CN107271663A - 一种赭曲霉素a免疫亲和柱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，所述方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序。本发明利用二醛和单醛分别对壳聚糖进行交联反应，形成氨基反应完全且富含羟基的交联壳聚糖基质；利用交联壳聚糖与甲基环氧氯丙烷进行交联活化反应，避免了赭曲霉素A单抗中的结合活性位置与交联壳聚糖的非特异性相互作用，使绝大部分抗体处于游离状态；交联壳聚糖的活化反应与偶联抗体的反应分开进行，从而最大限度的保证了赭曲霉素A单抗的活性。

Description

一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法。
背景技术
赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素。其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A。与黄曲霉毒素的检测方法一样，赭曲霉毒素A的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析柱-荧光光度法等。目前免疫亲和层析柱-高效液相色谱法和免疫亲和层析柱-荧光光度法，具有快速、灵敏、准确的特点，已被国家标准GB/T 18979-2003所采用。免疫亲和层析柱-高效液相色谱法和免疫亲和层析柱-荧光光度法的核心技术就是制备性能稳定、安全可靠，结果可以信赖的免疫亲和柱。目前亲和柱固定基质的选择分几大类：高分子材料、生物大分子、生物高分子材料。在上述几种材料中，生物高分子材料具有环境友好，价格便宜等优点，已经成为研发的热点。
壳聚糖作为一种廉价易得的生物高分子材料已经越来越得到广泛地应用于各种生化检测材料中。壳聚糖分子中具有氨基和羟基，因此改性的方式多，反应灵活。经过改性，壳聚糖也能形成结构规整的微球。目前壳聚糖的改性交联主要通过其结构上的氨基与醛类形成席夫碱来实现。壳聚糖上的氨基完全席夫碱化留下的羟基则能够保证下一步与抗体偶联反应的均一性和稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取技术方案是：一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，所述方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖溶于体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解；壳聚糖经过二醛交联、单醛交联，真空干燥得到交联壳聚糖基质；
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖，悬浮于甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加氢氧化钠水溶液，于50-70℃恒温水浴振荡器上活化反应4-8h，反应结束后，用水反复洗涤，真空干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖分散于赭曲霉素A抗体的缓冲液中，于35-39℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、磷酸盐缓冲液进行洗涤至赭曲霉素A抗体不能检出，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
优选地，所述步骤1)中的所述二醛交联、单醛交联方法为：待壳聚糖在1％醋酸溶液中完全溶解后，将二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应；然后将单醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应，冷却，加入与水互溶的溶剂帮助沉淀，过滤，滤饼用与水不互溶的溶剂洗涤，将过滤得到的滤饼于真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
优选地，所述步骤1)中二醛交联，二醛添加量为壳聚糖质量的1-2倍；搅拌反应时间为2-4h，搅拌反应温度为20-40℃。
优选地，所述步骤1)中单醛交联，单醛加量为壳聚糖质量的0.5-1.5倍；搅拌反应时间为2-4h，搅拌反应温度为20-40℃。
优选地，所述步骤2)中氢氧化钠水溶液的浓度为40wt％，交联壳聚糖与氢氧化钠水溶液质量比为1：1-2；所述交联壳聚糖与活化剂质量比为1：4-6。
优选地，所述步骤1)中的壳聚糖交联所用的二醛为链长2-6个碳的二醛；壳聚糖交联所用的单醛为链长1-5个碳的单醛。
优选地，所述步骤1)中壳聚糖经过二醛交联、单醛交联后，加入与水互溶的溶剂帮助沉淀；所述与水互溶的溶剂为链长1-4个碳的单醇、丙酮中的任意一种；所述水互溶的溶剂体积用量为壳聚糖质量的8-12倍，所述质量单位为g，所述体积单位为mL。
优选地，所述步骤1)中壳聚糖经过二醛交联、单醛交联后，过滤，得到滤饼用与水不互溶的溶剂洗涤；所述与水不互溶的溶剂为乙醚、沸点30-60的石油醚、沸点60-90的石油醚、正己烷、环己烷中的任意一种或几种；所述水不互溶的溶剂体积用量为壳聚糖质量的8-12倍，所述质量单位为g，所述体积单位为mL。
优选地，所述步骤1)中壳聚糖与醋酸溶液质量体积比为1：8-12，所述质量单位为g，所述体积单位为mL；所述真空干燥温度为50-70℃。
优选地，所述步骤2)中赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液的浓度为3-5g/l，缓冲液的pH为7.4-8.2，体积用量为活化壳聚糖质量15-25倍，所述体积单位为L，所述质量单位为g。
本发明设计思路如下：1)首先利用二醛对壳聚糖进行交联反应，形成交联壳聚糖；2)利用单醛对交联壳聚糖进行再交联，使壳聚糖上未反应的氨基反应完全，并且限定了交联壳聚糖微球中孔道的内径大小与疏水结构；3)利用甲基环氧氯丙烷而不是环氧氯丙烷进行交联反应，通过空间位阻以及疏水相互作用，很好的避免了赭曲霉素A单抗中的结合活性位置与交联壳聚糖的非特异性相互作用；甲基环氧氯丙烷上的甲基也很好的降低了交联后暴露出的羟基的反应活性；4)交联壳聚糖的活化反应与偶联抗体的反应分开进行，从而最大限度的保证了赭曲霉素A单抗的活性。
本发明偶联率检测及计算方法如下：
G1＝(C0-C1)*V0/W1
G1：偶联率(g/g)；
C0：赭曲霉素A抗体的起始浓度(g/l)
C1：赭曲霉素A抗体的最终浓度(g/l)
V0：赭曲霉素A抗体溶液的体积(l)
W1：活化壳聚糖的质量(g)
本发明赭曲霉素A抗体的检测方法:利用紫外分光光度法确定赭曲霉素A抗体的浓度标准曲线，利用标准曲线确定抗体的浓度。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：1、本发明利用二醛和单醛分别对壳聚糖进行交联反应，形成氨基反应完全且富含羟基的交联壳聚糖基质。2、本发明将抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到交联壳聚糖上，更好地保持抗体的活性；利用交联壳聚糖与甲基环氧氯丙烷进行交联活化反应，避免了赭曲霉素A抗体中的结合活性位置与交联壳聚糖的非特异性相互作用，使绝大部分抗体处于游离状态。3、本发明交联壳聚糖的活化反应与偶联抗体的反应分开进行，从而最大限度的保证了赭曲霉素A抗体的活性。4、本发明偶联率最高达到0.68g/g，偶联效率高，本发明制备的以壳聚糖为载体的免疫亲和柱能够与赭曲霉素A特异性结合，能得到纯度较高的赭曲霉素A；免疫亲和柱对赭曲霉素A最大结合容量约为391ng/g，回收率达到97.2％。
