CN105296558B - 一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分段发酵生产低分子量γ‑聚谷氨酸的方法。本发明通过微孔滤膜过滤除菌的方法制备发酵用培养基，然后接种枯草芽孢杆菌，采用分段发酵法进行培养：第一阶段，温度30‑36℃，通气流量2‑10Nm3/h，搅拌速度50‑200rpm，培养12‑24h；第二阶段，温度35‑39℃，通气量加1‑2倍，搅拌速度加1‑2倍，培养24‑96h；得到高产物浓度(30‑60g/L)、低分子量(35‑260KDa)的γ‑聚谷氨酸发酵液。本发明通过调整和优化发酵工艺，在微生物发酵阶段直接获得高浓度的低分子量产物，是一种高效低成本生产低分子量γ‑聚谷氨酸的新工艺。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种由微生物发酵产生的谷氨酸聚合物，具有保湿、维持皮肤弹性、提升天然保湿因子含量、美白肤色、促进营养成分吸收等功效，可通过微生物发酵进行工业生产。
γ-聚谷氨酸生物学功能与其相对分子量密切相关，低分子量产品在化妆品中应用广泛，但直接发酵产物分子量较大，必须经后期酸解降低分子量(目前降低分子量的主要方法)，这会造成含量(产物浓度)严重减少。直接发酵产物分子量较大(＞1000KDa)，用于化妆品添加影响肤感，因此需要低分子量产品(＜260KDa)。目前已报道多种获得低分子量γ-聚谷氨酸的方法，例如菌株筛选，但实验周期长、不确定性高；酶解法效率高，但还处于实验研究阶段；酸/碱水解法虽然在工业生产中最常用，但有数据表明酸水解后产物浓度会减少32％。因此上述方法均不适合工业生产。近年来不少研究发现，碳源、金属离子、发酵温度、搅拌速度等不仅会影响发酵产物γ-聚谷氨酸的产量，而且也影响到其相对分子量，但具体量效关系未见报道。因此，目前很需要一种能在不减少产物浓度的情况下，生产低分子量γ-聚谷氨酸的新工艺方法。
目前在售的γ-聚谷氨酸主要是高分子量级别，以台湾味丹公司的产品为代表。市场上低分子量γ-聚谷氨酸的产品非常少，产量质量也不高，生产能力有限，低分子量γ-聚谷氨酸产品市场仍处于开拓阶段，经济前景很好。
发明内容
本发明针对现有技术中低分子量γ-聚谷氨酸生产工艺繁琐、效率低的不足，以现有工业发酵菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7为研究对象，通过优化和控制发酵工艺，使菌株在发酵阶段直接产生低分子量产物，提供一种低成本高效的基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法。
本发明的基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中，采用分段发酵法进行培养：第一阶段，温度30-36℃，通气流量2-10Nm3/h，搅拌速度50-200rpm，培养12-24h；第二阶段，温度35-39℃，通气流量比第一阶段的增加1-2倍，搅拌速度比第一阶段的增加1-2倍，继续培养24-96h，由此得到低分子量γ-聚谷氨酸发酵液；
所述的发酵用培养基，每升含有柠檬酸10-20g、谷氨酸钠15-30g、甘油50-100g、硫酸镁0.01-0.1g、硫酸锰0.01-0.1g、氯化铁0.01-0.1g和氯化钙0.01-0.1g，余量为水，调pH至7.0-7.5。
所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102。
所述的发酵用培养基优选采用过滤除菌，得到无菌的发酵用培养基。所述的过滤除菌是使用孔径规格为0.1μm-0.45μm的微孔滤膜过滤1-3次。通过微孔滤膜过滤除菌的方法制备发酵用培养基，可防止常规蒸汽灭菌时高温破坏各营养组分，最大限度保持各组分活性，有利于分段发酵生产高浓度低分子量γ-聚谷氨酸。
所述的接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中，其接种量为体积分数1～10％。
本发明通过调整和优化发酵工艺，在微生物发酵阶段直接降低产物分子量并提高了产物浓度，是一种高效低成本生产低分子量γ-聚谷氨酸的新工艺。通过分段发酵法直接在发酵阶段降低分子量并提高产物浓度，使低分子量γ-聚谷氨酸产量最大化，避免采用常规的酸解法，造成产量损失。本发明发酵生产的低分子量γ-聚谷氨酸产物浓度高达30-60g/L，分子量低至35-260KDa，常规发酵方法生产的γ-聚谷氨酸浓度约为15-30g/L，分子量约为1000KDa。低分子量γ-聚谷氨酸丰富了产品类别，扩大了γ-聚谷氨酸的应用市场，具有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中使用的发酵菌种枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGA-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102，该菌公开于专利号：ZL 200610122640.5，发明名称为：γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。
实施例1：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐中，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为1％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度36℃，通气流量2Nm3/h，搅拌速度50rpm，培养12h；第二阶段，温度35℃，通气流量加1倍，搅拌速度加1倍，继续培养48h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为31.2g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为230KDa。
实施例2：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为2％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度34℃，通气流量2Nm3/h，搅拌速度50rpm，培养12h；第二阶段，温度35℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养48h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为38.8g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为190KDa。
实施例3：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为3％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度34℃，通气流量4Nm3/h，搅拌速度100rpm，培养24h；第二阶段，温度35℃，通气流量加1倍，搅拌速度加1倍，继续培养72h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为46.1g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为110KDa。
实施例4：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后使用0.1μm微孔滤膜过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为4％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度34℃，通气流量4Nm3/h，搅拌速度100rpm，培养24h；第二阶段，温度35℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为49.8g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为95KDa。
