JPH0438390B2 - - Google Patents

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JPH0438390B2
JPH0438390B2 JP57034035A JP3403582A JPH0438390B2 JP H0438390 B2 JPH0438390 B2 JP H0438390B2 JP 57034035 A JP57034035 A JP 57034035A JP 3403582 A JP3403582 A JP 3403582A JP H0438390 B2 JPH0438390 B2 JP H0438390B2
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streptomyces
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antibiotic
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規な微生物に関し、さらに詳しく
は、ストレプトミセス属に属するカルバペネム系
抗生物質生産菌であつて式 式中、R1は水素原子、水酸基又は基−Ｏ−SO3
Ｈを表わす、 で示される化合物の脱パントテノイル化酵素活性
が欠失した新規微生物及びこれらのＬ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アルギニン又はアデニン要求性変異菌、
ストレプトミセス属に属するカルバペネム系抗生
物質生産菌であつて上記式（）で示される化合
物の脱パントテノイル化酵素活性及びアセチル化
酵素活性を有する微生物の栄養要求性変異菌、並
びに上記２種の変異菌の細胞融合によつて創製さ
れる式 式中、R1は水素原子、水酸基又は基−Ｏ−SO3
Ｈを表わす、 で示される化合物の生産能を有する新規微生物に
関する。 下記式 で示される７−オキソ−１−アザビシクロ
〔3.2.0〕ヘプト−２−エン−２−カルボン酸骨格
（カルバペネム骨格）を有する抗生物質（以下こ
の骨格を有する抗生物質をカルバペネム系抗生物
質という）は、一般に高い抗菌力とβ−ラクタマ
ーゼ阻害活性を有しており、従来から、ストレプ
トミセス属に属する各種の微生物の発酵培養液か
ら種々のカルバペネム系抗生物質が単離されてい
る〔例えば、チエナマイシン（ジヤーナル・オ
ブ・アンテイビオテイクス、32巻（1979年）、１
〜12頁）、エピエエナマイシン類（第17回インタ
ーサイエンス・コンフアランス・オン・アンテイ
ミクロビアル・エイゼンツ・アンド・ケモテラピ
ー、要旨第80および第81号（1977年））、Ｎ−アセ
チルチエナマイシン（西ドイツ特許2652681号
（1977年））、オリバニン酸類（ジヤーナル・オ
ブ・アンテイビオテイクス、32巻（1979年）、287
〜304頁）、PS−５（ジヤーナル・オブ・アンテイ
ビオテイクス、32巻（1979年）、262〜286頁及び
ジヤーナル・オブ・フアーメンデイシヨン・テク
ノロジー、57巻（1979年）265〜272頁）、PS−６
（公開特許公報昭54−59295号）、PS−７（公開特
許公報昭54−92983号）など〕。 しかし、これ迄に提案されているカルバペネム
系抗生物質はカルバペネム骨格の３−位にアミノ
エチルチオ基やアセチルアミノエチルチオ基など
の短鎖の置換基を有するものばかりである。 ところが、ごく最近、本発明者らが見い出した
ストレプトミセス・sp.OA−6192（FERMBP−
11）が、これまでに発表されているカルバペネム
系抗生物質と３−位の置換基の種類においてタイ
プの異なる、すなわち３−位に長鎖のパントテノ
イルアミノエチルチオ基を有する前記式（）で
示される抗生物質OA−6129A、Ｂ及びＣを生産
することが判明し先に提案した（特願昭55−
135829号、同55−144507号及び55−170864号出願
明細書参照）。 そこで、本発明者らは、３−位にパントテノイ
ル基を含まない従来のタイプのカルバペネム系抗
生物質生産菌と上記の３−位にパントテノイル基
を含む抗生物質OA−6129A、Ｂ及びＣ生産菌の
間の生合成的相違について鋭意研究を重ねた結
果、ストレプトミセス属に属する従来のタイプの
カルバペネム系抗生物質生産菌はカルバペネム系
抗生物質の生合成経路において中間で３−位にパ
ントテノイル基を含むカルバペネム系化合物を生
成した後これに脱パントテノイル化酵素を作用さ
せてパントテノイル基を離脱せしめることにより
最終のカルバペネム系抗生物質を生産しているこ
と（なお、この脱パントテノイル化酵素に関して
は特願昭56−101161号出願明細書参照）、そして
逆に、抗生物質OA−6129A、Ｂ及びＣ生産菌は
脱パントテノイル化酵素活性を本質的に欠失して
いるという事実をつきとめ、従来のタイプのカル
バペネム系抗生物質生産菌に変異処理を加えて脱
パントテノイル化酵素活性が欠失した突然変異菌
を多数創製し、上記事実の確認を行なつた。かか
る脱パントテノイル化酵素活性が欠失したカルバ
ペネム系抗生物質生産菌は従来の文献に未載の新
規な微生物である。 しかして、本発明によれば、ストレプトミセス
属に属するカルバペネム系抗生物質生産菌であつ
て、前記式（）で示される化合物の脱パントテ
ノイル化酵素活性が欠失した新規微生物が提供さ
れる。 本発明により提供される新規微生物には、天然
界から検索されたもの及び何らかの変異処理によ
つて既知の微生物から創製されたものの両者が包
含される。 本発明の新規微生物を天然界から検索により取
得する場合、その検索は次のようにして行なうこ
とができる。 すなわち、天然界からの検索がβ−ラクタム感
受性菌を検定菌とするビオアツセイ寒天平板と、
これに種々のタイプのβ−ラクタマーゼを添加し
たビオアツセイ寒天平板とを用いて、土壌分離菌
の培養液を検定し、前者の寒天平板に阻止円を
与え、更に後者のいくつかの寒天平板における阻
止円が前者のそれより小さい培養液を与える土
壌分離菌を検索する。次にその土壌分離菌の培養
液中の活性成分を活性炭に吸着させ、その溶出濃
縮液をペーパークロマトグラフイーまたは薄層ク
ロマトグラフイーで展開し、β−ラクタム感受性
菌を検定菌とするビオオートグラフイーにより抗
生物質OA−6129群に属する化合物が検出されれ
ば、その菌は本発明の微生物であるということが
できる。 この検索方法を具体例によりさらに説明すれば
次に通りである。 β−ラクタム感受性菌のビオアツセイ寒天平板
として、後述するコマモナス検定板を用い、これ
にパチルス・セレウス569の生産するβ−ラクタ
マーゼを添加したコマモナスCV検定板と、シト
ロバクター・フロインデイーＥ−９の生産するβ
−ラクタマーゼを添加したコマモナスCM検定板
とを調製する。一方、土壌分離菌の培養液を８
mm直径のパルプデイスクにしませて、それぞれの
検定板に乗せ、35℃で20時間培養したのち、コマ
モナス検定板で阻止円を与え、且つコマモナス
CV検定板またはコマモナスCM検定板での阻止
円がコマモナス検定板での阻止円より小さい、培
養液を与えた土壌分離菌を選出する。 次にその土壌分離菌の培養液に該液の２％
（Ｗ／Ｖ）量に相当する特製白鷺活性炭（武田薬
品工業(株)製）を加え、15分間攪拌した後、遠心分
離により沈殿を集め、この沈殿を用いた培養液
と同容量の蒸留水で洗浄し、再び遠心分離して沈
殿を集める。この沈殿に前記で用いた培養液の
半容量に相当する量の50％（Ｖ／Ｖ）アセトン水
