CN105296558B - 一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分段发酵生产低分子量γ‑聚谷氨酸的方法。本发明通过微孔滤膜过滤除菌的方法制备发酵用培养基,然后接种枯草芽孢杆菌,采用分段发酵法进行培养:第一阶段,温度30‑36℃,通气流量2‑10Nm3/h,搅拌速度50‑200rpm,培养12‑24h;第二阶段,温度35‑39℃,通气量加1‑2倍,搅拌速度加1‑2倍,培养24‑96h;得到高产物浓度(30‑60g/L)、低分子量(35‑260KDa)的γ‑聚谷氨酸发酵液。本发明通过调整和优化发酵工艺,在微生物发酵阶段直接获得高浓度的低分子量产物,是一种高效低成本生产低分子量γ‑聚谷氨酸的新工艺。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域,具体涉及一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种由微生物发酵产生的谷氨酸聚合物,具有保湿、维持皮肤弹性、提升天然保湿因子含量、美白肤色、促进营养成分吸收等功效,可通过微生物发酵进行工业生产。
γ-聚谷氨酸生物学功能与其相对分子量密切相关,低分子量产品在化妆品中应用广泛,但直接发酵产物分子量较大,必须经后期酸解降低分子量(目前降低分子量的主要方法),这会造成含量(产物浓度)严重减少。直接发酵产物分子量较大(>1000KDa),用于化妆品添加影响肤感,因此需要低分子量产品(<260KDa)。目前已报道多种获得低分子量γ-聚谷氨酸的方法,例如菌株筛选,但实验周期长、不确定性高;酶解法效率高,但还处于实验研究阶段;酸/碱水解法虽然在工业生产中最常用,但有数据表明酸水解后产物浓度会减少32%。因此上述方法均不适合工业生产。近年来不少研究发现,碳源、金属离子、发酵温度、搅拌速度等不仅会影响发酵产物γ-聚谷氨酸的产量,而且也影响到其相对分子量,但具体量效关系未见报道。因此,目前很需要一种能在不减少产物浓度的情况下,生产低分子量γ-聚谷氨酸的新工艺方法。
目前在售的γ-聚谷氨酸主要是高分子量级别,以台湾味丹公司的产品为代表。市场上低分子量γ-聚谷氨酸的产品非常少,产量质量也不高,生产能力有限,低分子量γ-聚谷氨酸产品市场仍处于开拓阶段,经济前景很好。
发明内容
本发明针对现有技术中低分子量γ-聚谷氨酸生产工艺繁琐、效率低的不足,以现有工业发酵菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7为研究对象,通过优化和控制发酵工艺,使菌株在发酵阶段直接产生低分子量产物,提供一种低成本高效的基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。
本发明的基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法,包括以下步骤:
接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中,采用分段发酵法进行培养:第一阶段,温度30-36℃,通气流量2-10Nm3/h,搅拌速度50-200rpm,培养12-24h;第二阶段,温度35-39℃,通气流量比第一阶段的增加1-2倍,搅拌速度比第一阶段的增加1-2倍,继续培养24-96h,由此得到低分子量γ-聚谷氨酸发酵液;
所述的发酵用培养基,每升含有柠檬酸10-20g、谷氨酸钠15-30g、甘油50-100g、硫酸镁0.01-0.1g、硫酸锰0.01-0.1g、氯化铁0.01-0.1g和氯化钙0.01-0.1g,余量为水,调pH至7.0-7.5。
所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7,其保藏编号为:CCTCC NO:M206102。
所述的发酵用培养基优选采用过滤除菌,得到无菌的发酵用培养基。所述的过滤除菌是使用孔径规格为0.1μm-0.45μm的微孔滤膜过滤1-3次。通过微孔滤膜过滤除菌的方法制备发酵用培养基,可防止常规蒸汽灭菌时高温破坏各营养组分,最大限度保持各组分活性,有利于分段发酵生产高浓度低分子量γ-聚谷氨酸。
所述的接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中,其接种量为体积分数1~10%。
本发明通过调整和优化发酵工艺,在微生物发酵阶段直接降低产物分子量并提高了产物浓度,是一种高效低成本生产低分子量γ-聚谷氨酸的新工艺。通过分段发酵法直接在发酵阶段降低分子量并提高产物浓度,使低分子量γ-聚谷氨酸产量最大化,避免采用常规的酸解法,造成产量损失。本发明发酵生产的低分子量γ-聚谷氨酸产物浓度高达30-60g/L,分子量低至35-260KDa,常规发酵方法生产的γ-聚谷氨酸浓度约为15-30g/L,分子量约为1000KDa。低分子量γ-聚谷氨酸丰富了产品类别,扩大了γ-聚谷氨酸的应用市场,具有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
以下实施例中使用的发酵菌种枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGA-7,其保藏于中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为:CCTCC NO:M206102,该菌公开于专利号:ZL 200610122640.5,发明名称为:γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。
实施例1:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐中,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为1%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度36℃,通气流量2Nm3/h,搅拌速度50rpm,培养12h;第二阶段,温度35℃,通气流量加1倍,搅拌速度加1倍,继续培养48h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为31.2g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为230KDa。
实施例2:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为2%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度34℃,通气流量2Nm3/h,搅拌速度50rpm,培养12h;第二阶段,温度35℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养48h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为38.8g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为190KDa。
实施例3:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为3%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度34℃,通气流量4Nm3/h,搅拌速度100rpm,培养24h;第二阶段,温度35℃,通气流量加1倍,搅拌速度加1倍,继续培养72h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为46.1g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为110KDa。
实施例4:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后使用0.1μm微孔滤膜过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为4%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度34℃,通气流量4Nm3/h,搅拌速度100rpm,培养24h;第二阶段,温度35℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为49.8g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为95KDa。
