CN1228444C - 提取β－淀粉酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过纤维素酶提取β-淀粉酶的方法。本发明进一步涉及β-淀粉酶提取过程中纤维素酶的使用。

Description

提取β-淀粉酶的方法
技术领域
本发明和酶技术相关。更准确的说，本发明和从谷类植物中提取β-淀粉酶的方法以及所述提取过程中酶的使用相关。
发明背景
β-淀粉酶是一种淀粉降解酶，能够水解α-1，4键。它存在于如细菌和植物中，能够从淀粉链的非还原端将淀粉主要分解成麦芽糖。如在谷粒中含有丰富的β-淀粉酶，在需要时它将谷物中的营养贮备，即淀粉转化成糖。谷类中的淀粉主要以直链淀粉和支链淀粉的形式贮存。β-淀粉酶将所有的直链淀粉转变为麦芽糖而将大约60％的支链淀粉转变成麦芽糖而将剩下的转变成糊精。
β-淀粉酶是商业上重要的酶，如在淀粉工业中它可用来生产麦芽糖。含大量麦芽糖的产品可以用于如糖果和食品工业。人们已经从细菌和植物中分离出β-淀粉酶。如已经从芽孢杆菌属(Bacillus)细菌(US 4 970 158和JP 60 126 080)和耐热梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(US 4 647 538)中得到了β-淀粉酶。从细菌中得到的β-淀粉酶除了将淀粉转化成麦芽糖之外，还产生相当大量的麦芽三糖，而来自植物的β-淀粉酶产生相对较多的麦芽糖，因此更适于用在目的为得到尽可能甜的和\或可发酵的产品的方法里。而且，从细菌大规模生产β-淀粉酶是很困难的。工业上的β-淀粉酶是植物来源的，通常谷物，特别是大麦或小麦，以及大豆都可用作酶源。
生长的过程中β-淀粉酶在谷粒中形成并贮藏于其中。谷粒由胚芽和含有淀粉的胚乳(即，核)组成，它们被盾片隔开。胚乳由一个糊粉层包围着，整个谷粒被果皮层、种皮层和真实外壳包围。小麦没有严格意义上的外壳，但果皮和种皮形成了坚固的外壳层。β-淀粉酶主要积累在胚乳和盾片中。人们发现在紧贴糊粉层下面的胚乳最外部分中β-淀粉酶最多。
对大麦β-淀粉酶已经进行详尽的研究。该β-淀粉酶及其生产的描述参见如以下出版物：D.E.Briggs，Barley，Chapman & Hall，London，1978；Cook，Barley and Malt，Academic Press，London，1962；J.R.A.Pollock，Brewing Science，Academic Press，London，1979。该酶的系统名为1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶(E.C 3.2.1.2)。过去分离谷类β-淀粉酶时首先将谷粒磨碎或碾碎，然后对β-淀粉酶用水或缓冲液进行提取。从这种提取物中进行酶的纯化自然很困难且费力，因为除了所要的酶，提取物中还含有谷粒中一些其他的可溶性成分。人们尝试改进溶液中β-淀粉酶的分离，如在硫酸铵的存在下用多聚体吸附酶(US 5 294 341)。有人试验用蛋白酶将β-淀粉酶从面筋中释放出来(JP 63 079 590)。
通过往小麦淀粉生产的废液中加入藻酸钠然后回收凝聚的酶(JP 60027 383)或者通过形成磷酸钙凝胶吸附该酶然后将其回收(JP 63 248 389)的方法也可分离出β-淀粉酶。来自淀粉生产的废液并不是好的β-淀粉酶来源，因为废液非常稀而且含有大量别的成分，这使纯化和浓缩难于进行，而导致低产率。
为了得到更纯的粗提物并避免艰难的下游处理，有人建议从完全或部分脱壳的谷粒中提取β-淀粉酶。如当大麦粒以不破损胚乳的方式去掉外壳时，胚乳最外层起一种过滤的作用而防止不溶物质进入浸渍水中并限制了可溶性物质的进入。最好是在还原性物质的存在下进行提取，还原性物质可以将β-淀粉酶从谷粒的其他蛋白中释放出来(FI 61 516和US 4 675296)。
