JPH06141875A - 微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ５−アミノレブリン酸生産菌を、特定の天然
成分の特定量を、特に特定の方法で添加した培地で培養
し、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提
供する。 【構成】 酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、麦芽エキス、肉エキスか
らなる群の天然成分から選ばれる少なくとも１種２〜５
０ｇ／リットルを、（１）菌体増殖が対数増殖期中期以
降に達した後に、一度に、または連続的もしくは断続的
に添加するか、（２）培養開始時に１〜１０ｇ／リット
ルを添加し、菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後
に、１〜５０ｇ／リットルを、一度に、または連続的も
しくは断続的に添加した培地で、微工研菌寄第１２５４
２号，第１２５４３号として寄託された５−アミノレブ
リン酸生産菌を培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、５−アミノレブリン酸
生産菌を、特定の天然成分の特定量を添加した培地で培
養して、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方
法、およびこの天然成分の特定量を特定の方法で添加し
た培地で培養して、５−アミノレブリン酸生産菌を高濃
度化し、かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】５−
アミノレブリン酸は、ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフ
ィルなどのテトラピロール化合物のプレカーサとして、
生体系中で重要な役割を果たしている化合物である。こ
の５−アミノレブリン酸は、人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物であり、近年、除草剤，殺虫
剤，その他への利用が注目されている（特公表６１−５
０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参照）。

【０００３】しかし、この天然の５−アミノレブリン酸
は、コストが高く、除草剤や殺虫剤等として使用するに
は実用性に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃ
ｔｏｂｅｒ，２９，１９８４）。

【０００４】このような現状において、５−アミノレブ
リン酸について、多くの化学合成方法が検討されている
（例えば、特開平２−７６８４１号，同２−２６１３８
９号公報参照）が、未だ充分な方法が開発されていな
い。また、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレ
ブリン酸の製造方法も検討されている（例えば、特開平
２−９２２９３号，同３−１７２１９１号公報参照）。

【０００５】生体系中では、５−アミノレブリン酸は、
グリシンと、コハク酸もしくはグルタミン酸とから生合
成され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼにより２
分子が縮合してポルフォビリノーゲンとなり、遂次反応
して各種テトラピロール化合物へと代謝される。ただ
し、このデヒドラターゼは、一般に、活性が高いため、
通常、生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積されるこ
とは稀である。そこで、微生物を用いた５−アミノレブ
リン酸の製造法では、レブリン酸に代表されるような５
−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添
加し、５−アミノレブリン酸を蓄積させる方法がよく知
られている。

【０００６】ところで、一般に、微生物は、酵母エキス
等の天然成分を含んだ培地で培養を行うと、最小培地で
培養した場合に比べ、非常に高い増殖性を示す。したが
って、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレブリ
ン酸の製造方法においても、その培養に天然成分を添加
することで、菌体濃度を数倍に上昇させることが可能で
ある。

【０００７】ただし、この場合、光合成細菌は、高い増
殖性を示しながらも、５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼの活性阻害物質の添加、無添加にかかわらず、５−
アミノレブリン酸を殆ど生成しない場合が多い。つま
り、天然成分により何らかの蓄積阻害が起きていること
になる。

【０００８】一方、例えば、本発明者等により先に提案
された工業技術院微生物工業技術研究所微工研菌寄第１
２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）や第１２５４
３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）のように、自然変異
もしくは人為的な変異処理により、５−アミノレブリン
酸蓄積に関する酵素の天然成分に対する感受性が無くな
り（すなわち「脱感作」して）、５−アミノレブリン酸
を蓄積するようになった光合成細菌も存在する（特願平
３−２８９３０３号明細書参照−以下、「先提案」と言
う）。ただし、これらの菌の場合も、菌体濃度は向上す
るが、最小培地で培養した場合に比べ、５−アミノレブ
リン酸の蓄積量は低く、生産収率は低いものとなってい
る。

