KR101985304B1 - 비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법 - Google Patents

비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주는 비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 제조한 청국장은 기능성 장류의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있어, 장류 산업에 매우 유용할 것으로 판단된다.

Description

비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법{Manufacturing method of Cheonggukjang using Bacillus subtilis SRCM100757 strain producing vitamin K2 and γ-PGA and secreting amylase, protease and cellulase}
본 발명은 비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법에 관한 것이다.
비타민 K2는 골아세포 형성을 촉진시키고, 골파괴세포를 감소시켜 골형성을 돕고, 골 흡수를 막아주는 역할을 한다. 뼈에 존재하는 오스테오칼신(osteocalcin)은 일명 Bone Gla(γ-calboxyl glutamic acid) 단백질이라고 불리는 단백질로서 칼슘과 결합할 수 있는 Gla를 3개 포함하고 있는데 비타민 K2에 의하여 카르복실화되어야 칼슘과 결합할 수 있으며, 비타민 K2가 결핍되는 경우, 카르복실화되지 않은 오스테오칼신은 낮은 수준으로 카르복실화(under-carboxylation)된 상태로 혈액으로 흘러오게 되고, 상기 혈액 중에 낮은 수준으로 카르복실화된 오스테오칼신(under-carboxylated osteocalcin)이 증가되어 골다공증이 유발될 수 있다. 따라서, 골다공증 예방은 칼슘 흡수가 중요한 요인으로 작용하는데, 오스테오칼신(osteocalcin)은 칼슘과 결합하여 뼈의 무기질화 과정에 작용하고, 오스테오칼신(osteocalcin) 생성은 비타민 K2에 의존한다. 비타민 K2의 공급원으로 일반식품은 함량이 매우 부족하기 때문에 바실러스 서브틸리스가 합성하는 대두발효제품을 권장하고 있으며, 이러한 관점에서 일본에서는 "나토(natto)"를 이용한 칼슘 흡수와 관련 특정보건용 식품이 시판되고 있고 또한 미국에서도 비타민 K2를 강화시킨 콩 발효 제품이 판매되고 있으나 국내에서는 아직 이러한 연구는 전혀 진행되지 않고 있으며 제품 또한 개발되지 못하고 있다. 따라서 비타민 K2의 합성능이 우수한 균주 및 건강기능 식품의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
한편, γ-PGA는 글루탐산 단량체(monomer glutamic acid)의 α-아미노기와 γ-카르복실기 사이의 아미드 결합(amide linkage)에 의해 결합된 동종중합체(homopolymer)이며, 발효 산물(fermentation product)로서 밝혀졌다. 일본의 전통발효식품인 낫토(natto)의 점액성 물질이 대표적인 γ-PGA로서 보고되어 있다. 최근 수년간의 연구 결과 우리나라 전통발효 식품인 청국장에서도 γ-PGA를 생산하는 고초균(Bacillus sp.)이 분리된 후 활발하게 연구 중이며, 특히 청국장에서 분리된 균주에 의해 생산되는 γ-PGA는 낫토(natto)에서 분리된 균주에 의해 생산되는 γ-PGA보다 높은 생산성과 큰 분자량을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 γ-PGA는 수용성, 음이온성, 무독성, 생분해성, 생체적합성, 식용 등의 다양한 특성을 가지고 있기 때문에 다양한 분야에서 응용되고 있다.
한국공개특허 제2014-0044161호에서는 '고초균과 젖산균을 이용한 이단발효를 통한 γ-ＰＧＡ와 ＧＡＢＡ가 증진된 발효물 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0045661호에서는 '비타민 Ｋ2 생성능이 높은 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 청국장의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 제조방법'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통장류로부터 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주(KCCM11969P)를 이용하여 청국장을 제조한 결과, 비타민 K2 및 γ-PGA 함량이 증진된 기능성 청국장을 제조할 수 있는 점을 확인하였다.
