CZ303447B6

CZ303447B6 - Zpusob extrakce beta-amylasy

Info

Publication number: CZ303447B6
Application number: CZ20032036A
Authority: CZ
Inventors: Kekki@Pekka
Original assignee: Danisco Sugar Oy
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2012-09-19
Also published as: ZA200305605B; US20040067570A1; WO2002062980A1; DK1363999T3; AR035221A1; CN1228444C; AU783947B2; RU2003127065A; KR20020065361A; CY1107469T1; KR100483501B1; EE05410B1; JP2004520830A; DE60210586T2; ES2261644T3; NZ527055A; FI109358B; UA75632C2; PT1363999E; ATE323155T1

Abstract

Zpusob extrakce .beta.-amylasy z obilniny za prítomnosti celulasy, hemicelulasy a beta-glukanasy ve vodném médiu za vzniku extraktu, který obsahuje beta-amylasu. Použití celulasy, hemicelulasy a beta-glukanasy pri extrakci .beta.-amylasy z obilniny.

Description

Způsob extrakce beta-amylasy

Oblast techniky

Přihláška se týká enzymové technologie. Přesněji, vynález se týká způsobu extrakce β-amylasy z obilnin a použití enzymu při zmíněné extrakci.

io Dosavadní stav techniky β-amylasa je enzym odbourávající škrob, tento enzym hydrolyzuje alfa-1,4 vazby. Nachází se např. u baktérií a rostlin a štěpí škrob na neredukujícím konci škrobového řetězce především na maltosu, β-amylasa je hojná např. v zrnech, kde v případě potřeby přeměňuje nutriční zásoby obilek, tj, škrob, na cukr. U obilnin je škrob převážně uložen ve formě amylasy a amylopektinu. β-amylasa přeměňuje veškerou amylosu na maltosu, zatímco amylopektin přeměňuje z 60 % na maltosu a zbytek na dextrin.

β-amylasa je komerčně významný enzym, který se používá např. ve škrobovém průmyslu pro výrobu maltosy. Výrobky obsahující velké množství maltosy se používají např. pro výrobu cukrovinek a v potravinářském průmyslu, β-amylasa byla vyizolována z baktérií i z rostlin. Například byla získána z baktérií rodu Bacillus (US 4 970 158 a JP 60 126 080) a z termostabilní baktérie rodu Clostridium (US 4 647 538), β-amylasy získané z bakterií navíc kromě maltosy také produkují značná množství maltotriosy, zatímco rostlinné β-amylasy produkují relativně více maltosy a jsou proto vhodnější pro procesy, jejichž cílem je získat co nej sladší a/nebo co nejvhodnější produkty pro fermentací. Kromě toho je výroba β-amylasy z baktérií ve velké množství obtížná, β-amylasa používaná v průmyslu je získávána z rostlin, obvykle z obilnin, zejména z ječmene nebo pšenice, ale jako zdroje enzymu se také používají sójové boby.

Během růstu se β-amylasa vytváří v zrnech, kde je skladována. Zrno se skládá ze zárodku a z endospermu obsahujícího škrob, tj. jádra, obě části jsou od sebe vzájemně odděleny štítkem. Endosperm je obklopen aleuronovou (lepkavou) vrstvou a celé zrno je obaleno oplodím, osemením a vlastní slupkou. Pšenice nemá řádnou slupku, ale oplodí a o semení tvoří tvrdý vnější obal. β-amylasa se především hromadí v endospermu a štítku. Největší množství β-amylasy se nachá35 zí v nejvíce vně umístěných částech endospermu bezprostředně pod aleuronovou vrstvou.

