KR102243418B1 - 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법 - Google Patents
신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주, 상기 초산균을 이용하여 콤부차 음료를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 콤부차 음료에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주를 사용할 경우, 자연적인 콤부차를 사용할 경우보다도, 일정한 수준의 품질이 유지되는 콤부차 음료를 효과적으로 제조할 수 있으므로, 콤부차 음료의 산업적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주, 상기 초산균을 이용하여 콤부차 음료를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 콤부차 음료에 관한 것이다.
콤부차는 국내에서는 홍차버섯으로 알려졌으며, 세균과 효모의 공생균체 발효에 의해 얻어지는 발효 음료로 주로 홍차와 설탕을 주원료로 한다. 콤부차(Kombucha, K)는 약간 달고 신맛이 나는 발효 음료로 당이 첨가된 홍차 추출액에 박테리아와 효모에 의한 알코올발효와 초산균과 유산균에 의한 초산발효와 유기산 발효에 의해 제조된다(Greewalt et al. 2000).
현재까지 연구를 통해 분리된 콤부차의 균주는 대부분이 초산균이며, 그 중 Acetobacter xylinum은 콤부차 상층부에 "tea fungus"라 불리는 셀룰로오스막을 형성하는 역할을 한다고 알려져 있다(Poklwar et al. 2010). 콤부차에서 초산과 에탄올의 생산에 효모와 초산균은 매우 중요한 균주이다. LAB(Lactic acid bacteria)는 콤부차에서 적은 양 관찰되므로 과거에는 많은 관심을 끌지 못했다. LAB 첨가에 의해 식품 보존, 빵 및 코코아 발효, 콤부차에서의 DSL(D-saccharic acid 1,4 lacton) 생산과 같은 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다 (Masood et al. 2011; Yang et al., 2010).
콤부차의 효과는 폴리페놀, 글루쿠로닌산, DSL, 젖산, 비타민 등 발효과정에서 생성되는 다양한 미량 영양소(Vijayaraghavanet al., 2000)의 존재에 기인한다. 미국 식약청 (Food and Drug Administration, FDA)은 콤부차의 여러 상업 생산자의 사례를 평가하고 병원성 유기체 또는 기타 위생법 위반 (CDC, 1996)을 발견하지 못했습니다. 또한 미국 FDA에서도 콤부차가 GMP(Good Manufacturer’s Practice) 과정을 거쳐 생산되면 소비자가 섭취하기에 적합하며 독성이 없다고 확인한 바 있으며(Jayabalan et al. 2014), 기존에 보고된 세포 독성들도 높은 산도, 과량의 섭취, 비위생적 생산 등과 관련되었을 수 있다고 보고하였다. 뿐만 아니라, 한국등록특허 제10-0482308호에는 홍차 추출액에 효모 및 초산균으로 조성된 오리엔탈 티 펑거스(oriental tea fungus)를 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 콤부차(Kombucha) 음료의 제조방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0079167호에는 재료준비 단계; 소독된 병준비 단계; 찻물 제조 단계; 불순물 제거 단계; 설탕물 제조 단계; 찻물과 설탕물 혼합 단계; 혼합액 냉각 단계; 콤부차 투입 단계; 발효 단계; 필터링 및 숙성 단계; 로 구성된 감잎을 이용한 콤부차 음료의 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 이처럼 자연적으로 얻어진 콤부차를 사용할 경우, 제조된 콤부차 음료의 품질이 일정하지 않다는 문제점이 있다. 자연적으로 얻어진 콤부차는 이에 포함된 초산균과 각종 유기산을 생성하는 균주의 함량비, 균주의 종류 등이 각각 상이하기 때문에, 동일한 종류의 콤부차를 사용한다 하여도 다양한 발효조건에 따라 서로 다른 품질의 콤부차 음료가 제조될 수 있다는 문제점이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 일정한 수준의 품질을 갖는 콤부차 음료를 제조하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 콤부차로부터 유래된 신규한 초산균의 발효물과 별도의 젖산균 발효물을 이용할 경우, 일정한 수준의 품질이 유지되는 콤부차 음료를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 하나의 목적은 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 신규한 초산균(Acetobacter aceti KOM)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 초산균을 이용하여 콤부차 음료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 콤부차 음료를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 일정한 수준의 품질을 갖는 콤부차 음료를 제조하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 자연적으로 얻어지는 콤부차를 발효시키는 대신에 특정 초산균을 사용하여 초산발효를 수행하고, 이에 유기산을 추가할 경우, 콤부차 음료의 품질을 일정한 수준으로 유지할 수 있을 것이라는 점에 착안하였다.
