NL8403540A - Werkwijze voor het verbeteren van l-serine producerende microorganismen, verbeterde l-serine producerende microorganismen, en werkwijze voor het produceren van l-serine onder toepassing daarvan. - Google Patents

Description

- > ·Λ ---- f , · χ., t. 'i , ' , - .

S V

-1-

Werkwijze voor het verbeteren van L-serine producerende micro-organismen, verbeterde L-serine producerende microorganismen, en werkwijze voor het produceren van L-serine onder toepassing daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verbeteren van L-serine producerende microorganismen zodat zij technische hoeveelheden L-serine produceren in kortere tijd en met een minimale verontreiniging aan aminozuren.

5 L-serine is een niet-essentieel aminozuur dat .hoofdzakelijk wordt gebruikt als een dieetsupplement in parenterale voeding. Op technische schaal wordt L-serine geproduceerd door fermentatie van bepaalde microorganismen die L-serine produceren en in de fermentatievloeistof ophopen.

10 In het Amerikaanse octrooischrift 4.183.786 is een werkwijze beschreven voor de omzetting van glycine tot L-serine onder gebruikmaking van een waterig medium dat glycine bevat en microbiêle cellen van een mutant behorende tot Nocardla butanica. Uit het Amerikaanse octrooischrift 3.623.952 is 15 bekend dat L-serine kan worden geproduceerd en verzameld door kweken van bepaalde stammen van Arthrobacter oitreus, Brevibac-terium helvolum, Corynebacterium. sp., en Candida pulcherrima op gebruikelijke, glycine bevattende media. Verder is uit het Amerikaanse octrooischrift 3.880.741 bekend dat kunstmatig 20 geïnduceerde mutanten van Corynebacterium glycinophilum die voor hun groei leucine, isöleucine, methionine, tryptofaan, serine of glycine nodig hebben, uit glycine meer L-serine produceren dan de ouder stam die voomoemde nutriënten niet behoeft.

Glycine is een kostbare precursor en moeilijk 25 van L-serine te scheiden. Daarom is het gewenst dat bij de fermentatie zo veel mogelijk glycine wordt omgezet tot L-serine.

Volgens de uitvinding wordt hierin voorzien met verbeterde microorganismen met verhoogde L-serine productiviteit.

30 ...

8403540 Λ -2- 4___ <r *

Gevonden is dat microorganismen die serine-dehydra-tase negatief zijn en resistentie vertonen tegen tenminste één van de drie aminozuuranaloga serinehydroxamaat, methionine-hydroxamaat en glycinehydroxamaat, in kortere tijd meer glucine 5 omzetten tot L-serine dan de ouder stammen waaruit zij door mutatie zijn verkregen, en dat zonder vorming van grote hoeveelheden verontreinigende aminozuren en minder degradatie van L-serine.

De biochemische omzetting van glycine tot L-serine 10 berust op aldolcondensatie van glycine met een êén-koolstofeenheid door het enzym serinehydroxymethyltransferase (E.C. 2.1.2.

IJ.. De één-koolstof eenheid kan in het fermentatiemedium aanwezig zijn of enzymatisch door het microorganisme worden gevormd.

De bij de aldolcondensatie gebruikte co-factoren zijn tetra-15 hydrofolaat en pyridoxal-5-fosfaat.

In de microorganismen die bij de werkwijze volgens de uitvinding worden gebruikt voor het produceren van L-serine uit glycine, is de L-serineproductie ontregeld ten gevolge van resistentie tegen tenminste één van de bovengenoemde drie amino-20 zuuranaloga. Bovendien is het enzym serinedehydratase, dat

bij de afbraak van L-serine een rol speelt, tenminste gedeeltelijk geïnactiveerd. Ten gevolge van één en ander wordt met de mutanten volgens de uitvinding de omzetting van glycine tot L-serine versneld en verhoogd. Zo werd met een mutant van 25 Corynebaeterlum'glyclnophflum (ook bekend als'corynebacteriumsp. I

ATCC 21341 na 4 tot 5 dagen fermenteren tenminste ongeveer 8,0 g/liter L-serine verkregen tegen 1,5-2,0 g/liter na 6 dagen met voornoemde ouderstam.