を加え、室温で30分間攪拌後、遠心分離して上澄
をえた。この上澄液をロータリー・エバポレータ
ーを用いて30〜35℃で濃縮して、上記で用いた培
養液に対して20倍の濃縮液をえた。この濃縮液
を東洋紙No.50（東洋紙(株)製）で80％アセトニ
トリル／トリス／EDTA〔アセトニトリル120ml、
PH7.5の1/10Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液30ml、PH7.5の1/10Ｍエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム塩水溶液１mlから
なる〕溶媒を用い下降法ペーパークロマトグラフ
イーを16時間行つた後、コマモナス・テリゲナＢ
−996を検定菌としてビオオートグラフイーを行
なう。そして、抗生物質OA−6129A、同OA−
6129B又は同OA−6129Cと同じ移動距離（Rf値
のところ）に阻止帯を示した土壌分離菌を本発明
の目的微生物の候補として選出する。 このようにして選出された候補菌については、
さらにペーパークロマトグラフイーや薄属クロマ
トグラフイーを行ない、抗生物質OA−6129A、
同OA−6129B又は同OA−6129Cの生産性を確認
する。 これにより、当業者は本発明の目的に適合した
微生物を容易に検索することができる。 上記の如くして検索された抗生物質OA−
6129A、同OA−6129B及び同OA−6129C生産菌
の代表的なものには、ストレプトミセス属に属す
る抗生物質OA−6129A、同OA−6129B及び同
OA−6129C生産菌が包含され、その好適な一例
としては、福岡県福岡市の住吉神社の近くで採取
した土壌から分離した放線菌で、本発明者らが
OA−6129菌株の番号を付した菌株が挙げられ
る。 このOA−6129菌株の菌学的性質は次の通りで
ある。 １ 形態 顕微鏡下でよく分枝した基中菌糸より、直状〜
曲状（Straight〜flexuous）の気菌糸を伸長し、
輪生枝はみとめられない。成熟した胞子鎖は10個
以上の楕円〜円筒形をした胞子から成り、胞子の
うは認められない。胞子の大きさは0.6〜1.0×0.7
〜2.5ミクロン位で、胞子の表面は平滑である。
鞭毛胞子はみとめられない。 ２ 各種培地における生育状態 培養は特記しないかぎり28°〜30℃で行つた。
また色調の記載は主としてエツチ・デイ・トレス
ナーとイー・ジエー・バカス（H.D.Tresner
andE.J.Backus）著、ジヤーナル・オブ・アプラ
イド・ミクロビオロジイー（Journal ofApplied
Microbiology）11巻、４号、（1963年）335〜338
頁の方法に従い、〔〕内に示す符号〔CHMコー
ド（code）〕はコンテイナー・コーポレーシヨ
ン・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニ
ユアル（Container Corporation of Americaの
Color Harmony Manual）を用いた。 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地： 黄灰〔2dc〕〜明るい灰黄茶〔3ge〕の中等
度生育上に、黄灰〔2dc〕〜灰黄ピンク〔5dc〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられな
い。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地： うす黄〔2db〕〜明るいオリーブ茶〔2ge〕
の良好な生育上に、明るい灰〔ｄ〕の気菌糸を
着生する。尚この気菌はおくれて灰黄ピンク
〔5dc〕となる。溶解性色素はみとめられない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP培
地−５）： 穏やかな黄ピンク〔4gc〕〜明るい茶〔4ie〕
の良好な生育上に、明るい灰〔ｄ〕〜明るい灰
赤茶〔5fe〕の気菌糸を着生する。溶解性色素
は認められない。 (4) スターチ無機塩寒天培地（ISP培地−４）： うす黄〔2db〕〜灰色〔2fe〕の良好な生育上
に明るい灰〔ｄ〕の気菌糸を着生する。溶解性
色素は生成しない。 (5) チロシン寒天培地（ISP培地−７）： 灰黄〔3ec〕〜明るい茶〔4ie〕の生育上に、
明るい灰〔ｄ〕〜明るい茶灰〔3fe〕の気菌糸
を着生する。培地は極く僅かに茶色を帯びる。 (6) 栄養寒天培地： うす黄〔2db〕または明るい黄〔2fb〕〜明
るいオリーブ茶〔2ge〕の良好な生育上に、明
るい灰赤茶〔5fe〕の気菌糸を着生する。溶解
性色素はみとめられない。 (7) イーストエキス・麦芽エキス寒天培地（ISP
培地−２）： 穏やかな黄ピンク〔4gc〕〜明るい茶〔4ie〕
の良好な生育上に、灰黄ピンク〔5dc〕或いは
やゝおくれて明るい灰〔ｄ〕の気菌糸を着生す
る。溶解性色素はみとめられない。 (8) オートミール寒天培地（ISP培地−３）： 灰黄色〔3ec〕〜明るいオレンジ黄〔3ea〕、
或いは明るい灰黄茶〔3ge〕の良好な生育上
に、明るい茶灰〔3fe〕〜明るい灰赤茶〔5fe〕
の気菌糸を着生し、菌集落の周辺の培地は僅か
に褐色を呈す。 (9) リンゴ酸石灰寒天培地： 暗色〜黄灰〔2dc〕の中等度の生育上に、明
るい灰〔ｄ〕〜明るい灰赤茶〔5fe〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。生育
菌集落の周辺にカルシウム塩の溶解帯が見られ
る。 (10) グレコース・ペプトン・ゲラチン培地（20℃
培養） うす黄〔2db〕〜茶色の良好な生育上に白色
〔ｂ〕〜灰黄ピンク〔5cb〕の気菌糸を着生す
る。培養長期（約３週間以上）にわたると褐色
の溶解性色素を生成した。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲 イーストエキス・麦芽エキス寒天培地（ISP培
地−２）を用いて10°、20°、25°、30°、34°、37°
、
40°、45°、50℃の各温度で実験の結果、37℃では
殆んど発育出来ない。40℃以上では全く発育しな
い。その他の各温度では生育がみとめられた。最
適生育温度範囲は20〜30℃と思われる。 (2) ゲラチンの液化：液化する。 (3) スターチの加水分解：分解する。 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固しない
が、ペプトン化する。 (5) メラニン様色素の生成： ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ISP培地−
６）及びトリプトン・イーストエキス・プロス培
地（ISP培地−11）ではメラニン様色素の生成は
認められなかつた。チロシン寒天培地で極く僅か
に茶色を呈するも、メラニンの生成は痕跡程度で
ある。 ４ 各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリブ
寒天倍地使用） (1) Ｌ−アラビノ−ス ＋ (2) Ｄ−キシロース ＋ (3) Ｄ−グルコース ＋ (4) Ｄ−フラクトース ＋ (5) シユークロース 疑わしい (6) イノシトール − (7) Ｌ−ラムノース ＋ (8) ラフイノース − (9) Ｄ−マンニツト ＋ ＋は同化する、−は同化しない。 以上の菌学的性質よりOA−6129菌株は
Streptomyces属に属する菌株であつて、気菌糸
