ES2261644T3 - Un procedimiento de extraccion de beta-amilasa. - Google Patents
Un procedimiento de extraccion de beta-amilasa.Info
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Abstract
Un procedimiento para la extracción de beta-amilasa desde cereal, caracterizado porque el cereal se extrae con un medio acuoso en la presencia de una preparación de enzima que comprende actividades de celulasa, hemicelulasa y beta-glucanasa para obtener un extracto que contiene beta-amilasa, seguido de recuperación de la citada beta-amilasa desde dicho medio.
Description
Un procedimiento de extracción de
\beta-amilasa.
La presente invención se refiere a la tecnología
de enzimas. Más concretamente, la invención se refiere a un
procedimiento de extracción de \beta-amilasa a
partir de cereal y a la utilización de una enzima en la citada
extracción.
La \beta-amilasa es una enzima
de degradación del almidón que hidroliza los enlaces
alfa-1,4. Se encuentra, por ejemplo, en bacterias y
plantas y escinde el almidón principalmente en maltosa en el extremo
no reductor de la cadena de almidón. La
\beta-amilasa es abundante, por ejemplo, en
granos, donde convierte el almacén de nutrientes del cereal, es
decir el almidón, en azúcar, si es necesario. En los cereales, el
almidón se almacena principalmente en la forma de amilosa y
amilopectina. La \beta-amilasa convierte toda la
amilosa en maltosa, con lo que aproximadamente el 60% de la
amilopectina se convierte en maltosa y el resto en dextrina.
La \beta-amilasa es una enzima
comercialmente significativa que se utiliza, por ejemplo, en la
industria del almidón para producir maltosa. Los productos que
contienen grandes cantidades de maltosa se emplean, por ejemplo, en
la industria de confitería y de alimentación. La
\beta-amilasa ha sido aislada de bacterias y de
plantas. Por ejemplo, ha sido obtenida a partir de bacterias
Bacillus (Patente estadounidense 4 970 158 y Patente japonesa
JP 60 126 080) y de bacterias Clostridium termoestables
(Patente estadounidense 4 647 538). Además de la maltosa, las
\beta-amilasas derivadas de bacterias producen
cantidades considerables de maltotriosa, mientras que las
\beta-amilasas basadas en plantas producen
relativamente más maltosa y por eso son más adecuadas para procesos
en los que el propósito es obtener productos lo más dulce y/o
fermentables posible. Además, la producción a gran escala de
\beta-amilasa de bacterias es difícil. La
\beta-amilasa utilizada en la industria está
basada en plantas, en cuyo caso se obtiene normalmente de cereales,
en particular cebada o trigo, pero también la soja es utilizada como
fuente de enzima.
Durante el crecimiento, la
\beta-amilasa se forma en los granos, donde se
almacena. Un grano consta de un germen y una endosperma que contiene
almidón, es decir, un núcleo, componentes que están separados entre
sí por el escutelo. La endosperma está rodeada por una capa de
aleurona y el grano completo está rodeado por una capa, el
pericarpio, una envoltura dura, la testa, y la cáscara propiamente
dicha. El trigo no tiene propiamente cáscara, sino que el pericarpio
y la testa forman una cáscara externa dura. La
\beta-amilasa se acumula principalmente en la
endosperma y el escutelo. Las cantidades mayores de
\beta-amilasa se encuentran en las porciones más
externas de la endosperma inmediatamente debajo de la capa de
aleurona.
La \beta-amilasa de cebada ha
sido estudiada a fondo. Esta \beta-amilasa y su
producción están descritas en, por ejemplo, en las siguientes
publicaciones: D. L. Briggs, Barley, Chapman & Hall,
Londres, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press,
Londres, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Science, Academic
Press, Londres 1979. El nombre sistemático de la enzima es
1,4-alfa-D-glucano
maltohidrolasa (EC 3.2.1.2). Antes, la
\beta-amilasa se separaba de cereal triturando o
moliendo primero el grano y extrayendo luego la
\beta-amilasa con agua o un agente tampón. La
purificación de la enzima desde un extracto de esta clase es
naturalmente difícil y laboriosa porque, además de la enzima
buscada, el extracto contiene varios otros componentes del grano
solubles. Se han realizado intentos para mejorar la separación de
\beta-amilasa desde una solución que la contiene,
por ejemplo por adsorción de la enzima con polímero en la presencia
de sulfato de amonio (Patente estadounidense 5 294 341). Se han
llevado a cabo experimentos de liberación de
\beta-amilasa de gluten con proteasa (Patente
japonea JP 63 079 590).
