FR2528868A1

FR2528868A1 - Procede de preparation de l-leucine par fermentation

Info

Publication number: FR2528868A1
Application number: FR8309899A
Authority: FR
Inventors: Mark Hampton Updike; Gary Jim Calton
Original assignee: WR Grace Ltd; WR Grace and Co Conn
Current assignee: GCP Products UK Ltd; WR Grace and Co Conn
Priority date: 1982-06-16
Filing date: 1983-06-15
Publication date: 1983-12-23
Also published as: SE8303391L; DE3320653A1; GB2122990A; AU1327183A; IT1163478B; JPS58220692A; IT8321508A0; GB8315822D0; AU551985B2; US4421854A; NL8300370A; CA1192156A; GB2122990B; CH654850A5; SE8303391D0

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION DE L-LEUCINE. SELON L'INVENTION, ON MET EN CULTURE, EN CONDITIONS AEROBIES, UNE SOUCHE MUTANTE D'ARTHROBACTER CITREUS RESISTANT A UN ANALOGUE DE L-LEUCINE, POUR DONNER UN BOUILLON DE FERMENTATION ET ON RECUPERE LA L-LEUCINE ACCUMULEE DANS LEDIT BOUILLON DE FERMENTATION. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA PREPARATION DES AMINOACIDES.

Description

La production de L-leucine, de L-valine et autres aminoacides par

fermentation a fait l'objet de recherches considérables De nombreux genres de micro-organismes ont été employés avec divers analogues d'aminoacides Le brevet US 3 865 690 enseigne la production de L-leucine par mise en culture d'une souche de Brevibacterium ou Corynebacterium rendue résistante à un antagoniste de leucine Le brevet US N 3 970 519 met en culture des souches des mêmes genres en présence de divers aminoacides pour produire de la L-leucine Du brevet US NO 3 893 888, on sait que la L-valine peut être produite de souches

mutantes de Brevibacterium résistant à l'acide 0-amino-/3-

hydroxyvalérique (AHV) Le brevet US 3 668 073 enseigne la préparation de L-leucine en utilisant un micro-organisme du genre Corynebacterium en présence d'un "promoteur" pour l'isoleucine, la méthionine, la phénylalanine ou la valine comme l'azaleucine ou AHV L'azaleucine a également été

utilisée comme analogue pour la production de L-leucine.

Voir Wang et autres, "Fermentation and Enzyme Technology", John Wiley and Sons, Inc, 1979, pages 18-20 Le brevet US 3 759 789 utilise des cultures d'Arthrobacter alkanicus qui sont résistantes à la L-thréonine Des précurseurs de L-leucine et L-isoleucine peuvent être ajoutés pour

augmenter les rendements.

La littérature qui suit est en rapport: 1 Araki, Kazumi, H Ueda and S Saigusa Fermentative Production of L-Leucine with Auxotrophic Mutants of Corynebacterium glutamicum Agr Biol Chem 38 ( 3)

565-572 ( 1974).

2 Calvo, R A, and J M Calvo Lack of End-Product Inhibition and Repression on Leucine Synthesis in a Strain of Salmonella typhimurium Science, 156,

1107-1109 ( 1967).

3 Kisumi, M, S Komatsubara and I Chibata Leucine Accumulations by Isoleucine Revertants of Serratia marcescens Resistant to Y -Aminobutyric Acid:

Lack of Both Feedback Inhibition and Repression.

J Biochem, 73, 107-115 ( 1973).

4 Tsuchida, T, F Yoshinaga, K Kubota, H Momose and S Okumura Cultural Conditions for L-Leucine Production by Strain N 218, a Mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256 Agr Biol.

Chem 39 ( 5), 1149-1153 ( 1975).

Tsuchida, T, and H Momose Genetic Changes of Regulatory Mechanisms Occurred in Leucine and Valine Producting Mutants Derived from

Brevibacterium lactofermentum 2256 Agr Biol.

Chem 39 ( 11) 2193-2198 ( 1975).

6 Tsuchida, T, F Yoshinaga, K Kubota, H Momose and S Okumura Production of L-Leucine by a

Mutant of Brevibacterium lactofermentum 2256.

Ag Biol Chem 38 ( 10), 19097-1911 ( 1974).