따라서, 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주(KCCM11969P)는 품질 좋은 청국장 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 전통장류로부터 분리된, 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주(KCCM11969P) 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 비타민 K2 및 γ-PGA 함량이 증진된 청국장을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주는 비타민 K2 및 γ-PGA를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 제조한 청국장은 기능성 장류의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있어, 장류 산업에 매우 유용할 것으로 판단된다.
도 1은 미생물 동정 시스템(Vitek 32)에 의해 본 발명에서 선발한 SRCM100757 균주의 동정결과를 나타낸다.
도 2는 미생물 동정 시스템(Vitek 32)에 의해 본 발명에서 대조구로 이용한 KCCM32835 균주의 동정결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 선발한 SRCM100757 균주 및 대조구로 이용한 KCCM32835 균주의 효소 활성 결과를 나타낸다. 전분(A), 스킴 밀크(B), CMC(C) 및 트리뷰티린(D)를 포함하는 아가 플레이트에서 나타난 할로(halo) 크기를 나타낸 것이다.
도 4는 GPGA(γ-PGA) 플레이트에 도말한 KCCM32835(A) 및 SRCM100757(B) 균주를 나타낸다. GPGA 플레이트는 균주 유래의 점질물(mucilages)로 커버되었다.
도 5는 본 발명에서 분리된 균주 배양액의 비타민 K2 함량을 분석한 결과이다. (A) 비타민 K2 함량 기준(standard), (B) SRCM100757 및 KCCM32835 균주의 TSB 배양액에서의 비타민 K2 함량
도 6은 본 발명에서 분리된 균주를 이용하여 제조된 청국장의 비타민 K2 함량을 분석한 결과이다. (A) 비타민 K2 함량 기준(standard), (B) SRCM100757 및 KCCM32835 균주를 이용하여 제조된 청국장에서의 비타민 K2 함량
도 7은 본 발명에서 분리된 균주 접종량(%) 및 발효시간(h)을 달리하여 제조한 청국장을 나타낸다. 균주 접종량은 본 발명의 균주를 불린 콩 무게의 0.5%(0.25×106~7 CFU/㎖), 1%(0.5×106~7 CFU/㎖), 2%(106~7 CFU/㎖)로 접종하였다
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통장류로부터 분리된, 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주(KCCM11969P) 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 증자된 대두에 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발효는 38~42℃에서 45~50 시간 동안 수행되고, 균주의 접종 농도는 106~8 CFU/㎖일 수 있고, 바람직하게는, 상기 발효는 40℃에서 48 시간 동안 수행되고, 균주의 접종 농도는 106~7 CFU/㎖일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid) 함량이 증진된 청국장을 제공한다.
또한, 본 발명은 전통장류로부터 분리된, 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주(KCCM11969P)를 제공한다.
본 발명에서 전통장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소 분비가 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 2월 7일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11969P).
본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주는 비타민 K2의 생성능이 우수하며, 상기 비타민 K2는 바람직하게는 메나퀴논-7(menaquinone-7)이다.
본 발명에 있어서, 스타터 균주란 장류 제조용 스타터(starter)로, 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 바실러스 서틸리스 SRCM100757 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)와 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 포함하는 장류를 제조할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다
재료 및 방법
1. 실험에 사용된 균주
(재)발효미생물산업진흥원에 보유중인 전통장류로부터 분리된 바실러스 균주 중 γ-PGA 생산능이 높은 균주 SRCM100757을 선별하였고, 2017년 2월 7일자로 한국종균협회(KCCM)에 기탁하였으며 수탁번호로 KCCM11969P를 부여받았다. 대조구로는 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 KCCM32835를 사용하였다. 본 발명의 SRCM100757를 동정하는 방법은 아래에 기재한 바와 같다.