现在已经发明了从谷物中提取β-淀粉酶的方法，该方法可以缩短谷物提取时间并提高酶的产量。该方法实施简单并特别适于处理脱壳的谷物，而这又方便了酶的进一步纯化。
发明简述
本发明β-淀粉酶提取方法的特征是：在纤维素酶存在的条件下在水性介质中对谷物进行提取以得到含β-淀粉酶的提取物。本发明进一步和从谷物提取β-淀粉酶时纤维素酶的使用相关。
纤维素酶用于例如从磨碎的谷物进行的淀粉生产中以减少浆的粘度以及从蛋白质中分离淀粉。现在令人惊讶的发现，在β-淀粉酶的提取水中加入纤维素酶能提高β-淀粉酶的产率并缩短提取时间。本发明优选的实施方案见相关的权利要求。
附图简述
图1描述温度随时间对β-淀粉酶产率的影响。
发明详述
本发明方法适用于提取含β-淀粉酶的不同谷物，如小麦、大麦、黑麦和大豆。优选用于提取小麦和黑麦，特别是大麦的β-淀粉酶。没发芽的谷粒除了β-淀粉酶不含大量的酶类，因此值得从这种谷粒中提取β-淀粉酶。该酶可以从没去壳的谷粒中提取但优选从去壳的、磨碎、碾碎或精加工的谷粒中提取。适宜的是去壳的黑麦和大麦。对去壳大麦粒的抽提效果是最好的。
为了防止淀粉从谷粒胚乳中进入提取物中，必须去壳以便不破坏真的活谷粒。然而，必须尽可能小心的去掉真壳。这样做的原因是外壳太厚以致其会阻挡β-淀粉酶的透过。因此，去壳的大麦是指谷粒真壳被去除但胚乳仍完好无损的大麦。实践中，这意味着通过去壳最多除去带壳麦粒重量的约20％。通常10％到20％的重量作为外壳物质被除去。在此情况下，胚乳的最外层(果皮、种皮和糊粉层)作为一种超滤器不仅防止不溶性物质还基本上防止了可溶性物质进入提取水中。用这种方法处理谷物而获得的提取物相对较纯，从而方便了进一步的处理，如酶的纯化和浓缩。酶工业中的公知方法如加压过滤和超滤可用于进一步的处理中。
谷物在水性介质如水或可能地在缓冲液中进行提取。提取过程中pH通常在6.0和6.5之间。提取最好在还原条件下进行。使用的还原活性的量将使和谷粒中结构蛋白结合的β-淀粉酶被释放出来。还原条件根据本身已知的方式而定，实践中时常用二氧化硫，如加入偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。去壳谷粒和水性介质的比例最好在5∶8和2∶3(重量/体积)之间。本发明方法适用于提取在钢仓中进行的工业规模的处理，如向其中加入19吨去壳大麦和含有0.5％偏亚硫酸氢钠和0.5％亚硫酸钠的29m3水。
用上述方式提取大麦，如不分离留在谷粒中的水分，提取产量为大麦中β-淀粉酶总含量的约45％到50％。在此情况下，提取时间为约72小时。当在提取水中加入纤维素酶时，多达总量65％的谷物β-淀粉酶可以被提取出来而提取时间缩短到约60小时。
纤维素是一种线性葡萄糖多糖，其葡萄糖单元之间通过β-1，4-糖苷键相连。在植物细胞壁中发现纤维素通常与木质素和半纤维素在一起。参与纤维素降解反应的酶被认为是纤维素酶。纤维素酶在工业上被用于如淀粉生产、纸的大规模加工、纺织品加工、酿酒厂中β-葡聚糖的降解和面包房中提高面粉的质量。本发明方法中，纤维素酶能降解任何活谷粒外壳下的表面结构。
商品化纤维素酶产品或者来自细菌如芽孢杆菌属或者来自真菌如酵母(比如酵母属(Saccharomyces))或霉菌。特别是，已经从霉菌中分离出了大量的纤维素酶。最通常用的纤维素酶生产霉菌属于腐质霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、毁丝霉属(Myceliopthora)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和木霉属(Trichoderma)。有些生产菌株已经进行了遗传改良。本发明优选使用来自霉菌，特别是木霉属的纤维素酶。