【０００９】本発明は、以上の諸点を考慮し、天然成分
を添加した培地中でも５−アミノレブリン酸を生産する
ことのできる５−アミノレブリン酸生産菌を、天然成分
を添加した培地、特に天然成分をより多量に含む培地で
高濃度化し、かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製造
する方法を提案することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の目
的を達成するために、研究を重ねる途上で、上記した先
提案の基礎となった知見、すなわち、（ａ）光合成細菌
を変異させたもののなかに、天然成分を添加した培地で
５−アミノレブリン酸を生成する菌株（光合成細菌の５
−アミノレブリン酸蓄積に対する天然成分の阻害に脱感
作した菌株）が存在すること、（ｂ）この菌株を使用す
れば、天然成分を添加した培地での菌体の高濃度化を計
ることができるとともに、５−アミノレブリン酸を高収
率で製造することができること、を踏まえて、さらに研
究を進めた結果、（ｃ）培地に添加する天然成分の種
類、量、そして添加方法を工夫することにより、５−ア
ミノレブリン酸蓄積を阻害しないばかりか、蓄積が著し
く促進されることを見出し、よって５−アミノレブリン
酸をこれまでの製造法よりも高収率で製造できること、
を確認し、本発明を開発するに至った。

【００１１】すなわち、本発明の５−アミノレブリン酸
の製造方法は、 〔１〕酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカ
ー、カザミノ酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から
選ばれる少なくとも１種を２〜５０ｇ／リットル（以
下、リットルを「Ｌ」と記し、ミリリットルを「ｍＬ」
と記す）添加した培地で、５−アミノレブリン酸生産菌
を培養することを特徴とし、 〔２〕上記の天然成分から選ばれる少なくとも１種を、
（１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、
（２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加する、
ことをも特徴とし、 〔３〕５−アミノレブリン酸生産菌が工業技術院微生物
工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４２）、第１２５４３号（ＦＥＲＭＰ−１２
５４３）の一方または双方であることをも特徴とする。

【００１２】本発明の製造方法に使用する５−アミノレ
ブリン酸生産菌は、光合成細菌、例えばロドバクター
セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ）を親株とし、これを変異して得られるも
のであって、上記した特定の天然成分の特定量を添加し
た培地で５−アミノレブリン酸を生産することのできる
菌株（天然成分による５−アミノレブリン酸蓄積阻害に
脱感作した菌株）である。具体例として、工業技術院微
生物工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２５４２），第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２５４３）として寄託されたものが挙げられる。こ
れら微工研菌寄第１２５４２号および第１２５４３号の
分離方法を、以下に例示する。

【００１３】上記の親株の増殖に必要な成分を試験管に
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物的変異原を用いる
方法がある。

【００１４】上記のような変異手法によって上記の親株
を変異した後、さらに緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。なお、この培養により生育した変異株の
中から、上記した特定の天然成分の特定量を添加した培
地においても５−アミノレブリン酸を生産することので
きる菌株を選択するには、これらの変異株を後述するよ
うな培地で培養し、培養液中の５−アミノレブリン酸を
測定し、５−アミノレブリン酸が生成されているか否か
を確認することによって行われる。

【００１５】以上のような分離・変異操作に用いる培地
には、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも
同様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピ
ルビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコ
ン酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルク
トース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の
炭素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常光合成
細菌の培養に用いられる成分が添加される。一般的な培
地成分としては、窒素源として、例えばアンモニア，塩
化アンモニウム，燐酸アンモニウム，硫酸アンモニウ
ム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，硝酸アンモ
ニウム，硝酸ナトリウム，尿素等の無機窒素化合物や、
酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，コーンス
ティープリカー，カザミノ酸等の有機窒素源を用いるこ
とができる。また無機塩類として、例えばカリウム，ナ
トリウム，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウ
ム，コバルト等の各塩類等を用いることができる。

【００１６】培養条件としては、親株，変異株ともｐＨ
約５〜１０，温度約１５〜４５℃，培養時間約１〜２０
日間で、菌体を生育させるには、親株、変異株とも約
０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、
また好気暗条件下であっても良い。

【００１７】以上の分離・変異操作によって得られる菌
株の例であるＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５は、親株
とほぼ同様の菌学的性質を有し、かつ上記した特定の天
然成分を添加した培地で５−アミノレブリン酸を生産す
る。このＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５株が、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５４２号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）および第１２５４３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）として寄託されている。

