CN101906448B - 一种生物合成川芎嗪的方法 - Google Patents
一种生物合成川芎嗪的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101906448B CN101906448B CN2010101042643A CN201010104264A CN101906448B CN 101906448 B CN101906448 B CN 101906448B CN 2010101042643 A CN2010101042643 A CN 2010101042643A CN 201010104264 A CN201010104264 A CN 201010104264A CN 101906448 B CN101906448 B CN 101906448B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ligustrazine
- seed
- biosynthesizing
- medium
- contain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- FINHMKGKINIASC-UHFFFAOYSA-N Tetramethylpyrazine Chemical compound CC1=NC(C)=C(C)N=C1C FINHMKGKINIASC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 162
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 18
- 244000113306 Monascus purpureus Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000002322 Monascus purpureus Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 15
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 12
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 12
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 abstract 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 13
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FXNDIJDIPNCZQJ-UHFFFAOYSA-N 2,4,4-trimethylpent-1-ene Chemical compound CC(=C)CC(C)(C)C FXNDIJDIPNCZQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010019617 Henoch-Schonlein purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000031814 IgA Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000112528 Ligusticum striatum Species 0.000 description 1
- 206010048961 Localised oedema Diseases 0.000 description 1
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010061373 Sudden Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036319 cervical spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 208000015446 immunoglobulin a vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 150000003216 pyrazines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000005801 spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- -1 γ-An Jidingsuan Chemical compound 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲菌种(Monascus purpureusTMP-001)，包括以下步骤：A)、在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上活化培养；B)、将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移到种子培养基中培养；得种子液；C)、将种子液转接到基础发酵培养基中培养，得含有川芎嗪的液体发酵产物。采用该方法生物合成川芎嗪，具有转化反应易于控制、安全性高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域和食品化学领域，具体涉及一种利用紫红曲菌液态发酵制备川芎嗪的方法。
背景技术
川芎嗪(Ligustrazine)，即2，3，5，6-四甲基吡嗪(tetramethypyrazine)，无色针状结晶，熔点80-82℃、沸点190℃，属吡嗪类生物碱，具有特殊异臭，有吸湿性，易升华，可溶于热水、石油醚，溶于氯仿、稀酸，不溶于冷水。川芎嗪作为抗心血管疾病药物临床应用已超过30年，被公认为安全无副作用。可以改善缺血性脑血管疾病的症状；治疗心绞痛和冠心病等心血管疾病；拮抗钙离子，对呼吸系统疾病有一定的治疗作用；可有效缓解肾病综合症患者的高凝状态和微血栓的形成，与激素联合治疗肾病综合症取得满意的效果；此外，还有用于突发性耳聋、颈椎病、过敏性紫癜、新生儿硬肿等病症的报道。川芎嗪经体内代谢产生的吡嗪酸衍生物具有明显的降血脂效果。
从中药中提取川芎嗪是目前一种常用的制备川芎嗪的方法，赵丽恋等证明多次的乙醇回流提取能使总的总提取转移率达82％；刘本等用法多索溶剂、超临界CO2和夹带10％甲醇的超临界CO2从川芎中提取川芎嗪。人工化学合成也是一种制备川芎嗪的方法，张锋等提出以3-羟基-2-丁酮和乙酸铵为原料合成川芎嗪，产率可达72％；中国专利CN1100765C中公开了一种通过2，3-丁二酮一肟反应获得四甲基吡嗪。虽然化学合成法能获得较高产率的四甲基吡嗪，但在合成过程中容易产生副产物及有机试剂残留的问题，存在安全风险，同时会带来环境污染的问题。1962年，Kos-uge和Kamiya第一次报道利用微生物(Bacilussubtilis)发酵产生川芎嗪；1967年，Demain等分离得到谷氨酸棒杆菌突变株，发现它能产生大量的川芎嗪；中国专利CN1100765C中公开了一种枯草芽孢杆菌生物转化制备川芎嗪的方法。
目前，没有见到通过紫红曲霉发酵产生川芎嗪的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物合成川芎嗪的方法，该方法操作简单，转化反应易于控制，无污染，安全性高，而且能耗少、成本低廉。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-001)，包括以下步骤：
A)、菌种活化：