Bij uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding 30 voor het verbeteren van L-serine producerende microorganismen, worden mutaties geïnduceerd waardoor afbraak van gevormd L-serine door de microorganismen aanzienlijk wordt verminderd zo niet geheel vermeden. De hoeveelheid gevormd L-serine die de mutanten voor eigen behoefte benutten, is in elk geval mini-35 maal, zodat de in de fermentatievloeistof verzamelde L-serine 8403540 -3- practisch. in zijn geheel beschikbaar blijft om te worden gewonnen.

Verder wordt de metabole controle over de L-serine productie uit glycine ontregeld door inductie van mutaties die aan de microorganismen resistentie verlenen tegen grote 5 hoeveelheden hydroxymaatderivaten van serine, methionine en/of glycine. Gevonden is, dat resistentie tegen één of meer van deze drie verbindingen bijzonder doeltreffend is om een verhoogde L-serine productie te bewerkstelligen. Bij resistentie tegen andere L-serine analoga is dit veel minder of in het geheel niet 10 het geval.

Verder is gevonden, dat wanneer in één enkele stam serinedehydratase- negativiteit en resistentie tegen serinehydroxamaat, glycinehydroxymaat en/of methionine»hydroxy-maat gelijktijdig worden geïnduceerd, de L-serine productie 15 uit glycine door de mutant aanzienlijk verbetert. En nog meer wanneer de mutant resistent is tegen alle drie de aminozuur-anaioga. Deze verbetering betreft vooral de opbrengst aan L-serine.

De mutanten worden verkregen door kunstmatige 2Q en spontane mutaties onder toepassing van een bepaalde selectieprocedure. De kunstmatige mutatie omvat bestralen met ultraviolet licht en/of behandelen met een chemisch mutagens. , Mutagen.tia met een breed spectrum zoals ultraviolet licht en N-methyl-Nf-nitro-N-nitrosöguanidine (NG) veroorzaken een groot 25 aantal lesies waardoor de eigenschappen van het mieroorganisme ingrijpend worden gewijzigd. Maar omdat de genetische beschadiging ook verstrekkend is, hebben de mutagéntia·-'* een grotere neiging om schadelijke veranderingen teweeg te brengen. Meer beperkt werkzame mutagen&La zoals ethylmethaansulfonaat (EMSl leiden tot 30 relatief meer beheerste mutaties als ook tot mutaties van een bepaalde soort, afhankelijk van het mutagentia. Het mutagens, wordt in gebruikelijke doseringen of hoeveelheden toegepast.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding voor het verbeteren van L-serine producerende 35 microorganismen, omvat de volgende stappen.

Eerst wordt met een breed spectrum mutagens;. (NG) 8403540 1 * * -4- « een serinesdehydratase negatieve mutant geselecteerd. Aangenomen wordt, dat de mutant door de lesies gevormd door expositie aan NG, vatbaar wordt voor latere mutaties die analoge resistentie verlenen. Vervolgens worden mutanten geselecteerd die ook 5 resistent zijn tegen de bovengenoemde hydroxymaten, hetzij met een specifiek mutagens. met een beperkt werkingsspectrum zoals EMS hetzij door spontane mutatie. Aangenomen wordt dat deze volgorde het meest geschikt is om een levensvatbare, stam met de gewenste karakteristieken te verkrijgen. Maar een 10 andere volgorde is ook mogelijk, in het bijzonder voor het induceren van resistentie tegen de hydroxymaten. Verder kan een specifiek mstagensr. met een beperkt werkingsspectrum dat iets minder krachtig is, worden toegepast.

Bij deze voorkeursuitvoeringsvorm wordt uitgegaan 15 van een mieroorganisme waarvan bekend is dat het glycine om kan zetten tot het L-serine. Voor voorbeelden van geschikte microorganismen kan worden verwezen naar de bovengenoemde Amerikaanse oetrooischriften 4.183.786 en 3.623.952. Om daarin het serinedehydratase te inactiveren', wordt bij voorkeur 20 als volgt te werk gegaan. Een gezonde cultuur van de ouderstam wordt geëxposeerd aan het mutagensc NG. Vanuit deze cultuur worden microorganismen overgebracht op een medium dat alle voedingsstoffen bevat, en ongeveer 2-5 dagen bij normale temperatuur geïncuheerd. Van dit medium worden afzonderlijke 25 kolonies af genomen en overgebracht op minimale en complete media om kolonies te selecteren die als stikstofbron benut L-serine niet afbreken. Het minimale medium bevat voldoende voedingsstoffen voor de. groei van de microorganismen. Xn het complete medium wordt de stikstofbron vervangen door 30 L-serine.