La \beta-amilasa ha sido
aislada desde el líquido residual de la producción de almidón de
trigo por adición de alginato de sodio y por recuperación de la
enzima coagulada (Patente japonesa JP 60 027 383) o por formación de
un gel de fosfato de calcio al que se adsorbe la enzima que se
recupera entonces (Patente japonesa JP 63 248 389). El líquido de
desecho de la producción de almidón no es una buena fuente de
\beta-amilasa ya que está muy diluido y contiene
grandes cantidades de otros componentes que hacen difícil la
purificación y concentración y como resultado de ello, el
rendimiento es bajo.
Para obtener un extracto de material de partida
más puro y para evitar un procesado derivado difícil, se ha sugerido
la extracción de la \beta-amilasa de los granos
completos o parcialmente descascarillados. Cuando, por ejemplo, se
descascarillan los granos de cebada de tal manera que no se rompe su
endosperma, las capas más externas de la endosperma funcionan como
una especie de filtro que evita el acceso de substancias insolubles
al agua de maceración y restringe el acceso de substancias solubles.
Es preferible llevar a cabo la extracción en la presencia de una
substancia reductora que libera \beta-amilasa
desde otras proteínas del grano (Patentes FI 61 516 y US 4 675
296).
La Patente estadounidense 4 675 269 se refiere a
un método para preparar un producto de
\beta-amilasa comercial a partir del grano de
cebada completo o parcialmente descascarillado por extracción de los
granos con agua. La Patente estadounidense US 3.492.203 se refiere a
extracción de \beta-amilasa del salvado de trigo
con agua. Ninguno de los documentos sugiere la utilización de una
enzima que libera \beta-amilasa.
\newpage
Se ha descubierto ahora un procedimiento para
extracción de \beta-amilasa a partir de cereal,
que reduce el tiempo de extracción del cereal y mejora el
rendimiento de la enzima. El procedimiento es sencillo de realizar y
es particularmente adecuado para procesar el cereal descascarillado,
facilitando además la purificación de la enzima.
El procedimiento para extraer
\beta-amilasa según la invención se caracteriza
por la extracción del cereal en presencia de celulasa en un medio
acuoso para obtener un extracto que contiene amilasa. La invención
se refiere además a la utilización de celulasa en la extracción de
\beta-amilasa desde el cereal.
La celulasa se utiliza, por ejemplo, en la
producción de almidón a partir del cereal molido para reducir la
viscosidad de la suspensión espesa y para separar el almidón de la
proteína. Se ha encontrado sorprendentemente ahora que la adición de
celulasa al agua de extracción de \beta-amilasa
mejora el rendimiento de \beta-amilasa y permite
la reducción del tiempo de extracción. Los modos de extracción
preferidos de la invención son los señalados en las reivindicaciones
adjuntas.
La Figura 1 muestra la influencia de la
temperatura sobre el rendimiento de \beta-amilasa
en función del tiempo.
El procedimiento de la invención es aplicable a
la extracción de diferentes cereales que contienen
\beta-amilasa, por ejemplo al procesado de trigo,
cebada, centeno y soja. Se prefiere emplearla para la extracción de
\beta-amilasa de trigo y de centeno y en
particular la de cebada. Se emplea preferiblemente para extraer la
\beta-amilasa de trigo y de centeno, y en
particular de cebada. Los granos sin germinar no contienen
cantidades significativas de enzimas distintas a
\beta-amilasa, por cuya razón es útil extraer
\beta-amilasa de tales granos. La enzima se puede
extraer de granos sin descascarillar pero es preferible su
extracción de granos descascarillados, molidos o descortezados. Es
recomendable descascarillar el centeno y la cebada. Los mejores
resultados se alcanzan por extracción de granos de cebada
descascarillados.