在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上，在28～30℃恒温培养活化7～9天；
B)、种子制备：
将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移到种子培养基中，在160～200rpm、28～32℃的恒温摇床上培养30～40h；得种子液；
C)、液态发酵培养：
将步骤B)所得的种子液转接到基础发酵培养基中，在120～210rpm、26～34℃的恒温摇床上培养9～11天，得含有川芎嗪的液体发酵产物；所述种子液与基础培养基的重量比为5％～13％。
作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的改进：紫红曲菌株TMP-001保藏名称为：紫红曲(Monascus purpureus)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年09月06日，保藏号为：CGMCC NO.3272。
作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进：种子培养基组成为：每100ml种子培养基中含有2.8～3.2g粳米粉、1.8～2.2g葡萄糖、1.8～2.2g蛋白胨、0.08～0.12gMgSO4·7H2O、0.18～0.22g NaNO3和0.23～0.27g KH2PO4，其余为水；pH值自然。基础发酵培养基组成为：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉3～7g、蛋白胨1.0～5.0g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaNO3 0.2g和KH2PO4 0.25g，其余为水；调pH值为4～8。配置后的基础发酵培养基的自然pH值为4.5左右，可用NaOH溶液或HCl溶液来调节pH值。
作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进：步骤B)中孢子悬浮液的浓度为8×106～2×107个/ml；孢子悬浮液与种子培养基的体积比为10∶45～55。
作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进：每100ml种子培养基中含有3g粳米粉、2g葡萄糖、2g蛋白胨、0.1g MgSO4·7H2O、0.2g NaNO3和0.25g KH2PO4，其余为水；pH值自然。每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g和蛋白胨3g；种子液与基础培养基的重量比为7％。
发明人首次发现并诱变筛选到能产生川芎嗪的紫红曲菌种，并且优化了其产生川芎嗪的发酵培养基配比和发酵条件。紫红曲原产于中国，已有一千多年的生产、应用历史；其作为真菌属的一种，既是中药又是食品。在发酵过程中，不仅能产生红曲色素、各种酶类，而且还能产生Monacolin K、γ-氨基丁酸、麦角固醇等活性物质，可以起到治疗与预防心脑血管疾病的作用。其发酵制品受到人们的喜爱，越来越广泛应用到各种食品和保健品中。通过紫红曲发酵产生川芎嗪，不仅增加紫红曲的附加值，还提供了一种生物合成川芎嗪的途径。
发明人将紫外诱变筛选获得的紫红曲TMP-1菌种(Monascus purpureus TMP-1)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC NO.3272。
本发明的生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲霉液态发酵产生含有川芎嗪的液体发酵产物；该液体发酵产物中包含有扩张血管、抑制血小板聚集、改善脑部局部供血不足的中药功效成分生物碱川芎嗪单体。
对液体发酵产物中川芎嗪的含量可按照如下方法进行检测：
在液体发酵产物中加入有机试剂进行提取同时进行酸化处理，获得酸化后的川芎嗪预处理溶液，用0.45μm微孔膜过滤后采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进行检测定量。
进行提取所用的有机溶剂包括：甲醇、乙醇、乙酸乙酯等；优选乙酸、乙醇和水的混合溶液，其中乙酸含量优选为5％，乙醇含量为50％-80％，余量为水，上述％为体积％。采用上述乙酸、乙醇和水的混合溶液，在提取川芎嗪的同时还把川芎嗪进行酸化处理，有利于提高川芎嗪的提取率和增加川芎嗪单体的稳定性。
在川芎嗪有机溶剂提取过程可以采用超声辅助提取的方法，超声功率为220-600W，优选400W；超声处理时间为30-180min，优选60min。
提取溶液经过微孔膜处理后采用Waters2695液相色谱仪进行定量检测，其检测条件如下：流动相，超纯水(含5％乙酸)∶甲醇＝80∶20；Waters色谱柱Symmetry300TM C18，4.6×150mm，3.5μm；柱温，35℃；流速，0.8ml/min；检测波长，290nm；进样量，10ul。
本发明利用紫红曲液态发酵制备川芎嗪，操作简单易行，微生物发酵转化过程易于控制，无污染，安全性高，而且与其他的制备方法相比能耗少、成本低廉。本发明发酵法生产川芎嗪相对于有机溶剂提取和化学合成制备川芎嗪有一定的优势。本发明对传统紫红曲功能的新产品开发和功效物质基础提供了重要依据，为传统紫红曲产品附加值的提升提供了新途径，同时为川芎嗪的生物合成提供了新思路和理论支持。
具体实施方式
实施例1、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
A)、菌种活化：
在无菌环境下将上述保藏的紫红曲菌种转接于试管中的麦芽汁琼脂培养基(市购)上，在30℃的温度恒温培养活化7天；
B)、种子制备：
配制种子培养基：每100ml种子培养基中含有3g粳米粉、2g葡萄糖、2g蛋白胨、0.1gMgSO4·7H2O、0.2g NaNO3和0.25g KH2PO4，其余为水；pH值自然。配制完成后进行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121℃灭菌处理20min。
将上述步骤A)所得的麦芽汁琼脂斜面上生长成熟的紫红曲霉孢子完全洗到10ml的无菌水中，振荡摇匀，制成孢子悬浮液(1.8×107个/ml)；然后转移到种子培养基中(取50ml种子培养基加于250ml的三角瓶中)，在转速180rpm、温度为30℃的恒温摇床上培养36h；得种子液。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉7g、蛋白胨3g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaNO3 0.2g和KH2PO4 0.25g，其余为水，pH值自然(pH值为4.5左右)。配制完成后进行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121℃灭菌处理20min。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转接到基础发酵培养基中，在180rpm、30℃的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为6.562μg/ml。
实施例2、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
A)、菌种活化：
在无菌环境下将上述保藏的红曲菌种转接于试管中的麦芽汁琼脂培养基(市购)上，在28℃的温度恒温培养活化9天；
B)、种子制备：
配制种子培养基：同实施例1。