の形状はセクシヨンRF（Section Rectifle−
xibiles）と考えられ、胞子表面平滑であつた。
気菌糸の色調は大多数の培地、即ちオートミール
寒天、グリセリン・アパラギン寒天、スターチ・
無機塩寒天等の培地では明るい灰色〔ｄ〕で、灰
色系（Gray series）の菌株である。しかしシユ
ークローズ・硝酸塩寒天、イーストエキス・麦芽
エキス寒天、及びグルコース・アスパラギン寒天
培地では培養時期に依つては灰黄ピンク〔5dc〕
の赤色系（Red series）を呈する事がある。ま
た、基中菌糸の色は培養初期はいづれの培地でも
うす黄〜灰黄で、培養を続けると黄茶〜灰黄茶或
いは茶色の色調を示す様になる。メラニン色素は
ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地中及びト
リプトン・イーストエキス・プロス中にみとめら
れず、またその他の水溶性色素も多くの培地で生
成しなかつた。しかしチロシン寒天倍地、グルコ
ース・ペプトン・ゲラチン培地及びオートミール
寒天倍地中に僅かに茶色の色素をみとめた。 本発明者等は本菌をストレプトミセス・sp.OA
−6129（Streptomyces sp.OA−6129）として、
工業技術院微生物工業技術研究所に特許手続上の
微生物の寄託に関するブタペスト条約による国際
寄託として微工研条寄第11号（FERM BP−11）
として寄託している。 なお、上記菌学的性質をさらに検討したところ
によれば、上記の菌株はストレプトミセス・クレ
メウス（Streptomyces cremeus）種に属する菌
株と認めることができる。 また、本発明の新規微生物はまた、ストレプト
ミセス属に属する既知のカルバペネム系抗生物質
生産菌に変異処理を加えることによつて創製する
ことも可能である。 この創製に使用しうるカルバペネム系抗生物質
生産菌は、ストレプトミセス属に属する式 式中、R2は水素原子又はアセチル基を表わし、 R1は前記の意味を有する、 で示されるカルバペネム系抗生物質を主生産物又
は副生産物として生産する能力を有する任意の微
生物であることができ、具体的には次のものを例
示することができる：ストレプトミセス・フルボ
ビリデスA933（FERMB Ｐ−10）、ストレプトミ
セス・カトレヤ（NRRL8057またはFERM Ｐ−
33095）ストレプトミセス・フルボビリデス
（ATCC15863若しくは21954）、ストレプトミセ
ス・フラボグリゼウス（NRRL8139若しくは
8140）、ストレプトミセス・オリバセウス
（ATCC21379〜21382、31126若しくは31365）、ス
トレプトミセス・ケダネンシス（ATCC4880）、
ストレプトミセス・アルゲンテオルス
（ATCC11009）、ストレプトミセス・フラボビレ
ンス（ATCC3320）、ストレプトミセス・フラア
ブス（ATCC3369）、ストレプトミセス・シオヤ
エンシス（ATCC13989）、ストレプトミセス・サ
ブスピーシーズ・オーラテイリス（ATCC31358）
又はストレプトミセスsp.SF−2050（FERMP−
4358）など。 これらの微生物はそれ自体公知の変異処理に付
すことにより脱パントテノイル化酵素活性が欠失
した突然変異菌に変えることができる。 すなわち、上記の如くカルバペネム系抗生物質
生産菌を紫外線照射、放射線照射、化学変異誘起
剤処理等の通常の変異誘導方法によつて処理する
ことにより、脱パントテノイル酵素活性が欠失し
た菌株を取得することができる。ここでは、スト
レプトミセス・フルボビリデイスA933（FERM
BP−10）を用いてＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）処理によつて変
異を行つた場合について以下さらに詳細に説明す
るが、他の菌についても同様にして変異処理を行
なうことができる。 (1) 変異処理 イーストエキス−麦芽エキス寒天倍地（ISP培
地−２）上で28℃、２週間培養したストレプトミ
セス・フルボビリデイスA933の斜面培養１本の
表面からかきとつた胞子をジオクチルスルホサク
シネート0.005％を含むPH8.5の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液10mlに懸濁し、ミリポアフイルター
（孔径10ミクロン，LCWP）で過し、液に
NTGを最終濃度400μg／mlになるように添加し
28℃で1.5時間保つ。このとき90％の殺胞子効果
があつた。NTG処理胞子液を2500×ｇで20分間
遠心分離し、胞子を0.85％生理食塩水に懸濁し、
適当に希釈して、その胞子懸濁希釈液をISP培地
−２上に塗布し、28℃で７日間培養を行いコロニ
ーを形成させた。 (2) 変異菌株の単離法 上記の如くISP培地−２上に形成したコロニー
を拾い、ISP培地−２斜面培地上に移し28℃で２
週間培養を行つた。これらの各菌株の斜面培地か
ら１白金耳をSE−４種母培地〔牛肉エキス0.3
％、バクトトリプトン0.5％、グルコース0.1％、
可溶性でんぷん2.4％、酵母エキス0.5％、炭酸カ
ルシウム0.4％、大豆粉（味の素(株)製ミート特等）
0.5％、PH7.0〕３mlを含む試験管培地へ接種し、
28℃で２日間振とう培養した。つぎのこの培養液
0.5mlをG.M.培地（大豆粉4.5％、グリセリン10
％、K2HPO40.2％、MgSO4・7H2O0.1％、CaCO3
0.3％、ビタミンB125γ／ml、PH7.0）10mlを含む
250ml三角フラスコに接種し、28℃でロータリー
シエーカー上４日間培養した。この培養液を用い
て前記に示した検索方法により脱パントテノイル
化酵素欠失菌株ストレプトミセス・フルボビリデ
イスN1501株を見出した。これにより、当業者は
本発明の目的に適合した微生物を式（）で示さ
れるカルバペネム系抗生物の生産能を有する菌か
らそれ自体公知の変異処理により容易に検索する
ことができる。 上記の如くして検索された微生物の一例である
ストレプトミセス・フルボビリデイスN1501株の
菌学的性質は次の通りである。 １ 形態 顕微鏡下でよく分枝した基中菌糸より、直状〜
曲状（Straight〜flexuous）の気菌糸を伸長し、
輪生枝はみとめられない。成熟した胞子鎖は10〜
50個の楕円〜円筒形をした胞子から成り、胞子の
うは認められない。胞子の大きさは（0.8〜1.0）
×（1.0〜2.0）ミクロン位で、胞子の表面は平滑
である。鞭毛胞子はみとめられない。 ２ 各種培地における生育状態 培養は特記しないかぎり28°〜30℃で行つた。
また色調の記載は主としてエツチ・デイ・トレス
ナーとイー・ジエー・バカス（H.D.Tresner
andE.J.Backus）著、ジヤーナル・オブ・アプラ
イド・ミクロビオロジイー（Journal of
Applied Microbiology）11巻、４号、（1963年）
335〜338頁の方法に従い、〔〕内に示す符号
〔CHMコード（code）〕はコンテイナー・コーポ
レーシヨン・オブ・アメリカのカラー・ハーモニ
ー・マニユアル（Container Corporation of
AmericaのColor Harmony Manual）を用い
た。 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地： 黄灰〔2dc〕〜灰色〔2fe〕の中等度生育上
に、明るい茶灰〔3fe〕〜茶灰〔5ih〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地： 明るい黄〔１1/2fb〜2fb〕の良好な生育上
