Körnern oder teilweise geschälten Körner extrahiert wird. wenn zum Beispiel Gerstekörner derart geschält werden, daß ihr Endosperm nicht bricht, fungieren die äußersten Schichten des Endosperm als eine Art Filter, der einen Zutritt von unlöslichen Substanzen zu dem Einweichwasser verhindert und den Zugang von löslichen Substanzen beschränkt. Es ist bevorzugt, eine Extraktion in Gegenwart einer reduzierenden Substanz durchzuführen, welche β-Amylase aus anderen Proteinen des Korns freisetzt ( FI 61 516 und US 4 675 296 ).
US 4 675 269 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines kommerziellen β-Amylase-Produkts aus ganzen oder wenigstens teilweise wiedergeschälten Gerstekörnern durch Extrahieren der Körner mit Wasser. US 3 492 203 bezieht sich auf die Extraktion von β-Amylase aus Weizenkleie mit Wasser. Kein Dokument legt die Verwendung eines β-Amylase-freisetzenden Enzyms nahe.
Ein Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase aus Getreide, das die Getreideextraktionszeit verringert und die Ausbeute an Enzym verbessert, wurde nun erfunden. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und ist besonders zur Verarbeitung von geschältem Getreide geeignet, das auch eine weitere Reinigung des Enzyms erleichtert.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Getreide in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Cellulase unter Erhalt eines Extraktes, der β-Amylase enthält, extrahiert wird. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von Cellulase bei der Extraktion von β-Amylase aus Getreide.
Cellulase wird z.B. bei der Herstellung von Stärke aus gemahlenem Getreide unter Reduzierung der Aufschlämmungsviskosität und unter Abtrennung von Stärke von Protein verwendet. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Zusatz von Cellulase zu dem Extraktionswasser von β-Amylase die Ausbeute an β-Amylase verbessert und eine Verringerung der Extraktionszeit zuläßt. Die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Einfluß der Temperatur auf die Ausbeute an β-Amylase als eine Funktion der Zeit.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren der Erfindung ist auf die Extraktion von verschiedenen β-Amylase-enthaltenden Getreiden anwendbar, z.B. auf die Verarbeitung von Weizen, Gerste, Roggen und Soja. Es wird vorzugsweise zum Extrahieren von β-Amylase von Weizen und Roggen und insbesondere der von Gerste verwendet. Ungekeimte Körner enthalten keine signifikanten Mengen an anderen Enzymen als β-Amylase; aus diesem Grund lohnt es sich, β-Amylase aus solchen Körnern zu extrahieren. Das Enzym kann aus ungeschälten Körnern extrahiert werden, wird aber vorzugsweise aus geschälten, gemahlenen, geschroteten oder polierten Körnern extrahiert. Es ist ratsam, Roggen und Gerste zu schälen. Die besten Resultate werden durch Extrahieren von geschälten Gerstekörnern erzielt.
Um den Eintritt von Stärke aus dem Kornendosperm in den Extrakt zu verhindern, muß ein Schälen so durchgeführt werden, daß das tatsächliche lebende Korn nicht gebrochen wird. Allerdings muß die tatsächliche Schale möglichst sorgfältig entfernt werden. Der Grund dafür ist, daß die Schale so dicht ist, daß sie die Penetration von β-Amylase behindert. Geschälte Gerste bedeutet somit Gerste, von der die tatsächliche Schale des Kerns entfernt wurde, das Endosperm aber intakt geblieben ist. In der Praxis bedeutet dies, daß höchstens etwa 20% des Gewichts eines ungeschälten Korns durch Schälen entfernt wird. Üblicherweise wird 10 bis 20% als Schalenmaterial entfernt. In diesem Fall fungieren die äußersten Schichten (Pericarp-, Testa- und Aleuronschicht) des Endosperms als eine Art Ultrafilter, der den Zutritt von unlöslichen Substanzen und im wesentlichen auch den von löslichen Substanzen in das Extraktionswasser verhindert. Der aus Körnern, die auf diese Weise bearbeitet wurden, erhaltene Extrakt ist relativ rein, was eine weitere Bearbeitung, zum Beispiel Reinigung und Konzentrierung des Enzyms, erleichtert. Zur weiteren Bearbeitung können Verfahren, die in der Enzymindustrie allgemein bekannt sind, zum Beispiel Durchfiltration und Ultrafiltration, angewendet werden.
