CN102329623A

CN102329623A - 一种农用盐碱消生产方法及其应用

Info

Publication number: CN102329623A
Application number: CN200910113201A
Authority: CN
Inventors: 魏明重
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2009-01-05
Publication date: 2012-01-25

Abstract

一种农用盐碱消生产方法及其应用，本发明目的在于用生物技术获得一种高效、快速、低成本的治理土地盐碱地的方法。一种农用盐碱消的组成是，利用嗜盐杆菌在盐碱环境中，能转化盐碱，成为酶的蛋白质(蛋白质多为氨基酸的化合物)奇妙的“修复工具”，能够修复DNA，也能够修复盐碱地。腐植酸小分子是黄腐植酸，黄腐植酸由15种以上氨基酸组成，腐植酸具有离子交换、螯合、吸附、凝聚、胶溶、还原等绿色功能，有助于修复盐碱地。稀土可以提高酶的活性，活化嗜盐杆菌提供的酶，也就是说提高蛋白质的活性。在一定条件下，可促进作物生根发芽，增加作物叶绿素含量，增强光合作用速率，提高作物对氮、磷、钾的吸收，稀土可增强作物抗逆性。稀土有“四两拨千斤的威力”。三者组合，强有力地促进高效、快速、治理盐碱地，在农户使用多种抗盐碱产品对比中盐碱消突显优势。

Description

一种农用盐碱消生产方法及其应用

技术领域

嗜盐杆菌的生产属生物技术领域。

技术背景

全国耕地14亿亩，盐碱地约4亿亩，新疆有耕地6000万亩，1/3属盐碱地，农业发展史.在一定程度上是一部和盐碱作斗争的历史。

历来采用水利改良盐碱地，耕作改良，化学改良，生物改良等多种方法，改良盐碱地获得了很大的进展和成绩。但是改造盐碱地是一个世界难题，需要长期卓绝的奋斗。生产不息，奋斗不止。

发明内容

一种农用盐碱消及其应用

本发明目地在于用生物技术获得一种高效、快速、低成本的治理土地盐碱地的方法。

一种农用盐碱消的组成是，利用嗜盐杆菌在盐碱环境中，能转化盐碱，成为酶的蛋白质(蛋白质多为氨基酸的化合物)奇妙的“修复工具”，能够修复DNA，也能够修复盐碱地。腐植酸小分子是黄腐植酸，黄腐植酸由15种以上氨基酸组成，腐植酸具有离子交换、螯合、吸附、凝聚、胶溶、还原等绿色功能，有助于修复盐碱地。

稀土可以提高酶的活性，活化嗜盐杆菌提供的酶，也就是说提高蛋白质的活性。在一定条件下，可促进作物生根发芽，增加作物叶绿素含量，增强光合作用速率，提高作物对氮、磷、钾的吸收，稀土可增强作物抗逆性。稀土有“四两拨千斤的威力”。

三者组合，强有力地促进高效、快速、治理盐碱地，在农户使用多种抗盐碱产品对比中盐碱消突显优势。

嗜盐菌似乎是修复DNA损伤的高手。为了解其中的奥秘，马里兰大学在美国航空航天局的资助下进行了一系列研究。研究人员用辐射轰击法破坏嗜盐菌的DNA，使其分裂成碎片，但它们在几个小时内就能将所有的染色体“召集”到一起，重新恢复正常功能。嗜盐菌为何能有如此顽强的生存能力？马里兰嗜盐菌研究项目主任乔斯林·迪鲁吉罗认为，根本的原因在于嗜盐菌是在一个原本就不适合生命生存的地方生存和进化的。死海海水的盐浓度是正常海水的5-10倍，多数海洋生命在死海里会很快死亡。高盐浓度导致与辐射类似的后果，使有机体的细胞，特别是细胞中的DNA受损。在这种含盐量极高的极端环境中生存和进化，正是嗜盐菌能够承受辐射和其他恶劣环境的原因。在强烈的紫外线光束的照射下，多数微生物会全部死亡，但80％的嗜盐菌活了下来，且能继续正常生存和繁殖。研究人员还做了一个实验，将含有嗜盐菌细胞的海水置于模拟太空的真空环境里，结果水分很快蒸发，留下的盐分形成了含有微量水分的结晶体，嗜盐菌细胞躲藏在这些像一个个小房子似的盐的晶体里，能避免进一步的干燥缺水，可以在很长的一段时间内处于半休眠状态。如果盐的晶体有机会重新溶入有水环境中，嗜盐菌细胞会重新活跃起来，修复由于缺水引起的DNA损伤，迅速恢复正常的生存活动。