に、明るい茶灰〔3fe〕〜暗い灰〔3ih〕の気菌
糸を着生し、溶解性色素はみとめられない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP培
地−５）： 灰黄〔3ec〕一部明るい茶灰〔3fe〕の良好な
生育上に、明るい灰〔ｄ〕〜明るい灰赤茶
〔5fe〕の気菌糸を着生する。溶解性色素はみと
められない。 (4) スターチ無機塩寒天培地（ISP培地−４）： うす黄〔2db〕〜うす黄緑〔241/2dc〕の良
好な生育上に暗い灰〔3ih〕の気菌糸を着生す
る。溶解性色素は生成しない。 (5) チロシン寒天培地（ISP培地−７）： 明るい黄〔2fb〕、後に明るいオリーブ茶
〔2ge〕の良好な生育上に、明るい灰〔ｄ〕だ
がやや緑がかつた。気菌糸を着生する。培地は
極く僅かに茶色を帯びる。 (6) 栄養寒天培地： 明るい茶灰〔3fe〕の中等度生育上に、明る
い灰〔ｄ〕の気菌糸を着生する。溶解性色素は
みとめられない。 (7) イーストエキス・麦芽エキス寒天培地（ISP
培地−２）： 白〔ｂ〕の良好な生育上に、明るい茶灰
〔3fe〕〜茶灰〔5ih〕の気菌糸を着生する。溶
解性色素はみとめられない。 (8) オートミール寒天培地（ISP培地−３）： 暗い灰〔3ih〕の良好な生育上に、明るい茶
灰〔3fe〕〜暗い灰〔3ih〕の気菌糸を着生す
る。溶解性色素は認められない。 (9) リンゴ酒石灰寒天培地： 明るいオリーブ茶〔2ge〕の中等度の生育上
に、明るい灰茶〔3fe〕の気菌糸を着生し、溶
解性色素はみとめられない。 (10) ペプトン・イーストエキス・鉄寒天倍地
（ISP培地−６）： うす黄〔2db〕の良好な生育上にあわい白
〔ｗ〕〜明るい灰〔ｄ〕の気菌糸を着生する。 ３ 生理的性質 (1) 生育温度範囲 イーストエキス・麦芽エキス寒天培地（ISP
培地−２）を用いて10°、20°、25°、30°、34°、
37°、40°、45°、50℃の各温度で実験の結果、37
℃では殆んど発育出来ない。40℃以上では全く
発育しない。その他の各温度では生育がみとめ
られた。最適生育温度範囲は20〜30℃と思われ
る。 (2) ゲラチンの液化：液化する。 (3) スターチの加水分解：分解する。 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固しない
が、ペプトン化する。 (5) 硝酸塩の還元：還元する (6) メラニン様色素の生成： ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ISP培地
−６）及びチロシン寒天倍地ではメラニン様色
素の生成は認められなかつた。トリプトン・イ
ーストエキス・ブロス培地（ISP培地−11で極
く僅かに茶色の色素を生産した。 ４ 各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリブ
寒天倍地用） (1) Ｌ−アラビノ−ス ＋ (2) Ｄ−キシロース ＋ (3) Ｄ−グルコース ＋ (4) Ｄ−フラクトース ＋ (5) シユークロース ± (6) イノシトール − (7) Ｌ−ラムノース ＋ (8) ラフイノース − (9) Ｄ−マンニトール ＋ ＋は同化する、−は同化しない。 以上の菌学的性質をもつストレプトミセス・フ
ルボビリデイスN1501はその親菌株であるA933
株と生産する抗生物質は異にするが、その菌学的
性質は同じであつた。 該菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第103号（FERM BP−
103）として国際寄託されている。 以上に述べた脱パントテノイル化酵素活性が欠
失した新規微生物はさらに変異処理を加えること
によりＬ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン又はＬ−
アデニン要求性等の栄養要求性突然変異菌に変え
ることができる。かかる栄養要求性突然変異菌の
創製はそれ自体公知の変異処理および手段並びに
培地選択法を用いることにより行うことができる
が、ストレプトミセス・フルボビリデイスN1501
を代表例として栄養要求性変異菌株の創製法をさ
らに具体的に説明すれば次のとおりである。 すなわち、ストレプトミセス・フルボビリデイ
スN1501株を紫外線照射、放射線照射、化学変異
誘起剤処理等の通常の変異誘導方法によつて処理
し、微生物遺伝学実験で通常に用いられるレプリ
カ法によつて栄養その他微量要素要求変異株を選
択取得する。 次に、このストレプトミセス・フルボビリデイ
スN1501株を用いて紫外線処理によつてＬ−ヒス
チジン要求株を誘導した例を示す。 イーストエキス・麦芽エキス寒天倍地（ISP培
地−２）上で28℃、２週間培養したストレプトミ
セス・フルボビリデイスN1501株の斜面培養１本
の表面からかき取つた胞子を0.005％ジオクチル
スルホサクシネート含有生理食塩水10mlに懸濁し
シヤーレに移す。このシヤーレをゆるやかに振と
うしつつ表面より30cmの距離において紫外線滅菌
ランプ（20w）を用いて70秒間照射した。このと
き99.9％の殺胞子作用があつた。照射の終つた胞
子懸濁液を適宜希釈してISP培地−２に塗布とし
４日間培養した。１枚のシヤーレ上10乃至200コ
ロニー生じたシヤーレをマスタープレートとレプ
リカ法で最少培地（Ｌ−アスパラギン0.05％、K2
HPO40.05％、MgSO4・7H2O0.02％、グコース
1.0％（別殺菌）、デイフコバクトアガー1.5％、
および微量金属要素溶液〔蒸留水１につきZo
Cl240mg、FeCl3・6H2O200mg、CuCl210mg、Mo
Cl2・4H2O10mg、Na2B4O7・10H2O10mg、（NH4）
0Mp24・4H2O10mgを溶かしたもの）を１につき
２ml加える。PH7.0〕と完全培地（ISP培地−２）
にレプリカし７日間培養して完全培地のみで生育
するコロニーを選択し、ISP培地−２の書面培地
上に拾つた。これらの栄養要求株についてホリデ
イの方法〔NatureNo.4540，p987（1956）〕によつ
て要求物質を決定したところＬ−ヒスチジン要求
株としてストレプトミセス・フルボビリデイス
N1501−No.24が得られた。この菌株は親菌株と同
様に脱パントテノイル酵素欠失株であり、式
（）で示される抗生物質OA−6129群の生産能
を有しており、栄養要求性は異にするが、その菌
学的性質は親菌株であるストレプトミセス・フル
ボビリデイスN1501と同一であつた。 上記の如く創製されたストレプトミセス・フル
ボビリデイスN1501−No.24は、通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第105号
（FERM BP−105）として国際寄託されている。 さらに、本発明によれば、ストレプトミセス属
に属するカルバペネム系抗生物質生産菌であつ
て、前記式（）で示される抗生物質OA−6129
群の脱パントテノイル化酵素活性及びアセチル化
酵素活性を有する微生物のＬ−アルギニン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−アデニン又
はビタミンB6要求性変異菌が提供される。 かかる栄養要求性変異菌の創製に使用しうる親
菌株は、ストレプトミセス属に属する式 式中、R1は前記の意味を有する。 で示される化合物を主生産物又は副生産物として