Getreide wird in einem wäßrigen Medium, zum Beispiel Wasser, oder möglicherweise in einer Pufferlösung, extrahiert. Während einer Extraktion ist der pH üblicherweise zwischen 6,0 und 6,5. Die Extraktion wird vorzugsweise unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Es wird so viel reduzierende Aktivität verwendet, daß die β-Amylase, die an das Strukturprotein des Korns gebunden ist, freigesetzt wird. Die reduzierenden Bedingungen werden in an sich bekannter Weise eingestellt, in der Praxis oft mit SO₂, z.B. durch Zugeben von Natriummetabisulfit und/oder Natriumsulfit. Das Verhältnis von geschälten Körnern zu dem wäßrigen Medium liegt vorzugsweise zwischen 5:8 und 2:3 (Gewicht/Volumen). Das Verfahren der Erfindung ist für Prozesse im industriellen Maßstab geeignet, wo eine Extraktion in einem Stahlsilo durchgeführt wird, in das z.B. 19 Tonnen geschälte Gerste und 29 m³ Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit enthält, gegeben werden.
Durch Extrahieren von Gerste in der oben beschriebenen Weise kann eine Extraktionsausbeute, die etwa 45 bis 50% des gesamten β-Amylase-Gehalts von Gerste enthält, ohne Abtrennen des Wassers, das im Inneren des Korns zurückbleibt, erhalten werden. In diesem Fall ist die Extraktionszeit etwa 72 h. Wenn Cellulase dem Extraktionswasser zugesetzt wird, kann 65% der Gesamtmenge an β-Amylase im Getreide extrahiert werden, während die Extraktionszeit auf etwa 60 h verringert wird.
Cellulose ist ein lineares Glucosepolysaccharid, dessen Glucose-Einheiten durch β-1,4-Glucosidbindungen verknüpft sind. Sie wird in Zellwänden von Pflanzen gefunden, wo sie oft zusammen mit Lignin und Hemicellulose vorliegt. Enzyme, die an Zersetzungsreaktionen von Cellulose beteiligt sind, werden als Cellulasen angesehen. Cellulasen werden industriell, z.B. in der Stärkeproduktion, in der Papiermasseverarbeitung, der Textilbearbeitung, dem Abbau von β-Glucan in Brauereien und bei der Verbesserung der Mehlqualität in Bäckereien, verwendet. In dem erfindungsgemäßen Verfahren baut Cellulase die Oberflächenstrukturen unter einer Schale eines lebenden Korns ab.
Im Handel verfügbare Celluloseprodukte stammen entweder aus Bakterien, zum Beispiel der Gattung Bacillus, oder aus Pilzen, zum Beispiel Hefen (z.B. Saccharomyces) oder Schimmel. Große Mengen an Cellulasen werden insbesondere aus Schimmelpilzen isoliert. Die am gängigsten verwendeten Cellulase produzierenden Schimmel gehören zu den Gattungen Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium und Trichoderma. Einige der Produktionsstämme wurden genetisch modifiziert. Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise Cellulase, die aus einem Schimmelpilz, insbesondere aus Trichoderma-Schimmel, stammt.
Kommerzielle Enzympräparate enthalten unterschiedliche Enzymaktivitäten und ihre Mengen und Verhältnisse können von einem Hersteller zum anderen leicht variieren. Für die Erfindung ist es essentiell, daß das Produkt wenigstens Cellulase-, Hemicellulase- und β-Glucanaseaktivität enthält. Mit anderen Worten, in diesem Kontext bezieht sich Cellulase auf ein Enzympräparat, das wenigstens Cellulose, Hemicellulose und β-Glucan abbaut. Alle kommerziellen Cellulase-Produkte, die vom Anmelder getestet wurden (produziert von Genencor International, Röhm Enzymer GmbH and Novo Nordisk) verbesserten die Ausbeute an β-Amylase. Cellulase-, Hemicellulase- und β-Glucanase-Aktivitäten werden z.B. in Novo's Handbook of Practical Biotechnology, 1986, beschrieben.