Ječmenná β-amylasa byla důkladně studována. Tato β-amylasa a její výroba jsou popsány např. v následujících publikacích: D. E. Briggs, Barley, Chapman & Halí, London, 1978; Cook, Barley and Malt, Academie Press, London, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Science, Academie Press,

London, 1979. Systematický název enzymu je 1,4-alfa-D-glukanmaltohydrolasa (EC 3,2.1.2). V minulosti byla β-amylasa separována z obilnin nejprve drcením nebo mletím zrn a potom byla extrahována vodou nebo pufrem. Purifikace enzymu z extraktu tohoto druhu je přirozeně náročná a pracná, neboť kromě samotného enzymu obsahuje extrakt několik dalších rozpustných složek obsažených v zrnu. Byly učiněny pokusy pro zlepšení separace β-amylasy z jí obsahujícího roz45 toku, např. adsorpcí enzymu na polymer za přítomnost síranu amonného (US 5 294 341). Pro uvolnění β-amylasy z lepku byla zkoušena proteasa (JP 63 079 590).

β-amylasa byla také izolována z kapalných odpadů z produkce pšeničného škrobu přidáním alginátu sodného a zpětným získáním sraženého enzymu (JP 60 027 383) nebo vytvořením gelu z fosfátu vápenatého, na který se enzym adsorbuje a ze kterého je následně znovu získán (JP 63 248 389). Kapalné odpady z produkce škrobu nejsou dobrým zdrojem β-amylasy, protože jsou velmi ředěné a obsahují velká množství dalších látek, které činí purifikaci a koncentraci obtížnými a díky tomu je výtěžek nízký.

-1 CZ 303447 B6

Aby se získal čistší hrubý extrakt a aby se předešlo obtížím při následném zpracování, bylo navrženo, aby byla β-amylasa extrahována ze zrn zcela nebo částečně oloupaných. Jestliže jsou např. zrna ječmene vyloupána takovým způsobem, že jejich endosperm není narušen, pak fungují nejpovrchnější vrstvy endospermu jako jakýsi druh filtru, který zabraňuje průniku nerozpustných látek do máčecí vody a omezuje průnik rozpustných látek. Je upřednostňována extrakce prováděná za přítomnosti redukující látky, která uvolňuje β-amylasu z dalších proteinů zrna (FI 61 516 a ZS 4 675 296).

US patent 4 675 269 popisuje způsob přípravy obchodovatelného výrobku β-amylasy ze zrn ječmene, která jsou úplně nebo alespoň částečně zbavená slupek, přičemž zrna jsou podrobena extrakce vodou.

US 3 492 203 popisuje získání β-amylasy extrakcí pšeničných otrub vodou.

Žádný z uvedených dokumentů (US patent 4 675 269 a US patent 3 492 203) nepopisuje ani nenavrhuje použití enzymatického uvolňování β-amylasy.

Nyní byl vynalezen způsob extrakce β-amylasy z obilnin, který zkracuje dobu extrakce a zvyšuje výtěžek enzymu. Postup je jednoduchý a je obzvláště výhodný pro zpracování loupaných obilnin, což také usnadňuje další purifikaci enzymu.

Podstata vynálezu

Krátký popis vynálezu

Způsob extrakce β-amylasy podle tohoto vynálezu je charakterizován extrakcí obilnin za přítomnosti celulasy ve vodném roztoku, aby byl získán extrakt obsahující β-amylasu. Vynález se dále týká použití celulasy pro extrakci β-amylasy z obilnin.

Celulasa je používána např. pro produkci škrobu z mletých obilnin, aby se snížila vískozita suspenze a oddělil škrob od proteinu. Nyní bylo překvapivě zjištěno, že přidání celu losy do extrakční vody zvyšuje výtěžek β-amylasy a umožňuje zkrácení extrakční doby. Výhodná provedení vynálezu jsou připojena v závislých patentových nárocích.

Krátký popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje vliv teploty na výtěžek β-amylasy jako funkci času.