嗜盐菌为何能在这一系列实验中存活下来？迪鲁吉罗研究小组和西雅图系统生物技术研究所的科学家们用现代基因测试工具观察嗜盐菌细胞DNA受损的全过程，发现嗜盐菌在受到强烈紫外线照射和被置于模拟太空的真空环境后，其整套“分子修复工具”都被激活了。所谓“分子修复工具”是一种叫做酶的蛋白质。嗜盐菌里有着一定数量承担修复工作并“随时待命”的酶，当受到致命剂量的辐射照射时，这些“埋伏”着的酶会很快出动，对DNA进行“抢救”，然后其他种类的酶继续其修复工作，并激活产生这些酶的基因。迪鲁吉罗研究小组还发现，在嗜盐菌2400个基因的基因组里包含了好几套独特的DNA修复“工具”。嗜盐菌的这些DNA修复“工具”，有的其他动植物也有，有的则是细菌才有的，还有的是一种叫做archaea太古代微生物(嗜盐菌所属的种类)所特有的，嗜盐菌则拥有所有这些修复“工具”。此外，它还有几种别的物种所没有的新奇的DNA修复“工具”。

嗜盐菌的分离

了解嗜盐菌在实验室中的培养方法和高产细菌视紫质(Bacteriochodopsin，BR)的培养条件以及菌种保藏等常规工作。

二、原理

嗜盐菌在系统发生上与甲烷细菌(methanobacteria)、热酸菌(thermoacidophilic bacteria)均属干古细菌类(archaebacteria)，这种只有在极高盐浓度介质中才能生长的细菌在分类学上属于盐杆菌科(Halobacteriaceae)、已经知道，此科下有两个属：一个属为盐杆菌属(Halobacierium)，如盐制品盐杆菌(H.salinarium)，盐生盐杆菌(H.halobium)；另一个属为盐球菌属(Halococcus)，如鱈盐球菌(H.mohnruae)，盐杆菌科的细菌有机体具有古细菌类特征的核糖体(如16S rRNA)；不具有一般细菌所具有的那种细胞壁(如细胞壁上不含有一般细菌细胞壁所具有的肽壤糖等典型组分，而是由糖蛋白组成)；有极端嗜盐的原核细胞，仅能在大于2mol/L的NaCl中才能正常生长：它们的酶系也仅在高盐的介质中才具有正常活性；它们的蛋白质含有较多的酸性氨基酸残基等。

这一科的生物大都是蛋白水解型的，属于异养的需氧呼吸代谢类型。当它们从自然界中分离出来时，都包含有C-50类胡萝卜素，但在自然界中以及在人工培养条件下，均会遇到无色素的菌体。另外，有许多菌株还含有视黄醛(Rctinal)类色素，即细菌视紫质。但BR是否存在以及它在细胞中的含量，在任何一个菌株中均与生长条件有关，因此它不是分类学上的特征。

在20世纪60年代，发现了嗜盐菌中含BR的膜，即紫膜(为细胞膜的一部分)具有光驱动的质子泵功能，并导致产生光合磷酸化。此后对这一细菌的研究有了更加广泛的兴趣，相继开展了有关光能转换、紫膜结构和功能、对极端环境的调节适应以及探讨古细菌进化途径的因子等等多方面的研究。嗜盐菌中细菌的细胞壁由糖蛋白组成，在2mol/L NaCl中会完全失去其坚硬性，在低于1mol/L NaCl的介质中，细胞壁破碎并发生溶胞。在经受中等强度的机械压力时，也能引起溶胞。这些特点是与另一属盐球菌属不同的。它们的细胞壁由坚固的硫酸盐杂多糖组成，在水中其结构也不会破坏，细胞也不呈通常的棒形。