실험에 사용된 균주
SRCM / KCCM Genus Species
SRCM100757 Bacillus subtilis
KCCM32835 Bacillus subtilis
실험에 사용된 배지의 제조
NA(Nutrient agar) BD, Difco 23g/L
NB(Nutrient broth) BD, Difco 8g/L
TSB(Tryptic soy broth) BD, Difco 30g/L
GPGA (6N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정 / Agar는 고체배지에만 첨가됨) L-glutamic acid Sigma aldrich 20g/L
Glucose Sigma aldrich 10g/L
Yeast extract Sigma aldrich 10g/L
NaCl DAEJUNG 15g/L
(NH4)2SO4 Sigma 5g/L
CaCl2 SAMCHUN 0.1g/L
MgSO4·7H2O KANTO 0.1g/L
KH2PO4 Sigma 0.5g/L
Agar BD, Difco 15g/L
D.W
2. 실험에 사용된 균주의 동정
SRCM100757과 KCCM32835를 NA 배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 정치배양 후 오염여부를 확인하였다. 단일 콜로니를 취하여 3 mL 식염수(0.45% NaCl)에 현탁하여 탁도를 2.2McF 근처로 조정하였다. 현탁액이 담긴 튜브를 BCL 카드에 장착한 후 미생물자동동정기(Vitek32)를 이용하여 동정하였다.
3. 배양액에서의 비타민 K2 및 crude γ-PGA 함량 분석
3-1. 배양액에서의 비타민 K2 함량 분석
냉동고에 보관되어 있는 균주를 NA 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 정치배양 후 오염여부를 확인하였다. 단일 콜로니를 취하여 TSB(8ml)에 접종하여 37℃, 180rpm 배양기에서 배양하였다. 배양액의 O.D600 값이 1.0일 때 배양액을 원심분리(13,000rpm/10min/4℃)하여 배양상등액을 얻었다. 상등액 4ml을 50ml 팔콘 튜브에 취한 후 2-프로판올 4.8ml(시그마 알드리치)과 n-헥산 9.6ml(J.T baker)을 첨가하여 3분간 볼텍싱하였으며 1시간 동안 실온 암소에서 방치하였다. 원심분리(3,000rpm/10min/4℃)하여 상등액 2ml을 15ml 팔콘 튜브에 취한 후 50℃에서 질소농축하였다. 질소농축 후 2ml 에탄올(HPLC 그레이드)를 첨가하여 녹였으며 0.45㎛ 필터(ADVANTEC PTFE)를 사용하여 여과한 후 HPLC 시료로 사용하였다.
3-2. GPGA 플레이트에서의 γ-PGA 생성량 관찰
각 SRCM100757, KCCM32835 스톡을 NA 배지에 도말하여 37℃ 배양기에 24시간 배양하였다. 오염 여부를 확인한 후 단일 콜로니를 루프로 취하여 GPGA 아가 플레이트에 도말하여 37℃ 배양기에서 약 12시간 배양하였다.
3-3. 배양액에서의 γ-PGA 함량 분석
GPGA 배양액으로부터 공지된 방법을 응용하여 crude γ-PGA를 분리하였다. NB에서 활성된 균주배양액의 O.D600 값이 0.5가 되도록 NB를 이용해 희석하여 농도를 조절하고 TSB 액체 배지의 1%가 되도록(80㎕, v/v) TSB에 접종하여 37℃, 180rpm 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양액의 O.D600 값이 1.0이 될 때 회수하여 배양액을 원심분리하였으며 배양상등액 5ml을 새 50ml 팔콘 튜브에 취하였다. 동량의 멸균증류수 5ml을 첨가하여 3분간 볼텍싱 후 15,000 xg/10min/4℃ 원심분리 후 펠렛은 남겨 건조 균체량을 측정하였다. 상등액은 회수하여 차가운 에탄올을 4배 부피비로 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 밤새 정치시켰다. 15,000 xg/10min/4℃ 원심분리하여 상층액을 제거하였고 침전체에 소량의 DW를 첨가하여 동결건조하여 건조항량을 구하였으며 γ-PGA 생산량은 다음과 같이 산출하였다.