Para evitar el acceso del almidón de la
endosperma del grano al extracto, el descascarillado se lleva a
cabo de manera que no se rompa el grano vivo presente. Sin embargo,
la cáscara presente se ha de separar lo más cuidadosamente posible.
La razón de esto es que la cáscara es tan densa que impide la
penetración de \beta-amilasa. Cebada
descascarillada significa, por tanto, que al grano de cebada que se
le ha quitado la cáscara presente se le ha dejado la endosperma
intacta. En la práctica esto significa que, como máximo, se separa
por descascarillado aproximadamente un 20 del peso de un grano sin
descascarillar. Normalmente se separa 10 a 20% como material de
salvado. En este caso las capas más externas (pericarpio, testa y
capa de aleurona) de la endosperma funcionan como una especie de
ultrafiltro que evita el acceso de substancias insolubles y
substancialmente también el de substancias solubles al agua de
extracción. El extracto obtenido de los granos procesados por este
método es relativamente puro, lo que facilita el posterior
procesado, tal como purificación y concentración de la enzima. En
los posteriores tratamientos se pueden emplear procesos conocidos
generalmente en la industria de las enzimas, tales como filtración a
presión y ultrafiltración.
El cereal se extrae en un medio acuoso, tal como
agua, o es posible hacerlo en una solución tampón. Durante la
extracción, el pH está normalmente entre 6,0 y 6,5. La extracción se
lleva a cabo preferiblemente en condiciones reductoras. Se utiliza
la actividad reductora suficiente para liberar la
\beta-amilasa unida a la proteína estructural del
grano. Las condiciones reductoras se establecen de la manera ya
conocida, en la práctica frecuentemente con SO_{2} por ejemplo por
adición de metabisulfito de sodio y/o solución de sulfito de sodio.
La relación de granos descascarillados al medio acuoso está
preferiblemente entre 5.8 y 2:3 (peso/volumen). El procedimiento de
la invención es adecuado para procesos a escala industrial donde la
extracción se lleva a cabo en un silo de acero al que, por ejemplo,
se añaden 19 toneladas de cebada descascarillada y 29 m^{3} de
agua que contiene 0,5% de metabisulfito de sodio y 0,5% de sulfito
de sodio.
Por extracción de la cebada de la manera antes
descrita, se puede obtener un rendimiento de extracción que incluye
aproximadamente 45 a 50% del contenido total de
\beta-amilasa de la cebada sin separación del agua
que permanece dentro del grano. En este caso, el tiempo de
extracción es de aproximadamente 72 horas. Cuando la celulasa se
añade al agua de extracción, se puede extraer una cantidad tan alta
como 65% de la cantidad total de \beta-amilasa del
cereal mientras que el tiempo de extracción se reduce a
aproximadamente 60 horas.
La celulosa es un polisacárido lineal de glucosa
cuyas unidades de glucosa están unidas por enlaces
\beta-1,4-glucosido. Se encuentra
en paredes celulares de plantas donde está presente frecuentemente
junto con lignina y hemicelulosa. Las enzimas que participan en
reacciones de descomposición de celulosa se conocen como celulasas.
Las celulasas se emplean industrialmente por ejemplo en la
producción de almidón, procesado de pasta de papel, procesado de
textiles, degradación de \beta-glucano en la
industria cervecera y para mejorar la calidad de harinas en
panadería. En el procedimiento según la presente invención, la
celulasa rompe las estructuras de superficie bajo la cáscara de un
grano vivo.
Los productos de celulasa comerciales derivan de
bacterias tales como las del género Bacillus, o de hongos,
tales como levaduras (por ejemplo Saccharomices) o mohos. Se
han aislado grandes cantidades de celulasas a partir de hongos de
mohos, en particular. Los mohos de producción de celulasa más
comúnmente utilizados pertenecen al género Humicola, Fusarium,
Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium y Trichoderma. Algunas
de las cepas de producción han sido modificadas genéticamente. En la
presente invención se emplea preferiblemente celulasa derivada de
hongos de mohos, en particular de mohos Trichoderma.