盐杆菌的细胞所要求的生长环境，如介质中离子组分、盐浓度和PH等，常反映了它们的生态特点，如从高碱性、高盐分的沙漠潮中分离到的种类都要求高pH、低镁和高NaCl浓度的介质，而从晒盐场中分离的则要求中性pH、一般镁离子浓度和高NaCl浓度的介质。

嗜盐菌生长的条件除了NaCl盐浓度要大于2mol/L以外，还要求Na⁺、Mg²⁺为细胞外介质中的主要阳离子，而在细胞内部这类离子也保持着同样的强度，但K⁺则是细胞内的主要阳离子。

本实验介绍的培养方法主要是以盐生盐杆菌作为对象，这是一种从盐场中分离出来的，目前世界上各实验室使用最广泛的嗜盐菌。

三、实验材料

培养盐生盐杆菌最好选用Oxoid或Inolcx蛋白胨。有些蛋白胨如美国Bacto-Tryptone(Difco0123-01)或Bacto-peptone(Difco 0118-01)因含有一种能使嗜盐菌细胞溶胞的物质，故不能使用。有一些蛋白胨在准备培养基过程中会产生少量沉淀，可以在培养基未加热前用6000g离心30min(20℃)除去，或用0.45μm过滤器去除。

液体培养基由蛋白胨加盐基介质(即为保持细菌正常生长所要求的离子组分和高渗浓度的介质，常简称为BS)组成，这样的培养基常简写为RM。盐生盐杆菌RM的化学配方如下：NaCl 233.76g/L，MgSO₄·7H₂O 9.4g/L，Na₆C₄H₅O₂·2H₂O(柠檬酸钠)3.0g/L，KCl 2.0g/L，Oxoid L-37蛋白胨10g/L，调节pH为7.2左右。

BS即是指上面配方中不含蛋白胨和柠檬酸钠的溶液。在上述培养基中加入1.5％(质量体积分数)琼脂后即成固体培养基、121℃、灭菌15～20min。

四、方法与步骤

1.液体通气培养

细菌可在大体积、透明的玻璃瓶中培养，如20L体积的玻璃瓶，内盛1L培养液。将瓶水平放置，这样可使培养液有较大的表面接受光照。为了给以充分的光照条件，可以在瓶子的上、下两个方向各放置4只20W的日光灯管。虽然照明对色素形成不一定是必需的，但在照明条件下(10⁴～10⁶crg/s·cm²)可以使细菌合成最大产率的紫膜。

用1％处于稳定生长期的菌液来接种。细菌可在高达57℃下生长，但为了防止水分过分蒸发，通常调节生长温度为38～40℃。为了保证良好的有氧生长条件，瓶中必须通氧。空气在未进入培养液前先流过蒸馏水，以防止培养液的过分蒸发。培养液中可用喷雾微量抗泡剂以防止泡沫大量形成。在开始生长的36h里，介质的通气量可以保持为250L/h，这样的通气量在开始生长的6h里，使4L的培养液达到氧的饱和状态，然后氧浓度迅速下降到10％的饱和水平。故在36h后，通气速率可调节到160L/h，这样的速率使得氧浓度在其后的生长期间保持为低于5％的饱和状态。在这样的氧浓度下，细菌能以最高速率合成紫膜。在110h生长后，此时细菌已处于稳定生长期约30h，可以收获。

细胞的生长情况可用测定在660nm处的浊度来检查，也可以进行细胞计数。紫膜生长通常在细菌生长的对数期快结束时出现，而且在氧的供应降低时有最大产率。随着培养条件的变化，紫膜的产率也会有很大差别。某些条件下可以完全不产紫膜。故在实验室中的不同条件下，需要掌握生长期间的一些参数。如对数生长期的廷续时间、稳定生长期的开始时间，介质中氧的接受情况等。

