JPH04210596A - ジマルトシルサイクロデキストリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は、ジマルトシルサイグロ
デキストリンの酵素的製造方法に関する。 ［０００２］ 【従来の技術】サイクロデキストリン（以下、　ｒＣＤ
Ｊと略記する。）はグルコース残基がα−１，４−結合
により環状に結合したオリゴ糖であって、グルコース残
基６個からなるα−ＣＤ、７個からなるβ−ＣＤ、８個
からなるγ−ＣＤなどが一般に知られている。ＣＤには
、その構造上内部に空洞がありしかもこの空洞が疎水性
であるため、各種油性物質を取り込むことができる。 ［０００３］その為、このような性質を利用して食品工
業、製薬工業などの分野において１）不安定物質の安定
化、２）揮発性物質の保持、３）難・不溶性物質の可溶
化等種々の用途が考えらねる。しかしながら、各ＣＤの
水に対する溶解性は低く　１００ｇの水（室温）に対し
α−ＣＤは約１４ｇ、β−ＣＤは約２ｇ、γ−ＣＤで約
２３ｇ程度であり、実用化における不利な性質を示すこ
とから、この点の改良が望まれている。 ［０００４］

【発明が解決しようとする課題】この様な観点からＣＤ
の溶解性を向上させるために、ＣＤのグルコース残基の
０６の位置にグルコースが結合したグルコシル−ＣＤ（
小林ら、澱粉科学、３０．２３１〜２３９．１９８３）
やマルトースが結合したマルトシル−ＣＤ　（坂野ら、
特開昭６１７０９９６）などの単分岐ＣＤが既に製造さ
れている。 ［０００５１更に単分岐ＣＤの溶解性を向上させること
を目的に、グルコースが２個結合したジグルコシルーＣ
Ｄやフル１〜−スが２個結合したジマルトシルーＣＤを
製造する方法が公知となっている。例えば、前者におい
ては特開昭６２−１０６９０１号公報、特開昭６２−１
６４７０１号公報が、後者においては特開昭６１−２８
７９０１号公報、特開昭６１２８７９０２号公報が挙げ
られる。しかしながら、これら特許公開公報における実
施例の記載からも明らかなように、従来法におけるジマ
ルトシルーＣＤの製造方法はいずれもマルトースとＣＤ
との混合物を高濃度　（３０〜８５％）下でプルラナー
ゼと長時間（２４〜９６ｈｒ）反応させジマルトシルー
ＣＤ　（もしくはジマルトシルーＣＤからジグルコシル
ーＣＤへの変換用基質）を生成させる方法である。 ［０００６］本発明汗らは、ジマノ則−シルーＣＤを製
造する方法において長時間（２４〜９６ｈｒ）反応を必
要としない非常に短時間で行える反応方法の開発を目的
として鋭意研究を重ねた結果、マルトシル−ＣＤにプル
ラナーゼ活性を有するアミラーゼを作用させることによ
って短時間でフマル１−シル−ＣＤを製造することがで
きる知見を得、本発明を完成するに至った。 ［０００７］

【課題を解決するための手段】本発明は、フル１ヘシル
サイクロデキストリンをプルラナーゼ活性を有するアミ
ラーゼの存在下に処理してジマルトシルサイクロデキス
１へＪンを製造することからなるジマル１−シルサイク
ロデキス１へりンの製造方法である。以下、本発明を具
体的に説明する。 ［０００８］本発明はマルトシル−ＣＤを所定の固形分
濃度の溶液とし、プルラナーゼ活性を有するアミラーゼ
を所定量加え、液の温度・　ｐＨなどを酵素の至適作用
範囲に維持し、５〜６０分、好ましくは２０〜３０分、
反応させ次いで生成したジマルトシルーＣＤをクロマト
グラフィーなどの方法によって反応液から分離・採取す
ることからなるジマルトシルーＣＤの製造方法である。 ［０００９］前記した如＜ＣＤとして各種のものが知ら
れているが、本発明はこれらＣＤを任意に使用すること
ができる。本発明において用いられるプルラナーゼ活性
を有するアミラーゼは該活性を有するものであ１１ばい
ずれの起源のものでもよいが、例えば、アミラーゼＡＰ
Ｅが用いられる。このアミラーゼＡＰＥは、本発明者ら
が既に出願している特開昭６４−６０３７６号公報に開
示しているものであって、以下の物理化学的性質を持つ
ものである。 ■　可溶性基質に対する作用 可溶性澱粉及びプルランに同等の初速度で作用し、前者
から主としてマルトテトラオース（Ｇ４）　、マルトペ
ンタオース（Ｇ、、）　、マルトヘキサオース（Ｇ６）
を、後者からは主としてマルトトリオース　（Ｇ３）を