Cellulasen können z.B. in Endocellulasen, Exocellulasen, Exocellobiohydrolasen und Cellobiasen eingeteilt werden. Endocellulasen, d.h. 1,4-β-D-Glucanglucanohydrolasen, spalten statistisch die β-1,4-Bindungen von Cellulose im Inneren des Moleküls und bilden Oligosaccharide. Exocellulasen, d.h. 1,4-β-D-Glucanglucohydrolasen, spalten β-1,4-Bindungen am Ende des Moleküls, wobei sie Glucose freisetzen. Ihre Wirkung auf die Cellobiose ist langsam. Exocellobiohydrolasen, d.h. 1,4-β-D-Glucancellobiohydrolasen, spalten die oben genannten Bindungen am nichtreduzierenden Ende des Moleküls, wobei sie Cellulose bilden, und Cellobiasen, d.h. β-D-Glucosid-glucohydrolasen, spalten Cellobiose in Glucose. Eine Hydrolyse von Cellulose in Glucose erfordert Endoglucanase (1,4-β-D-Glucanglucanohydrolase, EC 3.2.1.4), welche das Innere des Moleküls und auch substituierte Substrate spaltet, aber kristallisierte Cellulose nicht abbaut; Cellobiohydrolase (1,4-β-D-Glucan-cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), die kristallisierte Cellulose spaltet, und β-Glucosidase (β-D-Glucosidglucohydrolase, EC 3.2.1.21), die eine Cellobiase ist, die Cellobiose und Cello-Oligosaccharide in Glucose spaltet.
Eine Enzym-Gruppe, die Hemicellulose spaltet, d.h. Polysaccharide, die in der Natur gefunden werden und Pentosen enthalten, z.B. Arabinane, Galactane, Mannane und Xylane, werden Hemicellulasen genannt. β-Glucanasen spalten β-D-Glucane, d.h. Glucosepolymere, die verzweigt sein können und sowohl β-1,3- als auch β-1,4-Bindungen enthalten. β-Glucan wird z.B. in Zellwänden von Endospermzellen in Körnern gefunden. Lichenase ist Endo-β-glucanase (1,3·1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase), die die β-1,4-Bindungen von β-Glucan, das β-1,3- und β-1,4-Bindungen enthält, spaltet. Laminarinase (1,3-β-D-Glucan-3-glucanohydrolase) spaltet β-Glucan, das nur β-1,3-Bindungen enthält, zum Beispiel β-1,3-Bindungen von Kohlenhydraten des Laminarin-Typs, und Exoglucanase (1,3-β-D-Glucan-glucohydrolase) spaltet β-1,3-Bindungen von β-1,3-Glucanen, wodurch hauptsächlich Glucose gebildet wird.
Bei der Extraktion von β-Amylase wurden vielversprechende Resultate z.B. mit den Cellulase-Präparaten Spezyme CE und GC 440, produziert von Genencor International, erzielt. Das letztgenannte stammt von einem genetisch modifizierten Trichoderma longibrachiatum-Stamm und baut Cellulose, Hemicellulose und β-Glucan besonders effizient ab. Seine Aktivität wird als Wirkung auf Carboxymethylcellulose (RBB-CMC) ausge drückt; in diesem Fall ist die RBB-CMC-Aktivität wenigstens 1400 IU/g. Zusätzlich zu Cellulaseaktivität hat GC 440 β-Glucanase-, β-Glucosidase-, β-Xylosidase-, Xylanase- und Acetylesterase-Aktivität. Eine typische Charge an GC 440 enthält im Durchschnitt etwa 7000 bis 9000 U/ml DNS-CMC, etwa 6000 bis 8000 U/ml β-Glucanase, etwa 80 bis 90 U/ml β-Glucosidase, etwa 500 bis 600 nkat/ml β-Xylosidase, etwa 1700 bis 2000 nkat/ml Acetylesterase, etwa 700 bis 1400 U/ml RBB-Xylanase und etwa 1900 bis 2100 U/ml DNS-Xylanase. Sehr gute Resultate wurden auch unter Verwendung von Cellulase, die von Röhm Enzyme GmbH produziert wird und die unter dem Markennamen Rohalase^® Sep. verkauft wird, erzielt. Das Präparat stammt von einem Trichoderma reesei-Stamm und hält beachtliche Mengen an β-1,4-Endoglucanase-Aktivität (mindestens 4700 CU/g) und Xylanase (mindestens 3000 XylH/g) und geringere Mengen an Celobiohydrolase-Aktivität. Es enthält auch β-1,3-Glucanase-Aktivität, d.h. Laminarinase. Wenn die oben genannten Enzympräparate verwendet werden, beträgt eine geeignete Menge an Cellulase wenigstens 0,015%, vorzugsweise mindestens 0,020%, z.B. 0,018 bis 0,40 und insbesondere 0,024 bis 0,030% des Gewichts an Getreide.