将上述步骤A)所得的麦芽汁琼脂斜面上生长成熟的紫红曲霉孢子完全洗到10ml的无菌水中，振荡摇匀，制成孢子悬浮液(1.7×107个/ml)；然后全部转移到种子培养基中(取50ml种子培养基加于250ml的三角瓶中)，在转速180rpm、温度为30℃的恒温摇床上培养36h；得种子液。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：同实施例1。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转接到基础发酵培养基中，在180rpm、28℃的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为7.158μg/ml。
实施例3、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
步骤A)和步骤B)同实施例1。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g、蛋白胨3g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaNO3 0.2g和KH2PO4 0.25g，其余为水；pH值自然。配制完成后进行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121℃灭菌处理20min。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转接到基础发酵培养基中，在180rpm、28℃的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为7.454μg/ml发酵液。
实施例4、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
步骤A)和步骤B)同实施例1。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：同实施例1。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转接到基础发酵培养基中，在150rpm、30℃的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为5.323μg/ml发酵液。
实施例5、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
步骤A)和步骤B)同实施例1。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g、蛋白胨3g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaNO3 0.2g和KH2PO4 0.25g，其余为水，调pH值为7.0。配制完成后进行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121℃灭菌处理20min。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转接到基础发酵培养基中，在180rpm、30℃的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为8.799μg/ml发酵液。
实施例6、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为：CGMCC NO.3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤：
步骤A)和步骤B)同实施例1。
C)、液态发酵培养：
配制基础发酵培养基：同实施例5。
在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液2.1ml转接到基础发酵培养基中，在180rpm、30℃的恒温摇床上培养11天，得含有川芎嗪的液体发酵产物(以下简称发酵液)。
取发酵液5.0ml，与提取液(80％乙醇和5％乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以1∶5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。
将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为10.246μg/ml发酵液。
实施例7、
将实施例1中种子液的用量改成1.5ml，其余同实施例1，最终测得液体发酵产物中川芎嗪含量为6.836μg/ml发酵液。
实施例8、
将实施例1中种子液的用量改成3.9ml，其余同实施例1，最终测得液体发酵产物中川芎嗪含量为6.319μg/ml发酵液。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种生物合成川芎嗪的方法，其特征是：利用紫红曲菌种(Monascus purpureus)TMP-001，紫红曲菌株TMP-001保藏名称为：紫红曲(Monascus purpureus)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年09月06日，保藏号为：CGMCC NO.3272；包括以下步骤：
A)、菌种活化：
在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上，在28～30℃恒温培养活化7～9天；
B)、种子制备：
将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移到种子培养基中，在160～200rpm、28～32℃的恒温摇床上培养30～40h；得种子液；
所述种子培养基组成为：每100ml种子培养基中含有2.8～3.2g粳米粉、1.8～2.2g葡萄糖、1.8～2.2g蛋白胨、0.08～0.12g MgSO4·7H2O、0.18～0.22g NaNO3和0.23～0.27g KH2PO4，其余为水；pH值自然；
C)、液态发酵培养：
将步骤B)所得的种子液转接到基础发酵培养基中，在120～210rpm、26～34℃的恒温摇床上培养9～11天，得含有川芎嗪的液体发酵产物；所述种子液与基础培养基的重量比为5％～13％；
所述基础发酵培养基组成为：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉3～7g、蛋白胨1.0～5.0g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaNO30.2g和KH2PO40.25g，其余为水；调pH值为4～8。
2.根据权利要求1所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是：所述步骤B)中孢子悬浮液的浓度为8×106～2×107个/ml；孢子悬浮液与种子培养基的体积比为10∶45～55。
3.根据权利要求2所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是：每100ml种子培养基中含有3g粳米粉、2g葡萄糖、2g蛋白胨、0.1g MgSO4·7H2O、0.2g NaNO3和0.25g KH2PO4，其余为水；pH值自然。