Nadat deze platen voldoende lang zijn geïncubeerd om groei of uitblijven van groei te kunnen vaststellen, ongeveer 1-7 dagen, worden klonen geselecteerd die wel op het minimale medium maar niet op het complete medium groeien. Deze klonen 35 vertonen serine-dehydratase^negativiteit, dat wil zeggen dat zij niet in staat zijn om L-serine af te breken om in hun stik- 8403540

t i S

-5- stofbehoefte te voorzien. Klonen beginnen op te komen in de eerste fase van de groeiperiode. Maar omdat niet alle serinedehydratase-negatieve klonen ook L-serine producerende stammen zijn, verdient het voorkeur om tenminste enkele dagen 5 te incuberen teneinde daarmee een hogere populatie van klonen te verkrijgen waaruit klonen met een overproductie aan L-serine kunnen worden geselecteerd. De klonen met de hoogste L-serine productie worden gebruikt voor de volgende mutaties en selecties.

Om resistentie tegen methionine-Bydroxamaat 10 te kweken, wordt een aan mutagens, geëxposeerde celpopulatie geïncubeerd op een vast^roeimedium dat voldoende methionine hydroxamaat bevat om de groei van niet-resistente microorganismen te remmen. Geschikte hoeveelheden.methionine^hydroxymaat bedragen ongeveer 0,1-1,0 mg per milliliter groeimedium.

15 Analoge resistentie kan worden bereikt door spontane mutatie of door expositie van het mi'croorganisme aan een chemisch, mutagenïïs of ultraviolet licht alvorens het op het analogon bevattende medium over te brengen. Na ongeveer 3—7 dagen incuberen bij normale temperatuur zijn methionine^hydroxymaat 20 resistente kolonies opgekomen. Bij voorkeur zijn deze kolonies ook serinedehydratase-negatief. Om vast te stellen of deze laatste karakteristiek behouden is gebleven, kunnen de kolonies opnieuw worden overgebracht op de boven beschreven minimale en complete media. Serine^dehydratase negatieve kolonies zullen 25 dan alleen op het minimale medium groeien.

Om resistentie tegen serine#hydroxamaat en glycine-hydroxymaat te kweken kan op dezelfde wijze als voor het kweken van resistentie tegen methionine«*hydroxamaat te werk worden gegaan. Voor het kweken van serine^hydroxamaat resistentie kan 30 met ongeveer 0,1 - 1,0 mg serine^hydroxamaat per ml groeimedium worden volstaan. Maar voor het kweken van resistentie tegen glycinerhydroxamaat is het gewenst om lagere concentraties toe te passen omdat gebleken is dat microorganismen gevoeliger zijn voor glycine-rhydroxamaat dan voor serine^hydroxamaat. Een 35 geschikte concentratie glycine^hydroxamaat om te overleven bedraagt bijvoorbeeld ongeveer 0,01 — 0,8 mg/ml.

8403540 * -6- Λ.

Uit het voorgaande volgt, dat de werkwijze volgens de uitvinding voor het verbeteren van L-ser£ne producerende microorganismen berust op stapsgewijze selectie van mutanten van een ouderstam die de gewenste karakteristieken vertonen, 5 te weten serine-dehydratase^ negativiteit en resistentie tegen tenminste één van de aminozuur analoga-serine*hydroxamaat, glycine-hydroxamaat en methionine-hydroxamaat. Met stapsgewijze selectie wordt bedoeld dat de in elke stap verkregen mutant in een volgende stap wordt gebruikt. De geïnduceerde mutaties 10 zijn dus cumulatief. Zo is de stapsgewijze selectie van mutanten bij de boven beschreven voorkeursuitvoeringsvorm als volgt verlopen:

Stap 1: De ouderstam werd geëxposeerd aan het mutagenh^- NG en de serine-hydratase. nega-15 tieve mutanten werden geselecteerd.

Stap.2: Dè in stap 1 verkregen mutanten werden geëxposeerd aan EMS en gekweekt op methionine-^, hydroxamaat bevattend medium waarna methionine-^ hydroxamaat resistente mutanten werden 20 geselecteerd.