β-Amylase kann in Gegenwart von Cellulase bei einer Temperatur von 20 bis 45°C extrahiert werden. Die Temperatur ist vorzugsweise 25 bis 32°C, z.B. 29 bis 31°C. Die Extraktionszeit kann 30 bis 72 h, üblicherweise wenigstens 48 h, z.B. 48 bis 66 h und insbesondere 55 bis 62 h sein. Eine geeignete Extraktionszeit bei 30°C ist etwa 60 h. Nachdem die Extraktion beendet wurde, werden Körner, Schrot oder Mehl aus dem Extraktionswasser entfernt, indem zum Beispiel ein Sieb verwendet wird, und β-Amylase wird aus dem Extraktionswasser gewonnen, aus dem es nach Wunsch gereinigt und/oder konzentriert wird.
Nach Extraktion kann das extrahierte und auf diese Weise abgetrennte Getreide beispielsweise zur Herstellung von Stärke eingesetzt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird β-Amylase extrahiert und der Extrakt wird vom Getreide abgetrennt, bevor die Stärke fraktioniert und vom Getreide abgetrennt wird. Wenn das Enzym aus unzerkleinerten Körnern extrahiert wird, werden die extrahierten Körner zuerst gemahlen, wonach das Stärkeherstellungsverfahren in an sich bekannter Weise durchgeführt wird, d.h. die gemahlenen Körner werden in Wasser gemischt und das Getreide wird unter Verwendung von Sieben und Zentrifugalkraft fraktioniert. Während des Mahlens wird üblicherweise Cellulase zusammen mit β-Glucanase zugesetzt, um die Viskosität zu reduzieren und Stärke von Protein zu trennen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie auf die darin offenbarten Ausführungsformen zu beschränken.
Beispiel 1
Bestimmung von β-Amylase
Vor Bestimmung der Gesamtmenge an β-Amylase wurde die Schale entfernt, das zu analysierende Getreide wurde trocken zu feinem Mehl vermahlen und 10 g davon wurden in einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. 100 ml 0,5%ige (Gewicht/Volumen) Natriumsulfit-Lösung wurden zugesetzt und die Substanzen wurden in geeigneter Weise vermischt. Das Gemisch wurde für 24 h in dem Kolben stehengelassen, wurde aber gelegentlich geschüttelt. Danach wurde es geeigneterweise vermischt und durch ein dünnes Filterpapier (MN 640 W) filtriert. Das Filtrat wurde im Verhältnis 1:50 mit destilliertem Wasser verdünnt und die Aktivität wurde durch das unten beschriebene Verfahren bestimmt. Dieser Enzym-Assay wurde auch zum Beispiel zur Bestimmung des β-Amylase-Gehalts von Extraktionslösungen in den unten beschriebenen Beispielen verwendet.
Im Prinzip wurde β-Amylase bestimmt, wie es im Food Chemical Codex IV, General Test an Apparatus, 485, beschrieben ist.
Hier ist eine DP-Einheit (diastatische Kraft) als die Menge an Enzym in 0,1 ml einer 5% Probenverdünnung definiert, die eine Menge an reduzierenden Zuckern, die zur Reduzierung von 5 ml Fehling-Lösung ausreicht, aus 100 ml Substrat bei 20°C in 1 Stunde produziert. (Das Bestimmungsverfahren entspricht nicht der Definition von DP).
Die Enzymaktivität wurde durch Hydrolysieren von Stärke bei 20°C, pH 4,6, für 30 Minuten bestimmt. Die resultierenden reduzierenden Zucker wurde titrimetrisch mit Alkaliferricyanid bestimmt. Um ein Stärkesubstrat zu produzieren, wurden 20 g (Trockensubstanz) Stärke (Baker 1130) mit etwa 50 ml Wasser vermischt. Es wurden etwa 500 ml siedendes Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde für genau 2 Minuten gekocht. Es wurden 20 ml Acetatpuffer (0,5 M, pH 4,6) zu der abgekühlten Stärkelösung gegeben und mit destilliertem Wasser wurde auf 1 l verdünnt. 200 ml Stärkesubstrat, das auf 20°C temperiert war, wurde in einen 250 ml-Meßkolben pipetiert, 10 ml verdünnte Enzymprobe wurden zugegeben und die Substanzen wurden gut vermischt. Die Probe wurde für genau 30 Minuten in einem Wasserbad mit 20°C inkubiert und es wurden 20 ml 0,5 N NaOH zugesetzt. Die Substanzen wurden gut vermischt und auf 250 ml verdünnt. 10 ml Enzymverdünnung und 20 ml 0,5 N NaOH wurden in einen 250 ml-Meßkolben für eine 0-Probe pipetiert. Die Substanzen wurden gut vermischt und 200 ml Stärkesubstrat wurde zugesetzt und es wurde auf 250 ml verdünnt.