附图说明
图1为活化壳聚糖与壳聚糖偶联赭曲霉素A的制备图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖1.05g溶于10mL体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解，待壳聚糖完全溶解后，将1.5g戊二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h；然后将1.0g乙醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h，冷却，加入与10ml丙酮帮助沉淀，过滤，滤饼用10ml石油醚(沸点30-60)洗涤3次，将过滤得到的滤饼于60℃真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖1.28g，悬浮于5.5g活化剂甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加1.3g的40wt％氢氧化钠水溶液，于60℃恒温水浴振荡器上活化反应6h，反应结束后，用水反复洗涤，干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖1.54g分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液(30ml，4g/l，pH7.6)中，于37℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、pH7.6磷酸盐缓冲液进行洗涤，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
本实施例制备赭曲霉素A免疫亲和柱检测偶联率为0.68g/g。
实施例2
本实施例赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖1.07g溶于10mL体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解，待壳聚糖完全溶解后，将1.4g乙二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h；然后将1.1g丙醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h，冷却，加入与10ml甲醇帮助沉淀，过滤，滤饼用10ml正己烷洗涤3次，将过滤得到的滤饼于60℃真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖1.31g，悬浮于5.8g活化剂甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加1.5g的40wt％氢氧化钠水溶液，于60℃恒温水浴振荡器上活化反应6h，反应结束后，用水反复洗涤，干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖1.61g分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液(30ml，4g/l，pH7.8)中，于37℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、pH7.8磷酸盐缓冲液进行洗涤，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
本实施例制备赭曲霉素A免疫亲和柱检测偶联率为0.67g/g。
实施例3
本实施例赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖1.08g溶于10mL体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解，待壳聚糖完全溶解后，将1.3g丙二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h；然后将0.8g甲醛缓慢的滴入瓶中交联固化，35℃搅拌反应3h，冷却，加入与10ml乙醇帮助沉淀，过滤，滤饼用10ml环己烷洗涤3次，将过滤得到的滤饼于60℃真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖1.34g，悬浮于5.7g活化剂甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加1.4g的40wt％氢氧化钠水溶液，于60℃恒温水浴振荡器上活化反应6h，反应结束后，用水反复洗涤，干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖1.65g分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液(30ml，4g/l，pH7.9)中，于37℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、pH7.9磷酸盐缓冲液进行洗涤，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
本实施例制备赭曲霉素A免疫亲和柱检测偶联率为0.65g/g。
实施例4
本实施例赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖1.0g溶于12mL体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解，待壳聚糖完全溶解后，将1g丁二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，20℃搅拌反应4h；然后将0.5g丁醛缓慢的滴入瓶中交联固化，20℃搅拌反应4h，冷却，加入与12ml丙醇帮助沉淀，过滤，滤饼用12ml乙醚洗涤3次，将过滤得到的滤饼于70℃真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖1g，悬浮于4g活化剂甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加1g的40wt％氢氧化钠水溶液，于50℃恒温水浴振荡器上活化反应8h，反应结束后，用水反复洗涤，干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖1g分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液(25ml，3g/l，pH8.0)中，于35℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、pH8.0磷酸盐缓冲液进行洗涤，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