Stap 3: De in stap 2 verkregen mutanten werden gekweekt op serine>hydroxamaat bevattend medium waarna serinahydroxamaat resistente mutanten werden geselecteerd.

25 Stap 4: De in stap 3 verkregen mutanten werden gekweekt op glycine"hydroxamaat bevattend medium waarna glycine"hydroxamaat resistente mutanten werden geselecteerd.

Aldus werden mutanten verkregen die zowel serine-30 dehydratase negatief waren als ook resistent tegen alle drie de aminozuur-analogs methionine-hydroxamaat, serine"hydroxamaat en glycine-hydroxamaat.

Wanneer de stammen met de gewenste karakteristieken één maal zijn verkregen, kunnen zij in schudkolven of fermen-35 tatoren worden getest op L-serine productie. Op deze wijze kunnen één of meer verbeterde stammen worden geselecteerd die 8403540 ' * ~r » -7- de gewenste eigenschap (pen)..' vertonen, te weten de hoogste opbrengst aan L-serine, maximale opbrengst in de kortste fermentatietijd en/of de beste omzettingsgraad (dat wil zeggen de kleinst achtergebleven hoeveelheid niet-omgezet glycine 1.

5 Deze testfermentatie kan volgens gebruikelijke methoden worden uitgevoerd» Als cultuurmedium kan elk fermentatie-medium worden gebruikt dat een koolstofbron, stikstofbron, anorganische zouten en eventueel andere kleine hoeveelheden organische voedingsstoffen bevat. Als koolstofbron kunnen 10 fermenteerbare suikers, proteïne hydrolysaten en proteïnen worden gebruikt. Als stikstofbron komen in aanmerking ureum, ammoniumzouten van organisöhe zuren bijvoorbeeld ammoniumacetaat en ammoniumoxalaat, en ammoniumzouten van anorganische zuren bijvoorbeeld ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat en ammoniumchlo-15 ride. De hoeveelheid koolstof- en stikstofbronnen in het medium bedraagt in de regel 0,001 - 20 gew./vol.%. Verder kunnen anorganische stoffen bijvoorbeeld kaliumfosfaat en magnesiumsulfaat, en/of vitaminen bijvoorbeeld biotine en thiamine worden toegevoegd.

20 De fermentatietemperatuur bedraagt zoals gebruike lijk ongeveer 20-45°C en bij voorkeur ongeveer 26-34°C, afhankelijk van het microorganisme. De pE bedraagt ongeveer 5-8 en bij voorkeur ongeveer 6,5-7,5. De fermentatie in schudkolven duurt ongeveer 16-176 uren, bijvoorbeeld 96 uren, 25 en gedurende deze tijd hoopt zich L-serine in de fermentatie.-vloeistof op. Cellen en andere vaste bestanddelen kunnen op gebruikelijke wijze uit de eultüürvloeistof worden verwijderd, bijvoorbeeld door filtreren of centrifugeren.

De hoeveelheid gevormd L-serine kan tijdens en 3Q na afloop van de fermentatie worden bepaald door hogedrukvloei-stofchromatografie of op elke andere geschikte manier. Glycine-gehaltes kunnen ook worden bepaald. Op grond van de analyseresultaten kan de kloon of kunnen de klonen met de gewenste karakteristieken worden gekozen.

35 De uitvinding heeft verder betrekking op een werk wijze voor het produceren van L-serine onder toepassing van 8403540 -8- * » ^ * een verbeterd microorganisme met de boven beschreven karakteristieken. De werkwijze kan op laboratoriumschaal, in een proeffabriek of op technische schaal worden uitgevoerd.

Met de werkwijze volgens de uitvinding voor het 5 verbeteren van L-serine producerende microorganismen zijn mutante stammen van Corynebacterium glycinoMiilum verkregen met een verminderde neiging tot afbraak van L-serine en resistentie tegen serinehydroxamaat, glyeinehydroxamaat en methionine-hy^roxamaat. Twee van deze mutanten zijn gedeponeerd bij het 10 ATCC onder nummer ATCC 39495 en ATCC 39496. De uitvinding is hiertoe echter niet beperkt maar kan ook worden toegepast op het verbeteren van andere L-serine producerende microorganismen.

In de onderstaande voorbeelden werden de volgende cultuurmedia gebruikt.

