JP6931879B2 - 酸化型コエンザイムｑ１０の発酵生産方法、及びそれにより製造された酸化型高含有コエンザイムｑ１０ - Google Patents
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Description
本願発明は、微生物の発酵分野に関し、具体的には、酸化還元電位ＯＲＰ（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の調整・制御によって、生産菌（例えば、ロドバクター・スフェロイデス、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から、高含有率（例えば、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上）の酸化型コエンザイムＱ１０を生産する発酵法に関する。
コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）は、ユビキノン、ユビデカレノンとも呼ばれ、その化学名が２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−デカプレニルである。コエンザイムＱ１０は、そのキノン環の酸化還元特性及びその側鎖の物理化学的性質に由来する生物活性を有し、細胞が自ら生み出した天然の酸化防止剤及び細胞代謝活性化剤であり、酸化の防止性、ラジカルの消去、生体の免疫力の向上、老化の防止等の機能を有するものである。臨床的応用において、心臓病、ガン、糖尿病、急性・慢性肝炎、パーキンソン病等の様々な疾患の治療に広く使用されており、食品、化粧品及び老化防止健康製品の面においても多用されている。
現在、微生物発酵法は、コエンザイムＱ１０の主な生産方法である。微生物発酵法によるコエンザイムＱ１０の生産は、製品の品質及び安全性において、大きな競争優位性を持っており、大規模な工業生産に適している。
微生物でコエンザイムＱ１０を生産する場合、その発酵段階は、一般的に次の２つの段階に分けられる。１）菌の成長段階（微生物の増殖段階とも呼ばれる）。この段階では、通常、微生物を急速に増殖させて生産が必要とする菌濃度となるように、急速に増殖するのに十分な酸素の供給及び栄養を維持する必要がある。それとともに、代謝物であるコエンザイムＱ１０の合成が迅速に開始する。２）コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階（合成段階と呼ばれることもある）。この段階では、発酵菌が酸素を急速に消費し、発酵液中の溶存酸素は通常、比較的に低い値となり、発酵微生物が酸素制限状態にある。このとき代謝物であるコエンザイムＱ１０は急速に合成され蓄積される。合成・蓄積段階は、発酵液中のコエンザイムＱ１０の力価変化に従って画分すると、通常、初期（コエンザイムＱ１０の力価が速く増加する曲線となる）、中期（コエンザイムＱ１０の力価の増加が緩やかになるが、明らかな増加傾向を保っている）及び後期（コエンザイムＱ１０の力価の増加曲線がほぼ平らになり、発酵時間につれて少しだけ増加する）に分けられる。一般に、コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の初期、中期及び後期の間の時間間隔は約１０〜２０時間である。
ＣＮ１０２８７６７４３Ｂに開示されているように、発酵過程を調整するために段階的酸素供給の制御策が採用され、発酵過程の菌成長段階及び合成・蓄積段階の初期において、酸素を多く供給することが採用され、菌の急速な成長及びコエンザイムＱ１０の合成の迅速開始を促進する。菌成長が安定期に入った（菌が明らかに増加しなくなる）後、酸素の供給を段階的に低減してコエンザイムＱ１０の比生産速度を高く維持し、基質であるグルコースの消費を減少させる。このような段階的な酸素供給パターンへの変更は、生産菌の最適な生理特性の状態をもたらし、コエンザイムＱ１０の生産コストを削減する。
微生物発酵によるコエンザイムＱ１０の生産過程において、当業者は、コエンザイムＱ１０の高生産率という目的を達成するために、通常、発酵液の菌種、溶存酸素、温度、圧力、培地、栄養素の追加速度等の影響要因を調節する。例えば、特許文献ＣＮ１０５４２０４１７Ａには、酸素消費速度（溶存酸素）および電気伝導率（栄養素の追加速度）を調節することで、相乗的にコエンザイムＱ１０の発酵過程を制御することを提案した。特許文献ＣＮ１０４５６１１５４Ａには、発酵過程における菌の形状を判断の根拠として、プロセスパラメータを調整することが開示された。特許文献ＣＮ１０３５０９７２９Ｂでは、ロドバクター・スフェロイデスを改良することによって、微生物のコエンザイムＱ１０を合成する能力を向上させた。これらのプロセスの共通の特徴は、生産されたコエンザイムＱ１０が、いずれも酸化型コエンザイムＱ１０と還元型コエンザイムＱ１０との混合物であり、かつ還元型コエンザイムＱ１０の割合が比較的高いことである。特に、特許文献ＵＳ７９１０３４０Ｂ２に記載されているプロセスでは、発酵終了後、微生物によって生産されたコエンザイムＱ１０のうち、還元型コエンザイムＱ１０の含有率は７０％以上であった。
酸化型コエンザイムＱ１０と還元型コエンザイムＱ１０とは細胞内で相互変換することができるので、種類を問わず、いずれのコエンザイムＱ１０も電子伝達体として関連の生理機能を発揮することができる。一方、酸化型コエンザイムＱ１０は比較的安定であり、保存が容易であるため、近年、酸化型コエンザイムＱ１０に対する市場のニーズはますます増加している。