Las preparaciones comerciales de enzimas
contienen varias actividades de enzima y sus cantidades y
relaciones pueden variar ligeramente de un fabricante a otro. Es
esencial para la invención que el producto contenga al menos
actividades de celulasa, hemicelulasa y
\beta-glucanasa. En otras palabras, en este
contexto, celulasa se refiere a una preparación de enzima que
descompone al menos celulosa, hemicelulosa y
\beta-glucano. Todos los productos comerciales de
celulasa ensayados por los solicitantes (producidos por Genencor
International, Röhm Enzymer GmbH y Novo Nordisk) mejoraban el
rendimiento de \beta-amilasa. Las actividades de
celulasa, hemicelulasa y \beta-glucanasa están
descritas por ejemplo en Novo's Handbook de Practical Biotechnology,
1986.
Las celulasas se pueden dividir por ejemplo en
endocelulasas, exocelulasas, exocelobiohidrolasas y celobiasas. Las
endocelulasas, es decir
1,4-\betaD-glucano
glucanohidrolasas, escinden al azar enlaces
\beta-1,4 de celulosa dentro de la molécula y
forman oligosacáridos. Las exocelulasas, es decir,
1,4-\beta-D-glucano
glucohidrolasas escinden los enlaces \beta-1,4 en
el extremo de la molécula liberando glucosa. Su efecto sobre la
celobiosa es lento. Las exocelobiohidrolasas, es decir
1,4-\beta-D-glucan
celobiohidrolasas, escinden los enlaces antes mencionados en el
extremo no reductor de la molécula, formando celobiosa, y las
celobiasas, es decir
\beta-D-glucosido glucohidrolasas,
escinden la celobiosa en glucosa. La hidrólisis de celulosa en
glucosa requiere endoglucanasa
(1,4-\beta-D-glucanohidrolasa,
EC 3.2.1.4) que escinde el interior de la molécula y también
substratos sustituidos, pero no degradan la celulosa cristalizada,
celobiohidrolasa
(1,4-\beta-D-glucan
celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91), que escinde la celulosa
cristalizada, y \beta-glucosidasa
(\beta-D-glucosido glucohidrolasa,
EC 3.2.1.21), que es una celobiasa que escinde celobiosa y
celo-oligosacáridos en glucosa.
Un grupo de enzimas que rompe la hemicelulosa,
es decir, polisacáridos que se encuentran en la naturaleza y
contienen pentosas, por ejemplo arabinanos, galactanos, mananos y
xilanos, son las llamadas hemicelulasas Las
\beta-glucanasas rompen los
\beta-D-glucanos, es decir
polímeros de glucosa que pueden estar ramificados y contienen ambos
enlaces el \beta-1,3 y el
\beta-1,4. El \beta-glucano se
encuentra por ejemplo en las paredes celulares de las células de la
endosperma en granos. La lichenasa es una
endo-\beta-glucanasa
(1,3.1,4-\beta-D-glucan-4-glucanohidrolasa)
que escinde los enlaces \beta-1,4 de
\beta-glucano que contiene enlaces
\beta-1,3 y \beta-1,4. La
laminarinasa
(1,3-\beta-D-glucan-3-glucanohidrolasa)
escinde \beta-glucano que contiene solamente
enlaces \beta-1,3, tales como los enlaces
\beta-1,3 de hidratos de carbono del tipo de
laminarina, y la exoglucanasa
(1,3-\beta-D-glucano
glucohidrolasa) escinde enlaces \beta-1,3 de
\beta-1,3-glucanos, formando
principalmente glucosa.