生産する能力を有する任意の微生物であることが
でき、その具体例としては次のものを例示するこ
とができる：ストレプトミセス・フルボビリデス
A933（FERM BP−10）、ストレプトミセス・カ
トレヤ（NRRL8057orFERM Ｐ−33095）スト
レプトミセス・フルボビリデス（ATCC15863若
しくは21954）、ストレプトミセス・フラボグリゼ
ウス（NRRL8139若しくは8140）、ストレプトミ
セス・オリバゼウス（ATCC21379、〜21382、
31126若しくは31365）、ストレプトミセス・ゲダ
ネンシス（ATCC4880）、ストレプトミセス・ア
ルゲンテオルス（ATCC11009）、ストレプトミセ
ス・フラボビレンス（ATCC3320）、ストレプト
ミセス・フラアブス（ATCC3369）、ストレプト
ミセス・シオヤエンシス（ATCC13989）、ストレ
プトミセス・サブスピーシーズ・オーラテイリス
（ATCC31358）、又はストレプトミセスsp.SF−
2050（FERM Ｐ−4358）など。 これらの微生物を栄養要求性変異菌に変える方
法はそれ自体公知のものであり、ここではストレ
プトミセス・フルボビリデイスA933を代表例と
してそのＬ−アルギニン要求性菌株に変異する方
法についてさらに詳しく説明するが、その他の菌
株についても同様に処理することにより各栄養性
変異菌に変えることができる。 すなわち、スト
レプトミセス・フルボビリデイスA933（FERM
BP−10）株を紫外線照射、放射線照射、化学変
異誘起剤処理等の通常の変異誘導方法によつて処
理し微生物遺伝学実験で通常に用いられるレプリ
カ法によつて栄養その他微量要素要求変異株を選
択取得する。次にストレプトミセス・フルボビリ
デイスA933（FERM BP−10）株を用いて以下に
述べる如きNTG処理によつてＬ−アルギニン要
求性菌株を誘導する。 イーストエキス・麦芽エキス寒天倍地（ISP培
地−２）上で28℃、２週間培養したストレプトミ
セス・フルボビリデイスA933（FERM BP−10）
株の斜面培養１本の表面からかきとつた胞子を
0.005％ジオクチルスルホサクシネートを含むPH
8.5の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液10mlに懸濁
し、ミリポアフイルター（孔径10ミクロン，
LCWP）で過し液にNTGを最終濃度
400μg／mlになるように添加し、28℃で1.5時間保
つた。このとき90％の殺胞子効果があつた。
NTG処理胞子液を2500xgで20分間遠心分離し、
沈でんした胞子を0.85％生理食塩水に懸濁し宜希
釈して、ISP培地−２上に塗布し28℃で４日間培
養を行いコロニーを形成させた。１枚のシヤーレ
上100乃至200コロニー生じたシヤレーをマスター
プレートとし最少培地（前述と同じ）と完全培地
（ISP培地−２）にレプリカし７日間培養して完
全培地のみで生育するコロニーを選択しISP培地
−２の斜面培地上に拾つた。これらの栄養要求性
株についてホリデイの方法によつて要求物質を決
定し、Ｌ−アルギニン要求性株としてストレプト
ミセス・フルボビリデイス−A933−Ax−14を得
た。この菌株は脱パントテノイル化酵素活性及び
アセチル化酵素活性を保有し、式（−ｂ）で示
されるカルバペネム系抗生物質の生産能を有する
が、栄養要求性を異にする点で親菌株と差違を示
す。しかし、その他の菌学的性質は親菌株と同一
性を有するので前述のストレプトミセス・フルボ
ビリデイスN1501株のそれを参照されたい。これ
により、当業者は上記の栄養要求性をもつ微生物
を、式（−ｂ）で示されるカルバペネム系抗生
物質物の生産能を有する菌からそれ自体公知の変
異手段により容易に創製することができる。 上記のＬ−アルギニン要求性のストレプトミセ
ス・フルボビリデイスA933−Ax−14は、通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第102号（FERM BP−102）として国際寄託
されている。 本発明のさらに別の態様によれば、前述したａ
ストレプトミセス属に属するカルバペネム系抗生
物質生産菌であつて且つ前記式（）で示される
化合物の脱パントテノイル化酵素活性が欠失した
Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン又はＬ−アデニ
ン要求性微生物と ｂストレプトミセス属に属す
るカルバペネム系抗生物質生産菌であつて、前記
式（）で示される化合物の脱パントテノイル化
酵素活性及びアセチル化酵素活性を有し且つＬ−
アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイ
ン、Ｌ−アデニン又はビタミンB6要求性の微生
物との細胞融合によつて創製される式 式中、R1は前記の意味を有する、 で示される化合物の生産能を有する新規微生物が
提供される。 上記ａの微生物とｂの微生物との細胞融合はそ
れ自体公知の方法によつて行なうことができ、例
えば、岡西らの方法〔J.Gen.Microbiol，80，389
−400（1974）〕によつてそれぞれの微生物をプロ
トプラストとし、次いでポリエチレングライコー
ル存在下にR.H.Baltzの方法〔J.Gen.
Microbiol・，107，93−102（1978）〕によつて両
微生物に融合を行い再生培地上で生育させた後、
組換え体としての非要求性菌株を選択することに
より行なうことができる。 以下に前述した如く創製されたストレプトミセ
ス・フルボビリデイス−A933−Ax−14株〔ｂの
微生物の１種〕とストレプトミセス・フルボビリ
デイス−−N1501−No.24株〔ａの微生物の１種〕
を例にとつて細胞融合による新規微生物の調製法
をさらに詳しく説明する。 (1) 微生物の培養 ストレプトミセス・フルボビリデイスA933−
Ax−14株のISP培地−２斜面培地培養より一白金
耳の胞子をとりＮ・Ｚ培地（グリセリン２％、
Ｎ・Ｚ−アミン・タイプA1.0％、酵母エキス0.1
％、MgSO4・7H2O0.05％、K2HPO40.05％、PH
7.0）25mlを含む250ml三角フラスコに接種する。
これを28℃、40時間培養し培養液１mlをＳ培地
〔グルコース1.0％（別殺菌）、ペプトン0.4％、酵
母エキス0.4％、MgSO4・7H2O0.05％、KH2
HPO40.2％、K2HPO40.4％、グリシン0.5％、PH
7.0〕25mlを含む250ml三角フラスコに接種し20時
間振とう培養する。この菌体を遠心分離で集め次
項で示すプロトプラスト調製に供す。 もう一方の菌株としてストレプトミセス・フル
ボビリデイス−N1501−No.24を上記と同じ方法で
培養し菌体を集め次項で示すプロトプラスト調製
に供する。 (2) プロトプラストの調製 上記の如く得られた菌体を0.3Mのシユークロ
ース溶液で１回洗浄し遠心分離により菌体を集め
る。この菌体を細胞壁溶解酵素〔リゾチーム（シ
グマ社製）１mg／ml、Lytic enzyme No.２（協和
発酵(株)製〕0.1mg／ml〕を含むＰ培地〔シユーク
ロース10.3％、K2SO40.025％、MgCl2・6H2O0.2
％、CaCl2・2H2O0.37％（別殺菌）、KH2PO4
0.005％（別殺菌）、0.025M TES緩衝液、微量金
属要素溶液（培地１につき２mlの割合）、PH
7.2〕に懸濁し32℃、２時間反応させる。これを
綿をつめたフイルターを通し、液を遠心分離
（1500×ｇ、10分間）しプロトプラストを沈でん
