KR960009066B1 - L-글루탐산을 제조하는 발효방법 - Google Patents

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Abstract

내용없음.

Description

L-글루탐산을 제조하는 발효방법
본 발명은 조미료로서 널리 사용되는 L-글루탐산을 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다.
L-글루탐산은 산업적 규모로 브레비박테륨(Brevibacterium) 또는 코리네박테륨(Corynebacterium)속에 속하는 미생물을 사용하여 발효 공정으로 제조하여 왔다.
발효 공정에 의한 L-리신의 제조와 관련하여, 당해 아미노산은 L-리신을 생성시킬 수 있고 고농도(30g/dl)의 에틸렌 클리콜에 대해 내성이 있는 브레비박테륨 또는 코리네박테륨 속에 속하는 몇몇 균주에 의해 고수율로 제조할 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조 : 일본국 공개특허공보 제 115,186 호(1983)]. 그러나, L-글루탐산 발효에 관하여, 고농도(10g/dl)의 염화나트륨에 내성이 있는 L-글루탐산 생성 미생물이 L-클루탐산을 고수율로 생성한다는 사실은 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 적은 비용으로 산업적 규모로 L-아미노산을 제조하는 새로운 발효 공정을 개발하는 것이다.
L-글루탐산을 제조하는 통상적인 발효공정을 개선하는데 목적을 둔 연구에 의해, 브레비박테륨 또는 코리네박테륨의 L-글루탐산 생성 종으로부터 유도된 돌연변이체로부터 탁월한 L-글루탐산 생성 능력을 갖고 고농도의 염의 존재하에서 성장할 수 있는 균주를 분리하는데 성공했다. 본 발명은 액체 배양 배지중에서, L-글루탐산을 생성시킬 수 있고 고농도의 염의 존재하에서도 성장할 수 있는 브레비박데륨 또는 코리네박레륨 속에 속하는 돌연변이체 균주를 성장시키고 ; 상기 액체 배지중에서 형성되어 축적된 L-글루탐산을 회수함을 포함하는, L-글루탐산을 제조하는 신규한 발효 공정에 관한 것이다. 본 발명의 공정에서 사용되고 고농도의 염의 존재하에서도 성장할 수 있는 돌연변이체의 대표적인 예로는 고농도 염화나트륨의 존재하에서 성장할 수 있는 브레비박테륨 락토페르멘툼(AJ 12300, FERM P-8846, FERM BP-1363)[기탁번호 : KFCC-10448, 기탁일 : 1987년 10월 23일, 기탁기관 : 한국종균협회] 및 코리네박테륨 글루타미컴(AJ 12301, FERM P-8847, FERM BP-1364)[기탁번호 : KFCC-10499, 기탁일 : 1987년 10월 23일, 기탁기관 : 한국종균협회]이 포함된다. FERM-P 번호로 상기 정의한 돌연변이체는 일본국 이바라기켄 쓰쿠바군 야타베마치 히가시 1쵸메 1-3소재의 국제 통상 산업성 산업 과학 기술국 발효 연구소(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciences and Technology, Ministy of InternationaI Trade and Industry : FRI)에 1986년 7월 10일자로 최초로 기탁되어 상기한 FERM-P 번호를 부여받았다. 그후 상기 돌연변이체 기탁물은 1987년 5월 15일에 부타페스트 조약하의 기탁물로 전환되었고, 이에따라 상응하는 FERM-BP 번호를 부여받았다.
이러한 균주는 브레비박테륨 락토페르멘툼(ATCC 13869)과 코리네박테륨 글루타미컴(ATCC 13032)으로부터 돌연변이화 방법을 사용하여 유도된다. 본 발명의 공정에 사용되는 돌연변이체가 유도되는 다른 모균주는 브레비박테륨종[예를 들면, 비. 플라범(B.flavum)(ATCC 14067), 비.데바리카텀(B.devaricatum)(NRRL B-2311) 및 비. 사카롤리티컴 (B. saccharoliticum) (ATCC 14066) ], 코리네박테륨종[예를들면, 씨.아세토애씨도필럼(C. acetoacidophilum)(ATCC 13870) 및 씨. 아세티글루타미컴(C. acetiglutamicum)(ATCC 15806)] 및 마이크로박테륨 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum)(ATCC 15354)과 같은 L-글루탐산 생성 미생물이 포함된다.
