JPH0123473B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

本発明は、7β−（４−カルボキシブチラミド）
−３−（１−メチル−1H−テトラゾール−５−イ
ル）チオメチル−7α−メトキシ−３−セフエム
−４−カルボン酸〔以下化合物(4)と略称する〕の
改良製造法に関する。 化合物(4)は、本発明者等によつて、さきに取得
された化合物で、その製造法は、特開昭50−
155646号および特開昭54−32694号公報に記載さ
れているように、ストレプトキセス属に属する
７−メトキシセフアロスポリン類抗生物質生産菌
（殊に 本発明者等が分離したストレプトミセス
オガノネンシス Ｙ−G19Z）を１−メチル−
５−メルカプトテトラゾールを添加さた培地で培
養して 7β−（５−アミノ−５−カルボキシバレ
ラミド）−３−（１−メチル−1H−テトラゾール
−５−イル）チオメチル−7α−メトキシ−３−
セフエム−４−カルボン酸を蓄積させ、ついで該
化合物またはその塩にＤ−アミノ酸酸化酵素活性
を有する菌体またはその処理物を過酸化水素の存
在下作用させる方法が行なわれた。 今回、本発明者等は、さきに使用したストレプ
トミセス オガノネンシス Ｙ−G19Z株を炭酸
マグネシウムの存在下に培養したところ、7β−
（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−３−
ヒドロキシメチル−7α−メトキシ−３−セフエ
ム−４−カルボン酸〔以下化合物(1)と略称する〕
が高濃度に生産されていることを知り、この化合
物(1)は、Ｄ−アミノ酸酸化酵素活性を有する菌体
またはその処理物で処理したのち、化学的に変換
することにより容易に化合物(4)に誘導できること
に着目し、本発明を完成するに至つたものであ
る。 すなわち、本発明は、ストレプトミセス オガ
ノネンシスを培養して、化合物(1)を蓄積させ（第
１工程）、該化合物またはその塩にＤ−アミノ酸
酸化酵素活性を有する菌体またはその処理物を過
酸化水素の存在下作用させて、7β（４−カルボキ
シブチラミド）−３−ヒドロキシメチル−7α−メ
トキシ−３−セフエム−４−カルボン酸〔以下化
合物(2)と略称する〕またはその塩を生成させ（第
２工程）、該化合物に、ジケテンを反応させて7β
−（４−カルボキシブチラミド）−３−（３−オキ
ソブチリルオキシ）メチル−7α−メトキシ−３
−セフエム−４−カルボン酸〔以下化合物(3)と略
称する〕またはその塩を得（第３工程）、ついで
この化合物に、１−メチル−５−メルカプトテト
ラゾールを反応させて化合物(4)を得る（第４工
程）ことを特徴とする化合物(4)の各良製造法であ
る。 以下、本発明の製造法の各工程を説明する。第
１工程：この工程は、ストレプトミセス オガノ
ネンシスに属する菌株を培地で培養し、化合物(1)
を蓄積させることによつて行なわれる。ストレプ
トミセス オガノネンシスに属する菌株として
は、上述のＹ−G19Z株（微工研菌寄第2725号、
アメリカン、タイプ、カルチアー、コレクシヨン
ATCC No.31667として寄託済み）またはその変
異株が使用される。 培養方法は一般微生物の培養方法に準じておこ
なわれるが通常は液体培地による深部培養法が有
利である。培養に用いられる培地としては、スト
レプトミセス属に属する本菌株が利用する栄養源
を含有する培地であればよい。すなわち合成培
地、半合成培地あるいは天然培地が用いられ、培
地の組成は、たとえば炭素源としてはグルコー
ス、シユークロース、マンニトール、グリセリ
ン、デキストリン、でん粉、植物油などが、窒素
源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミー
ル、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンス
チープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素その他の有機
または無機の窒素源が用いられる。また金属塩と
してはNa，Ｋ，Mg，Ca，Zn，Feなどの硫酸
塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩などが必要
に応じて添加される。殊に炭酸マグネシウムの添
加は、化合物(1)の生産能（力価）を高めるのに有
効である。さらに必要に応じて、メチオニン、シ
ステイン、シスチン、オレイン酸メチル、ラード
油、シリコン油、界面活性剤などの抗生物質生成
促進物質又は消泡剤が適宜使用される。 培養条件としては好気的条件下に培養するのが
一般的に有利で、培養温度は約18〜35℃の範囲が
望ましく、好ましくは約30℃附近が用いられ、培
地のPHは約５〜10、好ましくは約６〜８の範囲に
保持すると好結果が得られる。培養期間は培地の
組成、温度などによつて変動するが、一般に３〜
10日程度でよく、培養終了時に化合物(1)が蓄積さ
れる。 培養物より化合物(1)を単離採取するには通常の
微生物の培養物より抗生物質を単離する方法が適
用される。化合物(1)は主に培養液中に含有される
ので、遠心分離または過により菌体を除去した
後、過液から有効物質の抽出をおこなう。すな
わち適当な溶剤に対する溶解性および溶解度の
差、溶液からの析出性および析出速度の差、種々
の吸着剤に対する吸着親和性の差２種の液相間に
おける分配の差などを利用する一般の抗生物質の
製造に用いられる手段によつて、分離、採取、精
製される。この方法は必要に応じて単独で用いら
れ、あるいは任意の順序に組合せ、また反覆して
適用できる。 ストレプトミセス属に属する菌を用いて、化合
物(1)を生産する方法としては、ストレプトミセ
ス・チヤートリウシスSF−1623を好気的条件下
に培養し、培養液からこの物質を採取する方法が
知られている（特開昭50−121488号）が、本発明
で使用するＹ−G19Z株は、化合物(1)の単位ブロ
ス量当りの収量が極めて高い。すなわち、SF−
1623株に比べて1000倍以上に達する。従つて、こ
うして得られた化合物(1)は、本願目的化合物であ
る化合物(4)の安価な製造原料であり、本工程およ
びこれに続く第２乃至４工程を連続して実施する
ことにより、化合物(4)を工業的に有利に生産する
ことができる。 第２工程： Ｄ−アミノ酸酸化酵素活性を有する菌体または
その処理物を作用させるには、前工程の化合物(1)
を含む醗酵生産液にそのまま加えて作用されても
よいが、例えばイオン交換吸着などで処理した濃
縮液または、化合物(1)を一担単離したのち、その
溶液に加えてもよい。 ここに使用されるＤ−アミノ酸酸化酵素活性を
有する菌体としては、トリゴノプシス バリアビ
リスを挙げることができる。この菌体は、公知の
方法により活性化または固定化処理して用いられ
る。 上記菌体または処理物と化合物(1)との反応は通
常６〜８のPHで行なわれる。反応温度としては30
℃〜40℃で行なうことが望ましい。反応時間は主
として酵素力価により左右されるが通常１〜５時
間である。上記の酵素反応は好気的条件下で行な
われるので通常空気または酸素の通気化で行なう
のが好ましい。化合物(1)はその両性的な構造のた
めに発酵ブロスから抽出することが困難である
が、本発明方法によれば化合物(1)の発酵ブロス中
で菌体を除去した後適当な条件下に行なうことが
でき、生成した7β−（４−カルボキシブチラミ
ド）−３−ヒドロキシメチル−7α−メトキシ−３
−セフエム−４−カルボン酸〔化合物(2)〕を溶媒
抽出またはイオン交換樹脂の吸着により回収する
ことが容易にできる。反応液から、例えばPH2.5
の酸性とし、適当な有機溶媒、例えばメチルエチ
ルケトン、ｎ−ブタノールなどで抽出することが
できる。またイオン交換樹脂と溶媒抽出の組合せ
を使用すると好結果が得られる。適当なイオン交
換樹脂は液体アミンアニオン交換樹脂である。好
ましい溶媒はメチルエチルケトン、ｎ−ブタノー
ルなどである。また固体のイオン交換樹脂を使用
して分離することもできる。その場合の適当な溶
媒としては予備的な実験で容易に決めることがで
きる。 更に精製して純粋な物質を得るためには、抗生
物質の精製に通常使用される方法が用いられる。 化合物(2)はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩、有機アミン塩等として採取することができ
る。 第３工程： 前工程で得られた化合物(2)とジケテンとの反応