γ-PGA 생산능=γ-PGA 건조항량(mg/ml)/건조균체량(mg/ml)
4. 균주 배양액의 효소활성 테스트
효소활성 테스트를 위해 아가 플레이트 방법을 이용하였다. SRCM100757, KCCM32835 TSB 배양액의 O.D600 값이 1.0이 될 때 회수하여 13000rpm/10min/4℃ 원심분리하고 배양 상등액을 취해 100㎕씩 플레이트의 구멍에 분주한 후 1시간동안 UV를 이용하여 살균하였다. UV 살균 후 각 플레이트를 37℃에서 24시간 정치한 후 할로 형성을 측정하였으며 각 효소활성 배지는 다음과 같이 제작하였다.
4-1. 1.5% 전분 아가 플레이트 제작 및 할로 형성 확인
각 균주 배양액의 아밀라제(amylase) 활성을 테스트하기 위해 각 전분과 아가 1.5%를 첨가한 배지를 121℃에서 15분간 오토클레이브하여 멸균한 후 파이펫 에드(pipette aid)를 이용하여 페트리 디쉬(SPL, 90.00 x 15.00mm)에 25ml씩 분주하여 상온에서 굳힌 후 옐로우 팁 뒷부분을 이용하여 구멍을 뚫었다. 배양상등액을 로딩하여 24시간 정치한 후 루골 용액(lugol solution)을 이용하여 클리어 존 형성을 확인하고 그 지름을 측정하였다.
4-2. 2% 스킴 밀크 아가 플레이트 제작 및 할로 형성 확인
각 균주 배양액의 프로테아제 활성을 테스트하기 위해 스킴 밀크 2%와 아가 1.5%를 첨가한 배지를 위와 같은 방법으로 제작하였으며 24시간 정치 후 클리오 존 형성을 확인하고 그 지름을 측정하였다.
4-3. 1.5% CMC(carboxyl methyl cellulose) 아가 플레이트 제작 및 할로 형성 확인
각 균주 배양액의 셀룰라제 활성을 테스트하기 위해 각 CMC와 아가 1.5%를 첨가한 배지를 위와 같은 방법으로 제작하였으며 24시간 정치 후 0.5% 콩고 레드 용액으로 30분간 염색하였다. 이후 1M NaCl 용액으로 30분간 탈색(destaining)하여 할로 형성을 확인하고 그 지름을 측정하였다.
4-4. 1% 트리뷰티린(tributyrin) 아가 플레이트 제작 및 할로 형성 확인
각 균주 배양액의 리파아제 활성을 테스트하기 위해 1% 트리뷰티린과 1.5% 아가를 첨가한 배지를 위와 같은 방법으로 제작하였으며 24시간 정치 후 클리어 존 형성을 확인하고 그 지름을 측정하였다.
5. 본 발명의 SRCM100757 균주를 이용한 비타민 K2 함량 및 γ-PGA 고함량 청국장 제조
5-1. 균주 배양 및 접종
SRCM100757과 비교균주 KCCM32835를 각각 NA 배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 배양하였다. 오염여부를 확인한 후 단일 콜로니를 루프로 취하여 TSB 액체 배지(8ml)에 접종하여 37℃, 180rpm 진탕배양기에서 배양하였다. TSB에서 활성화된 균주배양액을 TSB 액체배지를 이용하여 희석하고, 원심분리기를 이용하여 3,000rpm, 15분간 cell down 시켰다. 이후, 멸균수로 희석하여 배양액의 O.D600 값이 0.4가 될 때 회수하여 삶은 콩에 0.5%(0.25×106~7 CFU/㎖), 1%(0.5×106~7 CFU/㎖), 2%(106~7 CFU/㎖)가 되도록 접종한 후 아래 5.2 청국장의 발효방법과 같이 제조하였다.