자외선, X-선 및 기타 방사선의 조사, 변이 유발소를 사용한 처리 및 미생물의 돌연변이화에 통상 사용되는 기타 기술을 상술한 모균주로부터 본 발명의 돌연변이체 균주를 유도하기 위해 사용할 수 있다. 30℃에서 250μg/ml의 N-니트로-N'-메틸-N-니트로소구아니딘으로 20분 동안 처리하는 것이 그 예이다. 본 명세서에서 고농도의 염은 액체 배지에 가할 경우, 배지의 삼투압을 증가시키며 이에 의해 배지에서 미생물의 성장이 지연되거나 억제되는 염을 의미한다. 대표적인 예로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화제 1철, 염화제 2 철, 염화망간(II), 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산제 1 철, 황산제 2 절, 황산마그네슘, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 인산암모늄, 글루탐산나트륨, 글루탐산암모늄, 솔비톨, 자당, 과당, 포도당, 푸마르산, 시트르산 및 에틸렌 글리콜 등이 포함된다. 본 명세서에서 고농도의 염의 존재하에서 성장할 수 있는 돌연변이체는 각각의 모균주의 성장을 억제하는 조건하에서 상술한 바와 같은 고농도의 염을 함유하는 고체 또는 액체 배양 배지에서 성장할 수 있는 돌연변이체 균주를 의미한다. 예로서, 고농도의 염화나트륨 존재하에서의 배양 시험 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00001
(+++) : 매우 잘 성장한다 ; (++) 잘 성장한다 ; (+) : 약간 성장 한다 ; (±) : 거의 또는 전혀 성장하지 않는다.
표 1에 나타낸 각 균주의 성장조건은 다음과 같이 평가되었다.
1%의 폴리펩톤, 1%의 효모 추출물, 0.5 내지 20.0%의 염화나토륨 및 2%의 한천을 함유하는 배양 배지(pH 7.0)를 120℃에서 20분 동안 멸균시켜 한천 플레이트를 제조한다.
육즙 사면 배지에서 24시간 동안 미리 배양시킨 각각의 균주를 멸균수에 현탁시키고, 이와 같이 하여 수득된 현탁액을 상기 제조한 각 한천 플레이트에 접종하고(플레이트당 100 내지 200개의 세포), 31.5℃에서 48시간 동안 계속 배양하고, 발현된 클로니의 크기를 측정한다. 이와 같이 하여 선택된 고농도의 염의 존재하에서 성장할 수 있는 균주는 성장하여 L-글루탐산 발효에 통상적으로 사용되는 공지된 기술에 의해 L-글루탐산을 생성시킬 수 있다.
탄소공급원, 질소공급원, 무기 이온 및 기타 영양소를 함유하는 통상적인 배양 배지를 본 목적에 사용할수 있다.
탄소공급원의 예로서 사탕무우 및 사탕수수 즙, 폐 당밀, 전분 가수분해물 기타 당 물질 ; 및 아세트산과 같은 유기산을 들 수 있다. 암모늄염, 암모니아수, 우레아 및 L-글루탐산 발효에 통상적으로 사용되는 기타의 질소공급원을 사용할 수 있다.
또한, 경우에 따라, 무기 이온(예를들면, 인산염 이온 및 마그네슘 이온)을 배양 배지에 가할 수 있다. 또한, 바이오틴(또는 바이오틴-활성 물질)을 그의 양이, 배양되는 균주의 만족할만한 성장에 대해 허용할수 있는 최고 농도를 초과하지 않는 조건에서 사용할 수 있다 ; 폐 당밀 또는 과량의 바이오틴을 함유하는 기타 물질을 탄소공급원으로 사용하는 경우, 페니실린(G, F, K, O, V 또는 X) 또는 고급 지방산 형태의 계면활성제(예를 들면, 슈크로즈 모노팔미테이트 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트)를 바이오틴 억제제로서 가한다. 또한, 배양조건은 30 내지 40℃ 범위의 온도 및 6 내지 8.5 범위의 pH에서의 호기성 조건으로서 L-글루탐산 발효에 대해 통상적으로 사용되는 배양조건과 같다.