Detailní popis vynálezu

Způsob podle tohoto vynálezu je použitelný pro extrakci různých obilnin obsahujících β-amylasu, např. po zpracování pšenice, ječmene, rýže a sóji. Je s výhodou použit pro extrakci β-amylasy z pšenice a rýže a obzvláště z ječmene. Nenaklíčená zrna neobsahují významná množství jiných enzymů kromě β-amylasy, z tohoto důvodu je výhodné extrahovat β-amylasu z takovýchto zrn. Enzym může být extrahován z nevyloupaných zrn, ale s výhodou je extrahován z oloupaných, mletých, drcených nebo omletých zrn. Je doporučeno rýži a ječmen vyloupat. Nejlepších výsledků je dosaženo extrakcí vyloupaných zrn ječmene.

Aby se zabránilo průniku škrobu z endospermu zrna do extraktu, musí být vyloupání provedeno tak, aby nedošlo k porušení vlastního Živého zrna. Vlastní slupka však musí být odstraněna co nej peč li věj i. Důvodem, je, že slupka je natolik hustá, že brání průniku β—amylasy. Vyloupaný

-2CZ 303447 B6 ječmen proto znamená ječmen, ze kterého byla odstraněna slupka zrna, ale jeho endosperm zůstal neporušen. V praxi to znamená, že nanejvýš zhruba 20 % hmotnosti nevyloupaného zrna je odstraněno loupáním. Obvykle je odstraněno 10 až 20 % hmotnosti jako slupka. V tomto případě fungují nejvíce vně umístěné vrstvy endospermu (oplodí, osemení a aleuronová vrstva), jako jakýsi druh ultrafíltru, který zabraňuje průniku nerozpustných látek a významně také průniku rozpustných látek do extrakční vody. Extrakt získaný ze zrn zpracovaných tímto způsobem je relativně čistý, což usnadňuje další zpracování, jako je purifikace a koncentraci enzymu. Pro další zpracování mohou být použity postupy obecně známé v enzymovém průmyslu, jako je tlaková filtrace a ultrafiltrace.

Obilnina je extrahována ve vodném médiu, jako je voda nebo případně roztok pufru. Během extrakce se pH obvykle pohybuje mezi 6,0 a 6,5. Extrakce je s výhodou prováděna za redukujících podmínek. Je používána taková redukující aktivita, aby se uvolnila β-amylasa navázaná na strukturální protein zrna. Redukující podmínky jsou nastaveny známým způsobem, v praxi je často používán SO₂, např. přidáním pyrosiričitanu sodného a/nebo siřičitanu sodného. Poměr vyloupaných zrn ku vodnému médiu je s výhodou mezi 5 : 8 a 2 : 3 (hmotnost/objem). Způsob podle vynálezu je vhodný pro výroby průmyslového rozsahu, kdy je extrakce prováděna v ocelovém silu, do kterého byly např. přidány 19 tun vyloupaného ječmene a 29 m³ vody obsahující 0,5 % pyrosiričitanu sodného a 0,5 % siřičitanu sodného.

Extrakcí ječmene metodou popsanou výše bez oddělování vody, která zůstává uvnitř zrn, může být získáno 45 až 50 % β-amylasy celkem přítomné v ječmeni. V tomto případě je extrakční doba 72 h. Pokud se extrakční vody přidá celu lasa, může být extrahováno až 65 % celkového množství β-amylasy z obilniny při zkrácení extrakčního času na 60 h.

Celulosaje lineární glukosový polysacharid, jehož glukosové jednotky jsou spojeny β-1,4-glukosidovými vazbami. Nachází se v buněčných stěnách rostlin, kde je často přítomna spolu s ligninem a hemicelulosou. Enzymy, které se podílí na rozkladných reakcích celulosy, se nazývají celulasy. Celulasy jsou průmyslově používány např. při výrobě škrobu, zpracování papírové hmoty, zpracování textilií, degradaci β—gl ukanu v pivovarnictví a při zlepšování kvality mouky v pekárnách. Ve způsobu extrakce podle této přihlášky celulasy rozkládají povrchové struktury nacházející se pod slupkou živého zrna.

