ES2354388T3 - Cepa de bacillus pumilus para obtener un alto rendimiento de tetrametilpirazina. - Google Patents
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Abstract
Una cepa de Bacillus pumilus capaz de producir tetrametilpirazina con alto rendimiento, que se denomina Bacillus pumilus RX3-17 y que ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el día 19 de abril de 2006 con el número de depósito CCTCC M 206043, teniendo dicha cepa las siguientes características bacte- rianas: - bacteria en forma de bacilo con una longitud de 1,5 - 3,0 µm, y un diámetro de 0,6 - 0,7 µm; - el color de las colonias es blanco lechoso; - con capacidad de esporulación; - reacción VP positiva; - produce ácido cuando se cultiva con glucosa, arabinosa, xilosa, manitol o fructosa; - capaz de hidrolizar caseína, gelatina y Tween 80; - capaz de utilizar citrato como fuente de carbono; - capaz de vivir en solución de NaCI al 10% (p/p) y crecer bajo 50ºC y - tener una secuencia de rDNA que comparte una similitud del 99% con otras cepas de Bacillus pumilus.
Description
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención pertenece al campo de la biotecnología. Hablando concreta-mente, esta invención se refiere a una cepa recientemente aislada de Bacillus pumilus productora de tetrametilpirazina con alto rendimiento. 5
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La tetrametilpirazina se aisló originalmente de Ligusticum wallichii en 1957. La tetrametilpirazina, cuya tonalidad podría ser descrita como la del cacao, café, lactosa, vino, y la planta de la especie galbanum, se usa ampliamente como aditivo aromati-zante en las industrias alimentaria, tabaquera y alcoholera. Es el principal alcaloide 10 biológicamente activo existente en la yerba china Chuanxiong que mejora la circula-ción de la sangre, tonifica y elimina los coágulos sanguíneos y se usa habitualmente en China como medicamento para diversas enfermedades, tales como enfermedades venosas del corazón y el cerebro, enfermedades del sistema respiratorio y en la en-fermedad glomerular. 15
Hay tres métodos para la producción de tetrametilpirazina, a saber, el método biosintético, la extracción directa de plantas y el método químico de síntesis.
En cuanto a la biosíntesis de tetrametilpirazina, la aplicación de biotecnología se refiere principalmente a la tecnología microbiana que incluye cribado y mutación de cepas y la tecnología de fermentación. Hasta la fecha hay algunos informes proceden-20 tes de China y principalmente de Francia, Japón, Alemania y Estados Unidos.
La tetrametilpirazina puede ser fermentada a partir de algunas clases de azú-cares. Es estado actual de la investigación de la biosíntesis de tetrametilpirazina es como sigue.
Kosuge et al., identificaron primeramente que algunos microbios son capaces 25 de producir pirazinas y en 1962 encontraron que el Bacillus subtilis era un productor de tetrametilpirazina. Ahora se sabe que algunas bacterias y epifitos pueden sintetizar diferentes clases de alquil-pirazinas (Seitz, 1994; Gallois, 1984). Yamaguchi et al., intentaron una vez utilizar estos microorganismos en fermentación sumergida, pero fracasó en su industrialización debido a la baja concentración del producto en el caldo 30 de fermentación (1993).
Itohiki-natto es uno de los alimentos obtenidos por fermentación más popula-res debido a su aroma especial de pirazinas. Es fermentado por los japoneses a partir de Bacillus natto en un medio sólido de semillas de soja. Sin embargo, los resultados fueron deficientes porque las fermentaciones en estado sólido fueron solo experienci-35
les. El rendimiento en sustancias aromatizantes fue menor de 22 µg/kg de peso húme-do (Kosuge et al., 1971).
Besson et al., de Francia realizaron una gran trabajo en este campo. Obtuvie-ron 0,58 g/kg utilizando Bacillus subtilis IFO 3013 por fermentación en estado sólido en medio de semilla de soja (1998). Este fue el mejor resultado del que se informó de 5 métodos biosintéticos para obtener tetrametilpirazina. Pero todavía se requieren gran-des esfuerzos antes de la consecución de la industrialización.