5-2. 청국장의 발효
선별된 대두를 1,200g을 3회 수세한 후 16시간 침지한 후 10분 동안 물 빼내기를 하여 1,000ml 유리 비커에 약 200g씩 담고, 방수포, 호일을 씌운 후 오토크레이브에서 121℃, 30분 동안 증자하였다. 증자된 대두를 60℃로 냉각하여 무균 조건에서 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) SRCM100757 (KCCM11969P) 균주와 비교균주 KCCM32835를 각각 불린 콩 무게의 0.5%(0.25×106~7 CFU/㎖), 1%(0.5×106~7 CFU/㎖), 2%(106~7 CFU/㎖)로 접종하였다. 유리용기를 잘 흔들어 균체가 잘 도포되도록 하고, 40℃에서 24시간, 48시간, 72시간 정치시켜 청국장을 제조하였다. 시료는 실온 및 암실에서 막자사발로 마쇄하여 이화학분석 및 Vitamin K2(MK-7) 생성능 측정을 위한 시료로 사용하였다.
6. 본 발명의 SRCM100757 균주를 이용하여 제조된 청국장의 비타민 K2 및 γ-PGA 함량 분석
6-1. 청국장에서의 비타민 K2 추출 및 분석
물리적인 힘을 가하여 균질화를 한 청국장 2g을 50ml 팔콘 튜브에 취하고 2-프로판올 4.8ml과 n-헥산 9.6ml을 첨가한 후 3분간 볼텍싱하여 실온, 암소에 1시간 방치하였다. 이후 3,000rpm/10min/4℃ 원심분리하여 상등액 2ml을 15ml 팔콘 튜브에 취한 후 50℃에서 질소농축하였다. 질소농축 후 에탄올(HPLC grade) 2ml을 첨가하고 볼텍싱하여 시료를 완전히 녹였으며 0.45㎛ 필터를 이용하여 HPLC 바이알에 취하였다. HPLC 분석조건은 표 3과 동일하다.
기기 HPLC, Agilent 1200 series
검출기 FLD, Agilent 1200 series, G1321A
검출 excitationλ= 320nm
emissionλ= 430nm
컬럼 SHISEIDO CAPCELL PAK C18, UG120, 5㎛, 4.6mm I.D. X 150mm / SHISEIDO RC-10, 4.0mm I.D. X 15mm
이동상 100% Methanol (HPLC grade, J.T Baker)
유속 0.8ml/min
주입량 10㎕
오븐 온도 40℃
스탠다드 Menaquinone-7 (USP)
분석시간 30min / each sample
6-2. 청국장에서의 γ-PGA 함량 측정
물리적인 힘에 의해 균질화된 청국장 5g을 50ml 팔콘 튜브에 취해 멸균 증류수 7ml을 첨가한 후 3분간 볼텍싱하였다. 15,000 xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상등액을 회수하여 차가운 에탄올을 4배 부피비로 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 밤새 정치시켰다. 15,000 xg, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였고 침전체에 소량의 DW를 가해 용해시켜 완전히 회수하였으며 회수된 침전체를 동결건조하여 건조항량을 구하고 γ-PGA 생산량을 산출하였다. γ-PGA 생산능은 다음과 같이 산출하였다.
γ-PGA 생산능=γ-PGA 건조항량(mg/ml)/청국장시료채취량(mg/ml)
6-3. 청국장에서의 이화학 시험분석
수분함량은 105℃ 상압가열 건조법에 따라 측정하였으며, pH 측정은 분쇄된 청국장을 동량의 증류수를 가하고 교반한 다음 pH 미터로 측정하였다. 또한, 수분활성도(Aw, Water activity)는 Novasina(LabTouch-aw, Swiss)를 사용하여 일회용 샘플 용기 안에 샘플제품을 넣고 측정하였으며, 아미노산성질소(A.N: Amino type Nitrogen)-Formol 방법으로 시험분석하였다.