生成する。 ■　生澱粉に対する作用 生澱粉に対して殆んど作用しないが、生澱粉分解活性を
有するアミラーゼとの併用にて生澱粉分解活性を著しく
増大させる。 ■　基質特異性 可溶性澱粉もしくは澱粉系糖質及びプルランに作用し、
デキストラン、マルトテトラオース、フル１ヘース、イ
ソマルトースには殆んど作用しない。 ■　至適ｐＨ及びｐＨ安定性 本酵素の可溶性澱粉に対する至適ｐＨはｐＨ７，０〜８
゜５であり、その安定ｐＨは５．０〜９．０である。さ
らに、プルランに対する至適ｐＨはｐＨ７，０であり、
その安定ｐＨは５．０〜８．０である。 ■　至適温度及び熱安定性 本酵素の可溶性澱粉及びプルランに対する至適温度は５
０℃であり、４０℃までは安定であるが、それ以上の温
度では活性が低下し、６０℃３０分間でほとんど失活す
る。 ■等　重　点 本酵素の等重点は電気泳動より測定すると４．１３であ
る。 ■分子量 本酵素の分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により約２１．８０００である。 ［００１０１アミラーゼＡＰＥはバチルス属に属するバ
チルス・サーキュランスＦ−２（微研菌奇第７３６１号
）を培養することにより得られる。上記酵素におけるプ
ルラナーゼとは主として多糖類プルランのα−１，６グ
ルコシド結合を加水分解するほか、アミロペクチンやグ
リコーゲンのα−１−１６−グリコシド結合をも切断す
る能力をもつ酵素のことであり、アミラーゼとは澱粉分
子中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するαア
ミラーゼ様の能力をもつ酵素のことである。 ［００１１］プルラナーゼ活性及びアミラーゼ活性は以
下の方法により測定される。即ち、プルラナーゼ活性に
おいては基質として１％プルラン溶液（ｐＨ７，０，１
００ｍ１ｉｌづン酸緩衝液）２００１ｚｌに酵素液２０
０μｍ　（適宜活性に応じて希釈したもの）を加え３０
℃、３０分間反応させる。 反応後、反応液中に生じた還元糖をソモギーネルソン法
で測定する。酵素ｍ位は、この条件で１分間にＩｇｍｏ
ｌｅのグルコースに相当する量の還元糖を遊離する酵素
量を１単位とする。アミラーゼ活性は上記条件下におい
て基質として可溶性澱粉を用い同様な操作を行った。ア
ミラーゼ活性１単位は１ユ記条件下で１２分間に１１Ｊ
ｍｏｌｅのグルコースに相当する量の還元糖を遊離する
酵素量とする。 ［００１２］プルラナーゼ活性を有するアミラーゼの使
用量は用いられる基質の品質あるいは反応の実施形式な
どにより多少の違いはあるが、マルトシル−ＣＤ１グラ
ム当り１０ｍ位以上（プルラナーゼ活性で表示）で用い
るのが好ましいがその量に左右されるものではない。　
本発明において原料として用いられるマルトシルＣＤは
いずれも市販の製品を用いることができるが、純度の高
いものを用いることが分離精製の手数を考えると有利で
ある。 ［００１３］本発明における基質濃度は従来法とは全く
異なる方法である為、反応が均一に行われる濃度条件下
であればよく、必ずしも２０％以上の高濃度条件下には
規定されるものではなく低濃度（１〜５％）条件下でも
ジマルトシルＣＤを生成することが特徴である。　本発
明の方法においては、反応はプルラナーゼ活性をもつア
ミラーゼの作用条件に適合させて実施される。従って３
０〜５０℃、ｐＨ６，０〜８．０で行うのが好ましい。 ［００１４］生成したジマルトシルーＣＤを反応液から
分離するには、ＮＨ２カラム（ヌクレオシルＮＨ２−Ｐ
Ｒ−５Ｕ）を用いた逆相分配クロマ１へグラフィーを用
いることによって容易に行うことができるが、その手段
には限定されるものではない。 ［００１５］

【発明の効果】本発明によれば、これまで長時間（２４
〜９６ｈｒ）反応を要していたジマルトシルＣＤの生産
が極めて短時間（１０〜３０分）のうちに効率よく得ら
れることができ、医薬品、食品、その他の一般の工業分
野でのＣＤの用途開発に奇怪することが多大である。 ［００１６１ 【実施例］次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