아울러, 상기 초산균으로는 다른 초산균 보다는 콤부차로부터 유래된 초산균을 사용할 경우, 제조된 콤부차가 자연적인 콤부차와 유사한 특성을 갖게될 것으로 예상하고, 콤부차 음료의 제조에 사용할 수 있는 초산균을 콤부차로부터 추출하고자 하였다. 그 결과, 16S rRNA 유전자의 수준에서 볼 때, 종래의 콤부차와 구별되는 신규한 초산균을 콤부차로부터 분리 및 동정할 수 있었다. 상기 신규한 초산균은 종래의 콤부차 유래 초산균 보다도 에탄올 내성이 우수하고, 초산에 대한 내산성이 우수함을 확인하였다.
콤부차를 발효시키면, 알코올 발효를 통해 생성된 에탄올이 존재할 뿐만 아니라, 발효를 통해 다양한 유기산이 존재하는 조건에서 초산발효가 수행되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 에탄올에 대하여 높은 수준의 내성을 갖고, 초산에 대한 내산성이 우수한 초산균을 사용하면, 콤부차를 보다 효과적으로 제조할 수 있다.
이러한 점에서 볼 때, 상기 신규한 초산균은 콤부차의 제조에 특화된 균주라고 할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 신규한 초산균은 지금까지 전혀 보고되어 있지 않으며, 상기 초산균을 사용하여 콤부차를 제조하는 방법 역시 본 발명자에 의해 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주를 제공한다.
본 발명의 용어 "콤부차(Kombucha)"란, 스코비라고도 하는 홍차버섯 또는 상기 홍차버섯을 원료로 사용하여 제조된 발효음료를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 콤부차는 스코비라고도 하는 홍차버섯을 의미하는 것으로 해석될 수 있고, "콤부차"라는 용어에 의한 오인혼동을 방지하기 위하여, 콤부차를 원료로 하여 제조된 발효음료는 "콤부차 음료"라고 명명하였다.
본 발명의 용어 "초산균(Acetobacter)"이란, 초산발효균이라고도 하며, 유기물 중의 알코올을 산화시켜서 초산을 생성하는 Pseudomonadaceae에 속하는 호기성의 세균균주를 의미한다. 타원 또는 단간상으로 세포는 단일 또는 짧은 연쇄상을 하고 있는 등 종류에 따라 다르다. 장기배양, 고온배양, 과잉식염, 알코올 첨가배양 등에 따라 실모양, 그래프 모양, 약간 부푼 것 등 특이한 모양을 보이는 경우도 있다. 포자는 형성하지 않지만 대부분은 액의 표면에 번식하여 균막을 만든다. 주편모나 극편모를 갖고 운동성이 있는 것과 편모를 갖지 않는 비운동성의 것이 있다. 젊은 세포는 Gram 음성이지만 오래된 세포는 Gram 양성이 되는 경우도 있다. Acetobacter속 균주는 4종으로 분류되는데 A. aceti, A. liquefaciens, A. pasteurianus와 A. hansenii인 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 초산균은 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 신규한 초산균(Acetobacter aceti KOM)을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 초산균은 에탄올에 대한 내성과 내산성이 우수하므로, 콤부차 제조방법의 특성상 에탄올과 초산이 과량으로 존재하는 환경에서도 콤부차 제조를 효과적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 콤부차의 추출물로 부터 수득한 다양한 초산균 중에서 지금까지 알려져 있지 않은 신규한 균주를 분리 및 동정한 결과, Acetobacter aceti의 신규한 아종으로 확인되었고, 이의 특성을 분석한 결과, 우레아를 이용하지만 셀룰로오스를 생산할 수 없다는 점에서 콤부차로부터 유래된 종래의 초산균인 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 균주와 구별되고, 상기 글루코노박터 옥시단스 균주 보다도 우수한 에탄올 내성 및 내산성을 나타냄을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 신규한 초산균을 "Acetobacter aceti KOM"이라 명명하고, 2019년 5월 28일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM12535P로 기탁하였다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 신규한 초산균을 이용하여 콤부차 음료를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 콤부차 음료를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 콤부차 음료의 제조방법은 (a) 상기 콤부차 음료 제조용 초산균을 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 접종 및 배양하여 콤부차 초산 발효물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 초산 발효물에 유기산을 추가하여 콤부차 음료를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "콤부차 추출물"은 스코비라고도 하는 홍차버섯의 추출물을 의미한다.
