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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Enzymtechnologie. Genauer ausgedrückt, die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase
aus Getreide und die Verwendung eines Enzyms bei dieser Extraktion.
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Hintergrund der Erfindung
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β-Amylase
ist ein Stärke-abbauendes
Enzym, das alpha-1,4-Bindungen
hydrolysiert. Es wird zum Beispiel in Bakterien und Pflanzen gefunden
und zerlegt Stärke
hauptsächlich
in Maltose am nicht-reduzierenden Ende der Stärkekette. β-Amylase kommt zum Beispiel
in Körnern,
reichlich vor, wo es den Nährstoffspeicher des
Getreides, das heißt
Stärke,
in Zucker, wenn erforderlich, umwandelt. In Getreiden wird Stärke hauptsächlich in
Form von Amylose und Amylopectin gespeichert. β-Amylase wandelt die gesamte
Amylose in Maltose um, wohingegen etwa 60% des Amylopectins in Maltose
und der Rest in Dextrin umgewandelt werden.
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β-Amylase
ist ein kommerziell bedeutendes Enzym, das z.B. in der Stärkeindustrie
zur Herstellung von Maltose eingesetzt wird. Produkte, die große Mengen
an Maltose enthalten, werden zum Beispiel in der Konfekt- und Nahrungsmittelindustrie
verwendet. β-Amylase
wird sowohl aus Bakterien als auch aus Pflanzen isoliert. Es wird
zum Beispiel aus Bacillus-Bakterien (
US
4 970 158 und
JP 60
126 080 ) und aus thermostabilen Clostridium-Bakterien (
US 4 647 538 ) erhalten.
Zusätzlich
zu Maltose produzieren β-Amylasen, die aus
Bakterien stammen, beträchtliche
Mengen an Maltotriose, wohingegen β-Amylasen aus Pflanzen vergleichsweise mehr
Maltose produzieren, und daher sind sie für Verfahren, bei denen der
Zweck ist, möglichst
süße und/oder fermentierbare
Produkte zu erhalten, geeigneter. Außerdem ist eine Produktion
von β-Amylase
aus Bakterien in großem
Maßstab
schwierig. Die in der Industrie verwendete β-Amylase stammt von Pflanzen,
wobei üblicherweise
Getreide, insbesondere Gerste oder Weizen aber auch Sojabohnen als
die Enzymquelle verwendet werden.
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Während des
Wachstums wird β-Amylase
in den Körnern
gebildet, wo sie gespeichert wird. Ein Korn besteht aus einem Keim
und einem stärkehaltigen
Endosperm, d.h. einem Kern, die durch ein Scuellum voneinander getrennt
sind. Das Endosperm wird von einer Aleuron-Schicht umgeben und das
gesamte Korn wird von einer Pericarp-Schicht, einer Testa-Schicht
und der tatsächlichen
Schale umgeben. Weizen hat keine geeignete Schale, aber das Pericarp
und die Testa bilden eine harte äußere Schale. β-Amylase
akkumuliert hauptsächlich
im Endosperm und Scutellum. Die größten Mengen an β-Amylase
werden in den äußersten
Teilen des Endosperms unmittelbar unter der Aleuron-Schicht gefunden.
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β-Amylase
von Gerste wurde gründlich
untersucht. Diese β-Amylase und ihre
Produktion werden z.B. in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
D. E. Briggs, Barley, Chapman & Hall,
London, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, London, 1962;
J. R. A. Pollock, Brewing Science, Academic Press, London, 1979.
Der systematische Name des Enzyms ist 1,4-alpha-D-Glucanmaltohydrolase
(EC 3.2.1.2). In der Vergangenheit wurde die β-Amylase von Getreide abgetrennt,
indem das Korn zuerst geschrotet oder gemahlen wurde und dann die β-Amylase
mit Wasser oder einem Puffer extrahiert wurde. Eine Reinigung von
Enzym aus einem Extrakt dieser Art ist natürlich schwierig und mühsam, da
der Extrakt zusätzlich
zu dem betreffenden Enzym mehrere andere lösliche Komponenten des Korns
enthält.
