JPH025396B2

JPH025396B2 -

Info

Publication number: JPH025396B2
Application number: JP55119490A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Gushima; Takeshi Saito; Yoji Yamaguchi; Kenichi Suzuki; Katsuyuki Funakoshi; Toshiaki Myoshi; Shozo Abe; Narimasa Tsunoda; Toshio Sasaki
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-08-29
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1990-02-01
Also published as: JPS5743697A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、7β−（５−アミノ−５−カルボキシ
バレラミド）−３−ヒドロキシメチル−7α−メト
キシ−３−セフエム−４−カルボン酸（以下化合
物（）と略称する）の醗酵による改良製造法に
関する。

化合物（）を製造する従来の方法は、ストレ
プトミセス・チヤートリウシスSF−1623を好気
的条件下に培養し、培養液からこの物質を採取す
る方法が知られている（特開昭50−121488）。同
公開公報によれば、その方法は、化合物（）の
直接製造法であり、セフアマイシンＣから化学的
に５工程を経て製造される既知の方法（特開昭46
−3286）に比べて著しい有利性を有していること
が記されているが、この方法の収量は低く、工業
的実施に適したものとは云いえない。

本発明者等は、化合物（）の効率的な製造法
の研究を鋭意進めてきたが、本発明者等が先に分
離した菌株につき種々培養の条件を検討し化合物
（）の生産性の著しくすぐれた方法を見出し、
本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ストレプトミセスオガ
ノネンシスを培養して化合物（）を培地に蓄積
させ、これを採取することを特徴とする化合物
（）の製造法である。即ち、本発明は上記培養
に際し、培地中に炭酸マグネシウムを添加するこ
とにより高収率で化合物（）を得る方法であ
る。ストレプトミセスオガノネンシスに属する
菌株としては、たとえばストレプトミセスオガ
ノネンシスＹ−G19Zが知られているが、この菌
株は埼玉県秩父郡小鹿野町の土壌より単離された
放線菌であり、その菌学的性状は、特開昭52−
79081に示されている。この菌株は、微工研菌寄
第2725号として、また、アメリカン、タイプ、カ
ルチヤー、コレクシヨンATCCNo.31167として寄
託されてる。

ストレプトミセスオガノネンシスＹ−G19Z
は、特開昭55−79394号公報に記載されているよ
うにセフアロスポリン核の３位にＰ−ハイドロキ
シシンナモイルオキシメチル基又はその硫酸エ
ステルを持つ7α−メトキシセフアロスポリンを
生産し、又特開昭52−79081号公報に記載されて
いるように、特定のチオール化合物の存在下に培
養することにより、それらのチオール化合物がセ
フアロスポリン核の３位にメチレン基を介して取
り込まれた一連の７−メトキシセフアロスポリン
化合物を生産しうる菌株として知られている。し
かるに、本発明者等は、同菌株の醗酵培養条件を
種々検討し、炭酸マグネシウムを添加して培養し
たところ、化合物（）が高濃度に生産されるこ
とを知つた。本菌株による化合物（）の単位ブ
ロス量当りの収量は極めて高く、頭記の公知菌株
ストレプトミセスチヤートリウシスSF−1623
の1000倍以上に達する。従つて本発明は、化合物
（）の工業的生産方法として実用的価値の高い
ものである。

本発明による化合物（）の生産は、ストレプ
トミセスオガノネンシスに属する菌株を培地に
培養することによつて行なわれ、特に、培地中に
炭酸マグネシウムを0.01〜１％添加して行われる
のが望ましい。

ストレプトミセスオガノネンシスに属する菌
株としては、上述のＹ−G19Z株に限定されるも
のではなく、その人工変異株または天然変異株を
も包含する。培養方法は一般微生物の培養方法に
準じておこなわれるが通常は液体培地による深部
培養法が有利である。培養に用いられる培地とし
ては、ストレプトミセス属に属する本菌株が利用
する栄養源を含有する培地であればよい。すなわ
ち合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用い
られ、培地の組成は、たとえば炭素源としてはグ
ルコース、シユークロース、マンニトール、グリ
セリン、デキストリン、でん粉、植物油などが、
窒素源しては肉エキス、ペプトン、グルテンミー
ル、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンス
チープリカー、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素その他の有機
または無機の窒素源が用いられる。また金属塩し
してNa、Ｋ、Mg、Ca、Zh、Feなどの硫酸塩、
硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐酸塩などが必要に応
じて添加される。殊に、炭酸マグネシウムの添加
は、化合物（）の生産能（力価）を高めるのに
有効である。さらに必要に応じて、メチオニン、
システイン、シスチン、オレイン酸メチル、ラー
ド油、シリコン油、界面活性剤などの抗生物質生
成促進物質又は消泡剤が適宜使用される。

培養条件としては好気的条件下に培養するのが
一般的に有利で、培養温度は約18〜35℃の範囲が
望ましく、好ましくは約30℃附近が用いられ、培
地のPHは約５〜10、好ましくは約６〜８の範囲に
保持すると好結果が得られる。培養期間は培地の
組成、温度などによつて変動するが、一般に３〜
10日程度でよく、培養終了時に目的物質が蓄積さ
れる。