0,05 N Ferricyanid-Reagens wurde hergestellt, indem 16,5 Kaliumferricyanid (K₃Fe(CN)₆) und 22 g Natriumcarbonat (Na₂CO₃) in Wasser gelöst wurden und das ganze auf einen Liter verdünnt wurde. Eine A-P-Z-Lösung wurde hergestellt, indem 70 g Kaliumchlorid (KCl) und 20 g Zinksulfat (ZnSO₄ × 7H₂O) in 700 ml destilliertem Wasser gelöst wurden, 200 ml konzentrierte Essigsäure zugegeben wurde und auf 1 l verdünnt wurde. Eine Kaliumiodid-Lösung wurde hergestellt, indem 50 g Kaliumiodid (KJ) in 100 ml destilliertem Wasser gelöst wurden und 2 Tropfen 50%iges Natriumhydroxid (NaOH) zugesetzt wurde. 10 ml Ferricyanid-Reagens und 5 ml Probe diese wurden gut gemischt und in einem siedenden Wasserbad für exakt 20 Minuten erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und 25 ml A-P-Z-Reagens und 1 ml KJ-Lösung wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde mit 0,05 N Natriumsulfat-Lösung titriert, bis die blaue Farbe verschwand (Dunkelblau → weiß).
Die β-Amylase-Aktivität wurde aus der folgenden Formel errechnet:
worin:

V0: = Verbrauch durch 0-Probe bei Titration (ml)
V1: = Verbrauch durch Probe bei Titration (ml)
K: = Verdünnungsfaktor

Beispiel 2
Die Wirkung von Cellulase auf die Extraktionszeit von β-Amylase wurde untersucht. β-Amylase wurde ohne Cellulase und mit Cellulase aus Gerste extrahiert. 10 kg Gerste, die mit einer Schälmaschine geschält worden war, wurden mit 15 l Wasser, das 0,5 Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit enthielt, extrahiert. Darüber hinaus wurde GC440-Cellulase, produziert durch Genencor, zu der zweiten Charge gegeben, wobei die Cellulase-Menge 0,029% des Gewichts an geschälte Gerste entsprach. Die Extraktion wurde bei 30°C durchgeführt. Die Aktivität der in der Extraktion verwendeten Körner war 155 DP°/g, die entsprechend Beispiel 1 bestimmt wurde. Die Resultate sind in Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Tabelle 1: Extraktion ohne Cellulase
Tabelle 2: Extraktion mit Cellulase
Die Resultate zeigen, daß ein Cellulasezusatz zu dem Extraktionswasser die Extraktionszeit von β-Amylase reduziert.
Beispiel 3
Die Wirkung von Cellulase auf die Extraktionsausbeute wurde untersucht. 10 kg geschälte Gerste mit einer β-Amylase-Aktivität von 155 DP°/g wurden in 15 l Wasser, das 0,5% Natriumbisulfit und 0,5% Natriumsulfit enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
Die Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der Menge an Gerste, die verwendet wurde, war 1550 kDP°. 8175 ml Extrakt mit einer Aktivität von 95 DP/ml wurde erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 776,6 kDP° und die Extraktausbeute war 50,1%.
Es wurde eine entsprechende Extraktion in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem eine Menge von GC440 zugesetzt wurde, die 0,025% des Gewichts der geschälten Gerste entsprach. Die Extraktionszeit war 60 h. Die Gesamtaktivität der Menge an Gerste, die verwendet wurde, war 1550 kDP°. 9825 ml Extrakt mit einer Aktivität von 102°DP/ml wurde erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 1002,2 kDP° und die Extraktausbeute war 64,7%.
Die Resultate zeigen, daß ein Zusatz von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase beträchtlich erhöhte.
Beispiel 4
Es wurde der Effekt der Temperatur auf die Extraktion von β-Amylase untersucht. Geschälte Gerste wurde in der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Art in Gegenwart von Cellulase bei unterschiedlichen Temperaturen extrahiert. Die Dosierung von Cellulase GC440 entsprach 0,027% des Gewichts der geschälten Gerste und die Extraktionstemperatur war 20°C, 25°C, 30°C oder 40°C. Die Resultate sind in 1 gezeigt. Die besten Resultate wurden bei 30°C erreicht.