Es wurden Anstrengungen unternommen, um eine Trennung von β-Amylase
aus einer dieser enthaltenden Lösung
zu verbessern, zum Beispiel durch Absorbieren des Enzyms mit Polymer
in Gegenwart von Ammoniumsulfat (
US
5 294 341 ). Eine Freisetzung ein β-Amylase aus Gluten wurde mit
Protease experimentell durchgeführt
(
JP 63 079 590 ).
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β-Amylase
wurde auch aus der Abfallflüssigkeit
der Weizenstärkeproduktion
isoliert, indem Natriumalginat zugesetzt wurde und das koagulierte
Enzym (
JP 60 027 383 )
isoliert wurde oder indem ein Calciumphosphatgel gebildet wurde,
an dem das Enzym adsorbiert und von dem es dann isoliert wird (
JP 63 248 389 ). Abfallflüssigkeit
aus der Stärkeproduktion
ist keine gute Quelle für β-Amylase,
da sie sehr verdünnt
ist und große
Mengen an anderen Komponente enthält, die eine Reinigung und
Konzentrierung schwierig machen, und als Resultat ist die Ausbeute
niedrig.
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Um
einen reineren Rohextrakt zu erhalten und um eine schwierige "Down-Stream"-Bearbeitung zu vermeiden,
wurde vorgeschlagen, daß β-Amylase
aus ganzen Körnern
oder teilweise geschälten
Körner
extrahiert wird. wenn zum Beispiel Gerstekörner derart geschält werden,
daß ihr Endosperm
nicht bricht, fungieren die äußersten
Schichten des Endosperm als eine Art Filter, der einen Zutritt von
unlöslichen
Substanzen zu dem Einweichwasser verhindert und den Zugang von löslichen
Substanzen beschränkt.
Es ist bevorzugt, eine Extraktion in Gegenwart einer reduzierenden
Substanz durchzuführen,
welche β-Amylase
aus anderen Proteinen des Korns freisetzt (
FI 61 516 und
US 4 675 296 ).
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US 4 675 269 bezieht sich
auf ein Verfahren zur Herstellung eines kommerziellen β-Amylase-Produkts aus
ganzen oder wenigstens teilweise wiedergeschälten Gerstekörnern durch
Extrahieren der Körner
mit Wasser.
US 3 492 203 bezieht
sich auf die Extraktion von β-Amylase
aus Weizenkleie mit Wasser. Kein Dokument legt die Verwendung eines β-Amylase-freisetzenden
Enzyms nahe.
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Ein
Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase
aus Getreide, das die Getreideextraktionszeit verringert und die
Ausbeute an Enzym verbessert, wurde nun erfunden. Das Verfahren
ist einfach durchzuführen
und ist besonders zur Verarbeitung von geschältem Getreide geeignet, das
auch eine weitere Reinigung des Enzyms erleichtert.
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Kurze Beschreibung der
Erfindung
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Das
Verfahren zum Extrahieren von β-Amylase
gemäß der Erfindung
ist dadurch gekennzeichnet, daß Getreide
in einem wäßrigen Medium
in Gegenwart von Cellulase unter Erhalt eines Extraktes, der β-Amylase enthält, extrahiert
wird. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von
Cellulase bei der Extraktion von β-Amylase
aus Getreide.
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Cellulase
wird z.B. bei der Herstellung von Stärke aus gemahlenem Getreide
unter Reduzierung der Aufschlämmungsviskosität und unter
Abtrennung von Stärke
von Protein verwendet. Es wurde nun überraschenderweise gefunden,
daß Zusatz
von Cellulase zu dem Extraktionswasser von β-Amylase die Ausbeute an β-Amylase
verbessert und eine Verringerung der Extraktionszeit zuläßt. Die
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen offenbart.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
den Einfluß der
Temperatur auf die Ausbeute an β-Amylase
als eine Funktion der Zeit.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Das
Verfahren der Erfindung ist auf die Extraktion von verschiedenen β-Amylase-enthaltenden
Getreiden anwendbar, z.B. auf die Verarbeitung von Weizen, Gerste,
Roggen und Soja. Es wird vorzugsweise zum Extrahieren von β-Amylase
von Weizen und Roggen und insbesondere der von Gerste verwendet.