商业用的酶制剂含有几种酶活性并且它们的量和比例可以因为生产商的不同而有轻微差别。本发明中酶产品必需至少含有纤维素酶、半纤维素酶和β-葡聚糖酶活性。换句话说，在本上下文中纤维素酶是指至少可以分解纤维素、半纤维素和β-葡聚糖的酶制剂。申请人试验的所有商业用纤维素酶产品(由Genencor International，Rhm Enzymer GmbH和NovoNordisk生产)均能提高β-淀粉酶的产率。纤维素酶、半纤维素酶和β-葡聚糖活性的描述见例如Novo的实用生物技术手册(1986年)。
纤维素酶可以分为如内切纤维素酶、外切纤维素酶、外切纤维二糖水解酶和纤维二糖酶。内切纤维素酶即1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，它能随机切开纤维素内部的β-1，4键而形成寡糖。外切纤维素酶即1，4-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，它能切开分子末端的β-1，4键，释放出葡萄糖。它们对纤维二糖的作用较慢。外切纤维二糖水解酶即1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，能在分子的非还原端切开上述的键，形成纤维二糖。纤维二糖酶即β-D-′葡糖苷葡萄糖水解酶，能将纤维二糖切成葡萄糖。将纤维素水解成葡萄糖需要内切葡聚糖酶(1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，E.C 3.2.1.4)(它能切开该分子以及被取代的底物的内部，但不能降解结晶态的纤维素)和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)(它能切开结晶态的纤维素)以及β-葡萄糖苷酶(β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.21)(它是一种纤维二糖酶，能将纤维二糖和纤维寡糖切成葡萄糖)。
有一组酶能分解半纤维素，即存在于自然界中含有戊糖的多糖如阿拉伯聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖和木聚糖，这组酶称为半纤维素酶。β-葡聚糖酶分解β-D-葡聚糖，即葡萄糖多聚体，此葡萄糖多聚体可能有分支且含有β-1，3和β-1，4键。如在谷粒胚乳细胞的细胞壁中发现存在β-葡聚糖。地衣多糖酶是内切-β-葡聚糖酶(1，3·1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)，能切开含有β-1，3和β-1，4键的β-葡聚糖的β-1，4键。昆布多糖酶(1，3-β-D-葡聚糖-3-葡聚糖水解酶)能切开只含有β-1，3键的β-葡聚糖如昆布多糖型碳水化合物的β-1，3键，外切葡聚糖酶(1，3-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)能切开β-1，3-葡聚糖的β-1，3键而主要生成葡萄糖。
对于提取β-淀粉酶，利用如Genencor International生产的纤维素酶制剂Spezyme CE和GC440，已经取得了有希望的结果。后一酶制剂来自遗传改良过的长枝木霉(Trichoderma Congibrachiatum)菌株，其能尤其有效地分解纤维素、半纤维素和β-葡聚糖。它的活力表示为对羧甲基纤维素的分解效果(RBB-CMC)，在这种情况RBB-CMC活力至少为1400IU/g。GC440除了具有纤维素酶活性，还具有β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖酶和乙酰酯酶活性。