En la extracción de
\beta-amilasa se han alcanzado resultados
prometedores por ejemplo con preparaciones de celulasa Spezyme CE y
GC 440 producidas por Genencor International. La última mencionada
deriva de una cepa de Trichoderma longibrachiatum
genéticamente modificada que rompe la celulosa, hemicelulosa y
\beta-glucano con particular eficacia. Su
actividad se expresa como efecto sobre carboximetilcelulosa
(RBB-CMC), en cuyo caso la actividad de
RBB-CMC es de al menos 1400 UI/g. Además de la
actividad de celulasa, la preparación GC 440 tiene actividad de
\beta-glucanasa,
\beta-glucosidasa,
\beta-xilosidasa, xilanasa y acetilesterasa. Una
partida típica de GC 440 contiene como media aproximadamente 7000 a
9000 U/ml de DNS/CMC, aproximadamente 6000 a 8000 U/ml de
\beta-glucanasa, aproximadamente 80 a 90 U/ml de
\beta-glucosidasa, aproximadamente 500 a 600
nkat/ml de \beta-xilosidasa, aproximadamente 1700
a 2000 nkat/ml de acetilesterasa, aproximadamente 700 a 1400 U/ml de
RBB xilanasa y aproximadamente 1900 a 2100 U/ml de DNS xilanasa. Se
han alcanzado muy buenos resultados utilizando celulasa producida
por Röhm Enzyme GmbH, que se vende bajo el nombre de marca
Rohalase®Sep. La preparación deriva de una cepa de Trichoderma
reesei y contiene cantidades considerables de actividad
\beta-1,4-endoglucanasa (al menos
4700 UC/g) y xilanasa (al menos 3000 XylH/g), y cantidades más
pequeñas de actividad de celobiohidrolasa. También se incluye
actividad de \beta-1,3-glucanasa,
es decir laminarinasa. Cuando se utilizan preparaciones de enzima
antes mencionadas, la cantidad adecuada de celulasa es de al menos
0,015%, preferiblemente de al menos 0,020%, por ejemplo 0,018 a
0,040 y particularmente 0,024 a 0,030% del peso del cereal.
La \beta-amilasa se puede
extraer en la presencia de celulasa a una temperatura de 20 a 45°C.
La temperatura es preferiblemente 25 a 32°C, por ejemplo, 29 a 31°C.
El tiempo de extracción puede ser de 30 a 72 horas, normalmente al
menos 48 horas, por ejemplo 48 a 66 horas y en particular 55 a 62
horas. Un tiempo de extracción adecuado a 30°C es aproximadamente 60
horas. Una vez completada la extracción, los granos, sémolas o
harinas se separan del agua de extracción utilizando por ejemplo un
tamiz y la \beta-amilasa es recuperada desde el
agua de extracción, purificándose y/o concentrándose si se
desea.
Después de la extracción, el cereal en el que se
ha hecho la extracción y separación se puede utilizar para producir
almidón, por ejemplo. Según la presente invención, se extrae la
\beta-amilasa y el extracto se separa del cereal
antes de fraccionar y separar el almidón del cereal. Si la enzima ha
sido extraída de granos sin romper, los granos en que se ha hecho la
extracción se muelen primero, después de lo cual se lleva a cabo el
proceso de producción de almidón de la manera en sí conocida, es
decir, los granos molidos se mezclan con agua y el cereal se
fracciona utilizando tamizado y fuerza centrífuga. Durante el
molido, se añade habitualmente la celulasa junto con
\beta-glucanasa para reducir la viscosidad y
separar el almidón de la proteína.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
sin que la limiten a los modos de realización descritos en
ellos.
Antes de la determinación de la cantidad total
de \beta-amilasa del cereal, se separó cualquier
cáscara del cereal que se iba a analizar, se molió cuando estaba
seco hasta obtener harina fina y se colocaron 10 g de ésta en un
matraz erlenmeyer de 100 ml. Se añadieron 100 ml de solución de
sulfito de sodio al 0,5% (peso/volumen) y se mezclaron las
substancias apropiadamente. Se dejó reposar la mezcla en el matraz
durante 24 horas y se agitó sacudiéndola de vez en cuando. Después
se mezcló apropiadamente y se filtró a través de papel de filtro
fino (MN 640 W). El filtrado se diluyó a una relación de 1:50 con
agua destilada y se determinó la actividad por el método descrito
abajo. Este ensayo de enzima se utilizó también como tal para
determinar el contenido de \beta-amilasa de
soluciones de extracción en los ejemplos que se describen
después.