Ungekeimte Körner
enthalten keine signifikanten Mengen an anderen Enzymen als β-Amylase;
aus diesem Grund lohnt es sich, β-Amylase
aus solchen Körnern
zu extrahieren. Das Enzym kann aus ungeschälten Körnern extrahiert werden, wird
aber vorzugsweise aus geschälten,
gemahlenen, geschroteten oder polierten Körnern extrahiert. Es ist ratsam,
Roggen und Gerste zu schälen.
Die besten Resultate werden durch Extrahieren von geschälten Gerstekörnern erzielt.
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Um
den Eintritt von Stärke
aus dem Kornendosperm in den Extrakt zu verhindern, muß ein Schälen so durchgeführt werden,
daß das
tatsächliche
lebende Korn nicht gebrochen wird. Allerdings muß die tatsächliche Schale möglichst
sorgfältig
entfernt werden. Der Grund dafür
ist, daß die
Schale so dicht ist, daß sie
die Penetration von β-Amylase
behindert. Geschälte
Gerste bedeutet somit Gerste, von der die tatsächliche Schale des Kerns entfernt
wurde, das Endosperm aber intakt geblieben ist. In der Praxis bedeutet
dies, daß höchstens
etwa 20% des Gewichts eines ungeschälten Korns durch Schälen entfernt
wird. Üblicherweise
wird 10 bis 20% als Schalenmaterial entfernt. In diesem Fall fungieren
die äußersten
Schichten (Pericarp-, Testa- und Aleuronschicht) des Endosperms
als eine Art Ultrafilter, der den Zutritt von unlöslichen
Substanzen und im wesentlichen auch den von löslichen Substanzen in das Extraktionswasser
verhindert. Der aus Körnern,
die auf diese Weise bearbeitet wurden, erhaltene Extrakt ist relativ
rein, was eine weitere Bearbeitung, zum Beispiel Reinigung und Konzentrierung
des Enzyms, erleichtert. Zur weiteren Bearbeitung können Verfahren,
die in der Enzymindustrie allgemein bekannt sind, zum Beispiel Durchfiltration
und Ultrafiltration, angewendet werden.
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Getreide
wird in einem wäßrigen Medium,
zum Beispiel Wasser, oder möglicherweise
in einer Pufferlösung,
extrahiert. Während
einer Extraktion ist der pH üblicherweise
zwischen 6,0 und 6,5. Die Extraktion wird vorzugsweise unter reduzierenden
Bedingungen durchgeführt.
Es wird so viel reduzierende Aktivität verwendet, daß die β-Amylase,
die an das Strukturprotein des Korns gebunden ist, freigesetzt wird.
Die reduzierenden Bedingungen werden in an sich bekannter Weise
eingestellt, in der Praxis oft mit SO2,
z.B. durch Zugeben von Natriummetabisulfit und/oder Natriumsulfit.
Das Verhältnis
von geschälten
Körnern
zu dem wäßrigen Medium liegt
vorzugsweise zwischen 5:8 und 2:3 (Gewicht/Volumen). Das Verfahren
der Erfindung ist für
Prozesse im industriellen Maßstab
geeignet, wo eine Extraktion in einem Stahlsilo durchgeführt wird,
in das z.B. 19 Tonnen geschälte
Gerste und 29 m3 Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit
und 0,5% Natriumsulfit enthält,
gegeben werden.
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Durch
Extrahieren von Gerste in der oben beschriebenen Weise kann eine
Extraktionsausbeute, die etwa 45 bis 50% des gesamten β-Amylase-Gehalts von Gerste
enthält,
ohne Abtrennen des Wassers, das im Inneren des Korns zurückbleibt,
erhalten werden. In diesem Fall ist die Extraktionszeit etwa 72
h. Wenn Cellulase dem Extraktionswasser zugesetzt wird, kann 65%
der Gesamtmenge an β-Amylase
im Getreide extrahiert werden, während
die Extraktionszeit auf etwa 60 h verringert wird.