Beispiel 5
Der Effekt von Cellulase auf die β-Amylaseausbeute aus Weizen wurde untersucht. 10 kg geschroteter Weizen mit einer β-Amylase-Aktivität von 128 DP°/g wurde in 15 l Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
Die Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der Menge an Weizen, die verwendet wurde, war 1280 kDP°. 9175 ml Extrakt mit einer Aktivität von 55°DP/ml wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb getrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 504,6 kDP° und die Extraktausbeute war 39,4%.
Eine entsprechende Extraktion wurde in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem eine Menge an GC440-Cellulase, die 0,036% des Gewichts des Schrots entspricht, zu dem geschroteten Weizen gegeben wurde. Die Extraktionszeit war 60 h. Die Gesamtaktivität der verwendeten Weizenmenge war 1280 kDP°. 10080 ml Extrakt mit einer Aktivität von 72°DP/ml wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 728,8 kDP° und die Extraktausbeute war 56,7%.
Die Resultate zeigen, daß Zusatz von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase beträchtlich erhöht.
Beispiel 6
Es wurde der Effekt von Cellulase auf die Ausbeute an β-Amylase aus poliertem Weizen untersucht. Weizen wurde mit einer Reispoliermaschine durch Brechen der Oberfläche und Entfernen des äußersten Teils poliert, d.h. das meiste des Pericarps wurde entfernt und die Testa leicht beschädigt. 10 kg polierten Weizen mit β-Amylase-Aktivität von 128 DP°/g wurden in 15 l Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
Die Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der verwendeten Weizenmenge war 1280 kDP°. 9780 ml Extrakt mit einer Aktivität von 15°DP/ml wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 146,7 kDP° und die Extraktausbeute war 11,5%.
Eine entsprechende Extraktion wurde in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem eine Menge an GC440-Cellulase, die 0,036 Gew.% des polierten Weizens entsprach, zu dem geschroteten Weizen gegeben wurde. Die Extraktionszeit war 60 h. Die Gesamtaktivität der verwendeten Weizenmenge war 1280 kDP°. 9250 ml Extrakt mit einer Aktivität von 35°DP/ml wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen Extrakts war demnach 323,8 kDP° und die Extraktausbeute war 25,3%.
Die Resultate zeigen, daß Zusatz von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase beträchtlich erhöht.

Claims

Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase aus Getreide, dadurch gekennzeichnet, daß Getreide in einem wäßrigen Medium in Gegenwart eines Enzympräparats, das Cellulase-, Hemicellulase- und β-Glucanase-Aktivität umfaßt, unter Erhalt eines Extraktes, der β-Amylase enthält, extrahiert wird, worauf eine Gewinnung der β-Amylase aus dem Medium folgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß β-Amylase aus Gerste, Weizen oder Roggen extrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß β-Amylase aus geschälter Gerste extrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß β-Amylase aus Getreidekörnern extrahiert wird, die durch ein Verfahren, ausgewählt aus Schälen, Mahlen, Schroten und Polieren, behandelt wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Extraktion unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die reduzierenden Bedingungen so angepaßt sind, daß sie eine reduzierende Aktivität bereitstellen, die fähig ist, die β-Amylase, die an ein Strukturprotein des Korns gebunden ist, freizusetzen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die reduzierenden Bedingungen durch Wasser, das SO₂ enthält, bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß geschälte Gerste mit Wasser, das SO₂ enthält, in einem Verhältnis von 5:8 bis 2:3, geschälte Gerste:Wasser, das SO₂ enthält, extrahiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Extraktion bei einer Temperatur von 25 bis 33°C, vorzugsweise 29 bis 31°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktionszeit 48 bis 66 h, vorzugsweise 55 bis 62 h ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cellulase Cellulase von Schimmel umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cellulase vom Trichoderma-Schimmel verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß Cellulase Cellulase von Gattungen, ausgewählt aus Humicola, Fusarium, Myceliphthora, Aspergillus, Penicillium und Trichoderma, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß β-Amylase aus gemahlenen Körnern extrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene β-Amylase durch Reinigung und/oder Konzentrierung behandelt wird.
Verwendung eines Enzympräparats, das Cellulase-, Hemicellulase- und β-Glucanase-Aktivität umfaßt, bei einer Extraktion von β-Amylase aus Getreide.