上記特許文献ＣＮ１０５４２０４１７Ａ、ＣＮ１０４５６１１５４Ａ、ＣＮ１０３５０９７２９Ｂのいずれにおいても、微生物によって生産されたコエンザイムＱ１０を専門的に処理することで、還元型コエンザイムＱ１０を酸化型コエンザイムＱ１０に変換する報告がない。特許文献ＵＳ７９１０３４０Ｂ２には、後処理工程において、酸化することで、還元型コエンザイムＱ１０の大部分を酸化型コエンザイムＱ１０に変換できることが提案されているが、その後処理工程は複雑であり、コストが高い。また、従来技術には、微生物発酵法を用いて酸化型高含有コエンザイムＱ１０を直接生産する方法に関する報告もない。
本発明の目的は、従来の微生物発酵法により生産された酸化型コエンザイムＱ１０の比率が低く、後処理工程が複雑であるなどの問題を解決し、発酵液のＯＲＰを制御することによって、生産菌（例えば、ロドバクター・スフェロイデスＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から酸化型高含有コエンザイムＱ１０を生産する発酵生産方法を提供することにある。
本願は、以下の酸化型コエンザイムＱ１０の発酵生産方法に関する。
生産菌の発酵過程において、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを−５０〜３００ｍＶに制御し、好ましくは、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを５０〜２００ｍＶに制御することを特徴とする、酸化型コエンザイムＱ１０の発酵生産方法。
生産菌の発酵過程において、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを−５０〜３００ｍＶに制御し、好ましくは、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを５０〜２００ｍＶに制御することを特徴とする、酸化型コエンザイムＱ１０の発酵生産方法。
前記発酵生産方法において、前記発酵液の溶存酸素の量を制御する方式と、前記発酵液のｐＨを制御する方式の少なくとも一方によって発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御し、好ましくは、前記発酵液の溶存酸素の量を制御する方式と前記発酵液のｐＨを制御する方式とを組み合わせる。
前記発酵生産方法において、発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力を制御する方式と、発酵液の単位体積あたりの空気導入量を制御する方式と、発酵タンクの内圧を制御する方式の少なくとも一方によって前記発酵液中の溶存酸素の量を制御し、好ましくは、上記方式の２種以上を組み合わせて前記発酵液中の溶存酸素の量を制御する。
前記発酵生産方法において、前記発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力が０．２５〜０．５０ｋｗ／ｍ３であり、前記発酵液の単位体積あたりの空気導入量が１．０〜１５．０ｖｖｍであり、及び／又は前記発酵タンクの内圧が０．０５〜０．３ＭＰａであり、好ましくは、前記発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力が０．３０〜０．４０ｋｗ／ｍ３であり、前記発酵液の単位体積あたりの空気導入量が５．０〜８．０ｖｖｍであり、及び／又は前記発酵タンクの内圧が０．０８〜０．１５ＭＰａである。
前記発酵生産方法において、前記発酵液のｐＨを３．５〜６．０に制御することによって前記発酵液のｐＨを制御し、好ましくは、前記発酵液のｐＨを４．０〜５．０に制御することによって前記発酵液のｐＨを制御し、より好ましくは、酸又はアルカリを添加することによって前記発酵液のｐＨを制御し、さらに好ましくは、前記酸又は前記アルカリを段階的又は連続的に添加することによって前記発酵液のｐＨを制御する。
前記発酵生産方法において、前記酸が有機酸又は無機酸であり、及び／又は前記アルカリが有機アルカリ又は無機アルカリであり、好ましくは、前記酸がリン酸、塩酸、硫酸、乳酸、プロピオン酸、クエン酸、及びシュウ酸のうちの１種又は２種以上であり、及び／又は好ましくは、前記アルカリがアンモニア水、水酸化ナトリウム、および液体アンモニアのうちの１種又は２種以上であり、より好ましくは、前記酸がリン酸、乳酸、又はクエン酸であり、及び／又は前記アルカリがアンモニア水、又は液体アンモニアである。
前記発酵生産方法において、発酵過程中におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階において発酵液のＯＲＰを制御し、好ましくは、発酵過程中におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の中後期において発酵液のＯＲＰを制御し、より好ましくは、発酵過程中におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の後期において発酵液のＯＲＰを制御する。
前記発酵生産方法において、前記発酵過程において、前記発酵液の電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに制御し、好ましくは、菌の成長段階において、酸素消費速度を３０〜１５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、かつ前記発酵液の電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに制御し、より好ましくは、コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階において、酸素消費速度を６０〜１２０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、かつ前記発酵液の電気伝導率を８．０〜１５．０ｍｓ／ｃｍに制御する。