En primer lugar, se determinó la
\beta-amilasa como se describe en Food Chemical
Codex IV, General Test and Apparatus, 485.
Una unidad DP (fuerza diastática) se define aquí
como la cantidad de enzima en 0,1 ml de una dilución de muestra al
0,5% que produce una cantidad de azúcares reductores suficiente para
la reducción de 5 ml de solución de Fehling de 100 ml de substrato a
20°C en 1 hora. (El método de determinación no corresponde a la
definición de DP).
La actividad de enzima se determinó por
hidrólisis de almidón a 20°C, pH 4,6, durante 30 minutos. Los
azúcares reductores resultantes se determinaron por volumetría con
ferricianuro alcalino. Para producir un substrato de almidón, se
mezclaron 20 g (substancia seca) de almidón (Baker 1130) con
aproximadamente 50 ml de agua. Aproximadamente se añadieron 500 ml
de agua a ebullición y la mezcla se hirvió durante exactamente 2
minutos. Se añadieron 20 ml de tampón acetato (0,5 M, pH 4,6) a la
solución de almidón enfriada y se diluyó con agua destilada hasta 1
litro. Se pasaron con pipeta 200 ml de substrato de almidón templado
a 20°C a un matraz volumétrico de 250 ml, se añadieron 10 ml de
muestra de enzima diluida y se mezclaron bien las substancias. La
mezcla se incubó durante exactamente 30 minutos en baño maría a 20°C
y se añadieron 20 ml de NaOH 0,5 N. Las substancias se mezclaron
bien y se diluyeron a 250 ml. Se pasaron con la pipeta 10 ml de
dilución de enzima y 20 ml de NaOH 0,5 N a un matraz volumétrico de
250 ml para una muestra-0. Se mezclaron las
substancias bien y se añadieron 200 ml de substrato de almidón y se
diluyeron a 250 ml.
El reactivo ferricianuro 0,05 N se preparó por
disolución de 16,5 g de ferricianuro de potasio
(K_{3}Fe(CN)_{6}) y 22 g de carbonato de sodio
(Na_{2}CO_{3}) en agua y diluyendo hasta 1 litro. Se preparó una
solución A-P-Z por disolución de 70
g de cloruro de potasio (KCl) y 20 g de sulfato de zinc (ZnSO_{4}
x 7H_{2}O) en 700 ml de agua destilada, por adición de 200 ml de
ácido acético concentrado y por dilución a un litro. Se preparó una
solución de yoduro de potasio por disolución de 50 g de yoduro de
potasio (KI) en 100 ml de agua destilada y por adición de 2 gotas de
hidróxido de sodio (NaOH) al 50%. Se pasaron con la pipeta 10 ml de
reactivo ferricianuro y 5 ml de muestra a un matraz volumétrico de
250 ml. Se mezcló bien todo y se calentó en un baño maría a
ebullición durante exactamente 20 minutos. La solución se enfrió y
se añadieron 25 ml de reactivo A-P-Z
y 1 ml de solución de KI. La mezcla se valoró con solución de
sulfato de sodio 0,05 N hasta que desapareció el color azul (azul
oscuro \rightarrow blanco)
La actividad de \beta-amilasa
se calcula con la fórmula
actividad =
\frac{(V0 - V1)\ x\ 23\ x\ K}{100}\
DP^{o}/ml
donde:
V0 = consumo por muestra-0 en la
valoración (ml)
V1 = consumo por muestra en la valoración
(ml)
K = factor de dilución
Se estudió el efecto de celulasa sobre el tiempo
de extracción de \beta-amilasa. Se extrajo la
\beta-amilasa de cebada sin celulasa y con
celulasa. Se extrajeron 10 kg de cebada descascarillada con máquina
de descascarillar en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de
sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. Además, se añadió celulasa
GC440 producida por Genencor a la segunda partida, la cantidad de
celulasa correspondiente a 0,029% del peso de cebada
descascarillada. La extracción se llevó a cabo a 30°C. La actividad
del grano utilizado en la extracción era de 155 DP°/g, que se
determinó según el ejemplo 1. Los resultados se muestran en las
tablas 1 y 2.