【００１８】本発明の製造方法では、上記したＣＲ−２
８６やＣＲ−２Ｓ５株に代表される５−アミノレブリン
酸生産菌に限らず、他の作出方法によって得られるも
の，他の菌を親株として得られるものを使用することが
できる。これらの５−アミノレブリン酸生産菌を、特定
の天然成分の特定量を添加した培地で培養することによ
り、５−アミノレブリン酸を高収率で製造することがで
き、またこの特定の天然成分の特定量を特定の方法で添
加した培地で培養することにより、これらの５−アミノ
レブリン酸生産菌を高濃度化し、かつ５−アミノレブリ
ン酸を高収率で製造することができる。

【００１９】以下、ＣＲ−２８６やＣＲ−２Ｓ５株を用
いて、本発明の製造方法により、５−アミノレブリン酸
を製造する場合につき、詳細に説明する。先ず、培地と
しては、上記の分離・変異操作に用いる培地に、酵母エ
キス、ペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から選ばれる少な
くとも１種を３〜５０ｇ／Ｌ添加した培地（以下、「特
定培地」と言う）を使用する。培養条件は、前述の分離
・変異操作の条件と同様である。ただし、この場合、約
０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条件が望ましい。

【００２０】上記の天然成分の添加量は少なすぎると、
５−アミノレブリン酸蓄積の促進効果が出ず、逆に多す
ぎても、菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、添加総量で約２〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは約３〜５
０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５〜３０ｇ／Ｌの範囲内
とする。

【００２１】なお、天然成分の添加量を約２ｇ／Ｌとす
る場合は、前述した先提案の実施例や後述の参考例７に
も示すように、培養開始時に全量を一度に添加しても、
５−アミノレブリン酸生産菌の生育が阻害されることは
なく、菌体濃度を高濃度化することができる。これに対
し、天然成分の添加量を約３ｇ／Ｌ以上もの大量にする
場合は、５−アミノレブリン酸の蓄積は促進されて、５
−アミノレブリン酸の製造量は増加するが、５−アミノ
レブリン酸生産菌の生育が阻害され、菌体の高濃度化を
図ることができず、したがって５−アミノレブリン酸の
製造量にも限界が生じてくる。

【００２２】そこで、５−アミノレブリン酸生産菌の高
濃度化をも図るべく、延いては５−アミノレブリン酸の
製造量の増大をも図るべく、添加方法を次のようにする
ことが好適である。 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、
（２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加する。 なお、上記の対数増殖期とは、細菌の数が対数的に増加
していく時期であり、微工研菌寄第１２５４２号、第１
２５４３号を使用する場合には、植菌後、約２４〜４８
時間で終了する。

【００２３】上記の（１）では、所定の菌体増殖時期に
達した時点で、一度に、または連続的もしくは断続的に
添加し、上記の（２）では、培養開始時に必要量の一部
を添加しておき、所定の菌体増殖時期に達した時点で、
残部を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加し
てもよい。なお、（１），（２）の連続的もしくは断続
的に添加する際には、同量づつであってもよいし、徐々
に多量となるようにしてもよい。天然成分による５−ア
ミノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合
は、後者の徐々に多量となるようにすることが好まし
い。

【００２４】また、上記の天然成分を添加した特定培地
には、５−アミノレブリン酸のプレカーサであるグリシ
ンとコハク酸もしくはグルタミン酸を添加すると、より
高濃度の５−アミノレブリン酸を生成することができる
が、培養開始時にグリシンとコハク酸もしくはグルタミ
ン酸を添加すると、菌株の増殖速度が遅くなるため、あ
る程度増殖した時点で添加することが好ましい。添加量
は、グリシンとコハク酸もしくはグルタミン酸のいずれ
の場合も、余り少なすぎると添加効果がなく、逆に余り
多すぎても菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、約１０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に約１５〜４５ｍｍ
ｏｌ／Ｌの範囲内とすることが好ましい。添加方法は、
一度に全量を添加してもよいが、連続的にまたは断続的
に添加してもよい。後者の場合は、同量づつであっても
よいし、徐々に多量となるようにしてもよい。５−アミ
ノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合は、
後者の徐々に多量となるようにすることが好ましい。