본 발명의 용어, "추출물"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서 제공하는 콤부차 추출물은 콤부차로부터 유래된 갓, 균사체, 포자 등을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 콤부차 추출물에 있어서, 상기 콤부차를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 추출에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 물이 사용될 수 있다. 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"이란, 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 본 발명에서 제공하는 콤부차를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 알코올을 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 사용되는 콤부차 추출물은 초산 발효가 용이하게 수행될 수 있도록 에탄올과 질소원으로서 효모추출물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가되는 에탄올의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나 일예로서, 1 내지 10%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 2 내지 5%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 3%(v/v)가 될 수 있다.
상기 추가되는 효모추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나 일예로서, 0.1 내지 10%(w/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 0.2 내지 1%(w/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 0.5%(w/v)가 될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 수행되는 초산발효 온도조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, 20 내지 40℃가 될 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35℃가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 30℃가 될 수 있다.
특히, 배양시 에탄올의 함량이 1%(v/v) 이하로 떨어질 경우 에탄올이 농도가 3%%(v/v) 이상이 되도록 에탄올을 배양물에 추가하면서 발효를 진행함이 바람직하다. 아울러, 상기 배양물의 최종 적정산도가 4.0%이상일 때 발효를 종료할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 신규한 초산균을 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 접종하여 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다.
상기 신규한 초산균을 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시켜야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 30℃로 유지할 수 있다.
본 발명의 용어 "발효물"이란, 배양물이라고도 하며, 본 발명에서 제공하는 신규한 초산균을 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 접종 및 배양하여 얻어진 결과물을 의미한다. 넓은 의미로 상기 배양물은 상기 초산균의 전체 배양물, 배양 상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양 상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 상기 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양 상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 수득한 콤부차 초산 발효물에 다양한 유기산을 직접적으로 추가하여 수행될 수 있다. 이때, 추가되는 유기산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, 뷰티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 아스코르브산, 설폰산, 설핀산, 사과산, 주석산, 벤조산, 개미산, 구연산, 호박산, 글리실산, 글리콜산, 니코틴산, 레몬산, 말산, 살리실산, 숙신산, 시트르산, 아세트살리실산, 알파케토글루타르산, 옥살산, 옥살아세트산, 유리산, 이소시트르산, 젖산, 카르본산, 카페인산, 쿠웬산, 포름산, 푸말산 등의 다양한 유기산을 단독으로 또는 조합하여 콤부차 초산 발효물에 추가될 수 있다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 수득한 콤부차 초산 발효물에 유기산을 생성하는 발효물을 추가하여 수행될 수 있다. 이때, 추가되는 발효물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서 젖산균 발효물이 될 수 있고, 다른 예로서, 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 젖산균을 접종 및 배양하여 수득한 젖산균 발효물이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "젖산균"이란, 유산균이라고도 하며, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산을 생성하는 세균류를 통칭하여 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 젖산균은 콤부차 음료의 산도 및 맛을 좌우하는 중요한 인자이다. 즉, 젖산균을 사용하여 수득한 콤부차 젖산 발효물의 종류에 의하여, 콤부차 음료의 산도와 맛이 변화되므로, 다양한 젖산균을 사용하여 연령, 성별, 기호도 별로 적합한 콤부차 음료를 제조할 수 있다. 이때 사용되는 젖산균은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, Bifidobacterium에 속하는 Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus 등의 균주가 될 수 있고, 다른 예로서, Lactobacillus acidophilus에 속하는 균주가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, Lactobacillus acidophilus에 속하는 ABT-5(Str. thermophilus) 균주, YF-L01(Str. thermophilus) 균주 등이 될 수 있다.