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Cellulose
ist ein lineares Glucosepolysaccharid, dessen Glucose-Einheiten
durch β-1,4-Glucosidbindungen
verknüpft
sind. Sie wird in Zellwänden
von Pflanzen gefunden, wo sie oft zusammen mit Lignin und Hemicellulose
vorliegt. Enzyme, die an Zersetzungsreaktionen von Cellulose beteiligt
sind, werden als Cellulasen angesehen. Cellulasen werden industriell,
z.B. in der Stärkeproduktion,
in der Papiermasseverarbeitung, der Textilbearbeitung, dem Abbau
von β-Glucan
in Brauereien und bei der Verbesserung der Mehlqualität in Bäckereien,
verwendet. In dem erfindungsgemäßen Verfahren
baut Cellulase die Oberflächenstrukturen
unter einer Schale eines lebenden Korns ab.
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Im
Handel verfügbare
Celluloseprodukte stammen entweder aus Bakterien, zum Beispiel der
Gattung Bacillus, oder aus Pilzen, zum Beispiel Hefen (z.B. Saccharomyces)
oder Schimmel. Große
Mengen an Cellulasen werden insbesondere aus Schimmelpilzen isoliert.
Die am gängigsten
verwendeten Cellulase produzierenden Schimmel gehören zu den
Gattungen Humicola, Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium und
Trichoderma. Einige der Produktionsstämme wurden genetisch modifiziert.
Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise Cellulase, die
aus einem Schimmelpilz, insbesondere aus Trichoderma-Schimmel, stammt.
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Kommerzielle
Enzympräparate
enthalten unterschiedliche Enzymaktivitäten und ihre Mengen und Verhältnisse
können
von einem Hersteller zum anderen leicht variieren. Für die Erfindung
ist es essentiell, daß das
Produkt wenigstens Cellulase-, Hemicellulase- und β-Glucanaseaktivität enthält. Mit
anderen Worten, in diesem Kontext bezieht sich Cellulase auf ein
Enzympräparat,
das wenigstens Cellulose, Hemicellulose und β-Glucan abbaut. Alle kommerziellen
Cellulase-Produkte, die vom Anmelder getestet wurden (produziert
von Genencor International, Röhm
Enzymer GmbH and Novo Nordisk) verbesserten die Ausbeute an β-Amylase. Cellulase-,
Hemicellulase- und β-Glucanase-Aktivitäten werden
z.B. in Novo's Handbook
of Practical Biotechnology, 1986, beschrieben.
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Cellulasen
können
z.B. in Endocellulasen, Exocellulasen, Exocellobiohydrolasen und
Cellobiasen eingeteilt werden. Endocellulasen, d.h. 1,4-β-D-Glucanglucanohydrolasen,
spalten statistisch die β-1,4-Bindungen von Cellulose
im Inneren des Moleküls
und bilden Oligosaccharide. Exocellulasen, d.h. 1,4-β-D-Glucanglucohydrolasen,
spalten β-1,4-Bindungen
am Ende des Moleküls,
wobei sie Glucose freisetzen. Ihre Wirkung auf die Cellobiose ist
langsam. Exocellobiohydrolasen, d.h. 1,4-β-D-Glucancellobiohydrolasen,
spalten die oben genannten Bindungen am nichtreduzierenden Ende
des Moleküls,
wobei sie Cellulose bilden, und Cellobiasen, d.h. β-D-Glucosid-glucohydrolasen,
spalten Cellobiose in Glucose. Eine Hydrolyse von Cellulose in Glucose
erfordert Endoglucanase (1,4-β-D-Glucanglucanohydrolase,
EC 3.2.1.4), welche das Innere des Moleküls und auch substituierte Substrate
spaltet, aber kristallisierte Cellulose nicht abbaut; Cellobiohydrolase (1,4-β-D-Glucan-cellobiohydrolase,
EC 3.2.1.91), die kristallisierte Cellulose spaltet, und β-Glucosidase (β-D-Glucosidglucohydrolase,
EC 3.2.1.21), die eine Cellobiase ist, die Cellobiose und Cello-Oligosaccharide in
Glucose spaltet.