2.摇瓶培养

摇瓶培养既可为较大量的液体培养准备接种液，也可用来收集紫膜。摇瓶所盛的液体通常为瓶体积的1/4～1/3。摇床振荡速率的大小控制着摇瓶内的氧气饱和程度。从而控制着紫膜的合成速率。如振荡频率为100r/min，生长6d，39℃，可以达到最大紫膜产率。而当提高至180r/min时，则菌体有较快的增长速度，但紫膜产率较低。

3.菌种保藏

菌种可以在RM固体培养基的琼脂平板上于4℃下保存6个月至1年。平板必须用石蜡膜严密封好，或将其置于密封的塑料袋中，以防干燥。RM琼脂斜面经严密封好后，在4℃下可保存1～2年。处于对数生长期的液体培养液(在RM基质中)在-10℃下可以保存更长时间。

4.色素突变菌株的分离

嗜盐菌细胞在RM-琼脂上形成很清晰的菌落，琼脂平板上可见有大数量的细胞，由它们形成的群体可通过双筒显微镜(4×25)放大进行观察。根据不同的颜色可以很容易地识别突变菌落。特别是在反射光下，当它们与大量相邻亲缘群体进行互相对照比较时，更易区别。

在分离时，首先将在RM液体培养中所得到的菌体液在显微镜下进行计数，并用BS稀释成10⁴个/mL，取0.05～0.1mL均匀涂布于琼脂平板上，若平板能得到500～1000个群体，则表明这些细胞的接种效率为100％。必须严防干燥，为此可将琼脂平板保存在密封的塑料袋中，于39℃下培养。第一次观察可在培养15d以后，第二次观察在总共培养了25d后。空泡的存在将严重影响颜色，因为它能将入射光反射回来。在相差显微镜下观察，带有空泡的单个细胞由于有很强的反射，对比细胞的暗背景显得很亮。

突变菌株用在RM-琼脂平板上反复划线的办法来纯化。突变菌株的表现型应加以记录，并在重新划线后再观察检查。

色素突变菌株的分离对于选育BR高产菌株是非常重要的。在连续做液体培养的进程中，由于菌种变异等多种原因，BR产率将逐渐减少，因此至少每隔一年需要进行一次高产菌株的分离筛选工作。此外，菌株分离工作还应用于选育除含BR外的其它色素系统的菌体。

(腐植酸)黄腐酸

()对盐碱地的改良中国有近四亿亩盐碱地，主要分布在东北松辽平原、西北、华北及滨海地区，包括盐土和碱土两大类。盐土主要是土体内含有较多的可溶性盐类，以NaCl、Na₂SO₄为主。碱土主要是土体内含有较多的NaHCO₃、Na₂CO₃和交换性钠，使土壤碱性过高，pH值一般在9.0左右。在农业生产中，盐碱土是障碍性低产土壤，其主要矛盾是含有过多的可溶性盐分，土壤溶液浓度过高，作物吸水困难。在这类土壤中，土壤营养平衡遭到破坏，影响养分的正常吸收。某些碱性盐类直接毒害、腐蚀作物，破坏作物根部的各种酶，影响新陈代谢和养分的吸收运转能力。

盐碱土土粒分散度高，土壤结构性很差，通气性不好，耕性不良，是需要改良的恶性土壤。“盐随水来，水随气散，气散盐存”是盐碱土的基本发生规律。通过加强排灌水利工程措施，降低地下水位，促进土体脱盐过程是有效的改良途径之一。通过合理施肥改良土壤结构，提高土壤阳离子代换能力也是不可忽视的。在这类土壤上施用含腐植酸类肥料，提高土壤的阳离子代换能力，促进土壤团粒结构的形成，就能破坏盐分上升，减缓表土盐分的积累，降低表土含盐量，起到“隔盐作用”。腐植酸分子上羧基等酸性基团，可在一定程度上中和土壤碱度，并加速Na+的脱除。腐植酸对土壤水有较强的吸持能力，使土壤的保水能力提高，在一定程度上降低了土壤水分的向上运动，从而减少了地面蒸发失水积盐过程。腐植酸作为有机物质施入土壤后，为土壤微生物提供了能量物质，使微生物活力加强，微生物大量繁殖分泌的有机酸也能降低土壤碱度。另外，腐植酸具有较强的生理活性，对根系的发展及体内的碳、氮和水分代谢，多种酶的活性都有促进作用，从而提高了作物的抗盐碱能力^[43]。