【００２５】また、５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼの活性阻害物質を添加することもできる。例えば、こ
の阻害物質としてレブリン酸を使用する場合、レブリン
酸の添加方法は、培養開始時（あるいはグリシンとコハ
ク酸の添加時）から一定の間隔で少量（同量）づつ添加
してもよいし、培養開始時（あるいはグリシンとコハク
酸の添加時）に全量添加しておいてもよい。菌の生育が
対数増殖期中期を過ぎた後に、全量を一度に、あるいは
少量（同量）づつ添加するとなおよい。

【００２６】培養液のｐＨは５〜１０の範囲内で、例え
ばＨＣｌ水溶液等の酸またはＮａＯＨ水溶液等のアルカ
リを用いて一定に保つことにより、より高濃度の５−ア
ミノレブリン酸を製造することができる。

【００２７】５−アミノレブリン酸の蓄積量は、培養後
一定時間が通過すると、減少してしまう。これは、培養
液中に添加されている上記のレブリン酸が代謝等により
減少してしまうため、レブリン酸による５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼの活性阻害効果が弱まり、５−ア
ミノレブリン酸が代謝されるためと考えられる。したが
って、５−アミノレブリン酸を高効率で製造するには、
所定の時間経過後（すなわち、５−アミノレブリン酸の
蓄積量がピークとなった時点で）、培養を停止すればよ
い。

【００２８】以上のようにして得られる培養液または反
応液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製する
ことができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収
することができ、このときカラムクロマトグラフィ等の
公知の精製方法を適宜併用することもできる。

【００２９】

【作用】本発明の製造方法では、使用する５−アミノレ
ブリン酸生産菌が、特定の天然成分が特定量で添加され
た培地において、５−アミノレブリン酸を生成し、培養
液中に５−アミノレブリン酸を多量に蓄積する作用をな
すため、５−アミノレブリン酸が高収率で製造される。

【００３０】また、本発明の製造方法では、上記の特定
の天然成分の特定量を、特定の方法で添加することによ
り、該天然成分による５−アミノレブリン酸生産菌の生
育阻害が回避されて、菌体が高濃度化され、かつ５−ア
ミノレブリン酸の生産量も一層向上する。

【００３１】

【実施例】

〔５−アミノレブリン酸生産菌の分離〕表１に示す光合
成細菌用の最小培地であるグルタメート・マレート培地
（培地１）の培地成分を、水道水１Ｌに溶かして培地１
を調製した。培地１のｐＨは６．８であった。

【００３２】

【表１】

【００３３】上記の培地１に酵母エキス２ｇ／Ｌを添加
して調製した培地（培地２）を、外径２１ｍｍの試験管
に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合成細
菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２２０
３を１白金耳植え継ぎ、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下
で３日間静置培養した。別の試験管に培地２を１０ｍＬ
分注し、滅菌した。この培地２に上記の培養液１を３白
金耳植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復振盪
培養した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０００
ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、遠心
分離前の培養液２と同量になるようにトリス・マレイン
酸バッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
を、さらに２度繰り返した。

【００３４】この後、再び１５，０００ｒｐｍにて３０
秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原である
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加
し、３０℃で８０分間静置インキュベートした。

【００３５】このようにして処理した菌１を、上記と同
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／Ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニー約１４，００
０個を、それぞれ培地２に植菌し、３０℃，５ｋｌｕｘ
で１．５日間静置培養した。

【００３６】次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３
０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌになる
ように添加し、培養を更に２日間続けた。その後、培養
液の上清から５−アミノレブリン酸を定量した。これら
約１４，０００個の変異菌株の中に、培地２中で５−ア
ミノレブリン酸を生成する菌株が数株存在していた。こ
の５−アミノレブリン酸を生成する菌株のうち生成量の
多い２株を、それぞれロドバクター セファロイデス
ＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５と命名した。