15 Nitrosoguanldlne mutatie medium

Glucose 0,5%

Pepton 1,0%

Vlees extrakt 1,0%

NaCl ' 0,5% 20 Gist extrakt 0,5%

Agar 2,0%

Gedeioniseerd water 94,5%

De bestanddelen werden verwarmd tot koken en daarna 15 minuten met stoom van 121°C gesteriliseerd. Het steriele 25 mengsel werd uitgeschonken in Petrischalen waarin men het liet stollen.

Serjne entmedium

Glucose 3,00% . (NH412S04 0,30% 30 K^HPC^ 0,16% ΚΗΡΟ. 0,04% 2 '4

MgS04.7H20 0,05%

Gist èxtrakt 0,50%

Pepton 2,00% 35 Gedeioniseerd water 93,95% - 8403540

S

* ίο -9-

De bestanddelen werden gemengd en het mengsel werd 20 min. geautoclaveerd bij 121°C.

Luriabouillon

Bacto-trypron (Difco) 10,0 g 5 Bacto-Gist extrakt (Difco) 5,0 g

NaCl 10,0 g 1,0 M NaOE 1,5 ml

De bestanddelen werden verenigd in een liter o gedeioniseerd water en 15 min. met stoom van 121 c gesteriliseerd.

10 Serineproductieentmedium

Glucose 50,00 g/1 (NH^12S04 2,00 g/1 NH4N03 3,00 g/1 K^P04 1,00 g/1 15 MgS04.7H20 0,50 g/1

Glycine 20,00 g/1 L-glutaminezuur 0,50 g/1 L-methionine 0,50 g/1 L-valine 0,50 g/1 2Q CaCC>3 25,00 g/1

Biotine 0,20 mg/1

Thiamine-HCIi 1,00 mg/1

Riboflavine 2,00 mg/1

Foliumzuur 1,00 mg/1 25 Calciumpantothenaat 1,00 mg/1

Nicotinamide 1,00 mg/1

Pyroxidine 1,00 mg/1

Pyridoxal 0,20 mg/1 PABA 1,00 mg/1 3Q De eerste negen bestanddelen werden in de aange geven hoeveelheden verenigd in één liter gedeioniseerd water en 12 min. geautoclaveerd bij 112°c. CaC03 werd afzonderlijk geautoclaveerd bij 112 C gedurende 12 min. De overige bestanddelen werden gemengd, gesteriliseerd door filtreren en 35 samen met het CaCO^ aan het afgekoelde medium toegevoegd.

8403540 • — o -10-

Gemodificëerd serineproductie medium

Dit medium werd op dezelfde wijze bereid als het serineproductiemedium behalve dat in plaats van 5/0% glucose 3,0% glucose werd gebruikt.

5 Serine productie minimaal medium

Glucose 0,500% (NH 1 SO 0,200% 4 2 4 KH„PO. 0,150% 2 4

KnHPO 0,050% 2 4 10 MgS04.7E20 0,050%

NaCl 0,010%

PeS04.7H20 0,001%

MnSO ..4H-0 0,001% 4 2

CaCl2.2H20 0,001% 15 Biotine 100 ug/l

Thiamine-HCl 1,0 mg/1

Agar 2,000%

De bestanddelen werden in één liter gedeioniseerd water verwarmd tot koken en daarna 15 min. geautoclaveerd bij 20 121°C. Het mengsel werd uitgeschonken petrischalen waarin men het liet stollen.

Serine productie ccmpleetfmedium Dit medium werd op dezelfde wijze bereid als het serine productie minimaal medium behalve dat in plaats 25 van 0,2% (NE^l^SC^ 0,2% L-serine werd gebruikt.

voorbeeld I

Van een gekoelde schuine voedingsagar (Difco1 werd een lus-vol Corynebacterium glycinophilum (ook bekend als Corynebacterium sp.). ATCC 21341 af genomen en geënt in 5,0 ml 3Q Luria bouillon in een 20 ml testbuis. De buis werd 24 uren geïncubeerd bij 32°C. De cellen werden afgecentrifugeerd, gewassen met en opnieuw gesuspendeerd in 10 ml Q,lM natriumfosfaatbuffer (OH. 7,01 in een testbuis.

N-methyl-N1 -nitro-N-nitrosoguanidine (NG).. werd 35 aan de celsuspensie toegevoegd in een concentratie van 0,5 mg/ml.