提高土壤微生物活性，改善土壤生物学性状

土壤之所以表现出具有生命的特征，主要因为在土壤中生活着种类繁多，数量巨大的微生物和土壤动物。据测定每1g土壤中就含有300～500万个微生物，每1亩耕层土壤可含有上千千克活的微生物。土壤作为微生物生活的环境，在适宜的条件下，这些微生物繁殖极快，活动旺盛，它们对施入或残留于土壤中的有机物质的分解，腐殖质的形成，养分的活化、释放、保持及土壤结构的形成、理化性状的改善都有重要作用。

施用腐植酸或腐植酸复合肥料能够促进土壤微生物的活动，增加有益微生物数量的事实，已被国内外大量的研究资料所证实。吉林省农科院土肥所的试验表明，土壤施用腐植酸后微生物活性增强，经测定土壤呼吸强度比对照提高1～3倍，土壤纤维素酶，磷酸酶及蛋白酶活性分别提高6％～50％，8.4％～46％，14％～42.9％^[43]。西北农学院的测定结果表明土壤施用风化煤堆沤肥后，土壤中氨化细菌、固氮菌、纤维分解菌等有益微生物数量平均增加40.9％，最高可达80％(表3- 43)。吉林市农科所的试验表明，白浆土施用草炭腐植酸复混肥后使灰漂层微生物总量增加1倍(增加值为2275万/g土，其中96.5％为细菌)。同时土壤中自生固氮菌数量也明显增加，与原土相比增加6倍^[33]。

表3-43腐植酸对土壤微生物数量的影响

1994年河北省农业大学研究了土壤有机质含量变化与腐植酸复合施肥用量的关系。结果(表3-44)发现，肥料中的腐植酸对土壤有机质含量增加的直接作用不大。但间接增加作用是直接作用的5～24倍，说明腐植酸复合肥施入土壤后，以适宜C/N，C/P，C/K比值供土壤微生物快速繁殖，从而对土壤有机质增加产生超补偿效应，这种效应是任何其他化学肥料所不具备的^[44]。

腐植酸及其肥料对土壤微生物活性的促进作用，不仅有利于土壤有机物质的腐殖化和土壤物理、化学性质的改善，而且有利于土壤养分的转化与释放，增加土壤有效养分，从而有效改善了作物的生长环境与营养条件，实现用地与养地相结合，达到培肥地力的目的。

实施例：

一种农用盐碱消生产方法及其应用

配方工艺原料(1)嗜盐杆菌液体指标1)含嗜盐杆菌1.1×10⁶/g以上。

(2)黄腐植酸液体含15种以上氨基酸，含黄腐酸6-8％。

(3)稀土

(放射性元素在国标以下)

嗜盐杆菌∶黄腐酸∶稀土 50∶47∶3(重量比)

将三种原料均匀勾兑，塑料桶包装。

附图是产品加工程序方框图。

Claims

1.一种农用盐碱消的生产方法，其特征在于，所用嗜盐杆菌是盐生盐杆菌作为原料，这是一种从盐场中分离出来的，目前使用最广泛的嗜盐菌，液体含菌浓度要在1.1×10⁶/g以上。配比量50％。

2.按权利要求1、一种农用盐碱消生产方法，其特征在于，所用的黄腐植酸含有15种以上的氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸等)浓度在6-8％。液体配比量是47％。

3.按权利要求1、一种农用盐碱消生产方法，其特征在于：

所用稀土RE₂O₃、0.015％、Ca1.3％、Si9.02％，有害物质汞0，铬43mg/kg、砷0.85mg/kg，镉0.3mg/kg、铅26.3mg/kg，均在国家标准以下。

RE₂O₃水溶液配比量3％。

4.按权利要求1、一种农用盐碱消产品包装采用塑料溶器。

5.按权利要求1、一种农用盐碱消使用方法，每亩地一公斤兑水1000公斤，均匀喷在地表，然后再喷清水2次，地面无积水为度。