| Tiempo, horas | Actividad de \beta-amilasa en DP°/ml de solución de extracción |
| 10 | 20 |
| 24 | 47 |
| 30 | 55 |
| 48 | 83 |
| 60 | 92 |
| 66 | 98 |
| 72 | 102 |
| 96 | 86 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo, horas | Actividad de \beta-amilasa en DP°/ml de solución de extracción |
| 10 | 23 |
| 24 | 55 |
| 30 | 70 |
| 48 | 92 |
| 60 | 104 |
| 66 | 104 |
| 72 | 100 |
| 96 | 90 |
Los resultados muestran que la adición de
celulasa al agua de extracción reduce el tiempo de extracción de
\beta-amilasa.
Se estudió el efecto de celulasa sobre el
rendimiento de extracción. Se extrajeron 10 kg de cebada
descascarillada con una actividad de \beta-amilasa
de 155 DP°/g en 15 litros de agua que contenía metabisulfito de
sodio al 0,5% y sulfito de sodio al 0,5%. La extracción se llevó a
cabo a 30°C sin celulasa o en presencia de celulasa.
El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72
horas. La actividad total de la cantidad de cebada utilizada fue de
1550 kDP°. Se obtuvieron 8175 ml de extracto con una actividad de 95
DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total
del extracto obtenido fue así de 776,6 kDP° y el rendimiento de
extracto 50,1%.
Se llevó a cabo la correspondiente extracción en
presencia de celulasa por adición de una cantidad de GC440
correspondiente al 0,025% del peso e la cebada descascarillada. El
tiempo de extracción fue de 60 horas. La actividad total de la
cantidad de cebada utilizada fue de 1550 kDP°. Se obtuvieron 9825 ml
del extracto con una actividad de 102 DP°/ml por separación del
extracto con tamiz. La actividad total del extracto obtenido fue así
de 1002,2 kDP° y el rendimiento de extracto de 64,7%.
Los resultados muestran que la adición de
celulasa al agua de extracción aumenta considerablemente el
rendimiento de \beta-amilasa.
Se estudió el efecto de la temperatura sobre la
extracción de \beta-amilasa. La cebada
descascarillada se extrajo de la manera descrita en los ejemplos
precedentes en la presencia de celulasa a diferentes temperaturas.
La dosis de celulasa GC440 correspondía a 0,027% del peso de la
cebada descascarillada y la temperatura de extracción fue de 20°C,
25°C, 30°C ó 40°C. Los resultados se muestran en la Figura 1. Los
mejores resultados se alcanzaron a 30°C.
Se estudió el efecto de celulasa sobre el
rendimiento de \beta-amilasa de trigo. Se
extrajeron 10 kg de trigo molido con una actividad de
\beta-amilasa de 128 DP°/g en 15 litros de agua
que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito de sodio al
0,5%. La extracción se llevó a cabo a 30°C ya sea sin celulasa o el
presencia de celulasa.
El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72
horas. La actividad total de la cantidad de trigo empleada fue de
1280 kDP°. Se obtuvieron 9175 ml de extracto con una actividad de 55
DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad total
del extracto obtenido era así de 504,6 kDP° y el rendimiento del
extracto 39,4%.
Se llevó a cabo la extracción correspondiente en
la presencia de celulasa por adición de una cantidad de celulasa
GC440 correspondiente a 0,036% del peso de las sémolas al trigo
molido. El tiempo de extracción fue de 60 horas. La actividad total
de la cantidad de trigo utilizada fue de 1280 kDP°. Se obtuvieron
10080 ml de extracto con una actividad de 72 DP°/ml por separación
del extracto con un tamiz. La actividad total de extracto obtenido
era así de 725,8 kDP° y el rendimiento del extracto 56,7%.