. . Het NG-cel-: ...fet&fermengsel werd 30 min. op kamertemperatuur 8403540 * ¢-^-c -11- gehouden. Hierna werden de cellen gewassen met 10 ml buffer, afgecentrifugeerd en nog eens vijf keer met de buffer gewassen.

De gewassen cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 5,0 ml van de buffer. Van deze celsuspensie werden 100 μΐ hoeveelheden 5 afgenomen en uitgestreken op platen van het nitrosoguanidine- mutatiemedium. De platen werden twee dagen bij 30°C geïncubeerd.

Van deze platen werden afzonderlijke kolonies afgenomen en uitgestreken op platen van het serine productie minimaal TBftdfinw en serine productie compleet medium om te onderzoeken 10 of de kolonies ook L-serine als stikstofbron benutten. Een kloon, aangeduid met SW5ER-1, werd opgespoord die wel op het minimale medium maar niet op het complete medium groeide.

Deze kloon was dus zó gemuteerd dat hij een verminderde neiging yertobnde om L-serine af te breken teneinde in zijn 15 stikstofbehoefte.te voorzien.

De SWSER-1 kloon werd gekweekt in 5,0 ml serine entmedium gedurende 2-dagen bij 30°C en een schudsnelheid van 260 omw./min. Een hoeveelheid van 2,0 ml werd overgebracht in 50 ml serineproductie medium in een 250 ml Erlenmeyerkolf 20 zonder deuk en 5 dagen gekweekt bij 30°C en 125 omw./min. Deze procedure werd gedupliceerd onder gebruikmaking van de ouder-stam ATCC 21341. Na afloop werden monsters van de fermentatie-vloeistoffen onderzocht door hogedrukvloeistofchromatografie.

De kloon SWSER-1 had 4,4 mg/ml-L-sérine geproduceerd tegen 25 1,6 mg/ml door de ouderstam ATCC 21341.

Voorbeeld II

Een verse schuine voedingsagar van Se kloon SWSER—1 werd gewassen met 10 ml G,1M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,01 en de gevormde suspensie weid in een 20 ml steriele Coming (TMl 30 centrifugeerbuis gebracht. Aan de suspensie werd ethylmethaan-sulfonaat (EMSl toegevoegd in een concentratie van 0,06 molair.

De suspensie werd gewerveld om de cellen met het mutagens te mengen en daarna 18 uren bij 30°C geïncubeerd.

Na afloop van de incubatie werden de cellen ge-35 centrifugeerd, twee keer gewassen met 10 ml 0,1 M kaliumfosfaat- 8403540' -12- β O' ^ . ...

buffer en opnieuw in 10 ml buffer gesuspendeerd. Bij elke keer wassen werden de cellen overgebraeiit in schone buizen om zich te ontdoen van mutagens dat op de binnenkant van de testbuls was achtergebleven. De gewassen celsuspensie werd 5 in hoeveelheden van 100 μΐ uitgestreken op platen van voedings-agar die 0,5 mg/ml van het aminozuuranalogon methioninehydroxa-maat bevatte. De platen werden 5 dagen bij 30°C geïncubeerd.

Aan de op de methionine hydroxymaat bevattende platen opgekomen kolonies was dus door de mutatie(s)' resistentie tegen het 10 aminozuuranalogon verleend.

Eén van de kolonies, aangeduid met SWSER-1-23 werd geselecteerd voor L-serine productie. De kolonie werd 24 uren gekweekt in 5,0 ml serine entmedium bij 3Q°C en 260 omw./min. Hierna werden hoeveelheden van 2,0 ml overgebracht in 250 ml 15 Erlenmeyerkolven zonder deuk die 50 ml serine productie medium bevatten en 6 dagen geïncubeerd. bij 30°C en 125 omw./min. Deze procedure werd gedupliceerd onder toepassing van de SWSER-1 kloon."De fermentatievloeistof van SWSER-i-23 bleek bij hoge drukvloeistofchromatografie 4,8. mg/ml L-serine te bevatten tegen 20 3,3 mg/ml L-serine in de fermentatievloeistof van SWSER-1.