区分に集める。沈でん物を氷水したＰ培地に懸濁
し遠心分離する。この洗浄操作をさらに１回行つ
た後、10ミクロンミリポアフイルターで過し、
液を遠心分離しプロトプラストを集める。 (3) 融合および再生の方法 上記(2)で得られた２菌株のプロトプラスト懸濁
液２mlを混合し、再び遠心分離し、上澄液を捨
て、Ｐ培地を0.2ml添加する。つづいて40％ポリ
エチレングライコール6000の溶液を２ml加え25℃
に３分間保つた後、Ｐ培地で適宜希釈し、再生培
地であるＡ培地（シユークロース10.3％、グルコ
ース0.5％、マルトエキストラクト0.8％、酵母エ
キス0.3％、MgCl2・6H2O0.4％、CaCl2・2H2
O0.7％、トリスヒドロキシアミノメタン0.3％、
寒天1.5％、PH7.0）上に塗布し26℃、７日間培養
する。 かくして得られたＡ培地上の胞子をかきとり、
常法により懸濁液として、適宜希釈して最少培地
に塗布し７日間培養した。生じたコロニーはＬ−
アルギニンおよびＬ−ヒスチジン非要求性組換え
体となつており、自然突然変異による復帰変異株
でないことは、同時に行つた元株単独の再生菌株
中には非要求性株は検出されない（10-6以下の出
現率）のに対し融合株では再生株中3.7％が非要
求次となつたことから明らかである。 (4) 融合株の生産物 かくの如く得られた融合株をSE−４培地に接
種し28℃、２日間振とう培養し、得られた培養液
0.2mlをG.M.培地10mlを含む250ml三角フラスコ
に接種し、28℃、４日間培養する。この培養液の
遠心分離上澄液5μをワツトンマン紙No.１に
スポツトし、ベロナール緩衝液（PH8.5、イオン
強度0.027）中で42V／cmにて30分間泳動を行い、
紙を検定菌としてスタフイロコツカス・アウレ
ウスFDA209Pを含む寒天培地上に15分間貼りつ
けた後、30℃、一夜培養する。その結果、陰極側
へ少くとも0.5mm通常３〜30mmの範囲で移動する
抗菌活性物質を生産する融合株をストレプトミセ
ス・フルボビリデイスf126株として選択する。こ
の融合株が如何なる抗菌活性物質を生産するかを
確認するため、30ジヤーフアーメンターに15
のG.M.培地を入れ、これに別のジヤーフアーメ
ンターでSE−４培地にて40時間通気攪拌培養し
た上記選択した融合株の種母培養液を300ml添加
し、72時間通気攪拌培養を行つた。培養液をフイ
ルタープレスによつて過し液14をイオン交
換樹脂ダイヤイオンPA306をつめたカラム（径10
cm×高60cm）に通し、通過液を同じ大きさのカラ
ムにつめたダイヤイオンHP20のカラムに吸着さ
せる。このカラムに20％アセトンを流し、200ml
づつのフラクシヨンを集めスタフイロコツカス・
アウレウス209Pに活性のある区分を集める。集
めた活性画分をロータリーエバポレーターにより
真空濃縮しアセトンを留去する。得られた濃縮液
300mlをPH7.2とし、QAE−セフアデツクスＡ−
25（フアルマシア製）1.5cm×40cmのカラムに通
じ、さらに水50mlで水洗した。通過液及び水洗液
を合し、その水溶液に食塩25gを加え、ダイヤイ
オンHP20AG（三菱化成製）1.5cm×40cmのカラ
ムに吸着させ、０％から10％まで連続的にアセト
ン濃度が濃くなる水溶液600mlにて溶出し、１フ
ラクシヨン６mlずつ分画した。そのフラクシヨン
No.15からNo.22までを合し凍結乾燥して白色粉末17
mgを得た。 かくして得られた物質について、特開昭54−
73788号公報に記載の方法によつて溶解性、ペー
パークロマトグラフイー、高圧紙電気泳動、紫
外線吸収スペクトル呈色反応、赤外線吸収スペク
トル、抗菌スペクトルをしらべたところ、下記式 で示される抗生物質NS−５（特開昭55−42536号
公報参照）であることが判明した。 この抗生物質NS−５は細胞融合に供したスト
レプトミセス・フルボビリデイスA933−Ax−14
株及びストレプトミセス・フルボビリデイス
N1501−No.24株によつては生産されない抗生物質
であり、前記(4)で選択された融合株は上記２つの
元の菌株の遺伝形質を受継いだ新規な微生物と認
められる。 この融合株、すなわちストレプトミセス・フル
ボビリデイスf126は通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第104号（FERM
BP−104）として国際寄託されている。 次に、本発明により提供される新規微生物であ
るストレプトミセス・sp.OA−6129及びストレプ
トミセス・フルボビリデイスN1501の有用性を示
すため、以下に実施例を掲げる。 〔実施例〕 (A) 500ml容エルレンマイヤーフラスコに100mlの
下記組成の種母培地（Ｓ−１）を入れ、常法に
より、120℃で15分間殺菌した。一方、ストレ
プトミセス・sp.OA−6129（Streptopmyces sp.
OA−6129）及び、ストレプトミセス・フルボ
ビリデイスN1501（Streptopmyces
fulvoviridis N1501）菌株の胞子を個々に充分
着生させ、これらの一白金耳を各々上記種母培
地に接種し、28℃で48時間ロータリーシエーカ
ー（200rmp、振幅７cm）で振とう培養した。
この種母培養液の各200mlを、それぞれ、下記
組成の種母培地（SE−４）15を入れた30
容ジヤー・フアーメンターに接種し、28℃、
400rpmで攪拌及び7.5／min通気の条件下に
90時間通気攪拌培養を行つた。培養中、各ジヤ
ー・フアーメンターに消泡剤としてシリコン
KM−75〔信越化学(株)製〕をそれぞれ0.07％使
用した。 (B) 以下の具体的な方法については、ストレプト
ミセス・sp.OA−6129（以下「OA−6129菌株」
というについて記載するが、ストレプトミセ
ス・フルボビリデイスN1501（以下「N1501菌
株」という）については、同様に実施した結果
のみを示す。 上記Ａで得られた24時間培養後の種母培養液
２を下記組成の生産培地（GM−１）100
を入れた200容醗酵タンクに接種し、28℃、
200rpmで攪拌及び50／min通気の条件下に
90時間通気攪拌培養を行つた。消泡剤としてシ
リコンKM−75〔前出〕を0.07％使用した。 経時的に培養液をサンプリングし、遠心分離
した上澄液についての抗菌力の測定を行つた。 各時間における測定結果は、下表に示す通り
であつた。
〔抗生物質OA−6129Aの精製〕
抗生物質OA−6129Aを主に含む溶出液を凍結
乾燥することによつて得られた茶褐色粉末を少量
の蒸留水に溶解し、バイオゲルＰ−２（バイオラ
ツド社製）充填カラム（８×100cm）に導き、蒸
留水で展開し、バイオアツセイにより活性画分
1.0を集めた。この活性画分を予め、0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH8.4）で平衡化したQAE−セフア
デツクスＡ−25（フアルマシア社製）充填カラム
（４×40cm）に吸着させ、上記緩衝液200mlで洗浄
後、濃度が０％から４％まで直線的に増加する食
塩水（合計3.0）で溶出を行つた。溶出液を15
mlずつ分画し、バイオアツセイを行い、画分51か
ら画分70まで、合計300mlの活性画分を得た。 この画分を凍結乾燥し、黄褐色の粉末を得た。 この粉末を少量の蒸留水に溶解し、5gの食塩
を加え、ダイヤイオンHP20AG〔三菱化成(株)製〕
充填カラム（２×50cm）に吸着させ、５％食塩水
50mlで洗浄後、蒸留水100mlで洗浄した。濃度が