Komerčně dostupné celulasové přípravky jsou získávány buď z baktérií, jako je rod Bacillus, nebo z hub, jako jsou kvasinky (např. Saccharomyces) nebo z plísní. Velká množství celulas byla izolována zvláště z plísní. Nej častěji používané plísně produkující celu lasu patří do rodu Humicola, husar i um, Myceliopthoa, Aspergillus, Penicillium a Trichoderma. Některé produkční kmeny byly geneticky modifikovány. Tato přihláška výhodně využívá celulasu získanou z plísní, obzvláště z plísní Trichoderma.

Komerční enzymatické přípravky obsahují několik enzymatických aktivit a jejich množství a poměry se mohou mírně lišit mezi jednotlivými výrobci. Pro vynález je nezbytné, aby tento přípravek obsahoval přinejmenším celulasovou, hemicelulasovou a β-glukanasovou aktivitu. Jinými slovy, v tomto kontextu celulasa znamená enzymatický přípravek, který rozkládá přinejmenším celulosu, hemicelulosu a β-glukan. Všechny komerční celulasové přípravky testované přihlašovatelem (produkované firmami Genencor International, Rohm Enzyme GmbH a Novo Nordisk) zvýšily výtěžek β-amylasy. Celulasová, hemicelulasová a β-glukanasová aktivity jsou popsány např. v Novo's Handbook of Practical Biotechnology, 1986.

Celulasy mohou být rozděleny např. na endocelulasy, exocelulasy, exocelobiohydrolasy a celobiasy. Endocelulasy, tj. l,4-β-D-glukanglukanohydrolasy, náhodně štěpí β—1,4 vazby celulosy uvnitř molekuly a vytvářejí oligosacharidy. Exocelulasy, tj. l,4-β-[>~glukang1ukohydrolasy, štěpí β-1,4 vazby na konci molekuly za uvolňování glukosy. Jejich účinek na celobiosu je pomalý. Exocelobiohydrolasy, tj. 1,4-β-D-glukancelobiohydΓoIasy, štěpí výše zmíněné vazby na neredu-3CZ 303447 B6 kujícím konci molekuly za tvorby celobiosy. Celobiasy, tj. β-D-gIukosidglukohydrolasy, štěpí celobiosu na glukosu. Hydrolýza celulosy na glukosu vyžaduje endoglukanasu (1,4—β-Dglukanglukanohydrolasa, EC 3.2.1.4), která štěpí uvnitř molekuly a také substituované substráty, ale nedegraduje krystalickou celulosu; celobiohydrolasu (l,4-(3-D-glukancelobiohydrolasa, EC 3.2.1.91), která štěpí uvnitř krystalickou celulosu; a β-glukosidasu (β-D-glukosidglukohydrolasa, EC 3.2.1.21), což je celobiasa, který štěpí celobiosu a celulosové oligosacharidy na glukosu.

Skupina enzymů, které štěpí hemicelulasu, tj. póly sacharidy, které se nacházejí v přírodě a obsahují pentosy, např. arabinany, galaktany, manany a xylany, se nazývají herní celu lasy, β-glukanasy štěpí β-D-glukany, tj. glukosové polymery, které mohou být větvené a obsahují jak (3-1,3, tak β-1,4 vazby, β-glukan se nachází např. v buněčných stěnách endospermových buněk v zrnech. Lichenasa je endo-(3-glukanasa (1,3·l,4-J3-D-glukan^4-glukanhydrolasa), která štěpí β-1,4 vazby glukanu, který obsahuje β-1,3 a β-1,4 vazby. Laminarinasa (l,3-[3-D-glukan-3-glukanhydrolasa) štěpí β-glukan, který obsahuje pouze β-1,3 vazby, jako jsou β-1,3 vazby u sacharidů laminarinového typu. Exoglukanasa (l,3-β-D-glukanglukohydrolasa) štěpí β-1,3 vazby β-1,3glukanů a vytváří hlavně glukosu.