다음 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다.
[실시예 1]
포도당 50mg/ml, 우레아 2mg/ml, KH2PO41mg/ml, MgSO4, 7H2O 0.4mg/ml, FeSO4, 7H2O 10μg/ml, MnSO4, 4H2O 10μg/ml, 콩단백질의 산 가수분해물(미에키) 5μg/ml, 티아민 염산염 100μg/l, 바이오틴, 2.5μg/ml 및 NaCl 25mg/ml를 함유하는 배양 배지를 제조한다. 상기 배지 20ml를 500ml들이 진탕플라스크에 분배하여 넣고 115℃에서 10분동안 가열하여 멸균시킨다. 표 2에 열거한 각각의 균주를 상기 배지에 접종하고, 왕복 진탕기내 31.5℃에서 30시간 동안 계속 발효시킨다. 이 기간 동안 우레아 수용액 450mg/ml를 소량씩 가하여 배양 배지의 pH를 6.0 내지 8.5의 범위로 유지시킨다. 소모된 당에 기초한 발효액에 축적된 L-글루탐산의 수율을 표 2에 열거하였다. 표로부터 분명한 바와 같이, 고농도의 염의 존재하에서도 성장할 수 있는 돌연변이체 균주가 다량의 L-글루탐산을 축적시킨다.
[표 2]
Figure kpo00002
[실시예 2]
폐 당밀(포도당으로서 ) 60mg/ml, KH2PO41mg/ml, MgSO4, 7H2O1mg/ml, 티아민 염산염 100μg/l 및(삼투압을 증가시키기 위한) NaCl 25mg/ml를 함유하는 배양 배지를 제조한다(pH 7.0). 상기 배지 20ml를 500ml들이 진탕 플라스크에 분배하며 넣고 115℃에서 10분 동안 가열하여 멸균시킨다. 표 3에 열거한 각각의 균주를 상기 배지에 접종하고, 왕복 진탕기내 31.5℃에서 36시간 계속 발효시킨다.
이 기간동안 우레아 수용액 450mg/ml를 소량씩 가하여 배양 배지의 pH를 6.0 내지 8.5의 범위로 유지시킨다. 발효액의 1 : 26 회석액의 흡광도가 562mμ에서 0.30에 달하는 경우, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트(PESP)를 가한다.
소모된 당에 기초한 발효액에 축적된 L-글루탐산의 수율은 표 3에 열거하였다. 표로부터 분명한 바와 같이, 고농도의 염의 존재하에서도 성장할 수 있는 돌연변이체 균주가 다량의 L-글루탐산을 축적시킨다.
[표 3]
Figure kpo00003
[실시예 3]
폐 당밀(포도당으로서) 150mg/ml, KH2PO41mg/ml, MgSO4, 7H2O 1mg/ml, 티아민 염산염 100μg/l, 소포제 0.02ml/l 및 솔비톨 50mg/ml를 함유하는 배양 배지를 제조한다(pH 7.0). 상기 배지 300ml를 11용병 발효기에 충전시키고 120℃에서 10분 동안 가열하여 멸균시킨다.
표 4에 열거한 각각의 균주를 상기 배지에 접종하고 통기 및 진탕시키면서 31.5℃에서 계속 발효시킨다. 암모니아 기체를 주입하여 배양 배지의 pH를 7.8로 유지하고, 발효액의 1 : 26 희석액의 흡광도가 562mμ에서 0.35에 달하는 경우, PESP를 가한다. 소모된 당에 기초하여 발효액에 축적된 L-글루탐산의 수율을 표 4에 열거하였다. 표로부터 분명한 바와 같이, 고농도 염의 존재하에서도 성장할 수 있는 돌연변이체 균주가 다량의 L-글루탐산을 축적시킨다.
[표 4]
Figure kpo00004

Claims (1)

1.0%의 폴리펩톤, 1.0%의 효모 추출물, 2.0%의 한천 및 10g/dl 이상의 염화나트륨을 함유하는 배양배지중 31.5℃에서 48시간 동안 성장할 수 있고 L-글루탐산을 생성시킬 수 있는, 브레비박테륨 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 또는 코리네박테륨 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 속하는 돌연변이체를 호기성 조건하에 액체 배지중에서 성장시킨 다음, 액체 배지중에서 형성되어 축적된 L-글루탐산을 회수함을 포함하여, L-글루탐산을 제조하는 발효 방법.
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