通常的一批GC440合有平均大约7000到9000U/ml DNS-CMC，大约6000到8000U/ml β-葡聚糖酶，大约80到90U/ml β-葡糖苷酶，大约500到600nkat/ml β-木糖苷酶，大约1700到2000nkat/ml乙酰酯酶，大约700到1400U/ml RBB木聚糖酶和大约1900到2100U/ml DNS木聚糖酶活力。用Rhm Enzyme GmbH生产的纤维素酶也得到了非常好的结果，该酶的商标名为RohalaseSep。此制剂来自里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株，其含有相当大量的β-1，4-内切葡聚糖酶活性(至少4700CU/g)和木聚糖酶(至少3000XylH/g)以及较少量纤维二糖水解酶活性。它也具有β-1，3-葡聚糖酶，即昆布多糖酶活性。当使用上述酶制剂时，适宜的纤维素酶量是谷物重量的至少0.015％，优选至少0.020％，如0.018到0.040％，特别地，0.024到0.030％。
β-淀粉酶可在20到45℃有纤维素酶存在的条件下提取。温度优选为25到32℃，如29到31℃。提取时间可以为30到72小时，通常至少48小时，如48到66小时，特别地，55到62小时。在30℃适宜的提取时间约为60小时。提取完成后，用如筛子将谷粒、去壳谷粒或面粉从提取水中分离出来，然后可以从提取水中回收β-淀粉酶，需要的话，可进行纯化和/或浓缩。
提取后，用这种方法提取和分离后的谷物可以例如用来生产淀粉。根据本发明，β-淀粉酶被提取出来且提取物在从谷物中分级分离淀粉之前与谷物分离开来。如果酶从未破损的谷粒中提取，则将提取过的谷粒首先进行碾磨，之后淀粉的生产按照本身已知的方法进行，即将碾磨后的谷粒和水混合然后谷物通过过筛和离心力进行分馏。碾磨时通常加入纤维素酶和β-葡聚糖酶以减少粘性并将淀粉从蛋白质中分离出来。
下面实施例举例阐明本发明但本发明不局限于其中所述的实施方式。
实施例1
测定β-淀粉酶
在测定谷物中β-淀粉酶总量之前，除去所有外壳，将所要分析的谷物碾磨并干燥成细面粉，取10克置于100毫升的锥形瓶中。加入100毫升0.5％(重量/体积)亚硫酸钠溶液并适当混合。将混合物置于瓶中24小时但偶尔进行摇动。之后将其适当混合并通过薄滤纸(MN 640W)过滤。滤液用蒸馏水进行1∶50倍的稀释，用下面描述的方法测定活力。该酶分析方法也就此用于测定下面所述实施例中提取液中β-淀粉酶的含量。
原则上，β-淀粉酶的测定按照食品化学制品规则IV，普通检验与设备(Food Chemical Codex IVGeneral Test and Apparatus)，485页所描述的方法进行。
这里一个DP单位(糖化力)定义为在0.1ml的5％样品稀释液中能在20℃，1小时中从100ml底物产生足够还原5毫升菲林溶液所需的还原糖量的酶量(测定方法和DP的定义并不一致)。
通过在20℃，pH4.6，30分钟内淀粉的水解来测定酶的活力。所得还原糖用碱性铁氰化物滴定来测定。为了制备淀粉底物，将20克(干物质)淀粉(Baker 1130)和约50毫升水混合。加入约500ml沸水，混合物煮沸恰好2分钟。将20毫升乙酸缓冲液(0.5M，pH4.6)加入冷却后的淀粉溶液中并用蒸馏水稀释至1升。用移液管取200毫升20℃的淀粉底物加入250毫升的容量瓶中，加入10毫升稀释过的酶样品并混匀这些物质。样品在20℃水浴孵育恰好30分钟后加入20毫升0.5N氢氧化钠。将瓶中物质混匀并稀释到250毫升。作为0-样品，用移液管取10毫升酶稀释液和20毫升0.5N氢氧化钠加入250毫升容量瓶中。将这些物质混匀，加入200毫升淀粉底物并稀释至250毫升。