7 Freundlich, M and J M Trela ( 1969) Control

of isoleucine, valine, and leucine biosynthesis.

J of Bacteriology, 101-106.

8 Izumi, Y, Y Asano, Y Tani and K, Ogata ( 1977).

Formation of valine and leucine by analog-resistant mutants of an obligate methyotroph, Methylomonas

aminofaciens J Ferment Technol, 55, 452-458.

9 Kisumi, M, S Komatsubara and I Chibata ( 1977) Pathway for isoleucine formation from pyruvate by leucine biosynthetic enzymes in leucineaccumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens J.

Biochem, 82, 95-103.

Kisumi, M, J Kato, S Komatsubara, I Chibata, ( 1973) Production of isoleucine, valine and leucine

by regulatory mutants of Serratia marcescens.

"Genetics of Industrial Microorganisms Bacteria".

11 Rogerson, A, and M Freundlich ( 1969) Control

of isoleucine, valine and leucine biosynthesis.

VIII Mechanism of growth inhibition by leucine in relaxed and stringent strains of Escherichia coli

K-12 Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.

Un article général sur les voies de biosynthèse pour la L-leucine ainsi que d'autres aminoacides a également été publié Voir: 12 Szentirmai, A and I Horvath ( 1976) Regulation of branched-chain amino acid biosynthesis Acta

Microbiol Acad Sci Hung, 23, 137-149.

1 '3 Umbarger; H E ( 1974) The elements involved in the multivalent regulation of the isoleucine and

valine biosynthetic enzymes of the Enterobacte-

riaceae Proceedings of the 1st Intersectional

Congress of IAMS, 1, Tokyo.

14 Umbarger, H E ( 1973) Genetic and physiological regulation of the isoleucine, valine and leucine biosynthetic enzymes of the Enterobacteriaceae

De " Genetics of Industrial Microorganisms".

Umbarger, H E ( 1978) Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation Ann Rev Biochem, 47

533-606, 563.

La présente invention concerne un procédé de préparation de L-leucine qui consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, des souches mutantes d'Arthrobacter

citreus résistant à un analogue de la L-leucine.

Les souches sauvages d'Arthrobacter citreus (comme ATCC 17775) choisies pour une mutation sont caractérisées par une surproduction de l'acide glutamique La voie de biosynthèse par laquelle les micro-organismes produisent la L-leucine est généralement connue On peut par exemple voir Umbarger, "Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation", Ann Rev Biochem 1978 47:563-565 Comme cela est indiqué dans cette référence, on pense que la synthèse se passe par les stades qui suivent: pyruvate; " acétolactate; o C<,/3 -dihydroxy isovalérate; 0 <-cétoisovalérate; C isopropylmalate;/3 -isopropylmalate;

O(-céisocaproate; L-leucine.

Certains analogues des aminoacides naturels sont appropriés à l'isolement des souches mutantes de cette invention Ces analogues sont toxiques aux souches qui ne surproduisent pas la L-leucine De tels analogues comprennent l'acide o' -amino-/ -hydroxyvalérique; la D-leucine; l'acide o< -aminoisoamylsulfonique; la norvaline; la norleucine; la métallylglycine; -l 'acide î -amino-/J -chlorobutyrique; la valine; l'O<chloroleucine; l'isoleucine; la /3-hydroxynorleucine; la/-hydroxyleucine; la cyclopentène alanine; la 3-cyclopentène-1-alanine;

l'acide 2-amino-4-méthylhexènoique; la 5 ',5 ', 5 ' -trifluoro-

leucine; la 4-azaleucine.

Le mutant résistant à l'analogue de leucine peut être obtenu par irradiation aux ultraviolets d'une souche du type sauvage d'Arthrobacter citreus ou en traitant la souche sauvage avec un mutagène comme du méthane sulfonate d'éthyle,de la N-méthyl-N 1-nitro-N-nitrosoguanidine et autres Ensuite, la souche peut être mise en culture en

présence de l'analogue pourisoler les colonies qui sur-

produisent la L-leucine.