실시예 1. 본 발명의 SRCM100757 균주의 동정 결과
SRCM100757과 KCCM32835의 단일 콜로니를 배양한 후 배양 현탁액이 담긴 튜브를 BCL 카드에 장착한 후 미생물자동동정기(Vitek32)를 이용하여 동정한 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다. 동정 결과에 따르면 본 발명의 SRCM100757 균주는 99%로 바실러스 서틸리스와 동일한 것으로 분석되었다.
실시예 2. 본 발명의 SRCM100757 균주의 효소활성 결과
본 발명에서 선발한 SRCM100757 균주의 효소 활성 결과를 도 3에 나타내었는데, 전분, 스킴 밀크 및 CMC을 포함하는 아가 플레이트에서는 할로(halo)가 나타나 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제가 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 트리뷰티린을 포함하는 아가 플레이트에서는 할로(halo)가 나타나지 않아서 리파아제 활성은 없는 것으로 분석되었다(도 3).
실시예 3. 본 발명의 SRCM100757 균주의 γ-PGA 생성능
본 발명에서 선발한 SRCM100757 균주의 γ-PGA 생성능을 조사한 결과를 도 4 및 표 4에 나타내었다. 각 SRCM100757, KCCM32835 글리세롤 스톡을 루프로 취하여 γ-PGA 아가 플레이트에 도말한 후 37℃ 배양기에서 24시간 배양하여 두 균주의 γ-PGA 생산능을 육안으로 비교하였다. 육안으로 비교해 볼 때 SRCM100757의 플레이트에서 γ-PGA로 추정되는 점질물의 생성량이 KCCM32835의 플레이트에 비하여 높은 것으로 확인되었다.
strain 건중량(mg/ml) γ-PGA 생성능
SRCM100757 4.26 1.3831169
KCCM32835 4.16 1.1555556
실시예 4. 본 발명의 SRCM100757 균주가 생성하는 비타민 K2 함량 분석 및 상기 균주를 이용한 청국장의 비타민 K2 함량 분석
본 발명에서 분리된 SRCM100757 균주가 분비하는 비타민 K2 함량을 분석하고자, SRCM100757 균주 배양액에서 비타민 K2 함량을 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. 본 발명의 SRCM100757 균주의 비타민 K2 함량은 0.064±0.0009(ppm)로, 대조구로 사용된 KCCM32835 균주의 0.031±0.0011보다 2배 정도 많은 양을 분비하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 분리된 SRCM100757 균주를 이용하여 제조된 청국장에서의 비타민 K2 함량을 분석한 결과를 도 6에 나타내었다. 본 발명의 SRCM100757 균주를 이용하여 제조된 청국장의 비타민 K2 함량은 27.38±2.79(ppm)로, 대조구로 사용된 KCCM32835 균주의 13.49±0.8보다 2배 정도 많은 양을 분비하는 것을 확인하였는데, 이는 발효시킨 청국장에서도 비타민 K2 함량이 높게 유지되는 점에서 매우 가치가 있는 것으로 분석된다.
또한, 균주 접종량 및 발효 시간을 달리하여 청국장을 제조하고, 조건에 따른 청국장에서의 비타민 K2 함량을 분석한 결과를 표 5에 나타내었다. SRCM100757 균주를 이용하여 제조된 비타민 K2 함량은 24시간 5.29~8.46 (ppm), 48시간 13.05~16.67 (ppm), 72시간 17.83~20.47 (ppm)으로, 발효시간이 높아질수록 비타민 K2 함량은 높게 확인되었다. 하지만, 같은 발효시간 내에 균주 접종량에 대한 비타민 K2 함량은 큰 차이는 없었다.