【００３７】〔５−アミノレブリン酸の製造〕 参考例１ 上述の５−アミノレブリン酸生産菌の分離例で得られた
変異菌株ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）お
よびＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄１２５４３号）を、それ
ぞれ各３本づつ試験管に入れた特定培地（実施例１の培
地１に、天然成分として酵母エキス２ｇ／Ｌを添加した
もの）（培地量１０ｍＬ）に接種し、３０℃，５ｋｌｕ
ｘの光照射下で１．５日間静置培養した。次いで、グリ
シンとコハク酸をそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン
酸を０，１０，３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、
培養を続けた。その後、培養液中に生成される５−アミ
ノレブリン酸の量の経時変化を測定した。この結果を、
表２に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】表２から明らかなように、ＣＲ−２８６及
びＣＲ−２Ｓ５は、特定培地中で多量の５−アミノレブ
リン酸を生成していることが判る。また、５−アミノレ
ブリン酸の生成量は、一定の時間が経過すると、減少し
てしまう。これは、前述したように、培養液中に添加し
たレブリン酸が代謝等により減少してしまうことによ
り、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼへの阻害効果
が弱まり、５−アミノレブリン酸が代謝されることを明
示していると解される。

【００４０】実施例１〜２０，比較例１〜５ 表３に示す光合成細菌用の最小培地であるグルタメート
・マレート培地の培地成分を水道水１Ｌに溶かして培地
３を調製した。培地３のｐＨは、６．８であった。

【００４１】

【表３】

【００４２】上記の培地３に、天然成分として酵母エキ
ス（株式会社日本製薬製商品名「Ｅｘｔｒａｃｔ Ｙｅ
ａｓｔ Ｄ−３，Ｄｒｙ」），カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ
製商品名「Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，Ｂａｃｔｏ
Ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙ」），ペプトン（株式会社
日本製薬商品名「ポリペプトン」），麦芽エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ製商品名「Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｂａｃｔ
ｏ」），コーンスティープリカー（和光純薬株式会社製
薬商品名「Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ，Ｐｏ
ｗｄｅｒ」）の５種類を、それぞれ０ｇ／Ｌ，２ｇ／
Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌになるように添
加し、計２５種類の特定培地を調製し、外径２１ｍｍの
試験官に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。
次に、ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）を接
種し、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下で、２４時間静置
培養した。次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３０
ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌ添加し、
培養を続けた。培養液中に蓄積する５−アミノレブリン
酸の量の経時変化を測定した。この結果を表４に示す。

【００４３】

【表４】

【００４４】表４から明らかなように、天然成分による
５−アミノレブリン酸の蓄積阻害に脱感作した菌株ＣＲ
−２８６に対して、天然成分の添加は著しい蓄積促進を
示している。しかし、酵母エキスの場合、添加量が１５
ｇ／Ｌになると蓄積量が減少しているが、これは生育阻
害がかかっているためと思われる。

【００４５】実施例２１ ＣＲ−２８６を、実施例１〜２０で調製した培地３に、
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを２ｇ／
Ｌとなるように添加して調製した特定培地に接種し、３
０℃、５ｋｌｕｘの光照射下で培養を開始した。４８時
間経過後（すなわち、菌体増殖が対数増殖期中期以降に
達した後）、グリシンとコハク酸を各３０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌ、上記と同じ酵母エ
キスを１０ｇ／Ｌとなるように添加し、その後、レブリ
ン酸を２４時間毎に２回、１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう
に添加した。また、２Ｎ−ＨＣｌ水溶液と、２Ｎ−Ｎａ
ＯＨ水溶液とを用いて、培養中の培養液をｐＨ６．５に
制御した。以上のような生産培養中に蓄積した５−アミ
ノレブリン酸量の最高値は、１．８ｇ／Ｌであった。

【００４６】実施例２２，２３ 実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスと、実施
例９〜１２で使用したものと同じペプトンとを、各５ｇ
／Ｌづつ、または１０ｇ／Ｌづつ、２種類同時に添加し
た以外は、実施例１〜２０および比較例１〜５と同様に
して培養を行った。この結果を表５に示す。