Los resultados muestran que la adición de
celulasa al agua de extracción aumenta considerablemente el
rendimiento en \beta-amilasa.
Se estudió el efecto de celulasa sobre el
rendimiento de \beta-amilasa de trigo
descortezado. El trigo se descortezó con máquina de descortezar
arroz por rotura de la superficie y separación de la parte más
externa, es decir, la mayor parte del pericarpio fué separado y la
testa ligeramente rota. Se extrajeron 10 kg de trigo descortezado
con actividad de \beta-amilasa de 128 DP°/g en 15
litros de agua que contenía metabisulfito de sodio al 0,5% y sulfito
de sodio al 0,5%. La extracción se llevó a cabo a 30°C sin celulasa
o en la presencia de celulasa.
El tiempo de extracción sin celulasa fue de 72
horas. La actividad total de la cantidad de trigo utilizada fue de
1280 kDP°/ml. Se obtuvieron 9780 ml del extracto con una actividad
de 15 DP°/ml por separación del extracto con un tamiz. La actividad
total del extracto obtenido era así 146,7 kDP° y el rendimiento del
extracto 11,5%.
Se llevó a cabo la correspondiente extracción en
la presencia de celulasa por adición de una cantidad de celulasa GC
440 que correspondía a 0,036% del peso del trigo descortezado a
trigo molido. El tiempo de extracción fue de 60 h. La actividad
total de la cantidad de trigo utilizada fue de 1280 kDP°. Se
obtuvieron 9250 ml de extracto con una actividad de 35 DP°/ml por
separación del extracto con un tamiz. La actividad total del
extracto obtenido era así 323,8 kDP° y el rendimiento del extracto
25,3%.
Los resultados mostraban que la adición de
celulasa al agua de extracción incrementaba considerablemente el
rendimiento de \beta-amilasa.
Claims (16)
1. Un procedimiento para la extracción de
\beta-amilasa desde cereal, caracterizado
porque el cereal se extrae con un medio acuoso en la presencia de
una preparación de enzima que comprende actividades de celulasa,
hemicelulasa y \beta-glucanasa para obtener un
extracto que contiene \beta-amilasa, seguido de
recuperación de la citada \beta-amilasa desde
dicho medio.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la \beta-amilasa se
extrae de cebada, trigo o centeno.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la \beta-amilasa se
extrae de cebada descascarillada.
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la \beta-amilasa se
extrae de los granos de cereal que han sido tratados por un proceso
seleccionado entre descascarillado, molido, triturado y
descortezado.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la extracción se
lleva a cabo en condiciones reductoras.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque las citadas condiciones reductoras se
adaptan a la provisión de actividad reductora capaz de liberar la
\beta-amilasa unida a una proteína estructural del
grano.
7. El procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque las citadas condiciones reductoras se
proporcionan por agua que contiene SO_{2}.
8. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cebada descortezada se extrae con
agua que contiene SO_{2} en una relación de 5:8 a 2:3, cebada
descascarillada:agua que contiene SO_{2}.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
extracción se lleva acabo a una temperatura de 25 a 33°C,
preferiblemente de 29 a 31°C.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tiempo
de extracción es 48 a 66 horas, preferiblemente 55 a 62 horas.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes caracterizado porque la celulasa
utilizada es celulasa de moho.
12. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza
la celulasa del moho Trichoderma.
13. El procedimiento según las reivindicaciones
1-11 caracterizado porque la celulasa
comprende celulasa de los géneros seleccionados entre Humicola,
Fusarium, Myceliophthora, Aspergillus, Penicillium y
Trichoderma.
14. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque la \beta-amilasa se
extrae de granos molidos.
15. El procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque la citada
\beta-amilasa recuperada se trata por purificación
y/o concentración.
16. Utilización de la preparación de enzimas que
comprende actividades de celulasa, hemicelulasa y
\beta-glucanasa en la extracción de
\beta-amilasa de cereal.
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