Při extrakci β-amylasy bylo dosaženo slibných výsledků např. s celulasovými přípravky Spezyme CE a GC 440, které vyrábí Genencor International. Posledně zmíněný přípravek je odvozen z geneticky modifikovaného kmene Trichoderma longibrachiatum a obzvláště účinně štěpí celulosu, hemicelulosu a β—glukan. Jeho aktivita je vyjádřena jako účinek na karboxymethylcelulosu (RBB-CMC), v kterémžto případě je RBB-CMC aktivita alespoň 1400 IU/g. Navíc kcelulasové aktivitě má GC 440 β-glukanosovou, β-glukosidasovou, β-xylosidasovou, xylanasovou a acetylesterasovou aktivitu. Typická šarže GC 440 obsahuje v průměru přibližně 7000 až 9000 U/ml DNS-CNC. přibližně 6000 až 8000 U/ml β-glukanasy, přibližně 80 až 90 U/ml β-glukosidasy, přibližně 500 až 600 nkat/ml β-xylosidasy, přibližně 1700 až 2000 nkat/ml acetylesterasy, přibližně 700 až 1400 U/ml RBB xylanasy a přibližně 1900 až 2100 U/ml DNS xylanasy. Velice dobrých výsledků bylo také dosaženo použitím celulasy vyráběné Rohm Enzyme GmbH, která je prodávána pod obchodním názvem Rohalase®Sep. Přípravek je odvozen z kmene Trichoderma reesei a obsahuje značné množství β-l,4-endog^ukanasové aktivity (nejméně 4700 CU/g) a xylanasy (nejméně 3000 XylH/g) a menší množství celobiohydrolasové aktivity. Také vykazuje (3-l,3-glukanasovou aktivitu, tj. laminarinasovou. Když jsou výše zmíněné enzymatické přípravky použily, vhodné množství celulasy je nejméně 0,015 %, s výhodou nejméně 0,020 %, např, 0,018 až 0,040 a zvláště pak 0,024 až 0,030 % hmotnosti obilniny.

β-amylasa může být extrahována za přítomnosti celulasy při teplotě od 20 do 45 °C, Teplota je s výhodou 25 až 32 °C, např. 29 až 31 °C. Extrakční doba může být 30 až 72 h, obvykle nejméně 48 h, např. 48 až 66 h a zvláště pak 55 až 62 h. Vodná extrakční doba při 30 °C je 60 h. Když je extrakce dokončena, zrna, kroupy nebo mouka jsou odděleny od extrakční vody použitím např. síta a β-amylasa je zpětně získána z extrakční vody, ze které je purifikována a/nebo v případě potřeby koncentrována.

Po extrakci mohou být obilniny, které byly extrahovány a separovány tímto způsobem, použity například pro výrobu škrobu. Podle této přihlášky je β-amylasa extrahována a extrakt je separován od obilniny před frakcionací škrobu a oddělen od obilniny. Pokud byl enzym extrahován z celých zrn, extrahovaná zrna jsou nejprve namleta, poté se provede proces výroby škrobu známým způsobem, tj. rozemletá zrna jsou smíchána s vodou a obilnina je frakcionována za použití prosívání a centr ifugační síly. Během mletí se obvykle přidávají celu lasa společně s β-glukanasou pro snížení viskozity a oddělení škrobu od proteinu.

Následující příklady ilustrují vynález bez omezení vzhledem k provedením zde popsaným.

-4 CZ 303447 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení β-amylasy

Před stanovením celkového množství β-amylasy z neloupané obilniny se zrní po usušení umele nájemnou mouku a 10 g mouky se odváží do 100 ml Ertenmeyerovy baňky. Přidá se 100 ml 0,5% (hmotnost/objem) roztoku siřičitanu sodného a látky se řádně promíchají. Směs se nechá stát v baňce 24 h za občasného míchání. Poté se směs řádně zamíchá a přefiltruje se přes tenký filtrační papír (MN 640 W). Filtrát se zředí v poměru 1 : 50 destilovanou vodou a metodou popsanou níže se stanoví aktivita. Tento enzymový test se také použije pro stanovení obsahu βamylasy v extrakčních roztocích v příkladech uvedených níže.