4.根据权利要求3所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是：每100ml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g和蛋白胨3g；种子液与基础培养基的重量比为7％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010101042643A CN101906448B (zh) | 2010-02-02 | 2010-02-02 | 一种生物合成川芎嗪的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010101042643A CN101906448B (zh) | 2010-02-02 | 2010-02-02 | 一种生物合成川芎嗪的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101906448A CN101906448A (zh) | 2010-12-08 |
| CN101906448B true CN101906448B (zh) | 2012-07-11 |
Family
ID=43262033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010101042643A Expired - Fee Related CN101906448B (zh) | 2010-02-02 | 2010-02-02 | 一种生物合成川芎嗪的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101906448B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103372040B (zh) * | 2012-04-20 | 2016-01-27 | 北京北大维信生物科技有限公司 | 一种调节血脂的红曲川芎药物组合及其制备方法 |
| CN107801905B (zh) * | 2017-09-25 | 2021-11-16 | 贵州大学 | 一种发酵薏米富集川芎嗪和溶纤酶功效成分的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101078006A (zh) * | 2006-05-26 | 2007-11-28 | 上海凯信生物科技有限公司 | 一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 |
| CN101445786A (zh) * | 2008-12-08 | 2009-06-03 | 江南大学 | 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法 |
| CN101503718A (zh) * | 2009-03-16 | 2009-08-12 | 浙江大学 | 川芎嗪的制备方法 |
-
2010
- 2010-02-02 CN CN2010101042643A patent/CN101906448B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101078006A (zh) * | 2006-05-26 | 2007-11-28 | 上海凯信生物科技有限公司 | 一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 |
| CN101445786A (zh) * | 2008-12-08 | 2009-06-03 | 江南大学 | 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法 |
| CN101503718A (zh) * | 2009-03-16 | 2009-08-12 | 浙江大学 | 川芎嗪的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴晶晶.红曲霉（Monascus.spp）产生川芎嗪的发酵工艺条件研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》.2011,(第07期),全文. * |
| 吴晶晶等.红曲霉液态发酵产生川芎嗪工艺研究.《中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集》.2010,全文. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101906448A (zh) | 2010-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101955980B (zh) | 一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株 | |
| CN105112305B (zh) | 一种富含Monacolin K的红曲米及其制备方法 | |
| CN105695543B (zh) | 一种生物表面活性素的生产方法 | |
| CN104893983B (zh) | 液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品 | |
| CN104673703B (zh) | 可同时促进酿酒酵母产酒精和风味物质的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105838622A (zh) | 黑曲霉hc306及在转化柚皮苷制备柚皮素中的应用 | |
| CN103224862B (zh) | 一种葛根黄酒及其制造方法 | |
| CN107156638B (zh) | 一种降脂红曲粉的制备方法 | |
| CN101608190A (zh) | 天然香料2-苯乙醇的制备方法 | |
| CN110507681A (zh) | 一种高值化利用人参花的工艺 | |
| CN114409660B (zh) | 一种cpa型吲哚生物碱类化合物及其制备方法与用途 | |
| CN103805648B (zh) | 高产安丝菌素发酵工艺 | |
| CN103255194B (zh) | 一种提高16α,17α-环氧黄体酮转化率的方法 | |
| CN103815279B (zh) | 一种富含辅酶q10红曲及其制备方法 | |
| CN102250981B (zh) | 一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法 | |
| CN109810909B (zh) | 一株高产番茄红素的红发夫酵母菌株及番茄红素生产方法 | |
| CN101906448B (zh) | 一种生物合成川芎嗪的方法 | |
| CN101928671B (zh) | 一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法 | |
| CN105211752A (zh) | 一种富含gaba的红曲米及其制备方法 | |
| CN103122361A (zh) | 一种改进左旋多巴生物合成的方法 | |
| CN103193854A (zh) | 桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法 | |
| CN102703329B (zh) | 一株高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的菌株及其应用 | |
| CN106893684A (zh) | 一种重组酵母菌株及其应用 | |
| CN101967457B (zh) | 利用秸秆生产2,3-丁二醇菌种筛选及发酵方法 | |
| CN115029385B (zh) | 一种利用微生物发酵提取茶粕中茶皂素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120711 Termination date: 20140202 |