발효조건을 달리한 제조한 청국장의 비타민 K2(MK-7) 생성능 확인
발효온도
(℃)		 발효기간
(시간)		 균주 접종량
(%)		 비타민 K2(MK-7) 함량
(ppm)
40 24 0.5 5.29 ± 1.43
40 24 1 8.46 ± 0.07
40 24 2 7.71 ± 0.28
40 48 0.5 13.05 ± 0.78
40 48 1 15.81 ± 1.15
40 48 2 16.67 ± 1.66
40 72 0.5 17.83 ± 1.94
40 72 1 20.13 ± 0.24
40 72 2 20.47 ± 1.53
실시예 5. 본 발명의 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 이화학적 특성 분석
수분함량은 발효시간이 경과함에 따라 감소하는 경향을 나타냈지만, 큰 차이는 보이지 않았으며, 균주 접종량에서도 큰 차이는 없었다. pH는 발효시간이 경과함에 따라 pH 또한 높아졌으며, 수분활성도는 시료간의 큰 차이는 없었다. 아미노산성 질소는 청국장의 구수한 맛 성분의 인자로 발효시간이 24시간부터 급격히 증가하여 최종 발효시간 72시간 때에는 530.9 ~ 580.8mg%의 범위로 증가하였고, 균주 접종량에서 차이는 없었다.
발효조건을 달리한 제조한 청국장의 이화학적 특성
발효
온도
(℃)		 발효
시간
(시간)		 균주
접종량
(%)		 수분
(%)		 pH Aw 아미노산성질소
(mg%)		 color value
L a b
40 24 0.5 56.6 7.93 0.824 129.8 59.87 5.58 7.55
40 24 1 55.9 7.94 0.851 127.9 58.87 5.59 6.86
40 24 2 56.2 7.89 0.865 136.8 61.10 5.29 6.99
40 48 0.5 55.6 8.43 0.867 466.7 58.50 5.42 5.46
40 48 1 54.3 8.35 0.899 470.5 57.23 5.68 5.66
40 48 2 55.8 8.41 0.878 486.7 58.15 5.35 5.29
40 72 0.5 54.7 8.42 0.805 550.9 57.68 5.43 4.97
40 72 1 53.8 8.43 0.846 545.9 55.60 5.75 4.51
40 72 2 53.7 8.39 0.806 580.8 57.22 5.53 4.90
또한, 발효시간을 달리하여 제조한 청국장은 발효시간이 높아질수록 색은 어두웠다(도 7). 따라서, 적정 발효시간은 48시간인 것으로 분석되었다.
실시예 6. 본 발명의 SRCM100757 균주를 이용한 청국장의 관능검사
제조한 청국장에 대해서 기호성을 평가하였다. 관능검사는 (주)참고을 기업부설연구소 10명의 연구원으로 하여금 관능검사를 하였다. 관능검사의 항목은 냄새와 맛의 기호도에 대하여 평가하였으며, 5점 척도법으로 실시하였다. 그 결과는 표 7에 나타냈다.
발효조건을 달리하여 만든 청국장의 맛과 냄새항목 기호도 조사에서 발효시간 72시간 조건에서 맛과 냄새 기호도에서 가장 낮게 나타났으며, 발효시간 48시간의 경우 맛의 기호도에서 높게 나타났으며, 발효조건 40℃에서 48시간 발효하였을 때, 맛과 냄새 기호도에서 가장 높게 나타났다.
발효
온도
(℃)		 발효
시간
(시간)		 균주
접종량
(%)		 맛 냄새
40 24 0.5 3.3 3.3
40 24 1 3.4 3.3
40 24 2 3.4 3.2
40 48 0.5 3.5 3.2
40 48 1 3.7 3.3
40 48 2 3.9 3.2
40 72 0.5 2.5 2.0
40 72 1 2.2 2.0
40 72 2 2.3 2.1
한국미생물보존센터(국외) KCCM11969P 20170207

Claims (3)

  1. 전통장류로부터 분리된, 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid)를 생성하고, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM100757 균주(KCCM11969P) 또는 이의 배양액을 증자된 대두에 106~7 CFU/㎖의 농도가 되도록 접종하여 38~42℃에서 45~50 시간 동안 발효하는 단계를 포함하는 청국장의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항의 방법으로 제조된 비타민 K2 및 γ-PGA(Poly-gamma-Glutamic Acid) 함량이 증진된 청국장.
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