は、通常不活性な溶媒中で、化合物(2)に対し、ほ
ぼ等モルのジケテンを反応させることによつて行
なわれる。反応溶媒としては、ジクロルメタン、
クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルホ
ルムアミドなどが単独または適宜混合して使用さ
れる。反応は室温以下、殊に冷却して行うのが好
ましい。化合物(2)は遊離の状態であるいは塩とし
て使用することができる。塩としては、アルカリ
金属塩、トリエチルアミン等の有機アミン塩が挙
げられる。 第４工程： こうして生成した化合物(3)は、ついで１−メチ
ル−５−メルカプトテトラゾールを反応させるこ
とにより、目的化合物(4)に導くことができる。こ
の反応は通常水中で行なわれるが、反応に関与し
ない親水性有機溶媒（たとえばテトラヒドロフラ
ン、ジメチルホルムアミド、アセトン、エタノー
ル等）と水との混合溶媒中で行うこともできる。
また、この反応は弱アルカリ性で行うのが好まし
い。 本発明によつて得られる化合物(4)は、有用な７
−メトキシセフアロスポリン誘導体を製造するた
めの重要な中間体である。 実施例 １ 澱粉１％、グルコース１％、大豆粉1.5％、イ
ーストエキス0.5％、リン酸水素ナトリウム0.1
％、硫酸マグネシウム0.05％、食塩0.3％を含む
培地を500mlの坂口フラスコに100mlづつ分注し
120℃、20分間滅菌する。それにストレプトミセ
ス オガノネンシスＹ−G19Zを接種し、30℃、
40時間培養する。別途に上記培地を２の坂口フ
ラスコに400ml分注し120℃、20分間滅菌したもの
に上記培養液を２〜３％接種して30℃、24時間培
養を行い種培養とする。別にデキストリン18％、
グリセリン２％、大豆粉２％、グルテンミール２
％、炭酸マグネシウム0.2％、水酸化ナトリウム
0.23％を含む主発酵培地20及び消泡剤としてア
デカノール（商品名）５mlを30の醗酵槽に仕込
み120℃、30分間滅菌したのち、これに種培養液
600mlを接種し、30℃で150時間培養すると、化合
物(1)が5100γ／ml蓄積した。培養終了後4N塩酸水
でPH4.0に調整し、ラジオライト（商品名）を加
えて過し過洗液と合せ24の液が得られ
る。この液をHP・20（三菱化成社製）６の
カラムを通過させる。通過液を4N水酸化ナトリ
ウム水でPH7.0に修正したのち、旭硝子社製イオ
ン交換（ANV及びCMV）を用いた電気透析槽
を使用して40時間電気透析を行い脱塩した。 次いでダウエツクス１×２（Cl^-）（ダウケミカ
ル社製）５のカラムに吸着させ、水洗後0.2ミ
リモルの食塩水溶液にて溶出しHPLC（高速液体
クロマトグラフイー） カラム：LS224（東洋曹達社製）4φ×500mm 溶出液：0.02Mクエン酸（PH3.2） 検出：UV検出器254nm にて分析し、溶出時間８分の化合物(1)の画分を集
める。この溶出画分を上記電気透析装置を用いて
16時間電気透析し脱塩する。脱塩後、減圧濃縮し
て凍結乾燥する。この粗粉末をさらにアビセルカ
ラム（溶媒 イソプロパノール：水＝７：３）で
精製しHPLCで分析し溶出時間８分の化合物(1)の
画分を集め減圧濃縮後、凍乾すると、52ｇの化合
物(1)の粗粉末（純度79％）が得られた。さらに理
化学的分析のため、この化合物(1)の粉末の一部を
順次アビセルカラム（展開溶媒 イソプロパノー
ル：水＝８：２）、セフアデツクスＧ・10カラム
（展開溶媒 水）で精製し凍結乾燥後、50℃で５
時間真空乾燥すると40mgの化合物(1)のナトリウム
塩の白色粉末が得られた。得られた化合物(1)ナト
リウム塩の理化学的性状は次の通りである。 (1) 核磁気共鳴スペクトル（D₂O） ppm：1.83（ｍ，2H） 2.48（ｍ，4H） 3.45〜3.60（ｄ，2H，Ｊ＝17.8） 3.54（ｓ，3H） 4.25（ｓ，2H） 5.18（ｓ，1H） (2) 赤外吸収スペクトル 1760cm^-1にβ−ラクタムの吸収 (3) 紫外部吸収スペクトル PH7.01/15モルリン酸緩衝液中で測定すると
263nm（E¹cm₁%157.4）に吸収極大を示した。 (4) 元素分析値（C₁₅H₂₀N₃O₈SNa・２1/2H₂O
として） Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 分析値(%) 38.70 5.35 8.86 6.78 理論値(%) 38.30 5.36 8.93 6.71 (5) 薄層クロマトグラフイー（アビセルSF） 展開溶媒：イソプロパノール：水＝７：３ Rf値＝0.36 実施例 ２ 実施例１において主発酵培地から炭酸マグネシ
ウムを除いた培地20を用いて30の発酵槽で行
つた。150時間後の化合物(1)の発酵力価は
2350γ／mlでありこの発酵液を実施例(1)と同様
にHP・20カラム通過、電気透析、ダウエツクス
１×２（Cl^-）カラムクロマト、電気透析、アビセ
ルカラムクロマト（展開溶媒 イソプロパノー
ル：水＝７：３）で精製を行い減圧濃縮後、凍結
乾燥すると化合物(1)の粗粉末40ｇ（純度64％）が
得られた。 実施例 ３ 実施例１のダウエツクス１×２（Cl^-）精製後の
凍乾分のうちの１ｇを0.1モルピロリン酸緩衝液
（PH7.5）100mlに溶解したのちソジウムアジド20
mg、30％過酸化水素水0.1ml、アデカノール0.3
ml、特開昭53−15494号記載の方法で得られたト
リゴノプシス・バリアビリスIFO0755株の活性化
菌液（Ｄ−アミノ酸酸化酵素含有）２mlを加え、
37℃にて１時間反応させる。HPLCで分析すると
溶出時間８分の化合物(1)が酸化的脱アミノ化され
た溶出時間12分の化合物(2)に変換していることが
わかる。この反応終了液を冷却遠心して菌体を除
却し、上清をダウエツクス１×２（Cl^-）100mlの
カラムに吸着させ、水洗したのち、0.2モルの食
塩水で溶出し、HPLCで分析し、溶出時間12分の
化合物(2)の画分を集める。この溶出画分を300ml
の炭末カラムに吸着させ、水洗したのち30％アセ
トン水溶液にて溶出させ、HPLCで分析し、溶出
時間12分の化合物(2)の画分を集める。この溶出画
分を減圧濃縮して凍結乾燥をする。 この凍乾物をアビセル（フナコシ社製）カラム
１を用いて展開溶媒イソプロパノール：水＝
７：３でクロマトグラフイーを行い、HPLCで分
析し溶出時間12分の化合物(2)の画分を集め減圧濃
縮し凍結乾燥を行う。 この凍乾物をさらにセフアデツクスＧ・10カラ
ム（1.2cm×90cm）に吸着させ水で展開し、
HPLC分析し溶出時間12分の化合物(2)の画分を集
め凍結乾燥し55℃にて５時間真空乾燥すると白色
の粉末35mgが得られた。 この化合物(2)ナトリウム塩の理化学的性状は次
の通りである。 (1) 核磁気共鳴スペクトル ppm：1.93（ｍ，2H） 2.45（ｍ，4H） 3.45〜3.59（ｄ，2H，Ｊ＝17.9） 3.55（ｓ，3H） 4.26（ｓ，2H） 5.17（ｓ，1H） (2) 赤外吸収スペクトル 1760cm^-1にβ−ラクタムの吸収 (3) 紫外部吸収スペクトル PH7.01/15Ｍリン酸緩衝液中で測定すると
263nm（Ｅ１cm １％189）に吸収極大を示す。 (4) 元素分析値（C₁₄H₁₆N₂O₈SNa・１1/2H₂O
として） Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 分析値(%) 37.38 4.18 6.24 7.32 理論値(%) 37.70 4.27 6.29 7.19 (5) 薄層クロマトグラフイー（アビセルSF） 展開溶媒：イソプロパノール：水＝７：３ Rf値＝0.74 実施例 ４ 実施例１と同様にストレプトマイセス オガノ
ネンシス Ｙ−G19Zの種培養を行い、主発酵培
地も実施例１と同様に炭酸マグネシウムを含む培
地20を30の発酵槽に仕込んで140時間培養を
行つた。 培養終了後、PHを4N塩酸水にて4.0に調整した
のちラジオライト（商品名）を加えて過し洗浄
水と合せると23の液が得られた。 この液をHP・20（三菱化成社製）６のカ
ラムを通過させた。通過液を4N水酸化ナトリウ
ム水でPH7.0に修正したのち実施例１と同様の電
気透析装置を用いて40時間電気透析を行つた。 次いでダウエツクス１×２（Cl^-）（ダウケミカ
ル社製）５のカラムに吸着させ水洗後0.2モル
の食塩水で溶出しHPLCで分析し溶出時間８分の
化合物(1)の画分を集める。 この溶出画分を4N水酸化ナトリウム水でPH7.6
に修正したのちソジウムアジド24ｇ、30％過酸化