Une culture viable d'une souche mutante produisant

la L-leucine d'Arthrobacter citreus résistant à l'aza-

leucine (produit de l'exemple 1) a été déposéeàl'American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sous le N ATCC 39103 De même, une culture du produit de l'exemple 2 a été déposée sous le

N ATCC 39106.

La fermentation des souches mutantes isolées d'Arthrobacter citreus peut être accomplie par culture avec agitation ou fermentation submergée en conditions aérobies La fermentation est effectuée à 25 à 40 C et à un p H de 5 à 8 (de préférence 6,5 à 7,5) On peut employer du carbonate de calcium et/ou de l'ammoniac pour ajuster le p H du milieu Alternativement, des dérivés de l'acide morpholino-sulfonique peuvent être employés, par exemple voir exemple 1 ci-dessous Le milieu de fermentation contient une source de carbone, une source d'azote et d'autres éléments Des sources appropriées de carbone pour la fermentation comprennent des sucres fermentables, des hydrolysats de protéine et des protéines Des exemples de sourcès appropriées d'azote sont l'urée, des sels d'ammonium d'acides organiques (comme l'acétate d'ammonium et l'oxalate d'ammonium) et des sels d'ammonium d'acides inorganiques (comme le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium) Les quantités des sources de carbone et d'azote dans le milieu sont de 0,001 à 20 % en poids/volume De même, des aliments organiques (comme de la liqueur de trempage de mals, de la peptone, des extraits de levure, des extraits de soja) et/ou des éléments inorganique (comme du phosphate de potassium, du sulfate de magnésium, des vitamines comme la biotine et la thiamine et des aminoacides comme la valine) peuvent être ajoutés au milieu La fermentation est accomplie en 16 à 176 heures et la L-leucine s'accumule dans le

bouillon de fermentation.

Quand la fermentation est terminée, c'est-à-dire qu'il y a accumulation d'environ 0,1 à 0,8 % en poids/ volume de L-leucine dans le bouillon, les cellules et autres composants solides de la culture sont retirés du bouillon de fermentation par des processus conventionnels comme une filtration ou une centrifugation Des processus connus peuvent être employés pour la récupération et/ou la purification de la L-leucine dans le filtrat de la solution qui surnage Par exemple, le bouillon filtré de fermentation est traité avec une résine échangeuse de cations forte Alors, la résine est éluée avec une solution alcaline diluée comme de l'ammoniac aqueux Les éluats contenant la L-leucine sont combinés et concentrés On ajoute, à la solution concentrée, un alcanol comme du méthanol ou de l'éthanol Les cristaux précipités peuvent être recristallisés dans un alcanol aqueux comme du méthanol aqueux et de l'éthanol aqueux pour donner des

cristaux purs de L-leucine.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention

sans la limiter.

EXEMPLE 1

Mutation par EMS et résistance aux faibles concentrations d'azaleucine Une plaque inclinée fraîche d'Arthrobacter citreus (ATCC 17775) a été lavée avec un tampon de phosphate de potassium à 0,1 M La suspension résultante de cellules a été décantée dans un tube stérile o l'on a ajouté du méthanesulfonate d'éthyle (EMS) en une quantité suffisante pour produire une concentration de 0,05 M Le tube a été incubé pendant 18 heures à 30 C Les suspensions des cellules ont alors été centrifugées, le produit surnageant a été décanté et les cellules ont été remises en suspension

dans un tampon frais.

Après deux lavages, les cellules ont été utilisées pour inoculer un tube du milieu suivant (Milieu E) On a

utilisé un inoculum à 10 %.

Milieu E Par litre de H 20 désionisée Glucose 50 g NH 4 C 1 5 g Urée 5 g K 2 HP 04 0,5 g 0,5 g KH 2 PO 4 O 5 g Mg SO 7 H 20 0,5 g Biotine 100 mg Thiamine HC Ol I mg

Acide 3-(N-morpholino)-

propane sulfonique (comme "MOPS", Sigma Chemical Company) 20,9 g Tracesd'élément en solution (voir ci-dessous) I ml

Le p H du milieu a été ajusté à 7,0 avec Na OH.