상기 젖산균 발효물은 보다 효과적인 젖산 발효를 수행하기 위해, 콤부차 추출물 또는 그의 분획물 외에도 당류를 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가되는 당류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 단당류, 이당류, 올리고당 등의 미생물이 이용가능한 당류를 사용할 수 있는데, 예를 들어, 설탕, 포도당, 과당, 등을 사용할 수 있다
또한, 상기 당류의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, 1 내지 20%(w/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 2 내지 10%(w/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 5%(w/v)가 될 수 있다.
상기 젖산발효물을 수득하기 위한 온도조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, 20 내지 40℃가 될 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35℃가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 30℃가 될 수 있다.
아울러, 초산 발효물의 산도와 젖산 발효물의 산도간에 현저한 차이가 있다고 알려져 있으므로, 상기 콤부차 초산 발효물에 콤부차 젖산 발효물을 가할 경우에는, 콤부차 초산 발효물 보다 더 많은 량의 콤부차 젖산 발효물을 사용함이 바람직하다. 이같은 콤부차 초산 발효물과 콤부차 젖산 발효물의 혼합비는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로서, 1:3 내지 1:15(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 1:5 내지 1:10(v/v)이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 1:7(v/v)이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 콤부차 음료의 구체적인 제조방법을 도 1을 통해 설명하기로 한다. 도 1은 콤부차 음료의 제조과정을 나타내는 공정개략도이다.
도 1에서 보듯이, 콤부차 추출물을 원료로 하고, 본 발명에서 제공하는 신규한 초산균 및 별도의 유산균을 사용한 초산 발효물과 젖산 발효물을 각각 수득한 후, 이에 포함된 불순물을 제거하기 위하여 원심분리하거나 또는 규조토를 통해 여과하였다. 이처럼 불순물이 제거된 초산 발효물과 젖산 발효물을 혼합하여 콤부차 음료를 제조한 다음, 이를 살균 및 포장하여 제품화하였다.
이때, 초산발효는 콤부차 원료 추출물에 주정 3% 및 질소원으로 효모추출물 0.5% 첨가한 다음, 초산균을 4% 접종하고, 30℃에서 aeration하면서 발효를 진행하였다. 발효 과정 중 pH, 적정산도 및 알코올 함량을 확인하면 알코올 함량이 1% 이하로 떨어질 경우 주정 3% 추가 첨가하면서 발효를 진행할 수 있다. 최종 적정산도가 4.0% 이상일 때 발효를 종료함이 바람직하다.
또한, 젖산발효는 콤부차 원료 추출물에 설탕 5%를 첨가한 다음, 젖산균을 접종하고[YF-L05 또는 ABT-5 접종(50 U/250 L)], 30℃에서 정치 배양하여 수행되었다. 이때, 발효 과정 중 pH, 적정산도의 변화가 없을 경우 발효를 종료할 수 있다.
상기 초산발효물과 젖산 발효물을 1:7(v/v)로 혼합하여 콤부차 음료를 제조한 다음, 이를 65 내지 70℃에서 10 내지 15분 정도 저온 살균하고, 포장하여 제품화 할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주를 사용할 경우, 자연적인 콤부차를 사용할 경우보다도, 일정한 수준의 품질이 유지되는 콤부차 음료를 효과적으로 제조할 수 있으므로, 콤부차 음료의 산업적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 콤부차 음료의 제조과정을 나타내는 공정개략도이다.