实施例5：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后使用0.45μm微孔滤膜过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为5％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度35℃，通气流量4Nm3/h，搅拌速度100rpm，培养24h；第二阶段，温度37℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为58.9g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为45KDa。
实施例6：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为6％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度35℃，通气流量6Nm3/h，搅拌速度150rpm，培养12h；第二阶段，温度37℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为52.4g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为80KDa。
实施例7：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为7％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度35℃，通气流量6Nm3/h，搅拌速度150rpm，培养24h；第二阶段，温度37℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为55.7g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为60KDa。
实施例8：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L，调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为8％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度35℃，通气流量6Nm3/h，搅拌速度150rpm，培养24h；第二阶段，温度37℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为31.8g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为260KDa。
实施例9：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L，调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为9％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度30℃，通气流量8Nm3/h，搅拌速度150rpm，培养24h；第二阶段，温度35℃，通气流量加1倍，搅拌速度加1倍，继续培养72h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为34.3g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为240KDa。
实施例10：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸10g/L、谷氨酸钠15g/L、甘油50g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、氯化铁0.01g/L和氯化钙0.01g/L，调节pH至7.0后依次使用0.1μm、0.22μm、0.45μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为10％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度32℃，通气流量10Nm3/h，搅拌速度200rpm，培养24h；第二阶段，温度39℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养96h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为42.1g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为180KDa。
实施例11：
称取培养基各组分，混合后用去离子水溶解，使各组分终浓度为：柠檬酸20g/L、谷氨酸钠30g/L、甘油100g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、氯化铁0.1g/L和氯化钙0.1g/L，调节pH至7.5后依次使用0.1μm、0.22μm微孔滤膜各过滤除菌一次，得到无菌的发酵用培养基。
将无菌的发酵用培养基加入发酵罐，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7至发酵用培养基中，接种量为2％(体积分数)，采用分段发酵法进行培养。第一阶段，温度34℃，通气流量5Nm3/h，搅拌速度100rpm，培养12h；第二阶段，温度35℃，通气流量加2倍，搅拌速度加2倍，继续培养24h，得到高浓度低分子量γ-聚谷氨酸发酵液。通过紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸产物浓度为30.8g/L，通过液相色谱法测定γ-聚谷氨酸产物分子量为260KDa。
Claims (5)
1.一种基于分段发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中，采用分段发酵法进行培养：第一阶段，温度30-36℃，通气流量2-10Nm3/h，搅拌速度50-200rpm，培养12-24h；第二阶段，温度35-39℃，通气流量比第一阶段的增加1-2倍，搅拌速度比第一阶段的增加1-2倍，继续培养24-96h，由此得到低分子量γ-聚谷氨酸发酵液；
所述的发酵用培养基，每升含有柠檬酸10-20g、谷氨酸钠15-30g、甘油50-100g、硫酸镁0.01-0.1g、硫酸锰0.01-0.1g、氯化铁0.01-0.1g和氯化钙0.01-0.1g，余量为水，调pH至7.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏编号为：CCTCC NO：M206102。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵用培养基是采用过滤除菌，得到无菌的发酵用培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的过滤除菌是使用孔径规格为0.1μm-0.45μm的微孔滤膜过滤1-3次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接种枯草芽孢杆菌于无菌的发酵用培养基中，其接种量为体积分数1～10％。
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Legal Events
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Application publication date: 20160203 Assignee: GUANGDONG DIMEI NEW MATERIAL TECHNOLOGY CO., LTD. Assignor: Guangzhou Demay Biological Technology Co., Ltd. Contract record no.: X2019980000143 Denomination of invention: Method for producing low-molecular-weight gamma-polyglutamic acid based on segmented fermentation Granted publication date: 20181120 License type: Exclusive License Record date: 20190911 |
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