Debido a la baja concentración de tetrametilpirazina en plantas, la extracción de tetrametilpirazina de materiales vegetales es una tecnología costosa y no apta para industrialización. Aunque el método de síntesis química puede producir un alto rendi-10 miento de tetrametilpirazina, exige unas condiciones de reacción intensas y unos equi-pos más sofisticados. Además, la tetrametilpirazina resultante no es considerada un producto natural y hay serios problemas en cuanto a la protección del medio ambiente. En contraste, el método de biosíntesis tiene ventajas tales como producto natural, ba-jos costes de materiales, condiciones de reacción suaves, benignidad ambiental y con 15 vistas al futuro los estudios hacen prever buenas perspectivas a la síntesis de tetrame-tilpirazina. Sin embargo, el aislamiento de la naturaleza de cepas productoras de te-trametilpirazina es un trabajo difícil y los rendimientos de las cepas naturales obtenidas de este modo son usualmente bajos. Al igual que la defectuosa base de partida de otros métodos microbianos, las tecnologías de producción de tetrametilpirazina por 20 biosíntesis por ahora son inmaduras y no han sido industrializadas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Debido a las dificultades y problemas actuales implicados en la producción de tetrametilpirazina, el objetivo de esta invención es aportar un Bacillus pumilus de alto rendimiento recientemente aislado para producir tetrametilpirazina con el sustrato de 25 glucosa, que puede ser empleado para la fermentación de tetrametilpirazina.
La cepa Bacillus pumilus RX3-17 de esta invención ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el 19 de abril de 2006. El número de depósito es CCTCC M 206043.
Las características fisiológicas y bioquímicas de Bacillus pumilus RX3-17 30 CCTCC M 206043 se describen en la Tabla 1 siguiente.
- Tabla 1.- Características fisiológicas y bioquímicas de la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043
- Características
- Resultados
- Bacilos Anchura Longitud Esporas Elipsoides Esporangios Reacción VP pH en VP Ácido procedente de glucosa Ácido procedente de arabinosa Ácido procedente de xilosa Ácido procedente de manitol Ácido procedente de fructosa Gas procedente de glucosa Hidrólisis de caseína Hidrólisis de gelatina Hidrólisis de almidón Hidrólisis de Tween 80 Hidrólisis de esculina Utilización de citrato Utilización de propionato Degradación de tirosina Fenilalanina-desaminasa NO3 a NO2 Indol Crecimiento a pH 5,7 Crecimiento con NaCl al 2% Crecimiento con NaCl al 5% Crecimiento con NaCl al 7% Crecimiento con NaCl al 10% Crecimiento a 45ºC Crecimiento a 50ºC Crecimiento a 55ºC Crecimiento con lisozima al 0,001 % Arginina-dihidrolasa
- + 0,6 – 0,7 µm 1,5 – 3,0 µm + + - + 5,0 + + + + + - + + - + - + - - - - - + + + + + + + - + -
La secuencia del rDNA de 16S de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 es similar en 99% a las otras cepas de Bacillus pumilus.
La cepa antes mencionada de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 se 5 emplea en la producción de tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV que contiene (por litro de agua destilada) 160 ~ 220 g de glucosa, 50 g de peptona de soja, 30 g de (NH4)2HPO4 y 15 mL de solución de mezcla de vitaminas. La solución de mez-cla de vitaminas contiene (por litro de agua destilada) 1,0 mg de d-biotina, 1,0 mg de
tiamina-HCl, 5,0 mg de riboflavina, 25 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de pantotenato-1/2 Ca y 100 mg de ácido nicotínico.
Cuando se usa el Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 antes mencio-nado para producir tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV, la temperatura de fermentación es 37ºC y la cepa se inocula en 50 mL del medio de fermentación SV 5 en matraces cónicos de 500 ml que se mantienen en un agitador a 120 rpm durante 96 ~ 120 horas para obtener el caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro.