０％から30％まで直線的に増加するアセトン水
（合計1.）で溶出し、１画分を10mlとし、その
溶出液を分画した。バイオアツセイにより、活性
画分35から画分45までの合計110mlを集め、これ
を凍結乾燥すると、黄褐色の粉末52mgが得られ
た。 抗生物質OA−6129A粗粉末52mgを、少量の蒸
留水に溶解し、セフアデツクスＧ−10（フアルマ
シア社製）充填カラム（２×80cm）に導き、蒸留
水で展開し、バイオアツセイにより、活性画分30
mlを集めた。この活性画分を予め、0.01リン酸緩
衝液（PH8.4）で平衡化したQAE−セフアデツク
スＡ−25（フアルマシア社製）充填カラム（２×
30cm）に吸着させ、上記緩衝液50mlで洗浄後、濃
度が０％から５％まで直線的に増加する食塩水
（合計800ml）で溶出を行い、溶出液を５mlずつ分
画した。バイオアツセイにより、活性画分36から
画分40までの合計25mlを集めた。 この画分に4gの食塩を加え、ダイヤイオン
HP20AG〔三菱化成(株)製〕充填カラム（２×40
cm）に吸着させ、蒸留水50mlで洗浄後、濃度０％
から30％まで直線的に増加するアセトン水（合計
800ml）で溶出し、１画分を５mlとし、その溶出
液を分画した。 バイオアツセイにより、活性画分105から画分
117の合計65mlを集めた。 これを凍結乾燥することにより淡黄色粉末21mg
を得た。 得られた凍結乾燥標品は次の特性を有した。 (1) 形状：淡黄色粉末 (2) 比旋光度：〔α〕24/D：11.6°（ｃ＝1.0、0.01M
リ
ン酸緩衝液、PH8.4） 但し、紫外部吸収においてλmax300nmのε
を5600とした時の値である。 (3) 分子式 理論分子式C20H30N3O7SNa（M.W.＝479） (4) 紫外部吸収スペクトラム λ0.01Mリン酸緩衝液(pH8.4) nax on(〓)：300）5600
） (5) 赤外部吸収スペクトラム（KBr）の主要ピ
ーク νKB〓naxcm-1： 1760（β−ラクタム） 1660（アミド） 1600（カルボキシレート） (6) 核磁気共鳴スペクトラム（溶媒：D2Ｏ） （内部基準：DSS） δ（ppm） 0.89（3H，ｓ，
【式】 0.92（3H，ｓ，
【式】 1.00（3H，ｔ，Ｊ＝7.5Hz，CH2−CH3） 1.60〜2.00（2H，ｍ，CH2−CH3） 2.48（2H，ｔ，Ｊ＝6.5Hz，Ｎ−CH2−CH2−
CO） 2.80〜3.65（11H，ｍ，Ｃ−4H2，Ｃ−6H，
Ｓ−CH2−CH2−Ｎ，Ｎ−CH2−CH2−CO，
Ｃ−CH2−OH） 3.95（2H，ｍ，Ｃ−5H，
〔抗生物質OA−6129B1及びB2精製〕
抗生物質OA−6129B1及びB2を主に含む溶出液
を、凍結乾燥することによつて得られた茶褐色の
粉末を、前述の抗生物質OA−6129Aを主に含む
区分と同様に、順次、バイオゲルＰ−２カラム処
理、QAE−セフアデツクスＡ−25カラム処理、
ダイヤイオンHP20AGカラム処理により溶出さ
れる第１の活性画分から抗生物質のOA−6129B1
の黄褐色粗粉末が840mg、遅れて溶出される第２
の活性画分には抗生物質OA−6129B2の黄褐色粗
粉末が470mg得られた。これらの粗粉末をそれぞ
れ、抗生物質OA−6129A粗粉末と同様に処理し
て、凍結乾燥品として該OA−6129B1の淡黄色粉
末21mgを得た。本粉末はさらに活性炭充填カラム
に吸着させた後、濃度が０％から50％まで直線的
に増加するイソプロピルアルコール水で溶出を行
い、300nmに紫外部極大吸収を有する画分を集
め、これを凍結乾燥して、淡黄色粉末８mgを得
た。また、N1501菌株の培養液からは、ほぼ同一
の性状の該粉末9.5mgが得られた。 得られた凍結乾燥粉末は、次の特性を示した。 (1) 形状：淡黄色粉末 (2) 比旋光度：〔α〕24/D24.2°（ｃ＝0.5、H2Ｏ中） (3) 分子式 C20H30N3O8SNa（M.W.＝495） (4) 紫外部吸収スペクトル λH2O naxnm（ε）300（6400） (5) 赤外部吸収スペクトル νKB〓naxcm-1： 1750（β−ラクタム） 1650（アミド） 1590（カルボキシレート） (6) 核磁気共鳴スペクトラム（溶媒：D2Ｏ、内
部基準DSS） δ：0.86（3H，ｓ，
【式】 0.89（3H，ｓ，
【式】 1.33（3H，ｄ，Ｊ＝6.0Hz
【式】 2.47（2H，ｔ，Ｊ＝6.5Hz，NH−CH2−CH2−
CO） 2.75〜3.70（11H，ｍ，ｃ−4H2，Ｃ−6H，Ｓ−
CH2−CH2−NH，NH−CH2−CH2−CO，
【式】 3.93（1H，ｓ，
【式】 3.95〜4.40（2H，ｍ，Ｃ−5H，
〔抗生物質OA−6129B2の精製〕
抗生物質OA−6129B2の粗粉末470mgを、前記
OA−6129B1と同様に、セフアデツクスＧ−10充
填カラム処理、QAE−セフアデツクスＡ−25充
填カラム処理、さらにダイヤイオンHP20AG充
填カラム処理し、抗生物質OA−6129B2の淡黄色
粉末23mgを得た。 また、N1501菌株の培養液からは、同様な粉末
24.5mgが得られた。 得られた凍結乾燥標品は次の特性を示した。 (1) 形状：淡黄色粉末 (2) 比旋光度：〔α〕24/D14.7°（ｃ＝1.0、0.01Mリ
ン
酸緩衝液、PH8.4） (3) 分子式 C20H30N3O8SNa（M.W.495） (4) 紫外部吸収スペクトラム λ0.01Mリン酸緩衝液(PH8.4) naxon(〓)＝300（5400） (5) 赤外部吸収スペクトラム（KBr）の主要ピ
ーク νKB〓naxcm-1： 1760（β−ラクタム） 1660（アミド） 1600（カルボキシレート） (6) 核磁気共鳴スペクトラム（溶媒：D2Ｏ，内
部基準DSS） δ：0.87（3H，ｓ，
【式】 0.92（3H，ｓ，
【式】 1.28（3H，ｄ，Ｊ＝7.0Hz，
【式】 2.45（2H，ｔ，Ｊ＝6.5Hz，NH−CH2−CH2−
CO） 2.75〜3.60（11H，ｍ，Ｃ−4H2，Ｃ−6H，Ｓ
−CH2−CH2−NH，NH−CH2−CH2−CO，
【式】 3.94（1H，ｓ，
【式】 3.95〜4.35（2H，ｍ，Ｃ−5H，
【式】 (7) ペーパークロマトグラフイー 東洋紙 No.50 展開溶媒 アセトニトリル／0.1Mトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩
衝液（PH7.5）／0.1Mエチレンジアミン水溶液
（PH7.5）＝120／30／１ 検出方法 Comamonas terrigena Ｂ−
996によるバイオオートグラフイー Rf値 0.17 (8) 高圧紙電気泳動 PH8.6のベロナール緩衝液、東洋紙No.51を
用い1500V、30分泳動した。 Rm値0.67（Rm値はPS−５ナトリウム塩の移
動度を1.0としたものである。 (9) 高速液体クロマトグラフイー 充てん剤；マイクロボンダパツクC18 カラム；7.8mm（内径）×30cm （日本ウオーターズリミテツド） 移動相；３％アセトニトリルを含む0.01モル
リン酸二アンモニウム緩衝液（PH7.5） 流量；1.5ml／min 検出方法；紫外部301nm 上記の条件下で、保持時間22.5分である。 以上の理化学的性質から抗生物質OA−
6129B1及びB2の平面構造は、 であり、B1、B2の相違は５，６−位の立体配
置がトランス又はシスで示される異性体と考え
られる。 (C) 抗生物質OA−6129Cの精製 前記の抗生物質OA−6129Cを含む溶出液7.0