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Eine
Enzym-Gruppe, die Hemicellulose spaltet, d.h. Polysaccharide, die
in der Natur gefunden werden und Pentosen enthalten, z.B. Arabinane,
Galactane, Mannane und Xylane, werden Hemicellulasen genannt. β-Glucanasen
spalten β-D-Glucane,
d.h. Glucosepolymere, die verzweigt sein können und sowohl β-1,3- als auch β-1,4-Bindungen
enthalten. β-Glucan
wird z.B. in Zellwänden
von Endospermzellen in Körnern
gefunden. Lichenase ist Endo-β-glucanase
(1,3·1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase),
die die β-1,4-Bindungen
von β-Glucan,
das β-1,3-
und β-1,4-Bindungen
enthält,
spaltet. Laminarinase (1,3-β-D-Glucan-3-glucanohydrolase)
spaltet β-Glucan,
das nur β-1,3-Bindungen
enthält,
zum Beispiel β-1,3-Bindungen
von Kohlenhydraten des Laminarin-Typs, und Exoglucanase (1,3-β-D-Glucan-glucohydrolase)
spaltet β-1,3-Bindungen
von β-1,3-Glucanen,
wodurch hauptsächlich
Glucose gebildet wird.
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Bei
der Extraktion von β-Amylase
wurden vielversprechende Resultate z.B. mit den Cellulase-Präparaten
Spezyme CE und GC 440, produziert von Genencor International, erzielt.
Das letztgenannte stammt von einem genetisch modifizierten Trichoderma
longibrachiatum-Stamm und baut Cellulose, Hemicellulose und β-Glucan besonders
effizient ab. Seine Aktivität
wird als Wirkung auf Carboxymethylcellulose (RBB-CMC) ausge drückt; in
diesem Fall ist die RBB-CMC-Aktivität wenigstens 1400 IU/g. Zusätzlich zu
Cellulaseaktivität
hat GC 440 β-Glucanase-, β-Glucosidase-, β-Xylosidase-,
Xylanase- und Acetylesterase-Aktivität. Eine typische Charge an
GC 440 enthält
im Durchschnitt etwa 7000 bis 9000 U/ml DNS-CMC, etwa 6000 bis 8000
U/ml β-Glucanase,
etwa 80 bis 90 U/ml β-Glucosidase,
etwa 500 bis 600 nkat/ml β-Xylosidase,
etwa 1700 bis 2000 nkat/ml Acetylesterase, etwa 700 bis 1400 U/ml
RBB-Xylanase und etwa 1900 bis 2100 U/ml DNS-Xylanase. Sehr gute Resultate wurden
auch unter Verwendung von Cellulase, die von Röhm Enzyme GmbH produziert wird
und die unter dem Markennamen Rohalase® Sep.
verkauft wird, erzielt. Das Präparat
stammt von einem Trichoderma reesei-Stamm und hält beachtliche Mengen an β-1,4-Endoglucanase-Aktivität (mindestens
4700 CU/g) und Xylanase (mindestens 3000 XylH/g) und geringere Mengen
an Celobiohydrolase-Aktivität.
Es enthält
auch β-1,3-Glucanase-Aktivität, d.h.
Laminarinase. Wenn die oben genannten Enzympräparate verwendet werden, beträgt eine
geeignete Menge an Cellulase wenigstens 0,015%, vorzugsweise mindestens
0,020%, z.B. 0,018 bis 0,40 und insbesondere 0,024 bis 0,030% des
Gewichts an Getreide.
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β-Amylase
kann in Gegenwart von Cellulase bei einer Temperatur von 20 bis
45°C extrahiert
werden. Die Temperatur ist vorzugsweise 25 bis 32°C, z.B. 29
bis 31°C.
Die Extraktionszeit kann 30 bis 72 h, üblicherweise wenigstens 48
h, z.B. 48 bis 66 h und insbesondere 55 bis 62 h sein. Eine geeignete
Extraktionszeit bei 30°C
ist etwa 60 h. Nachdem die Extraktion beendet wurde, werden Körner, Schrot
oder Mehl aus dem Extraktionswasser entfernt, indem zum Beispiel
ein Sieb verwendet wird, und β-Amylase
wird aus dem Extraktionswasser gewonnen, aus dem es nach Wunsch
gereinigt und/oder konzentriert wird.