Le milieu a été passé à l'autoclave pendant 15 minutes à 112 C Pour préparer le milieu E d'agar ou Medium E Agar, ajouter 15 g/l d'Agar Noble (Difco) à la solution du milieu E. La solution de tracesd'éléments était composée comme suit: Solution de tracesd'éléments Par litre d'eau désionisée Zn SO 4 7 H 20 8,8 g Fe SO 4 7 H 20 10,0 g Cu 504 À 5 H 20 60 mg Na 2 8407 1 OH 20 88 mg Na 2 Mo 2042 H 20 53 mg Mn 504 H 20 7,5 g Co Cl 2 À 6 H 20 120 mg Ca C 12 55 mg Le p H de la solutiondetraces d'éléments a été ajusté à 2 avec H 2504 et la solution a été stockée dans

une bouteille sombre à environ 2-0 C.

Les cellules ont été incubées pendant 17 heures à 30 C dans un agitateur giratoire à 300 t/mn et ont été ensuite étendues sur Medium E Agar (modifié seulement 2 % de glucose; le p H a été ajusté à 7,8 avant passage à l'autoclave) o divers niveaux (comme 0,2 à 10 g/l) d'azaleucine avaient été incorporés après passage à l'autoclave Les plaques ont été incubées à 30 C Quand des colonies sont apparues (comme après environ 2 à 4 jours d'incubation), on les a transférées à des plaques fraîches

de Medium E Agar.

Les isolats d'azaleucine ont été inoculés dans des tubes de Medium E et d'Isoleucine Medium 5, et on a incubé

pendant trois jours à 30 C, 300 t/mn.

Isoleucine Medium 5 1/ Par litre D I H 20 Glucose 100 g (NH)2 SO 4 50 g Mg SO 4 7 H 20 0,4 g Ca CO 3 50 g KH 2 PO 4 3 g Bacto-soytone 2/ 0,6 g Biotine 100 Múg Thiamine H Cl I mg Solution de tracesd'éléments I ml

Ajuster p H à 7,8 avec Na OH.

1/D I = désionisé 2/Un hydrolysat enzymatique de farine de soja vendu par Difco Laboratories, Inc. Un isolat désigné par 17775-14, résistant à 4 g/1

d'azaleucine, a produit 4,56 g/l de leucine dans l'Iso-

leucine Medium 5, comme on a pu le déterminer par

chromatographie liquide de haute performance (HPLC).

Pour l'analyse par HPLC, les aminoacides sont convertis en leurs dérivés dansyles (voir ci-dessous) puis séparés et analysés quantitativement pour chaque composant par des méthodes standards Le processus qui suit décrit

la façon de dériver les aminoacides pour l'analyse HPLC.

PRINCIPE

Le chlorure de dansyle (chlorure de 1-diméthyl-

aminonaphtalène-5-sulfonyle) réagit avec le groupe amine des aminoacides Les dérivés de dansyle peuvent être séparés par chromatographie liquide et détectés par

absorption des rayons ultraviolets.

Les réactifs utilisés dans la HPLC ci-dessus sont: 1 Tampon: peser 2,956 grammes de carbonate de lithium dans un ballon de 1 litre et diluer à la marque avec de l'eau distillée Ajuster le p H à 9,5 avec de l'acide chlorhydrique concentré. 2 Solution de chlorure de dansyle: peser 75 mg

de chlorure de dansyle dans un ballon volumé-

trique de 25 ml et diluer à la marque avec de l'acétonitrile. 3 Trempe: peser 5,0 grammes de chlorhydrate de méthylamine dans un ballon volumétrique de 250 ml et diluer jusqu'à la marque avec de

l'eau distillée.

4 Acide acétique.

Aminoacide standard H (Pierce Chemical Co,

catégorie N 20088).

6 Triéthylamine.

7 Mélange solvant: 877 ml d'eau distillée ml de méthanol 14 ml d'acide acétique ml de tétrahydrofurane 1,7 ml de triéthylamine

PROCESSUS

Préparation des standards 1 En utilisant une microseringue, placer 50, 100 et 200 -l de l'aminoacide standard Pierce

dans des ballons volumétriques de 5 ml.

2 Placer les ballons volumétriques de 5 ml dans un dessiccateur sous vide et sous vide, évaporer

jusqu'à siccité (il faut habituellement une nuit).