前記発酵生産方法において、前記生産菌がロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）であり、好ましくは、前記ロドバクター・スフェロイデスが自然界から選択された菌株、物理又は化学的変異誘発法により育種された菌株、又は遺伝子工学法により改良された菌株であり、より好ましくは、前記ロドバクター・スフェロイデスが受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７のロドバクター・スフェロイデス菌株、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８のロドバクター・スフェロイデス菌株、又は受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９のロドバクター・スフェロイデス菌株である。
前記発酵生産方法において、前記コエンザイムＱ１０が酸化型高含有コエンザイムＱ１０であり、かつ、好ましくは、前記酸化型高含有コエンザイムＱ１０中の酸化型コエンザイムＱ１０の含有率が９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
本願はさらに上記方法により製造されたコエンザイムＱ１０に関する。前記コエンザイムＱ１０は酸化型高含有コエンザイムＱ１０であり、かつ、好ましくは、前記酸化型高含有コエンザイムＱ１０における酸化型コエンザイムＱ１０の含有率が９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
前記方法により製造されたコエンザイムＱ１０において、前記コエンザイムＱ１０は食品、機能性栄養食品、特別健康食品、栄養補給剤、栄養品、動物用医薬品、飲料、飼料、化粧品、医薬品、薬剤、予防薬の製造に用いられる。
本願は、少なくとも以下の効果を奏する酸化型高含有コエンザイムＱ１０の発酵生産方法を提供する。
発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御することによって、微生物によって生産されるコエンザイムＱ１０は、酸化型コエンザイムＱ１０の含有率が９６％以上に達することができ、生成物の構成が比較的簡単で、後処理が容易となる。酸化型コエンザイムＱ１０は還元型コエンザイムＱ１０よりも安定であり、酸化型高含有コエンザイムＱ１０は、従来の発酵生産により得られたコエンザイムＱ１０に比べて、生体内で分解される量が低い。さらに、本願の発酵法は力価が高い。
本願は、発酵過程における発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御することによって、酸化型高含有コエンザイムＱ１０を生産するという酸化型高含有コエンザイムＱ１０の発酵生産方法を提供する。ＯＲＰが−５０〜３００ｍＶに制御され、好ましくは発酵液のＯＲＰが５０〜２００ｍＶに制御される。
本発明の方法に適する菌株は、特に限定されず、コエンザイムＱ１０を生産する既存の生産菌を使用してもよく、常法または遺伝子工学法により改良されたエンジニアリング菌を使用してもよい。
好ましくは、コエンザイムＱ１０の発酵生産に用いる前記菌株は、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）である。ロドバクター・スフェロイデスは、紅色細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の球菌（ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）種に属する光合成細菌である。
より好ましくは、前記ロドバクター・スフェロイデスは、自然界から選択された菌株、物理又は化学的変異誘発法により育種された菌株、又は遺伝子工学法により改良された菌株である。さらに好ましくは、コエンザイムＱ１０の発酵生産に用いる菌株は、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７のロドバクター・スフェロイデス菌株、又は受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８のロドバクター・スフェロイデス菌株、又は受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９のロドバクター・スフェロイデス菌株である。
従来技術では、コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階で、コエンザイムＱ１０の歩留まりを高く維持するために、発酵液のＯＲＰは−１５０〜−３００ｍＶに制御されることが一般的である。細菌自体の生理作用により、発生されたコエンザイムＱ１０は酸化型と還元型との混合物として存在し、その中で、還元型は７０％程度を占める。本願は、発酵液のＯＲＰを制御することにより、発酵微生物によって酸化型コエンザイムＱ１０を生産する方法を提供する。本願において、ＯＲＰを−５０〜３００ｍＶに制御し、発酵菌によって発生された酸化型コエンザイムＱ１０の割合は９６％以上に達した。前記方法のメカニズムは図１に示されている。ロドバクター・スフェロイデス内に電子伝達を行うＮＡＤ＋⇔ＮＡＤＨサイクルが存在し、ロドバクター・スフェロイデスの代謝にエネルギーを提供する。還元状態のＮＡＤＨが提供する還元力は、細胞体内の酸化型コエンザイムＱ１０が還元型コエンザイムＱ１０に変換する必須条件の１つである。発酵液の環境は細胞内のＮＡＤ＋⇔ＮＡＤＨサイクルに極めて大きな影響を与え、その中で、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰが重要な指標である。一般的には、発酵液のＯＲＰ値が−１５０〜−３００ｍｖであり、即ち、発酵液が還元条件下にある場合、ロドバクター・スフェロイデスが生産するコエンザイムＱ１０はほとんど還元型コエンザイムＱ１０である。発酵液のＯＲＰを高めることによって、発酵液環境の酸化性が強くなり、これによりＮＡＤ＋がＮＡＤＨへの変換が阻害される。ロドバクター・スフェロイデスが生産するコエンザイムＱ１０はＮＡＤＨによる十分な還元力が欠如している条件下において、酸化型コエンザイムＱ１０から還元型コエンザイムＱ１０への変換も極めて大きく影響され、その結果、酸化型コエンザイムＱ１０が細胞内で大量に生成する。