0.05N铁氰化物试剂的制备方法为：将16.5克铁氰化钾(K3Fe(CN)6)和22克碳酸钠(Na2CO3)溶于水中并稀释至1升。A-P-Z溶液的制备方法为：将70克氯化钾(KCl)和20克硫酸锌(ZnSO4×7H2O)溶于700毫升蒸馏水中并加入200毫升浓乙酸并稀释到1升。碘化钾溶液制备方法为：将50克碘化钾(KI)溶于100毫升蒸馏水并加入2滴50％氢氧化钠(NaOH)。用移液管取10毫升铁氰化物试剂和5毫升样品置于250毫升容量瓶中。将它们混匀后沸水浴中加热恰好20分钟。将溶液冷却后加入25毫升A-P-Z试剂和1毫升碘化钾溶液。混合物用0.05N硫酸钠溶液滴定直到蓝色消失(深蓝色→白色)。
β-淀粉酶活力用如下公式计算
其中
V0＝滴定0-样品所消耗的量(ml)
V1＝滴定样品所消耗的量(ml)
K＝稀释倍数
实施例2
研究了纤维素酶对β-淀粉酶提取时间的影响。分别在不加纤维素酶和加入纤维素酶时从大麦中提取β-淀粉酶。将10千克大麦用去壳机去壳后在含有0.5％偏亚硫酸氢钠和0.5％亚硫酸钠的15升水中进行提取。而且，将Genencor生产的GC440纤维素酶加入到第二批中，纤维素酶的用量为去壳大麦重量的0.029％。提取在30℃下进行。提取中使用的谷粒的活力为155DP°/g，其测定为根据实施例1进行。结果见表1和2。
表1.不加纤维素酶的提取
    时间，小时 提取液中β-淀粉酶活力(DP°/ml)
    10     20
    24     47
    30     55
    48     83
    60     92
    66     98
    72     102
    96     86
表2.加纤维素酶的提取
    时间，小时 提取液中β-淀粉酶活力(DP°/ml)
    10     23
    24     55
    30     70
    48     92
    60     104
    66     104
    72     100
    96     90
结果表明在提取水中加入纤维素酶可以减少β-淀粉酶的提取时间。
实施例3
研究了纤维素酶对提取产量的影响。将10千克去壳大麦在含有0.5％偏亚硫酸氢钠和0.5％亚硫酸钠的15升水中进行提取，去壳大麦的β-淀粉酶活力为155DP°/克。不加纤维素酶和加入纤维素酶的提取过程都在30℃进行。
不加纤维素酶的提取时间为72小时。所用大麦的总活力为1550kDP°。将提取物用筛子分离后得到8175毫升活力为95°DP/ml的提取物。这样所获提取物的总活力为776.6kDP°，提取产率为50.1％。
在加纤维素酶的相应提取过程中加入去壳大麦重量0.025％的GC440。提取时间为60小时。所用大麦的总活力为1550kDP°。将提取物用筛子分离后得到9825毫升活力为102°DP/ml的提取物。这样所得提取物的总活力为 1002.2kDP°，提取产率为64.7％。
结果表明往提取水中加入纤维素酶可以相当多的提高β-淀粉酶的产量。
实施例4
研究了温度对于提取β-淀粉酶的影响。将去壳大麦在纤维素酶存在下用前面实施例中所描述的方式在不同温度下提取。纤维素酶GC440的用量相应于去壳大麦重量的0.027％，提取温度分别为20℃，25℃，30℃或40℃。结果见图1。在30℃下效果最佳。
实施例5
研究了纤维素酶对来自小麦的β-淀粉酶产量的影响。将10千克碾磨过的小麦在含有0.5％偏亚硫酸氢钠和0.5％亚硫酸钠的15升水中进行提取，所述小麦的β-淀粉酶活力为128DP°/克。不加纤维素酶和加入纤维素酶的提取过程都在30℃进行。
不加纤维素酶的提取时间为72小时。所用小麦的总活力为1280kDP°。将提取物用筛子分离后得到9175毫升活力为55°DP/ml的提取物。这样所得提取物的总活力为504.6kDP°，提取产率为39.4％。