3 Transférer, à la pipette, 2,0 ml de tampon (réactif N 1 ci-dessus) dans chaque ballon volumétrique. 4 Transférer, à la pipette, 1,0 ml de chlorure de dansyle réactif (réactif N 2 ci-dessus)

dans chaque ballon volumétrique.

Bien mélanger et placer dans un bain d'eau à

C pendant 30 minutes.

6 Ajouter 100 Ail de trempe (réactif N 3) à

chaque ballon volumétrique.

7 Bien mélanger et laisser au repos pendant

environ 5 minutes.

A. 8 Ajouter 75 p m d'acide acétique (réactif NI 4)

à chaque ballon et mélanger.

9 Diluer aux marques avec le mélange solvant

(réactif N 7) et mélanger.

Note: Les standards doivent être maintenus au réfrigé-

rateur jusqu'à leur utilisation.

B Préparation de l'échantillon Note: Mettre tous les échantillons reçus pour l'analyse

au réfrigérateur.

1 Placer une portion de 50 fpl de chaque

échantillon dans un ballon volumétrique de 5 ml.

2 Continuer à partir de A-3 ci-dessus.

Note: Réfrigérer les échantillons dérivés jusqu'à ce

qu'ils soient analysés.

EXEMPLE 2

Seconde mutation avec EMS et résistance aux concentrations supérieures d'azaleucine Le mutant résistant à l'azaleucine, 17775-14,

préparé à l'exemple 1, a de nouveau été soumis à un traite-

ment au méthanesulfonate d'éthyle de la même façon qu'on

l'a précédemment décrit.

Après mutation EMS et incubation pendant une nuit à 30 C dans le milieu E ou Medium E, les cellules ont été lavées une fois avec un tampon à 0,1 M de phosphate et étalées sur du Medium E Agar contenant de l'azaleucine (ajoutée après passage à l'autoclave) à des concentrations de 4 à 20 g/l Le p H des agars contenant 12-20 g/l d'azaleucine avait été ajusté à 9,6 avec Na OH avant passage à l'autoclave- L'addition de 20 g/l d'azaleucine

a fait tomber le p H à 5,6 après passage à l'autoclave.

Les plaques ont été incubées pendant 3 à 7 jours à 30 C Les isolats résistants ont été transférés aux plaques de Medium E frais, d'o on les a inoculés dans des tubes d'Isoleucine Medium 5 Après incubation à 300 C, 300 t/mn pendant 3 jours, les bouillons récoltés ont été déterminés par HPLC, comme on l'a décrit en détail à 1 1 il l'exemple 1 Un isolat désigné par 17775-14-7, résistant à 20 g/l d'azaleucine, s'est révélé avoir un titre de

8,0 g/l de leucine.

Claims

REVENDICATI ONS

1. Procédé de préparation de L-leucine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en culture, en conditions aérobies, une souche mutante d'Arthrobacter citreus résistant à un analogue de L-leucine, pour donner un bouillon de fermentation et à récupérer la L-leucine

accumulée dudit bouillon de fermentation.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que le mutant est Arthrobacter citreus ATCC 39103.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée à une température

de 25 à 40 C pendant 16 à 176 heures.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le p H des milieux de fermentation pendant la

culture est de 5 à 9.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mutant est Arthrobacter citreus ATCC 39103 et la fermentation est effectuée à 25 à 40 C pendant 16

à 176 heures à un p H de 5 à 8.

6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que l'analogue est l'acide,(-amino-/?-hydroxy-

valérique; la D-leucine; l'acide o< -aminoisoamyl-

sulfonique; la norvaline; la norleucine; la méthallylglycine; l'acide O<amino-/3 -chlorobutyrique; la valine; l' O '-chloroleucine; l'isoleucine; la /3-hydroxynorleucine; la /3-hydroxyleucine; la cyclopentène alanine; la 3-cyclopentène-1-alanine;

l'acide 2-amino-4-méthy Ihexènoique; la 5 ',5 ',5 '-trifluoro-

leucine; la 4-azaleucine.

7 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 1, 3, 4 ou 6, caractérisé en ce que le mutant est

un mutant de ATCC 39103.

8. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1, 3, 4 ou 6, caractérisé en ce que le

mutant est ATCC 39103.