培養物より本発明の目的物を単離採取するには
通常の微生物の培養物より抗生物質を単離する方
法が適用される。本抗生物質（）は主に培養液
中に含有されるので、遠心分離または過により
菌体を除去した後、過液から有効物質の抽出を
おこなう。すなわち適当な溶剤に対する溶解性お
よび溶解度の差、溶液からの析出性および析出速
度の差、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、
２種の液相間における分配の差などを利用する一
般の抗生物質の製造に用いられる手段によつて、
分離、採取、精製される。この方法は必要に応じ
て単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合
せ、また反覆して適用できる。

実施例１澱粉１％、グルコース１％、大豆粉1.5％、イ
ーストエキス0.5％、リン酸水素ナトリウム0.1
％、硫酸マグネシウム0.05％、食塩0.3％を含む
培地を500mlの坂口フラスコに100mlづつ分注し
120℃、20分間滅菌する。それにスレレプトミセ
スオガノネンシスＹ−G19Zを接種し、40時間
培養する。別途に上記培地を２の坂口フラスコ
に400ml分注し120℃、20分間滅菌したものに上記
培養液を２〜３％接種して30℃、24時間培養を行
い種培養とする。別にデキストリン18％、グリセ
リン２％、大豆粉２％、グルテンミール２％、炭
酸マグネシウム0.2％、水素化ナトリウム0.23％
を含む主醗酵培地20及び消泡剤としてアデカノ
ール（商品名）５mlを30の醗酵槽に仕込み120
℃、30分間滅菌したのち、これに種培養液600ml
を接種30℃で150時間培養すると化合物（）が
5100γ／ml蓄積した。培養終了後4N塩酸水でPH
4.0に調整しラジオライト（商品名）を加えて
過し過洗液と合せ24の液が得られる。この
液をHP.20（三菱化成社製）６のカラムを通
過させる。通過液を4N水酸化ナトリウム水でPH
7.0に修正したのち、旭硝子社製イオン交換
（AMV及びCMV）を用いた電気透析槽を使用し
て40時間電気透析を行い脱塩した。

次いでダウエツクス１×２（Cl^-）（ダウケミカ
ル社製）５のカラムに吸着させ、水洗後0.2M
の食塩水溶液にて溶出しHPLC（高速液体クロマ
トグラフイー）カラム：LS224（東洋曹達社製）4φ×500mm 溶出液：0.02Mクエン酸（PH3.2）検出：UV検出器254nｍにて分析し化合物（）の画分を集める。この溶
出画分を上記電気透析装置を用いて16時間電気透
析し脱塩する。脱塩後、減圧濃縮して凍結乾燥す
る。

この粗粉末をさらにアビセルカラム（溶媒イソ
プロパノール：水＝７：３）で精製しHPLCで分
析し溶出時間８分の化合物（）の画分を集め減
圧濃縮後、凍乾すると52ｇの化合物（）の粗粉
末（純度79％）が得られた。

さらに理化学的析のため、この（）の粉末の
一部を順次アビセルカラム（展開溶媒イソピプロ
パノール：水＝８：２）、セフアデツクスG.10カ
ラム（展開溶媒水）で精製し、凍結乾燥後50℃で
５時間真空乾燥すると40mgの化合物（）の白色
粉末が得られた。

これの理化学的性状を示す。

(1) 核磁気共鳴スペクトル（D₂O） ppm：1.83（2H、多重線） 2.48（4H、多重線） 3.45〜3.60（2H、二重線Ｊ＝17.8） 3.54（3H、一重線） 4.25（2H、一重線） 5.18（1H、一重線） (2) 赤外吸収スペクトル 1760cm^-1にβ−ラクタムの吸収 (3) 紫外部吸収スペクトル PH7.01/15Ｍリン酸緩衡液中で測定すると
263nｍ（Ｅ1cm １％157.4）に吸収極大を示した。

(4) 元素分析値（C₁₅H₂₀N₃O₈SNa・１1/2H₂O
として）Ｃ（％）Ｈ（％）Ｎ（％）分析値 38.70 5.35 8.86 理論値 38.30 5.36 8.93 Ｓ（％）分析値 6.78 理論値 6.17 (5) 薄層クロマトグラフイー（アビセルSF） Rf値＝0.36 参考例１実施例１において主発酵培地から炭酸マグネシ
ウムを除いた培地20を30の醗酵槽で行つた。
150時間の化合物（）の醗酵力価は2350γ／ml
であり、この醗酵液を実施例１と同様にHP20
カラム通過、電気透析、ダウエツクス１×２
（Cl^-）カラムクロマト、電気透析、アビセルカ
ラムクロマト（展開溶媒イソピプロパノー
ル：水＝７：３）で精製を行い減圧濃縮後、凍結
乾燥すると化合物（）の粗粉末40ｇ（純度64
％）が得られた。

Claims

【特許請求の範囲】

１ストレプトミセス属に属する7β−（５−アミ
ノ−５−カルボキシバレラミド）−３−ヒドロキ
シメチル−7α−メトキシ−３−セフエム−４−
カルボン酸生産菌を炭酸マグネシウムの存在下に
培養して7β−（５−アミノ−５−カルボキシバレ
ラミド）−３−ヒドロキシメチル−7α−メトキシ
−３−セフエム−４−カルボン酸を蓄積させ、こ
の物質を採取することを特徴とする7β−（５−ア
ミノ−５−カルボキシバレラミド）−３−ヒドロ
キシメチル−7α−メトキシ−３−セフエム−４
−カルボン酸の改良製造法。