La presente invención supera el cuello de botella de la fermentación de tetra-metilpirazina, es decir, baja concentración del producto de fermentación, proporcio-nando la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 productora de tetrametilpi-10 razina con alto rendimiento. La propuesta de producción de tetrametilpirazina por fer-mentación microbiana tiene las ventajas de bajos costes de los materiales, condicio-nes de reacción suaves, producto natural, bajo coste global y benignidad ambiental.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La cepa Bacillus pumilus RX3-17 de esta invención ha sido depositada en el 15 China Center for Type Culture Collection el 19 de abril de 2006. El número de depósito es CCTCC M 206043.
La Figura 1 muestra la imagen por microscopía electrónica (2700 aumentos) de la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de la presente invención.
EJEMPLOS 20
EJEMPLO 1:
Etapa 1: Cribado y mutación para obtener Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043
Muestras de suelos de huertos de manzanos y viñas se pusieron en suspen-sión en solución salina y se calentaron a 80ºC durante 10 minutos, luego se extendie-ron en franjas sobre agar-agar nutriente y se incubaron a 37ºC para su cribado. El me-25 dio del agar-agar nutriente contiene (por litro de agua destilada) 10 g de peptona, 3 g de extracto de carne de vacuno, 5 g de NaCI y 18 g de agar-agar. El pH inicial del me-dio fue 7,2. El medio se esterilizó a 121ºC durante 15 minutos.
Las colonias individuales se aislaron e inocularon en caldo nutriente a 37ºC con agitación a 120 rpm. Las suspensiones de células en la fase semi-logarítmica se 30 trataron con 0,5 mg/L de nitrosoguanidina en tampón de ácido Tris-maleico 0,05 mol/L (pH 6,0) durante 30 min. El método de mutación se terminó diluyendo la mezcla de reacción. Después de una incubación de 5 horas con agitación a 37ºC, el cultivo se diluyó apropiadamente y se extendió en franjas sobre agar-agar nutriente para poste-rior aislamiento y cribado. El método de preparación del medio de caldo nutriente fue 35
el mismo que el del medio de agar-agar nutriente, solamente con la excepción de que no se añadió agar-agar.
La cepa, aislada por los métodos antes mencionados, se identificó por expe-rimentos fisiológicos y bioquímicos. Es de forma de bacilo, mide 1,5 µm a 3,0 µm de longitud y tiene un diámetro de 0,6 µm a 0,7 µm. El color de la colonia de la cepa bac-5 teriana es blanco lechoso. Puede producir esporas y la reacción VP es positiva. Pue-de utilizar glucosa, arabinosa, xilosa, manitol o fructosa para formar ácidos. La cepa bacteriana también puede hidrolizar caseína, gelatina y Tween 80, utiliza citrato, crece en un medio que contiene NaCI al 10% (p/p), y crecer a 50ºC. La secuencia del rDNA de 16S de esta cepa comparte el 99% de similitud con otras cepas de Bacillus pumi-10 lus.
La cepa se denominó Bacillus pumilus RX3-17 y ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el día 19 de abril de 2006 con el número de depósito CCTCC M 206043.
Etapa 2: Preparación de caldo celular de la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 15 206043 antes mencionada.
Un asa de siembra de la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 cultivada en un pico de flauta de agar-agar nutriente se inoculó en un matraz cónico de 300 ml que contenía 25 ml de caldo nutriente esterilizado y se cultivó a 37ºC con agi-tación a 120 rpm durante 12 horas para conseguir el caldo celular resultante. 20
Etapa 3: Preparación del caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro usando la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 antes mencionada y el medio de fermentación SV que contenía 160 g/L de glucosa.
El caldo celular obtenido en la etapa 2 se inoculó a una relación en volumen de 6% (v/v) en matraces cónicos de 500 ml cada uno de los cuales contenía 50 ml de 25 medio de fermentación SV esterilizado. La bacteria se cultivó a 37ºC con agitación a 120 rpm. Cuando la concentración de tetrametilpirazina alcanzó 1,50 ± 0,07 g/L a las 96 horas, se obtuvo el caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro.