Principielně se β-amytasa stanoví tak, jak je popsáno v Food Chemical Codex IV, General Test and Apparatus, 485.

Jednotka DP (diastatická síla) je zde definována jako množství enzymu v 0,1 ml 5% ředění vzorku, které vyprodukuje ze 100 ml substrátu při 20 °C za 1 hodinu množství redukujících sacharidů dostatečné pro redukci 5 ml Fehlingova roztoku. (Metoda stanovení neodpovídá definici DP).

Enzymová aktivita se stanoví hydrolýzou škrobu při 20 °C, pH 4,6 po dobu 30 minut. Vzniklé redukující sacharidy se stanoví titračně alkalickým hexakyanoželezitanem. Pro přípravu škrobového substrátu se smíchá 20 g suchého škrobu (Baker 1130) s přibližně 50 ml vody. Přidá se přibližně 500 ml vroucí vody a směs se povaří přesně 2 minuty. Ke zchlazenému roztoku škrobu se přidá 20 ml octanového pufru (0,5 M, pH 4,6) a doředí se destilovanou vodou do 1 litru. Do 250 ml odměmé baňky se napipetuje 200 ml roztoku škrobu o teplotě 20 °C, přidá se 10 ml ředěného roztoku enzymu a vše se dobře promíchá. Vzorek se inkubuje přesně 30 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C a přidá se 20 ml 0,5 N NaOH. Látky se dobře promíchají a doředí do 250 ml. Do 250 ml odměmé baňky se vzorkem číslo nula se napipetuje 10 ml ředěného roztoku enzymu a 20 ml 0,5 N NaOH. Složky se dobře promíchají a přidá se 200 ml škrobového substrátu a vše se doředí do 250 ml.

Připraví se 0,05 N roztok hexakyanoželezitanu rozpuštěním 16,5 g hexakyanoželezitanu draselného (K₃Fe(CN)₆) a 22 g uhličitanu sodného (Na₂CO₃) ve vodě a objem se upraví na 1 litr. Připraví se roztok A-P-Z rozpuštěním 70 g chloridu draselného (KCl) a 20 g síranu zineěnatého (ZnSO₄ x 7 H₂O) v 700 ml destilované vody, přidá se 200 ml koncentrované kyseliny octové a doředí se do 1 litru. Roztok jodidu draselného se připraví rozpuštěním 50 g jodidu draselného (ΚΪ) ve 100 ml destilované vody a přidají se 2 kapky 50% hydroxidu sodného (NaOH). Do 250 ml odměmé baňky se napipetuje 10 ml roztoku hexakyanoželezitanu a 5 ml vzorku. Vše se dobře promíchá a hřeje ve vroucí vodní lázni přesně 20 minut. Roztok se schladí a přidá se 25 ml roztoku A-P-Z a 1 ml roztoku KI. Roztok se titruje 0,05 N roztokem síranu sodného, dokud nezmizí modré zabarvení (tmavě modrá —> bílá).

β-amylasová aktivita se spočítá podle vzorce (V0-Vl)x23xK kde aktivita =-------------------100

- DP°/ml

-5CZ 303447 B6

V0 = spotřeba při titraci vzorku 0 (ml) VI = spotřeba při titraci vzorku (ml)

K = faktor ředění

Příklad 2

Studie účinku celu lasy na extrakční dobu β-amylasy io β-amylasa se extrahuje z ječmene bez celulasy a s celulasou. 10 kg ječmene vyloupaného loupacím strojem se extrahuje v 15 litrech vody obsahující 0,5 % pyrosiričitanu sodného a 0,5 % siřičitanu sodného. Navíc se ke druhé skupině přidá celulasa GC440 vyráběná firmou Genencor v množství odpovídající, 0,029 % hmotnosti vyloupaného ječmene. Extrakce se provádí při 30 °C. Aktivita zrn použitých pro extrakci je 155 DP°/g, jak bylo stanoveno podle příkladu 1.

Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1 a 2.

Tabulka 1. Extrakce bez celulasy

Doba, h	β-amylasová aktivita v DP°/ml extrakčního roztoku
10	20
24	47
30	55
48	83
60	92
66	98
72	102
96	86

Tabulka 2. Extrakce s celulasou

Doba, h	β-amylasová aktivita v DP°/ml extrakčního roztoku
10	23
24	55
30	70
48	92
60	104
66	104
72	100
96	90

-6CZ 303447 B6

Výsledky ukazují, že přidání celulasy do extrakční vody zkracuje extrakční dobu β-amylasy.

Příklad 3

Studie účinku celulasy na extrakční výtěžek kg vyloupaného ječmene s β-amylasovou aktivitou 155 DP°/g se extrahuje v 15 litrech vody obsahující 0,5 % pyrosiřičitanu sodného a 0,5 % siří čítánu sodného. Extrakce se provádí při 30 °C jak bez celulasy, tak za přítomnosti celulasy.

Extrakční doba bez celulasy je 72 h. Celková aktivita použitého množství ječmene je 1550 kDP°. 8175 ml extraktu s aktivitou 95 ^ůDP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 776,6 kDP°/ml a extrakční výtěžek je 50,1 %.

Odpovídající extrakce se provede za přítomnosti celulasy přidáním množství GC440 odpovídajícího 0,025 % hmotnosti vyloupaného ječmene. Extrakční doba je 60 h. Celková aktivita použitého množství ječmene je 1550 kDP°. 9825 ml extraktu s aktivitou 102 °DP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 1002,2 kDP°/ml a extrakční výtěžek je 64,7%.

Výsledky ukazují, že přidání celulasy do extrakční vody značně zvyšuje výtěžek β-amylasy.

Příklad 4

Studie účinku teploty na extrakci β-amylasy

Vyloupaný ječmen se extrahuje způsobem popsaným v předcházejících příkladech za přítomnosti celulasy při různých teplotách. Množství celulasy GC440 odpovídá 0,027 % hmotnosti vyloupaného ječmene a extrakční teplota je 20 °C, 25 °C, 30 °C nebo 40 °C. Výsledky jsou ukázány na Obrázku 1. Nej lepších výsledků se dosáhne při 30 °C.

Příklad 5

Studie účinku celulasy na výtěžek β-amylasy z pšenice kg drcené pšenice s β-amylasovou aktivitou 128 DP°/g se extrahuje 15 1 vody obsahující 0,5 % pyrosiřičitanu sodného a 0,5 % siřičitanu sodného. Extrakce se provádí při 30 °C jak bez celulasy, tak za přítomnosti celulasy.

Extrakční doba bez celulasy je 72 h. Celková aktivita použitého množství pšenice je 1280 kDP°. 9175 ml extraktu s aktivitou 55 °DP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 504,6 kDP°/ml a extrakční výtěžek je 39,4 %.

Odpovídající extrakce se provede za přítomnosti celulasy přidáním množství GC440 odpovídajícího 0,036 % hmotnosti krup k drcené pšenici, Extrakční doba je 60 h. Celková aktivita použitého množství pšenice je 1280 kDP°. 10 080 ml extraktu s aktivitou 72 °DP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 725,8 kDP°/ml a extrakční výtěžek je 56,7 %.