る。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものでない。 実施例、１ マルトシル−α−ＣＤ　（塩水港精糖（株）製、純度：
９３７％）５２■にｐＨ７，０、１００ｎ＋Ｍりン酸緩
衝液２ｍｌを加え溶解させ、これに特開昭６４−６０３
７６号公報の記載に従って、バチルス・サーキュランス
Ｉ−２（微工研菌奇第７３６１号）の培養液から調製し
たプルラナーゼ活性を有するアミラーゼを１単位（プル
ラナーゼ活性として）加え、３０℃で３０ｍ　ｉ　ｎ反
応させる。 ［００１７］反応終了後、反応液を１００℃、１０ｍ１
ｎ加熱し、残存の酵素を失活後、アンバーライトＭＢ−
３にて脱塩した。この反応液をヌクレオシルＮＨ２ＰＲ
５Ｕを充填したカラム（４，６Ｘ　１５０ｍｍ）に負荷
し、アセトニ１ヘリル／Ｈ２０／＝６０／４０の溶媒に
て溶出させる。試料負荷後、２７゜４ｍ１ｎに溶出され
てくる両分を集め、濃縮乾燥してフマル１ヘシル−α−
ＣＤの白色粉末、６．５■を得た。収率は、１０％であ
った。 ［００１，８］この白色粉末の元素分析値は、次の通り
であった。 元素分析値（Ｃ６０Ｈｌｏｏ　０５０）計算値　Ｃ＝４
４．４４％、Ｈ＝６．２２％、Ｏ＝４９．３４％実測値
　Ｃ＝４．４．３８％、Ｈ＝６．２０％この粉末を濃度
１０■／ｍｌの水溶液として薄層クロマｈグラフィー（
ワットマン社製、シリカゲルに一５Ｆ、２０×２０ｃｍ
）に１０μｍスボッ１〜後、酢酸エチル／メタノール／
水＝３７／４０／２３の展開溶媒にて２回」二昇法によ
り展開した。ヨウ素溶液を用いる発色及び硫酸を用いる
発色により呈色させたところ、市販品ジマルトシルＣＤ
と同位置に出現しかつ１スポツトを与えた。 ［００１９］また、」二記で得られた粉末２■とプルラ
ナーゼ（ノボインダストリージャパン社製、プロザイム
）１０単位とを、ｐＨ５，０，５０ｍＭ酢酸緩衝液で全
容＠　５００ｎ＋１になように溶解し、５０℃で１時間
反応させ、次いでこの反応混合物を高速液体クロマ１−
グラフィーにかけた結果、フル１ヘースとα−ＣＤが２
：１割合で生成していることを確認した。 ［００２０１更に市販品のジマル１−シルＣＤと高速液
体クロマ１へグラフィーにより、その保持時間（リテン
ション・タイム）を比較したところ全く同じ保持時間で
あることを確認した。更に上記で得られた物質２１１１
ｇを取り、これにグルコアミラーゼ（生化学工業製）　
１０単位を３０℃、ｐＨ５，０で作用させたところ、グ
ルコースとジグルコシルーα−ＣＤを２：ｌの割合で生
成することが液体クロマトグラフィーにより確認できた
。 ［００２１１以上の結果から、本発明においてジマルト
シルーα−ＣＤが生成されることが確認された。 比較例、１ 実施例１の条件下でプルラナーゼ活性を有するアミラー
ゼの代わりにプルラナーゼ（ノボインダストリージャパ
ン社製、プロザイム）１単位を使用して反応を実施した
が、ジマルトシルＣＤの生成は認めらねなかった。 比較例、２ 実施例１の条件下でプルラナーゼ活性を有するアミラー
ゼの代わりにアミラーゼ（大和化成（株）製、クライス
ターゼＰＡ）１単位を使用して反応を実施したが、フマ
ル１−シル−ＣＤの生成は認められなかった。 実施例、２〜４ 実施例、１と同一の要領により、基質の種類、基質の濃
度、酵素量を変えて反応を行い次表の結果を得た。 ［００２２］ 実 施 例 ＣＤｆｌ類 マルトシル β−ＣＤ マルトシル β−ＣＤ マルトシル γ−ＣＤ σ？尋鰺騙液（ｍｌ、 基質濃度（鞠／Ｗ％） 頃給 １６．７ 酵素量（単位） ジマルトシルＣＤ 生成量（Ｉｉｇ） ９．９ ８３．２ ７．０ 収 率（％） 厘４

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マルトシルサイクロデキストリンをプルラ
   ナーゼ活性を有するアミラーゼの存在下に処理してジマ
   ルトシルサイクロデキストリンを製造することを特徴と
   するジマルトシルサイクロデキストリンの製造方法。
2. 【請求項２】プルラナーゼ活性を有するアミラーゼがア
   ミラーゼＡＰＥである請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】プルラナーゼ活性を有するアミラーゼがバ
   チルス・サーキランスが産生するものである請求項１記
   載の製造方法。