をHP20ダイヤイオン（前出）充填カラム（５×
80cm）に吸着させ、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.4）
1.5で洗浄後、濃度が０％から20％まで直線的
に増加するアセトン水（合計6.0）で溶出した。
溶出液を250mlずつ分画し、画分９から画分13ま
での合計1.25の溶出液を得た。 この溶出液を、３％のアルキルジメチルベンジ
ルアンモニウムクロライド〔東京化成(株)製〕を含
むメチレンクロライド1.0で抽出を行い、続い
て、抽出後のメチレンクロライド層を８％ヨウ化
ナトリウム水溶液300mlで再抽出を行つた。 得られた抽出液300mlを予め0.01Mリン酸緩衝
液（PH8.4）で平衡化したバイオゲルＰ−２（前
出）充填カラム（８×100cm）に導き、上記緩衝
液で展開し、バイオアツセイを行い、活性画分
1.2を集めた。 この溶出液をダイヤイオンHP20充填カラム
（４×60cm）に吸着させ、蒸留水600mlで洗浄後、
濃度が０％から10％まで直線的に変化するアセト
ン水（合計3.0）で溶出した。溶出液を15mlず
つ分画し、バイオアツセイを行い、画分41から画
分115までの合計1.1の活性画分を得た。この溶
出液を予め0.01Mリン酸緩衝液（PH8.4）で平衡
化したQAE−セフアデツクスＡ−25（前出）充填
カラム（４×40cm）に吸着させ、上記緩衝液500
mlで洗浄後、濃度が０％から５％まで直線的に増
加する食塩水（合計3.0）で溶出を行つた。溶
出液を15mlずつ分画し、バイオアツセイを行い、
画分112から画分139までの合計420mlの活性画分
を得た。次に、この活性画分に最終濃度が５％に
なるように食塩を加え、ダイヤイオンHP20AG
（前出）充填カラム（３×60cm）に吸着させ、脱
イオン水で溶出を行つた。溶出液を15mlずつ分画
し、バイオアツセイを行い画分31から画分48ま
で、合計270mlの活性画分を得た。この活性画分
を凍結乾燥し、135mgの黄褐色の粉末を得た。 この粉末135mgを少量の蒸留水に溶解し、セフ
アデツクスＧ−10（前出）充填カラム（２×70cm）
に導き、蒸留水で展開し、バイオアツセイを行
い、活性画分合計68mlを得た。 これを予め0.01Mリン酸緩衝液（PH8.4）で平
衡化したQAE−セフアデツクスＡ−25充填カラ
ム（４×30cm）に吸着させ、上記緩衝液800mlで
洗浄後、濃度が０から５％まで直線的に増加する
食塩水（合計2.4）で溶出した。溶出液を13ml
ずつ分画し、バイオアツセイを行い、画分118か
ら画分139まで合計286mlを得た。 これに、最終濃度が５％になるように食塩を加
え、ダイヤイオンHP20AG充填カラム（３×60
cm）に吸着させ脱イオン水で溶出を行つた。溶出
液を10mlずつ分画し、300nmに、紫外部極大吸収
を有する画分を合計90ml集めた。 これを、凍結乾燥し、18mgの淡黄色の抗生物質
OA−6129C粉末を得た。また、N1501菌株の培
養液からは同様に20.0mgの淡黄色粉末を得た。 得られた抗生物質OA−6129Cの凍結乾燥標品
は次の特性を示した。 (1) 形状：淡黄色粉末 (2) 比旋光度：〔α〕24/D17.4°（ｃ＝0.55、0.01Mリ
ン酸緩衝液、PH8.2） (3) 元素分析値C20H29N3O11S2Na・2H2０とし
て） 計算値 C37.91％、H5.25％、N6.63％、
S10.12％ 分析値 C37.61％、H5.00％、N6.38％、
S9.52％ (4) 分子量 597.5731（分子式C20H29N3O11S2Na2 (5) 紫外部吸収スペクトラム（0.01Mリン酸緩衝
液中、PH8.2） λnaxnm（ε）：300.5（7600） (6) 赤外部吸収スペクトラム（KBr）の主要ピ
ーク νKB〓naxcm-1： 1750（β−ラクタム） 1660〜1595（アミド、カルボキシレート） 1250〜1220（硫酸エステル） (7) 核磁気共鳴スペクトラム（重水中）（内部基
準：DSS） δ0.86（3H，ｓ，
【式】 0.89（3H，ｓ，
【式】 1.49（3H，ｄ，Ｊ＝6.5Hz，CH3−CH−） 2.47（２，ｔ，Ｊ＝7.0Hz，NH−CH2−CH2−
CO） 2.70〜3.10（10H，ｍ，Ｃ−4H2，CH2−OH，
NH−CH2−CH2−CO，Ｓ−CH2−CH2−NH） 3.83（1H，dd，Ｊ＝5.5Hz，Ｊ＝9.5Hz，Ｃ−
6H） 3.94（1H，ｓ，
【式】 4.10〜4.43（1H，ｍ，Ｃ−5H） 4.78（1H，dd，Ｊ＝6.5Hz，Ｊ＝9.5Hz
【式】 (8) ペーパークロマトグラフイー 東洋紙 No.50 展開溶媒 アセトニトリル／0.1Mトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩
衝液（PH7.5）／0.1Mエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム水溶液（PH7.5）（120／30／１） 検出方法 Comamonas terrigena
B996によるバイオオートグラフイー Rf値 0.09 （PS−５のRf値は0.31を示した） (9) 高圧紙電気泳動 PH8.6のVeronal緩衝液、東洋紙No.51を用
い1500V、30分泳動した。 Rm値1.69（Rm値はPS−５ナトリウム塩の移
動度を1.0としたものである） (10) 色反応 ニンヒドリンに対する反応：陰性 ニールリツヒ試薬に対する反応：陽性 （11） 加水分解生成物（6NHCl，115℃，18時
間） PH1.8緩衝液による紙電気泳動 （3000V、20分）でシステアミン （Rm値2.26）、β−アラニン（Rm値1.53）
を確認した。（但し、Rm値はアラニンを1.0と
したものである） 以上の理化学的性質から抗生物質OA−
6129Cの平面構造は であり、５，６−シス立体配置を有すると考え
られる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス・クレメウス
    （Streptomyces cremeus）又はストレプトミセ
    ス・フルボビリデス（Streptomyces
    fulvoviridis）に属するカルバペネム系抗生物質
    生産菌であつて、式 式中、R1は水素原子、水酸基又は基−Ｏ−SO3
    Ｈを表わす、 で示される化合物の脱パントテノイル化酵素活性
    が欠失した新規微生物。 ２ ストレプトミセス・sp.OA−6129
    （Streptomyces sp.OA−6129）FERMBP−11又
    はストレプトミセス・フルボビリデイスN1501
    （Streptomyces fulvoviridisN1501）FERM BP
    −103である特許請求の範囲第１項記載の新規微
    生物。 ３ Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン又はアデニ
    ン要求性をさらに有する特許請求の範囲第１項記
    載のの新規微生物。 ４ ストレプトミセス・フルボビリデイスN1501
    −No.24（Streptomyces fulvoviridisN1501−No.
    24）FERM BP−105である特許請求の範囲第３
    項記載の新規微生物。
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