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Nach
Extraktion kann das extrahierte und auf diese Weise abgetrennte
Getreide beispielsweise zur Herstellung von Stärke eingesetzt werden. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird β-Amylase
extrahiert und der Extrakt wird vom Getreide abgetrennt, bevor die
Stärke
fraktioniert und vom Getreide abgetrennt wird. Wenn das Enzym aus
unzerkleinerten Körnern
extrahiert wird, werden die extrahierten Körner zuerst gemahlen, wonach
das Stärkeherstellungsverfahren
in an sich bekannter Weise durchgeführt wird, d.h. die gemahlenen
Körner
werden in Wasser gemischt und das Getreide wird unter Verwendung
von Sieben und Zentrifugalkraft fraktioniert. Während des Mahlens wird üblicherweise
Cellulase zusammen mit β-Glucanase
zugesetzt, um die Viskosität
zu reduzieren und Stärke
von Protein zu trennen.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung ohne sie auf die darin offenbarten Ausführungsformen zu
beschränken.
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Beispiel 1
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Bestimmung
von β-Amylase
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Vor
Bestimmung der Gesamtmenge an β-Amylase
wurde die Schale entfernt, das zu analysierende Getreide wurde trocken
zu feinem Mehl vermahlen und 10 g davon wurden in einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben.
100 ml 0,5%ige (Gewicht/Volumen) Natriumsulfit-Lösung wurden zugesetzt und die
Substanzen wurden in geeigneter Weise vermischt. Das Gemisch wurde
für 24
h in dem Kolben stehengelassen, wurde aber gelegentlich geschüttelt. Danach
wurde es geeigneterweise vermischt und durch ein dünnes Filterpapier
(MN 640 W) filtriert. Das Filtrat wurde im Verhältnis 1:50 mit destilliertem
Wasser verdünnt
und die Aktivität
wurde durch das unten beschriebene Verfahren bestimmt. Dieser Enzym-Assay
wurde auch zum Beispiel zur Bestimmung des β-Amylase-Gehalts von Extraktionslösungen in
den unten beschriebenen Beispielen verwendet.
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Im
Prinzip wurde β-Amylase
bestimmt, wie es im Food Chemical Codex IV, General Test an Apparatus, 485,
beschrieben ist.
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Hier
ist eine DP-Einheit (diastatische Kraft) als die Menge an Enzym
in 0,1 ml einer 5% Probenverdünnung
definiert, die eine Menge an reduzierenden Zuckern, die zur Reduzierung
von 5 ml Fehling-Lösung
ausreicht, aus 100 ml Substrat bei 20°C in 1 Stunde produziert. (Das
Bestimmungsverfahren entspricht nicht der Definition von DP).
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Die
Enzymaktivität
wurde durch Hydrolysieren von Stärke
bei 20°C,
pH 4,6, für
30 Minuten bestimmt. Die resultierenden reduzierenden Zucker wurde
titrimetrisch mit Alkaliferricyanid bestimmt. Um ein Stärkesubstrat
zu produzieren, wurden 20 g (Trockensubstanz) Stärke (Baker 1130) mit etwa 50
ml Wasser vermischt. Es wurden etwa 500 ml siedendes Wasser zugesetzt
und das Gemisch wurde für
genau 2 Minuten gekocht. Es wurden 20 ml Acetatpuffer (0,5 M, pH
4,6) zu der abgekühlten
Stärkelösung gegeben
und mit destilliertem Wasser wurde auf 1 l verdünnt. 200 ml Stärkesubstrat,
das auf 20°C
temperiert war, wurde in einen 250 ml-Meßkolben pipetiert, 10 ml verdünnte Enzymprobe
wurden zugegeben und die Substanzen wurden gut vermischt. Die Probe
wurde für
genau 30 Minuten in einem Wasserbad mit 20°C inkubiert und es wurden 20
ml 0,5 N NaOH zugesetzt. Die Substanzen wurden gut vermischt und
auf 250 ml verdünnt.