-7CZ 303447 B6

Příklad 6

Studie účinku celulasy na výtěžek β—amylasy z omleté pšenice

Pšenice se omele pomocí stroje na omílání rýže tak, že se rozruší povrch a odstraní se nej svrchnější část, tj. odstraní se většina oplodí a mírně se naruší osemení. 10 kg omleté pšenice s βamylasovou aktivitou 128 DP°/g se extrahuje 15 1 vody obsahující 0,5 % pyrosiřičitanu sodného a 0,5 % siřícitanu sodného. Extrakce se provádí při 30 °C jak bez celulasy, tak za přítomnosti ío celulasy.

Extrakční doba bez celulasy je 72 h. Celková aktivita použitého množství pšenice je 1280 kDP°. 9780 ml extraktu s aktivitou 15 °DP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 146,7 kDP°/ml a extrakční výtěžek je 11,5 %.

Odpovídající extrakce se provede za přítomnosti celulasy přidáním množství GC440 odpovídajícího 0,036 % hmotnosti krup k drcené pšenici. Extrakční doba je 60 h. Celková aktivita použitého množství pšenice je 1280 kDP°. 9250 ml extraktu s aktivitou 35 °DP/ml se získá oddělením extraktu pomocí síta. Celková aktivita získaného extraktu je pak 323,8 kDP°/ml a extrakční výtě20 žek je 25,3 %.

Průmyslová využitelnost

Způsob extrakce β-amylasy podle tohoto vynálezu je použitelný pro extrakci různých obilnin obsahujících β-amylasu, např. pro zpracování pšenice, ječmene, rýže a sóji. Je s výhodou použit pro extrakci β-amylasy z pšenice a rýže a obzvláště z ječmene, β-amylasa je komerčně významný enzym, který se používá např. ve škrobovém průmyslu pro výrobu maltosy. Výrobky obsahující velké množství maltosy se používají např. pro výrobu cukrovinek a v potravinářském průmyslu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

40 1. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny, vyznačující se tím, že obilnina je extrahována za přítomnosti celulasy, hemicelulasy a beta-glukanasy ve vodném médiu, aby byl získán extrakt obsahující beta-amylasu, a poté následuje opětovné získání uvedené β-amylasy ze jmenovaného média.

45
2. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že βamylasa je extrahována z ječmene, pšenice nebo rýže.
3. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že βamylasa je extrahována z loupaného ječmene.
4. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že βamyfasa je extrahována ze zrn obilniny, která byla zpracována procesem vybraným z loupání, mletí, drcení, omletí ajejich kombinací.

-8CZ 303447 B6
5. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že extrakce je prováděna za redukujících podmínek.
6. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 5, vyznačující se tím, že

5 jsou uvedené redukující podmínky upraveny tak, aby poskytly redukční aktivitu schopnou uvolnit beta-amylasu navázanou na strukturální protein zrna.
7. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 5, vyznačující se tím, že jsou uvedené redukující podmínky dosaženy vodou obsahující SO₂.
8. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že loupaný ječmen je extrahován vodou obsahující SO₂ v poměru 5:8 až 2:3 loupaný ječmen : voda obsahující SO₂.

15
9. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že extrakce je prováděna při teplotě 25 až 33 °C, s výhodou při 29 až 31 °C.
10. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 9,

20 vyznačující se t í m , že extrakční doba je 48 až 66 h, s výhodou 55 až 62 h.
11. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 10, vyznačující se tím, že celulasa je celulasa z plísně.

25
12. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku I až 11, vyznačující se tím, že je použita celulasa z plísně Trichoderma.
13. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 12, vyznačující se tím, že celulasa je celulasa z rodu vybraného z Humicola, Fusarium,

30 Myceliophtora, Aspergillus, Penicillium a Trichoderma.
14. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že β-amylasa je extrahována z mletých zrn.

35
15. Způsob extrakce β-amylasy z obilniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená znovu získaná beta-amylasa je zpracována metodou vybranou z purifikace, koncentrace nebo jejich kombinací.
16. Použití celu lasy, hemicelulasy a beta-glukanasy při extrakci β-amylasy z obilniny.