도 2는 콤부차로부터 유래된 초산균을 고체배지에 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a는 A-2 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 3b는 KOM-3 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 KOM-3 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 초산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 YF-L01 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 ABT-5 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 콤부차로부터 유래된 초산균을 고체배지에 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a는 A-2 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 3b는 KOM-3 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 KOM-3 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 초산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 YF-L01 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 ABT-5 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 콤부차 유래 초산균의 분리 및 동정
코아바이오에서 제공한 콤부차를 0.85% NaCl 용액으로 연속 희석하여 초산균 분리배지(1% yeast extract, 5% glucose, 3% ethanol, 3% CaCO3, 2.0% agar)에 100 μL를 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후 콜로니 주위로 투명한 환을 생성한 6개의 콜로니(A-1, A-2, A-3와 KOM-1, KOM-2, KOM-3)를 수득하였다(도 2). 도 2는 콤부차로부터 유래된 초산균을 고체배지에 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
수득한 콜로니로부터 각 균주를 분리하고, 분리된 균주로부터 16S rRNA 유전자를 각각 수득하였다. 상기 수득한 16S rRNA 유전자를 주형으로 하고, 범용 프프라이머로서 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 서열번호 1)와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 2)을 사용한 PCR을 수행하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 증폭된 각각의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정하였다. 상기 결정된 각 염기서열을 BLAST search(Zhang et al. 2000)와 Ribosomal Database Project(version 11)의 SeqMatch program에 적용하여, 서열일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 선택하였다. 상기 결정된 각 염기서열과 선택된 16S rRNA 유전자 염기서열을 CLUSTAL W(Thomson et al. 1994)을 사용하여 비교분석하였다. 상기 비교분석을 수행한 결과를 이용하여 계통수 분석을 수행하였는데, 대략적으로, 각 균주들의 16S rRNA유전자 염기 서열들을 정렬하고 chromatogram의 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화되도록 보정한 후 Tamura-Nei model에 기초한 Maximum Likelihoood 방법(Tamura et al. 2011)을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며, 계통분석과 bootstrap 분석은 MEGA program(Tamura et al. 2011)를 사용하였다. 그 결과, 6개의 콜로니 중에서 2개 콜로니(A-2 및 KOM-3)로부터 유래된 균주가 동정되었다(도 2a 및 2b).
도 3a는 A-2 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이고, 도 3b는 KOM-3 콜로니로부터 유래된 균주를 동정한 결과를 나타내는 계통수이다.
도 3a 및 3b에서 보듯이, A-2콜로니로부터 유래된 균주는 Gluconobacter oxydans로 확인되었고, KOM-3 콜로니로부터 유래된 균주는 Acetobacter aceti의 신규한 아종으로 확인되어 이를 "Acetobacter aceti KOM"이라 명명하였다.
실시예 2: 콤부차 유래 초산균의 특성분석
실시예 2-1: 생화학적 특징분석
상기 실시예 1에서 동정된 2종 균주인 A-2 콜로니로부터 유래된 균주("A-2 균주")와 KOM-3 콜로니로부터 유래된 균주("KOM-3 균주")의 생화학적 특징은 각 균주가 나타내는 Catalase, Oxidase, 인돌 생성능, 황화수소 생성능, 우레아 이용성, 셀룰로오스 생성능, 에탄올 산화능, 젖산 산화능 및 젤라틴 액화능(Gelatin liquefaction)을 분석하여 수행하였다(표 1).
상기 표 1에서 보듯이, 상기 2종 균주는 우레아 이용성과 셀룰로오스 생성능에서 차이를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, A-2 균주는 우레아를 이용하지 못하지만 셀룰로오스를 생산할 수 있고, KOM-3 균주는 우레아를 이용하지만 셀룰로오스를 생산할 수 없다는 차이를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 알코올 내성분석
상기 실시예 1에서 동정된 2종 균주인 A-2 균주와 KOM-3 균주의 알코올 내성을 분석하기 위하여, 상기 각 균주를 0 내지 9%(v/v)의 에탄올을 포함하는 배지에서 배양하고 1일 또는 5일이 경과된 후, 배양물의 적정산도(Titratable acidity)를 측정하였다(표 2). 이때, 적정산도는 중화적정시에 사용된 0.1 N NaOH(Daejung Chemical, Suwon, Korea)의 소비량을 이용하여 산출하였다. 대략적으로, 배양물에 증류수를 가하여 20배 희석하고, 1% phenolphthalein(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 40 μL를 첨가한 후, 30초 동안 이에 0.1 N NaOH를 50 μL씩 첨가하면서 교반하여 붉은색을 나타내게 되는 0.1 N NaOH의 소비량을 계측한 후, 하기 수식에 대입하여, 적정산도를 산출하였다.