水素水24ml、アデカノール3.6ml、特開昭53−
15494号記載のトリゴノプシス・バリアビリス
IFO 0755株のＤ−アミノ酸酸化酵素液500mlを加
えて37℃にて１時間反応させるとHPLC分析によ
り溶出時間８分の化合物(1)が酸化的脱アミノ化さ
れた溶出時間12分の化合物(2)に変換されているの
が確認された。 反応終了液にラジオライトを加え過し液を
上記同様の電気透析装置を用いて30時間電気透析
を行い脱塩した。 脱塩後、ダウエツクス１×２（Cl^-）２のカラ
ムに吸着させ水洗したのち0.5モルのトリエチル
アミン水溶液（PH7.0）で溶出すると化合物(2)の
トリエチルアミン塩を含む溶液が得られた。この
溶出液を上記同様の電気透析装置を用いて２時間
電気透析を行い、脱塩したのち、減圧濃縮し凍結
乾燥をした。凍乾物をジクロルメタル２に溶解
し、不溶物を過除却して液を減圧濃縮すると
淡黄色の化合物(2)のジトリエチルアミン塩が81ｇ
得られた。 実施例 ５ 化合物(2)のジトリエチルアミン塩14.5ｇをジク
ロルメタン160mlに溶解して氷水浴にて２〜５℃
に冷却する。それに氷酢酸2.3mlを加えた後、ジ
ケテン3.15mlを加えて同温度で10分間反応させ
る。さらに、氷水浴外で20〜25℃で約２時間反応
させる。反応終了後溶媒と過剰のジケテンを減圧
下に留去すると淡黄褐色カラメル状の化合物(3)の
ジトリエチルアミン塩を得る。 ついで、１−メチル−５−メルカプトテトラゾ
ール9.28ｇを水120mlに炭酸水素ナトリウム10.1
ｇをとかした溶液に加えて溶解し、この溶液を、
上で得られたカラメル状の生成物に加える。得ら
れた淡黄色溶液を内温40゜±１℃で15分間反応さ
せる。反応液を冷却後2N−塩酸でPH3.5〜３に調
整して（約38ml）酢酸エチル50mlで２回抽出して
未反応過剰の１−メチル−５−メルカプトテトラ
ゾールを抽出回収する。水層を更に2N−塩酸
（約45ml）でPH２に調整して未抽出の残りの１−
メチル−５−メルカプトテトラゾールをエーテル
50mlで２回抽出回収する。水層に食塩30ｇを加え
てメチルエチルケトンで３回（１回目100ml、３
回目30ml）抽出する。抽出液を飽和食塩水で洗浄
後メチルエチルケトンを減圧下留去すると化合物
(4)をカラメルとして9.5ｇを得る。このカラメル
にメチルエチルケトン20mlを加え種を入れて冷所
にて結晶化させると5.2ｇの化合物(4)の結晶を得
る。（収率55％） このものは、つぎの理化学的性状を示す。 (1) 融点：162.5℃ (2) 核磁気共鳴スペクトル：（d₆−DMSO） ppm：2.6〜2.9 （ｍ，2H，−CH₂−） 3.1〜3.4 （ｍ，4H，HOOC−CH₂ ， −CH₂ CONH−） 3.36 （ｓ，3H，−OCH₃） 3.56 （ｑ，2H，

【式】） 3.92 （ｓ，3H，−Ｎ−CH₃） 4.25 （ｑ，2H，C₃−CH₂S−） 5.05 （ｓ，1H，C₆−Ｈ） 9.11 （ｓ，1H，−NH−）。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス オガノネンシスを培養し
   て7β−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミ
   ド）−３−ヒドロキシメチル−7α−メトキシ−３
   −セフエム−４−カルボン酸を蓄積させ、該化合
   物またはその塩にＤ−アミノ酸酸化酵素活性を有
   する菌体またはその処理物を過酸化水素の存在下
   作用させて7β−（４−カルボキシブチラミド）−
   ３−ヒドロキシメチル−7α−メトキシ−３−セ
   フエム−４−カルボン酸またはその塩を生成さ
   せ、これにジケテンを反応させて、7β−（４−カ
   ルボキシブチラミド）−３−（３−オキソブチリル
   オキシ）メチル−7α−メトキシ−３−セフエム
   −４−カルボン酸またはその塩を得、ついで、こ
   の化合物に１−メチル−５−メルカプトテトラゾ
   ールを反応させることを特徴とする7β−（４−カ
   ルボキシブチラミド）−３−（１−メチル−1H−
   テトラゾール−５−イル）チオメチル−7α−メ
   トキシ−３−セフエム−４−カルボン酸の製造
   法。