10 ml Enzymverdünnung
und 20 ml 0,5 N NaOH wurden in einen 250 ml-Meßkolben für eine 0-Probe pipetiert. Die Substanzen wurden
gut vermischt und 200 ml Stärkesubstrat
wurde zugesetzt und es wurde auf 250 ml verdünnt.
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0,05
N Ferricyanid-Reagens wurde hergestellt, indem 16,5 Kaliumferricyanid
(K3Fe(CN)6) und
22 g Natriumcarbonat (Na2CO3)
in Wasser gelöst
wurden und das ganze auf einen Liter verdünnt wurde. Eine A-P-Z-Lösung wurde
hergestellt, indem 70 g Kaliumchlorid (KCl) und 20 g Zinksulfat
(ZnSO4 × 7H2O) in 700 ml destilliertem Wasser gelöst wurden,
200 ml konzentrierte Essigsäure
zugegeben wurde und auf 1 l verdünnt wurde.
Eine Kaliumiodid-Lösung
wurde hergestellt, indem 50 g Kaliumiodid (KJ) in 100 ml destilliertem
Wasser gelöst
wurden und 2 Tropfen 50%iges Natriumhydroxid (NaOH) zugesetzt wurde.
10 ml Ferricyanid-Reagens und 5 ml Probe diese wurden gut gemischt
und in einem siedenden Wasserbad für exakt 20 Minuten erhitzt. Die
Lösung
wurde abgekühlt
und 25 ml A-P-Z-Reagens und 1 ml KJ-Lösung wurden zugesetzt. Das
Gemisch wurde mit 0,05 N Natriumsulfat-Lösung titriert, bis die blaue
Farbe verschwand (Dunkelblau → weiß).
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Die β-Amylase-Aktivität wurde
aus der folgenden Formel errechnet:
worin:
- V0
- = Verbrauch durch
0-Probe bei Titration (ml)
- V1
- = Verbrauch durch
Probe bei Titration (ml)
- K
- = Verdünnungsfaktor
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Beispiel 2
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Die
Wirkung von Cellulase auf die Extraktionszeit von β-Amylase
wurde untersucht. β-Amylase
wurde ohne Cellulase und mit Cellulase aus Gerste extrahiert. 10
kg Gerste, die mit einer Schälmaschine
geschält worden
war, wurden mit 15 l Wasser, das 0,5 Natriummetabisulfit und 0,5%
Natriumsulfit enthielt, extrahiert. Darüber hinaus wurde GC440-Cellulase, produziert
durch Genencor, zu der zweiten Charge gegeben, wobei die Cellulase-Menge
0,029% des Gewichts an geschälte
Gerste entsprach. Die Extraktion wurde bei 30°C durchgeführt. Die Aktivität der in
der Extraktion verwendeten Körner
war 155 DP°/g,
die entsprechend Beispiel 1 bestimmt wurde. Die Resultate sind in
Tabellen 1 und 2 gezeigt.
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Tabelle
1: Extraktion ohne Cellulase
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Tabelle
2: Extraktion mit Cellulase
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Die
Resultate zeigen, daß ein
Cellulasezusatz zu dem Extraktionswasser die Extraktionszeit von β-Amylase
reduziert.
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Beispiel 3
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Die
Wirkung von Cellulase auf die Extraktionsausbeute wurde untersucht.
10 kg geschälte
Gerste mit einer β-Amylase-Aktivität von 155
DP°/g wurden
in 15 l Wasser, das 0,5% Natriumbisulfit und 0,5% Natriumsulfit
enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder
ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
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Die
Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der Menge
an Gerste, die verwendet wurde, war 1550 kDP°. 8175 ml Extrakt mit einer
Aktivität
von 95 DP/ml wurde erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt
wurde. Die Gesamtaktivität
des erhaltenen Extrakts war demnach 776,6 kDP° und die Extraktausbeute war
50,1%.
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Es
wurde eine entsprechende Extraktion in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem
eine Menge von GC440 zugesetzt wurde, die 0,025% des Gewichts der
geschälten
Gerste entsprach. Die Extraktionszeit war 60 h. Die Gesamtaktivität der Menge
an Gerste, die verwendet wurde, war 1550 kDP°. 9825 ml Extrakt mit einer
Aktivität
von 102°DP/ml
wurde erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde.