상기 표 2에서 보듯이, 상기 두 균주 모두 에탄올이 첨가된 배지에서 배양할 때, 에탄올의 함량이 증가될 수록 적정산도가 감소됨을 확인하였다. 특히, 6%(v/v)의 에탄올을 포함하는 배지에서 배양할 경우, A-2 균주는 0.268%의 적정산도를 나타내었고, KOM-3 균주는 1.688%의 적정산도를 나타내었으므로, A-2 균주의 알코올 내성 보다 KOM-3 균주의 알코올 내성이 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 내산성 분석
상기 실시예 1에서 동정된 2종 균주인 A-2 균주와 KOM-3 균주의 내산성을 분석하기 위하여, 상기 각 균주를 0 내지 3%(v/v)의 초산을 포함하는 Carr broth(yeast extract 2%, peptone 0.5%, pH 6.8)에서 배양하고 2일, 4일 또는 6일이 경과된 후, O.D.600값을 측정하였다(표 3).
상기 표 3에서 보듯이, 상기 두 균주 모두 초산이 첨가된 배지에서 배양할 때, 초산의 함량이 증가될 수록 균체의 증식수준이 감소됨을 확인하였다. 특히, KOM-3 균주는 1%(v/v)의 초산을 포함하는 배지에서 배양할 경우에는 별다른 차이를 나타내지 않고, 2%(v/v) 이상의 초산을 포함하는 배지에서 배양할 경우에 균체의 증식수준이 감소되었으나, A-2 균주는 1%(v/v)의 초산을 포함하는 배지에서 배양할 경우에도 균체의 증식수준이 현저히 감소됨을 확인하였다.
상기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과로부터, 콤부차로부터 분리된 2종의 초산균 중에서 상대적으로 우수한 알코올 내성과 내산성을 나타내는 KOM-3 균주가 콤부차의 초산발효를 수행하는데 효과적임을 알 수 있었는 바, 이하의 콤부타 음료 제조시에 사용하기 위하여, KOM-3 균주를 선발하였다.
이에 본 발명자들은 상기 KOM-3 콜로니로부터 유래된 Acetobacter aceti KOM 균주를 2019년 5월 28일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM12535P로 기탁하였다.
실시예 3: 콤부차 음료의 제조
상기 실시예 2에서 선발된 KOM-3 균주를 이용하여 콤부차의 초산 발효물을 수득하고, 상기 수득한 콤부차의 초산 발효물과 별도로 수득한 콤부차의 젖산 발효물을 혼합하여 콤부차 음료를 제조하였다.
실시예 3-1: 콤부차 초산 발효물의 수득
코아바이오로부터 제공받은 콤부차 원료추출물에 에탄올 3%를 첨가하고, 이에 상기 KOM-3 균주를 접종 및 배양하여 콤부차 초산 발효물을 수득하였다(도 3). 이때, 발효를 진행하면서 배양물의 pH와 적정산도가 변화되지 않으면, 상기 배양물에 에탄올의 농도가 3%(v/v)가 되도록 에탄올을 추가하면서 4% 이상의 적정산도에 도달할 때 까지 배양을 진행하였다. 아울러, 배양과정 중, 배양물 내의 에탄올 함량, pH 및 적정산도의 변화를 측정하였다.
상기 에탄올 함량은 Shimadzu Auto system gas chromatograph(GC-2010 plus)로 측정하였는데, GC 분석은 FID 검출기를 사용하여 수행되었다. CBP10 capillary column(L = 25 m, D = 0.33 mm, df = 0.5)을 사용하였다. Injector를 100℃로 가열하고 FID를 260℃로, 칼럼 온도 프로그램을 90℃에서 등온으로 하였다. 샘플은 splitless 모드로 주입되었다(Abdolmaleki et al., 2015).
상기 pH는 시료 10 mL를 취하여 pH meter (pH-200L, Istek Co, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 KOM-3 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 초산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4에서 보듯이, 발효가 진행될수록 pH와 적정산도가 증가하는 경향을 보였으며, 초산 발효의 기질로 사용되는 에탄올은 점차 감소되는 경향을 보였다. 발효 10일차 pH는 3.1, 적정산도는 2.66%, 에탄올은 0.04%였으며, 초산 발효 진행을 위해 3%의 에탄올을 추가 후 초산 발효를 진행하였다. 16일 발효시 pH는 3.00, 적정산도는 3.89%였으며, 초산 발효로 사용되는 기질인 에탄올은 0.05% 로 감소하였다. 적정산도가 4%를 넘지 않았으므로 에탄올을 3% 추가하여 발효를 계속 진행한 결과, 19일 발효시 적정산도가 4.03%로 식초의 기준이 4%를 초과하였으며, 산도 증가를 위하여 에탄올 3%를 추가한 후 계속발효를 진행하였다. 그 결과, 22일 발효시 적정산도는 4.38%로 증가하였다. 이상의 발효 결과에 의하면 에탄올을 3회정도 추가하면서 발효를 진행할 경우 적정산도가 4.0% 이상의 결과를 얻을 수 있었다.