Los componentes del medio de fermentación SV antes mencionados que con-tenían 160 g/L de glucosa fueron los siguientes. Un litro de agua destilada contenía 30 160 g de glucosa, 50 g de peptona de soja, 30 g de (NH4)2HPO4 y 15 mL de solución de mezcla de vitaminas. El pH se ajustó a 7,0. La solución de mezcla de vitaminas contenía (por litro de agua destilada) 1,0 mg de d-biotina, 1,0 mg de tiamina-HCl, 5,0 mg de riboflavina, 25 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de pantotenato-1/2 Ca y 100 mg de ácido nicotínico. 35
EJEMPLO 2: Preparación de caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro usando la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 obtenida de las etapas 1 y 2 Ejemplo 1, y el medio de fermentación SV que contenía 180 g/L de glucosa.
El Ejemplo 2 se realizó con la concentración de glucosa alterada de 180 g/L de acuerdo con la etapa 3 del Ejemplo 1. Cuando la concentración de tetrametilpirazi-5 na alcanzó 1,79 ± 0,08 g/L a las 104 horas, se obtuvo el caldo de fermentación de te-trametilpirazina maduro.
EJEMPLO 3: Preparación de caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro usando la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 obtenida de las etapas 1 y 2 del Ejemplo 1, y el medio de fermentación SV que contenía 200 g/L de glucosa. 10
El Ejemplo 3 se realizó con la concentración de glucosa alterada de 200 g/L de acuerdo con la etapa 3 del Ejemplo 1. Cuando la concentración de tetrametilpirazi-na alcanzó 2,22 ± 0,06 g/L a las 112 horas, se obtuvo el caldo de fermentación de te-trametilpirazina maduro.
EJEMPLO 4: Preparación de caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro 15 usando la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 obtenida en las etapas 1 y 2 del Ejemplo 1, y el medio de fermentación SV que contenía 220 g/L de glucosa.
El Ejemplo 3 se realizó con la concentración de glucosa alterada de 220 g/L de acuerdo con la etapa 3 del Ejemplo 1. Cuando la concentración de tetrametilpirazi-na alcanzó 1,67 ± 0,05 g/L a las 120 horas, se obtuvo el caldo de fermentación de te-20 trametilpirazina maduro.
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1.- Una cepa de Bacillus pumilus capaz de producir tetrametilpirazina con alto rendimiento, que se denomina Bacillus pumilus RX3-17 y que ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el día 19 de abril de 2006 con el número de depósito CCTCC M 206043, teniendo dicha cepa las siguientes características bacte-5 rianas:- bacteria en forma de bacilo con una longitud de 1,5 – 3,0 µm, y un diámetro de 0,6 – 0,7 µm;- el color de las colonias es blanco lechoso;- con capacidad de esporulación; 10- reacción VP positiva;- produce ácido cuando se cultiva con glucosa, arabinosa, xilosa, manitol o fructosa;- capaz de hidrolizar caseína, gelatina y Tween 80;- capaz de utilizar citrato como fuente de carbono; 15- capaz de vivir en solución de NaCI al 10% (p/p) y crecer bajo 50ºC y- tener una secuencia de rDNA que comparte una similitud del 99% con otras cepas de Bacillus pumilus.
- 2.- La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 1, en donde esta cepa se aplica a la fermentación de tetrame-20 tilpirazina.
- 3.- La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 2, en donde esta cepa se usa para producir tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV.
- 4.- La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-25 do con la reivindicación 3, en donde el medio de fermentación contiene (por litro de agua destilada) 160 ~ 220 g de glucosa, 50 g de peptona de soja, 30 g de (NH4)2HPO4 y 15 ml de solución de mezcla de vitaminas.
- 5.- La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 4, en donde la solución de mezcla de vitaminas contiene (por 30 litro de agua destilada) 1,0 mg de d-biotina, 1,0 mg de tiamina-HCl, 5,0 mg de ribofla-vina, 25 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de pantote-nato-1/2 Ca y 100 mg de ácido nicotínico.
- 6.- La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 2 ó 3, en donde esta cepa se inocula en 50 ml del medio de 35fermentación SV en matraces cónicos de 500 mL que se mantienen en un agitador a 120 rpm y 37ºC durante 96 ~ 120 horas para obtener el caldo de fermentación de te-trametilpirazina maduro.
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