Die Gesamtaktivität
des erhaltenen Extrakts war demnach 1002,2 kDP° und die Extraktausbeute war
64,7%.
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Die
Resultate zeigen, daß ein
Zusatz von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase
beträchtlich
erhöhte.
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Beispiel 4
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Es
wurde der Effekt der Temperatur auf die Extraktion von β-Amylase untersucht.
Geschälte
Gerste wurde in der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen
Art in Gegenwart von Cellulase bei unterschiedlichen Temperaturen
extrahiert. Die Dosierung von Cellulase GC440 entsprach 0,027% des
Gewichts der geschälten
Gerste und die Extraktionstemperatur war 20°C, 25°C, 30°C oder 40°C. Die Resultate sind in 1 gezeigt.
Die besten Resultate wurden bei 30°C erreicht.
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Beispiel 5
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Der
Effekt von Cellulase auf die β-Amylaseausbeute
aus Weizen wurde untersucht. 10 kg geschroteter Weizen mit einer β-Amylase-Aktivität von 128
DP°/g wurde
in 15 l Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit
enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder
ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
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Die
Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der Menge
an Weizen, die verwendet wurde, war 1280 kDP°. 9175 ml Extrakt mit einer
Aktivität
von 55°DP/ml
wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb getrennt wurde.
Die Gesamtaktivität
des erhaltenen Extrakts war demnach 504,6 kDP° und die Extraktausbeute war
39,4%.
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Eine
entsprechende Extraktion wurde in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem
eine Menge an GC440-Cellulase, die 0,036% des Gewichts des Schrots
entspricht, zu dem geschroteten Weizen gegeben wurde. Die Extraktionszeit
war 60 h. Die Gesamtaktivität
der verwendeten Weizenmenge war 1280 kDP°. 10080 ml Extrakt mit einer
Aktivität
von 72°DP/ml
wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde.
Die Gesamtaktivität
des erhaltenen Extrakts war demnach 728,8 kDP° und die Extraktausbeute war
56,7%.
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Die
Resultate zeigen, daß Zusatz
von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase
beträchtlich
erhöht.
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Beispiel 6
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Es
wurde der Effekt von Cellulase auf die Ausbeute an β-Amylase aus poliertem
Weizen untersucht. Weizen wurde mit einer Reispoliermaschine durch
Brechen der Oberfläche
und Entfernen des äußersten
Teils poliert, d.h. das meiste des Pericarps wurde entfernt und
die Testa leicht beschädigt.
10 kg polierten Weizen mit β-Amylase-Aktivität von 128
DP°/g wurden
in 15 l Wasser, das 0,5% Natriummetabisulfit und 0,5% Natriumsulfit
enthielt, extrahiert. Die Extraktion wurde bei 30°C entweder
ohne Cellulase oder in Gegenwart von Cellulase durchgeführt.
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Die
Extraktionszeit ohne Cellulase war 72 h. Die Gesamtaktivität der verwendeten
Weizenmenge war 1280 kDP°.
9780 ml Extrakt mit einer Aktivität von 15°DP/ml wurden erhalten, indem
der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde. Die Gesamtaktivität des erhaltenen
Extrakts war demnach 146,7 kDP° und
die Extraktausbeute war 11,5%.
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Eine
entsprechende Extraktion wurde in Gegenwart von Cellulase durchgeführt, indem
eine Menge an GC440-Cellulase, die 0,036 Gew.% des polierten Weizens
entsprach, zu dem geschroteten Weizen gegeben wurde. Die Extraktionszeit
war 60 h. Die Gesamtaktivität
der verwendeten Weizenmenge war 1280 kDP°. 9250 ml Extrakt mit einer
Aktivität
von 35°DP/ml
wurden erhalten, indem der Extrakt mit einem Sieb abgetrennt wurde.
Die Gesamtaktivität
des erhaltenen Extrakts war demnach 323,8 kDP° und die Extraktausbeute war
25,3%.
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Die
Resultate zeigen, daß Zusatz
von Cellulase zu dem Extraktionswasser die Ausbeute an β-Amylase
beträchtlich
erhöht.