【００４７】

【表５】

【００４８】実施例２４〜２７、比較例６ ＣＲ−２８６を、実施例１〜２０で調製した培地３に、
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを０ｇ／
Ｌ，２ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌにな
るように添加して調製した特定培地に接種し、３０℃、
５ｋｌｕｘの光照射下で４８時間培養した後、菌体重量
を測定した。この結果を表６に示す。

【００４９】

【表６】

【００５０】表６から明らかなように、天然成分（酵母
エキス）を添加することにより、非常に高い増殖性を示
すことが判る。また、実施例２７のように、１５ｇ／Ｌ
もの天然成分を培養開始時に一度に添加すると、生育阻
害がかかることも判るが、これを実施例２１のように数
回に分けて添加すれば、阻害がかかるどころか、むしろ
生育は促進される。

【００５１】実施例２８〜３１、比較例７ 使用した菌株をＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄第１２５４３
号）に、また培地に加える天然成分を酵母エキス１種類
としたこと以外は、すべて実施例１〜２０および比較例
１〜５と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。

【００５２】

【表７】

【００５３】比較例８〜１２ 使用した菌株を親株（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ１２２０３）としたこと以外
は、すべて実施例２８〜３１および比較例７と同様にし
て培養を行った。結果を表８に示す。

【００５４】

【表８】

【００５５】表８から明らかなように、親株であるＲｈ
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ
１２２０３株は、酵母エキスを添加しても５−アミノレ
ブリン酸を蓄積しなかった。

【００５６】実施例３２ ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）を、実施例
１〜１５で調製した培地３に、実施例１〜４で使用した
ものと同じ酵母エキスを１０ｇ／Ｌになるように添加し
て調製した特定培地（培地４）に接種し、３０℃、５ｋ
ｌｕｘの光照射下で４８時間予備培養した。この菌体
を、遠心分離により回収し、再び、培地４に、菌体濃度
を回収する前の２倍まで高濃度化して再懸濁し、生産培
養を行った。培養条件は、３０℃，５ｋｌｕｘ，光照射
条件下とし、グリシンとコハク酸を各６０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように生産培
養開始時に添加、その後レブリン酸を２４時間毎に２
回、３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した。また、２
Ｎ−ＨＣｌ水溶液、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐ
Ｈ６．５の一定に制御した。生産培養中に蓄積した５−
アミノレブリン酸量の経時変化を表９に示す。

【００５７】

【表９】

【００５８】表９から明らかなように、天然成分を１０
ｇ／Ｌ添加することにより、５−アミノレブリン酸を最
高約２．４ｇ／Ｌまで蓄積することができる。

【００５９】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明の製造方法
によれば、５−アミノレブリン酸生産菌が、特定の天然
成分の特定量を、特に特定の方法で添加した培地におい
て、非常に高い増殖率を示し、かつ５−アミノレブリン
酸を多量に蓄積することができるため、製造中の菌体濃
度を数倍に上昇させることができ、製造効率が大幅に向
上し、５−アミノレブリン酸の製造コストを低減するこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母エキス、ペプトン、コーンスティー
   プリカー、カザミノ酸、麦芽エキスからなる群の天然成
   分から選ばれる少なくとも１種を２〜５０ｇ／リットル
   添加した培地で、５−アミノレブリン酸生産菌を培養す
   ることを特徴とする５−アミノレブリン酸の製造方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の天然成分から選ばれる少
   なくとも１種を、（１）菌体増殖が対数増殖期中期以降
   に達した後に、一度に、または連続的もしくは断続的に
   添加するか、（２）培養開始時に１〜１０ｇ／リットル
   を添加し、菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後
   に、１〜４９ｇ／リットルを、一度に、または連続的も
   しくは断続的に添加する、ことを特徴とする５−アミノ
   レブリン酸の製造方法。
3. 【請求項３】 ５−アミノレブリン酸生産菌が工業技術
   院微生物工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（Ｆ
   ＥＲＭ Ｐ−１２５４２）、第１２５４３号（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１２５４３）の一方または双方であることを特徴
   とする請求項１，２記載の５−アミノレブリン酸の製造
   方法。