, Voorbeeld ~III

Een schuine voedingsagar van de in voorbeeld II verkregen kloon SWSER-1-23 werd gewassen met en opnieuw gesuspendeerd in 10 ml Q.,1Mkaliumfosfaatbuffer {pH 7,01. De suspen-25 sie werd in hoeveelheden van 100 μΐ uitgestreken op platen van voedingsagar die 0,5 mg/ml serinehydroxamaat bevatte. De

O

platen werden 5 dagen bij 30 C geïncubeerd. Tegen het eind van de incubatieperiode was er een significante groei op de platen waaruit bleek dat de SWSER*-l-23 kloon een mutatie bevatte 3Q waardoor hij resistent tegen serinehydroxamaat was geworden.

Voorbeeld IV

Een schuine voedingsagar van de in voorbeeld II verkregen kloon SWSER-1-23 werd gewassen met 10 ml gedeioniseerd water. De celsuspensie werd in hoeveelheden van 100 μΐ uitge-35 streken op platen van het sertnaproductie minimaal medium 8403540

C

^ 9 -° -13- dat 0/5 mg/ml glycinehydroxamaat bevatte. De platen werden 5 dagen bij 30°C geincubeerd. Tegen bet eind van de incubatieperiode waren op de platen kolonies opgekomen die blijkbaar door spontane mutatie resistent tegen glycinebydroxamaat waren 5 geworden.

Twee van deze kolonies/ aangeduid met SWSER-1-23-18 (thans ATCC 394951 en SWSER-1-23-20 (thans ATCC 394961 werden 's-nachts gekweekt in 5,0 ml serine entmedium bij 31°C. Na afloop werden de kweken overgebracht in 50 ml serine productie 10 medium en 6 dagen geincubeerd bij 31°C en 300 omw./min. Deze procedure werd gedupliceerd onder gebruikmaking van de SWSER-1-23 kloon. Blijkens hogedrukvloeistofchromatografie bevatte de fermentatievloeistof van SWSER-1-23-18 (ATCC 394951 4,8 mg/ml L-serine en de fermentatievloeistof van SWSER—1—23—20 (ATCC 15 394961 5,2 mg/ml L-serine tegen 2,7 mg/ml L-serine in de fermentatievloeistof van SWSER-1-23.

voorbeeld v

Een schuine voedingsagar van de kloon SWSER-1-23-20 (ATCC 394961 werd gewassen met 10,0 ml Q,1M kaliumfosfaatbuffer 20 (pH. 7,01. Van de celsuspensie werden hoeveelheden van 2,5 ml overgebracht in 250 ml Erlenmeyerkolven zonder deuk die 50 ml serine entmedium bevatten. De kolven werden 1 s-nachts gexncu-beerd bij 31 °C en 26Q omw./min. Vervolgens werd 50 ml gemodificeerd serine productie medium in een 250 ml Erlenmeyerkolf 25 zonder deuk met 2,0 ml van de entcultuur geënt. De kolf werd 5 dagen geincubeerd bij 31 C en 260 omw./min. onder toevoeging van 14 glucose na respectievelijk 48 en 72 uren.

Blijkens hogedrukvloeistofchromatografie was ;na de 5 daagse fermentatie 8,8 mg/ml L-serine gevormd.

3Q

8403540

Claims (18)