本实施例制备赭曲霉素A免疫亲和柱检测偶联率为0.67g/g。
实施例5
1)交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖1.0g溶于8mL体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解，待壳聚糖完全溶解后，将2g己二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，40℃搅拌反应2h；然后将1.5g戊醛缓慢的滴入瓶中交联固化，40℃搅拌反应2h，冷却，加入与8ml丁醇帮助沉淀，过滤，滤饼用8ml石油醚(沸点60-90)洗涤3次，将过滤得到的滤饼于50℃真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
2)抗体与交联壳聚糖的偶联：
a.取步骤1)交联壳聚糖1g，悬浮于6.0g活化剂甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加2.0g的40wt％氢氧化钠水溶液，于70℃恒温水浴振荡器上活化反应4h，反应结束后，用水反复洗涤，干燥，得到活化壳聚糖备用；
b.将活化壳聚糖1g分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液(15ml，5g/l，pH8.2)中，于39℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3)装柱：
取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、pH8.2的磷酸盐缓冲液进行洗涤，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
本实施例制备赭曲霉素A免疫亲和柱检测偶联率为0.66g/g。
实施例6
本实施例对制备的赭曲霉素A免疫亲和柱柱容量进行测定。以赭曲霉素A的稀碳酸氢钠溶液(100ppb)为洗脱液，上柱，直至流出液中赭曲霉素A的浓度恢复到初始浓度为止(结果见表1)。
柱容量计算方法如下：
G1＝C0*V0/W1
G1：柱容量(g/g)
C0：赭曲霉素A的起始浓度(g/l)
V0：流出液的体积(l)
W1：抗体交联活化壳聚糖的质量(g)
实施例7
本实施例对实施例1-5制备的赭曲霉素A免疫亲和柱加标回收率的测定。用4mol/L的氯化镁溶液进行洗脱，至流出液中赭曲霉素A不能检出。用荧光光度计测定流出液中赭曲霉素A浓度(结果见表1)。
表1实施例1-5亲和柱的偶联率、柱容量以及回收率
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：
1）交联壳聚糖基质的制备：
称取壳聚糖溶于体积分数1%醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解；壳聚糖经过二醛交联、单醛交联，真空干燥得到交联壳聚糖基质；
2）抗体与交联壳聚糖的偶联：
a．取步骤1）交联壳聚糖，悬浮于甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加氢氧化钠水溶液，于50-70℃恒温水浴振荡器上活化反应4-8h，反应结束后，用水反复洗涤，真空干燥，得到活化壳聚糖备用；
b．将活化壳聚糖分散于赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液中，于35-39℃恒温水浴振荡器上活化反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；
3）装柱：
取步骤2）制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、磷酸盐缓冲液进行洗涤至赭曲霉素A抗体不能检出，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。
2.根据权利要求1所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的所述二醛交联、单醛交联方法为：待壳聚糖在1%醋酸溶液中完全溶解后，将二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应；然后将单醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应，冷却，加入与水互溶的溶剂帮助沉淀，过滤，滤饼用与水不互溶的溶剂洗涤，将过滤得到的滤饼于真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。
3.根据权利要求1所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中二醛交联，二醛添加量为壳聚糖质量的1-2倍；搅拌反应时间为2-4h，搅拌反应温度为20-40℃。
4.根据权利要求1所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中单醛交联，单醛加量为壳聚糖质量的0.5-1.5倍；搅拌反应时间为2-4h，搅拌反应温度为20-40℃。
5.根据权利要求1所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中氢氧化钠水溶液的浓度为40wt%，交联壳聚糖与氢氧化钠水溶液质量比为1：1-2；所述交联壳聚糖与活化剂质量比为1：4-6。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的壳聚糖交联所用的二醛为链长2-6个碳的二醛；壳聚糖交联所用的单醛为链长1-5个碳的单醛。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中壳聚糖经过二醛交联、单醛交联后，加入与水互溶的溶剂帮助沉淀；所述与水互溶的溶剂为链长1-4个碳的单醇、丙酮中的任意一种；所述水互溶的溶剂体积用量为壳聚糖质量的8-12倍，所述质量单位为g，所述体积单位为mL。
8.根据权利要求1-5任意一项所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中壳聚糖经过二醛交联、单醛交联后，过滤，得到滤饼用与水不互溶的溶剂洗涤；所述与水不互溶的溶剂为乙醚、沸点30-60的石油醚、沸点60-90的石油醚、正己烷、环己烷中的任意一种或几种；所述水不互溶的溶剂体积用量为壳聚糖质量的8-12倍，所述质量单位为g，所述体积单位为mL。
9.根据权利要求1-5任意一项所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中壳聚糖与醋酸溶液质量体积比为1：8-12，所述质量单位为g，所述体积单位为mL；所述真空干燥温度为50-70℃。
10.根据权利要求1-5任意一项所述的一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中赭曲霉素A抗体的磷酸盐缓冲液的浓度为3-5g/l，缓冲液的pH为7.4-8.2，体积用量为活化壳聚糖质量15-25倍，所述体积单位为L，所述质量单位为g。
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