实施例5:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后使用0.45μm微孔滤膜过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为5%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度35℃,通气流量4Nm3/h,搅拌速度100rpm,培养24h;第二阶段,温度37℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为58.9g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为45KDa。
实施例6:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为6%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度35℃,通气流量6Nm3/h,搅拌速度150rpm,培养12h;第二阶段,温度37℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为52.4g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为80KDa。
实施例7:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为7%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度35℃,通气流量6Nm3/h,搅拌速度150rpm,培养24h;第二阶段,温度37℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为55.7g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为60KDa。
实施例8:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L,调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为8%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度35℃,通气流量6Nm3/h,搅拌速度150rpm,培养24h;第二阶段,温度37℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为31.8g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为260KDa。
实施例9:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L,调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为9%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度30℃,通气流量8Nm3/h,搅拌速度150rpm,培养24h;第二阶段,温度35℃,通气流量加1倍,搅拌速度加1倍,继续培养72h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为34.3g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为240KDa。
实施例10:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L,调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为10%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度32℃,通气流量10Nm3/h,搅拌速度200rpm,培养24h;第二阶段,温度39℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养96h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为42.1g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为180KDa。
实施例11:
称取培养基各组分,混合后用去离子水溶解,使各组分终浓度为:柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L,调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm微孔滤膜各过滤除菌一次,得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐,接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中,接种量为2%(体积分数),采用分段发酵法进行培养。第一阶段,温度34℃,通气流量5Nm3/h,搅拌速度100rpm,培养12h;第二阶段,温度35℃,通气流量加2倍,搅拌速度加2倍,继续培养24h,得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为30.8g/L,通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为260KDa。
Claims (5)
1.一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中,采用分段发酵法进行培养:第一阶段,温度30-36℃,通气流量2-10Nm3/h,搅拌速度50-200rpm,培养12-24h;第二阶段,温度35-39℃,通气流量比第一阶段的增加1-2倍,搅拌速度比第一阶段的增加1-2倍,继续培养24-96h,由此得到低分子量γ-聚谷氨酸发酵液;
所述的发酵用培养基,每升含有柠檬酸10-20g、谷氨酸钠15-30g、甘油50-100g、硫酸镁0.01-0.1g、硫酸锰0.01-0.1g、氯化铁0.01-0.1g和氯化钙0.01-0.1g,余量为水,调pH至7.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7,其保藏编号为:CCTCC NO:M206102。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的发酵用培养基是采用过滤除菌,得到无菌的发酵用培养基。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的过滤除菌是使用孔径规格为0.1μm-0.45μm的微孔滤膜过滤1-3次。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中,其接种量为体积分数1~10%。
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Legal Events
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Application publication date: 20160203 Assignee: GUANGDONG DIMEI NEW MATERIAL TECHNOLOGY CO., LTD. Assignor: Guangzhou Demay Biological Technology Co., Ltd. Contract record no.: X2019980000143 Denomination of invention: Method for producing low-molecular-weight gamma-polyglutamic acid based on segmented fermentation Granted publication date: 20181120 License type: Exclusive License Record date: 20190911 |
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