따라서, 에탄올과 효모 추출물을 첨가하여 콤부추출물로부터 초산 발효 진행 시 pH, 적정산도를 측정하면서 에탄올의 첨가 시기를 조정하며 발효를 진행할 경우, 3회의 에탄올 첨가를 통해, 4%를 초과하는 적정산도를 나타내는 콤부차 초산 발효물을 수득할 수 있었다.
상기 수득한 콤부차 초산 발효물에 포함된 유기산과 DSL(D-saccharic acid-1,4 lactone)의 함량을 분석하였다(표 4).
이때, 유기산과 DSL 분석은 시료액을 원심분리 시킨 후, 0.45 μm membrane filter로 여과하여 색소 및 단백 질 성분을 제거한 다음, HPLC 로 분석하였다. 유기산 분석 컬럼은 YMC Triart C18(5 μm, 250 mm x 4.6 mm, YMC Inc., Japan), 이동상은 20 mM Potassium dihydrogen phosphate (pH 2.4)와 메탄올의 혼합액(80:20)를 사용하였고, flow rate는 1.0 mL/min, injection volume은 20 μL, detector는 detector는 UV(210nm) detector를 사용하였다.
DSL 분석 column은 YMC Triart C18(5 μm, 250 mm x 4.6 mm, YMC In c., Japan), 이동상은 40 mM Borax buffer(pH 2.7)와 메탄올의 혼합액 (85:15)를 사용하였고, flow rate는 0.5 mL/min, injection volume은 10 μL, detector는 detector는 UV(210nm) detector를 사용하였다.
상기 표 4에서 보듯이, 유기산의 대부분은 초산으로 확인되었고, 약 67.27 mg/mL의 함량을 나타내었다. 초산 이외에는 구연산이 1.54 mg/mL의 함량을 나타내었고, 콤부차의 생리활성물질인 DSL은 4.25 mg/mL의 함량을 나타내었다.
실시예 3-2: 콤부차 젖산 발효물의 수득
Cristian Hansen(Denmark)로부터 제공받은 젖산균 ABT-5(Bifidobacterium, Lac. acidophilus, Str. thermophilus) 균주 또는 YF-L01(Str. thermophilus) 균주를 접종하고, 30℃에서 7일 동안 정치배양하였다(도 5 및 6). 이때, YF-L01 균주는 500 U/2500 L의 농도로 접종하고, ABT-5 균주는 50 U/250 L의 농도로 접종하였으며, 배양과정 중, 배양물 내의 에탄올 함량, 환원당 함량, pH 및 적정산도의 변화를 측정하였다.
상기 환원당 함량은 dinitrosalicylic acid(DNS)법(Miller, 1959)에 의해 측정하였다. 대략적으로, 증류수에 희석된 시료 1 mL에 DNS reagent 1 mL를 가하고, 끓는 물에서 15분 동안 중탕 시키면서 반응시켰다. 반응물을 냉각시켜 반응을 종료시킨 후, 이에 증류수 3 mL를 가하여 희석하고, Spectrometer(UV-2101, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)를 이용하여 546 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 당 정량은 glucose를 표준물질로 사용하여 상기방법으로 작성한 표준곡선으로부터 환산하였다.
도 5는 YF-L01 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 도 5에서 보듯이, 발효 5일까지 pH는 급격히 감소하다가 그 이후 서서히 감소하는 경향을 보였으며, 적정산도 역시 5일 이후 급격한 증가를 보이다가 서서히 증가하는 경향을 보였다.
도 6은 ABT-5 균주를 이용하여 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 도 6에서 보듯이, YF-L01 균주를 이용한 결과와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 다만, 환원당의 경우, 5일차에 최대의 환원당 함량을 보이다가 서서히 감소하는 경향을 나타낸다는 점에서 차이를 나타내었으나, 그 외의 에탄올 함량, pH 및 적정산도는 YF-L01 균주를 이용한 결과와 유사함을 확인하였다.