1. Werkwijze voor het verbeteren var^iit glycine L-serine producerende microorganismen, met het kenmerk dat, in demicroorganismen mutaties teweeg worden gebracht waardoor zij 1X serinedehydratase negatief worden en 2) resistent tegen 5 tenminste één van de aminozuuranalogateerinehydroxamaat, . glycinehydroxamaat en methioninehydroxamaat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat, de mutaties van de ouderstam en het selecteren van de mutanten worden uitgevoerd in één of meer van de volgende 10 stappen: A selecteren van een mutant met serinedehydratase-negativiteit, B selecteren van een mutant met serinehydroxamaat-resistentie, 15. selecteren van een mutant met glycinehydroxamaat- resistentie, en D selecteren van een mutant met methioninehydroxa-maatresistentie, waarbij tenminste het selecteren volgens stap A 20 moet worden 'uitgevoerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, tenminste één mutatie wordt geïnduceerd door expositie aan N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine en/of ethylmethaan-sulfonaat.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, het selecteren volgens stap A bestaat uit het: al overbrengen van kolonies op een plaat van minimaal medium, bl overbrengen van de kolonies op een plaat van 30 hetzelfde medium als in stap a) maar dat L-serine bevat als stikstofbron, cl incuberen van de platen uit de stappen al en bl gedurende ongeveer 1-7 dagen bij ongeveer 20-45°C, en d) selecteren van kolonies die wel op de plaat 8403540 'Λ *3- -----9 -15- uit stap al maar niet op de plaat uit stap b) opkomen.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, het-selecteren volgens stap B bestaat uit het het: al uitstrijken van cellen op een vast kweekmedium 5 dat ongeveer 0,1-1,0 mg/ml serinehydroxamaat bevat, b) incuberen van de plaat uit stap al gedurende ongeveer 1-7 dagen bij ongeveer 20-45°C, en cl selecteren van. op deze plaat opgekomen kolonies.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk 10 dat, het selecteren volgens stap C bestaat uit het: al uitstrijken van cellen op een vast kweekmedium dat ongeveer 0,01-0,8 mg/ml glycinehydroxamaat bevat, bl incuberen van de plaat uit stap (a) gedurende ongeveer 1-7 dagen bij ongeveer 20-45°C, en 15 cl selecteren van op deze plaat opgekomen kolonies.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, het selecteren volgens, stap D bestaat uit het: al uitstrijken van cellen op een vast kweekmedium dat ongeveer 0,1-1,0 mg/ml methioninehydroxamaat bevat, 20 bl incuberen van de plaat uit stap al gedurende ongeveer 1-7 dagen bij ongeveer 20-45°C, en cl selecteren van op deze plaat opgekomen kolonies.

8. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat, het selecteren volgens alle vier de stappen A, B, C en D wordt 25 uitgevoerd.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk dat, • eerst het selecteren volgens stap A wordt uitgevoerd onder toe passing van N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine als mutagens.

10. Werkwijze voor het produceren van L-serine door 30 fermentatie van een microorganisme dat glycine om kan zetten tot L-serine, met het 'kenmerk dat, een verbeterd L-serine producerend microorganisme met llserinedehydr^tase-negattviteit en 21 resistentie tegen tenminste één van de aminozuuranaloga serinehydroxamaat, glycinehydroxamaat en methioninehydroxamaat 35 wordt gekweekt onder aerobe omstandigheden. 8403540 -16- N. ' — v

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk dat, L-serine dat zich tijdens de fermentatie in het medium heeft opgehoopt daaruit wordt gewonnen.

12. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk 5 dat, het fermenteren wordt uitgevoerd gedurende ongeveer 16-176 uren bij een temperatuur van ongeveer 20-45°C en een pH van ongeveer 5-8.

13. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk dat, het verbeterd L-serine producerend mier©organisme een 10 mutant is van'Corynebacterium glycinophilum. • 14. Werkwijze volgens conclusie 13; met'het kenmerk dat, de mutant ATCC 39495 of ATCC 39496 is.

15. Verbeterd L-serine producerend microorganisme, gekenmerkt.door U. serinedehydratase-negativiteit en 2). resisten- 15 tie tegen tenminste êén van de aminozuuranaloga&erinehydroxamaat, glycinehydroxamaat en methioninehydroxamaat.

16. Verbeterd L-serine producerend microorganisme volgens conclusie 15, met het kenmerk dat, het microorganisme resistentie tegen tenminste één van de aminozuuranaloga ver- 20 toont bij een concentratie serinehydroxamaat of methionine-hydroxamaat van ongeveer 0,1-1,0 mg/ml en glycinehydroxamaat van ongeveer 0,01-0,8 mg/ml. i'7. Verbeterd L-serine producerend microorganisme volgens conclusie 15 en 16, met het kenmerk dat, het micro- 25 organisme resistent is tegen alle drie de aminozuuranaloga.

18. Verbeterd L-serine producerend microorganisme volgens één der conclusies 15-17, met het kenmerk dat, het microorganisme tot het genus Corynebacterium behoort.

19. Verbeterd L-serine producerend microorganisme 30 volgens conclusie 18, met het kenmerk dat, het microorganisme Corynebacterium glycinophilum ATCC 39495 en'Corynebacterium glycinophilum ATCC 39496 is.

20. Werkwijze voor het verbeteren van L-serine producerende microorganismen, verbeterde L-serine producerende 35 microorganismen, en werkwijze voor het produceren van L-serine onder toepassing daarvan, zoals beschreven in de beschrijving en 8403540 -17- voorbeelden. *. - ---- 8403540