在有纤维素酶的相应提取过程中向碾磨后的小麦中加入去壳谷粒重量0.036％的GC440纤维素酶。提取时间为60小时。所用小麦的总活力为1280kDP°。将提取物用筛子分离后得到10080毫升活力为72°DP/ml的提取物。这样所得提取物的总活力为725.8kDP°，提取产率为56.7％。
结果表明往提取水中加入纤维素酶可以相当多的提高β-淀粉酶的产量。
实施例6
研究了纤维素酶对来自精加工小麦的β-淀粉酶产量的影响。将小麦用精米机通过破坏表面并除去最外层部分(即大部分果皮被除去且种皮有轻微的损坏)进行精加工。将10千克精加工的小麦在含有0.5％偏亚硫酸氢钠和0.5％亚硫酸钠的15升水中进行提取，所述小麦的β-淀粉酶活力为128DP°/g。不加纤维素酶和加入纤维素酶的提取过程都在30℃进行。
不加纤维素酶的提取时间为72小时。所用小麦的总活力为1280kDP°。将提取物用筛子分离后得到9780毫升活力为15°DP/ml的提取物。这样所得提取物的总活力为146.7kDP°，提取产率为11.5％。
在有纤维素酶的相应提取过程中向碾磨后的小麦中加入精加工小麦重量0.036％的GC440纤维素酶。提取时间为60小时。所用小麦的总活力为1280kDP°。将提取物用筛子分离后得到9250毫升活力为35°DP/ml的提取物。这样所得提取物的总活力为323.8kDP°，提取产率为25.3％。
结果表明往提取水中加入纤维素酶可以相当多的提高β-淀粉酶的产量。

Claims (18)

1.从谷物中提取β-淀粉酶的方法，其特征是在纤维素酶存在的条件下在水性介质中提取谷物以得到含有β-淀粉酶的提取物，然后从所述介质中回收所述β-淀粉酶。
2.根据权利要求1的方法，其特征是β-淀粉酶提取自大麦、小麦或黑麦。
3.根据权利要求1的方法，其特征是β-淀粉酶提取自去壳大麦。
4.根据权利要求1的方法，其特征是β-淀粉酶提取自经选自去壳、碾磨、磨碎、精加工和其组合的方法处理过的谷粒。
5.根据权利要求1的方法，其特征是提取在还原条件下进行。
6.根据权利要求5的方法，其特征是所述还原条件宜于提供能够将谷粒结构蛋白结合的β-淀粉酶释放出来的还原活性。
7.根据权利要求5的方法，其特征是所述还原条件由含有SO2的水提供。
8.根据权利要求3的方法，其特征是去壳大麦用含有二氧化硫的水提取，其中去壳大麦与含二氧化硫的水的比例为5∶8到2∶3。
9.根据权利要求1-8中任何一个的方法，其特征是提取在25℃到33℃温度下进行。
10.根据权利要求9的方法，其中提取在29到31℃下进行。
11.根据权利要求1-8中任何一个的方法，其特征是提取时间为48到66小时。
12.根据权利要求11的方法，其中提取时间为55到62小时。
13.根据权利要求1的方法，其特征是所述纤维素酶包括具有纤维素酶、半纤维素酶和/或β-葡聚糖酶活性的酶制剂。
14.根据权利要求1-8中任何一个的方法，其特征是纤维素酶包括霉菌纤维素酶。
15.根据权利要求1-8中任何一个的方法，其特征是使用木霉属霉菌的纤维素酶。
16.根据权利要求1-8中任何一个的方法，其特征是纤维素酶包括选自如下的物种属的纤维素酶：腐质霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、毁丝霉属(Myceliopthora)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)和其组合。
17.根据权利要求1的方法，其特征是通过选自纯化、浓缩和其组合的处理方法对所述回收的β-淀粉酶进行处理。
18.纤维素酶在谷物β-淀粉酶的提取中的用途。
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