상기 콤부차 젖산 발효물의 수득한 이후, 콤부차 추출물의 젖산발효를 수행한 결과, 초산이 유기산의 거의 대부분을 차지하고 있으며, 젖산의 경우 극히 소량 검출되었다. 콤부차의 생리활성 물질로 알려진 글루쿠로닌산(glucuronic acid)은 ABT-5에 의한 발효물이 좀 더 많은 함량을 보였으며, DSL은 ABT-5에서만 측정됨을 확인하였다.
실시예 3-3: 콤부차 음료의 제조
상기 수득한 콤부차 초산 발효물과 콤부차 젖산 발효물을 1:7(v/v)의 비율로 혼합하여 콤부차 음료를 제조하고, 이에 포함된 유기산 및 DSL의 함량을 측정하였다(표 6).
상기 표 6에서 보듯이, 삳기 콤부차 음료는 유기산, 글루쿠로닌산과 DSL을 포함한다는 점을 확인하였다. 특히, 젖산 발효물을 수득할 때 사용된 젖산균에 따라, 글루쿠로닌산의 함량이 현저한 차이를 나타냄을 확인하였다.
이로 인하여, 본 발명에서 제공하는 방법으로 제조된 콤부차 음료는 종래의 콤부차 음료와는 달리 콤부차의 주요 특성인 산도를 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> COREBIO, INC.
Agency for Korea National Food Cluster (AnFC)
<120> Novel acetic acid bacteria and process for preparing Kombucha
beverages using the same}
<130> KPA190801-KR
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (17)
- 콤부차로부터 유래되고, 수탁번호 KCCM12535P로 기탁된 콤부차 음료 제조용 초산균인 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주로서, 상기 아세토박터 아세티 KOM 균주는 그의 에탄올에 대한 내성과 초산에 대한 내산성으로 인하여 콤부차의 초산 발효를 수행할 수 있는 것인, 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 아세토박터 아세티 KOM 균주는 우레아를 사용할 수 있고, 셀룰로오스를 생성하지 않는 것인, 아세토박터 아세티 KOM(Acetobacter aceti KOM) 균주.
- 삭제
- 삭제
- (a) 제1항의 아세토박터 아세티 KOM 균주를 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 접종 및 배양하여 콤부차 초산 발효물을 수득하는 단계; 및,
(b) 상기 수득한 콤부차 초산 발효물에 유기산을 생성하는 발효물을 추가하여 콤부차 음료를 수득하는 단계를 포함하는, 콤부차 음료의 제조방법으로서, 상기 유기산을 생성하는 발효물은 콤부차 추출물 또는 그의 분획물에 젖산균을 접종 및 배양하여 수득한 콤부차 젖산 발효물인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (a) 단계의 콤부차 추출물은 콤부차를 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득한 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (a) 단계의 배양은 20 내지 40℃에서 수행되는 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (a) 단계의 콤부차 추출물은 에탄올과 효모추출물을 추가로 포함하는 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 에탄올의 함량은 1 내지 10%(v/v)인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 효모 추출물의 함량은 0.1 내지 10%(w/v)인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 (b) 단계의 유기산은 뷰티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 아스코르브산, 설폰산, 설핀산, 사과산, 주석산, 벤조산, 개미산, 구연산, 호박산, 글리실산, 글리콜산, 니코틴산, 레몬산, 말산, 살리실산, 숙신산, 시트르산, 아세트살리실산, 알파케토글루타르산, 옥살산, 옥살아세트산, 유리산, 이소시트르산, 젖산, 카르본산, 카페인산, 쿠웬산, 포름산, 푸말산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유기산인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 젖산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주, 락토코커스(Lactococcus) 속 균주, 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 또는 페디오코커스(Pediococcus) 속 균주인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 콤부차 초산 발효물과 유기산을 생성하는 발효물의 혼합비는 1:3 내지 1:15(v/v)인 것인, 콤부차 음료의 제조방법.
- 제5항 내지 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 콤부차 음료.
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| KR1020190078226A KR102243418B1 (ko) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법 |
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| KR1020190078226A KR102243418B1 (ko) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법 |
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-
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