上述した酸化型高含有コエンザイムＱ１０の発酵生産方法は、微生物発酵の全過程に適している。好ましくは、上記方法はコエンザイムＱ１０の合成・蓄積の段階で使用する。さらに、発酵過程におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の中期と後期において発酵液のＯＲＰを制御する。さらに好ましくは、発酵過程におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の後期において発酵液のＯＲＰを制御する。
上記方法において、発酵液のＯＲＰ値の制御は、発酵過程における発酵液の溶存酸素またはｐＨを制御することによって、あるいは発酵液の溶存酸素およびｐＨをともに制御することによって行われる。好ましくは、発酵液のＯＲＰ値の制御は、発酵液の溶存酸素およびｐＨをともに制御することによって行われる。
発酵過程における溶存酸素濃度の変化は、酸素供給速度と酸素消費速度との動的バランスである。本願において、発酵タンクの単位体積当たりの撹拌動力の制御、発酵液の単位体積当たりの空気導入量の制御、または発酵タンクの内圧の制御、あるいはこれら３つをランダムに組み合わせる方式により、発酵液中の酸素供給を増加させ、これにより発酵液中の溶存酸素（溶解酸素）を高め、発酵液のＯＲＰ値を−５０〜３００ｍｖとなるようにする。その中で、好ましくは、発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力を０．２５〜０．５０ｋｗ／ｍ３に制御し、発酵液の単位体積あたりの空気導入量を１．０〜１５．０ｖｖｍに制御し（ここで、ｖｖｍとは、空気体積（ａｉｒ ｖｏｌｕｍｅ）／発酵液体積（ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）／ｍｉｎ（分）であり、即ち、１分あたりの空気導入量と発酵タンク内の実際の発酵液体積との比を指す）、発酵タンクの内圧を０．０５〜０．３ＭＰａに制御する。より好ましくは、発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力を０．３０〜０．４０ｋｗ／ｍ３に制御し、発酵液の単位体積あたりの空気導入量を５．０〜８．０ｖｖｍに制御し、発酵タンクの内圧を０．０８〜０．１５ＭＰａに制御する。
本願において、また、発酵液のＯＲＰ値が−５０〜３００ｍｖになるように発酵液ｐＨを制御することが好ましい。例えば、ｐＨを３．５〜６．０に制御することができ、より好ましくは、ｐＨを４．０〜５．０に制御する。また、酸又はアルカリの添加によりｐＨの制御を行うことが好ましい。前記酸は、発酵液のｐＨ調整に慣用される通常の酸であってもよく、リン酸、塩酸、硫酸、乳酸、プロピオン酸、クエン酸、シュウ酸のうちの１種又は２種以上であることが好ましい。前記アルカリは、発酵液のｐＨ調整に慣用される通常のアルカリであってもよく、アンモニア水、水酸化ナトリウム、液体アンモニアのうちの１種又は２種以上であることが好ましい。好ましくは、前記酸は、リン酸、乳酸、クエン酸であり、前記アルカリは、アンモニア水、液体アンモニアである。発酵菌への激しい影響を回避するために、酸又はアルカリを分けて添加する又は連続添加することによって発酵液のｐＨを制御してもよい。
前記方法において、発酵菌への栄養供給を維持するために、発酵液の電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに制御する。その中で、発酵液の電気伝導率の制御は、流加培地によって行われる。本発明に用いる培地は特に限定されず、炭素源、窒素源、リン源及び微量栄養素を含有する様々な通常の培地であってもよい。例えば、前記流加培地の配合は、流加液１Ｌあたりに酵母粉末８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸二水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素二カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値が７．０である。
前記発酵法において、発酵過程における温度は、本願の効果に影響を及ぼさない限り、特に限定されない。生産菌がより多くの酸化型コエンザイムＱ１０を生産することができる観点から、温度を２５〜３５℃に制御することが好ましい。
本願において、コエンザイムＱ１０の発酵生産前の種培養段階では、当業界の通常の培養手段を使用することができる。好ましくは、特許ＣＮ１０５４８３１７１Ａに記載の培養方法を参照することができる。具体的には、種培養段階では、Ｆｅ２＋濃度が０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの培地を用い、ロドバクター・スフェロイデス菌株は蘇生、および種培養基による拡大培養を経た後、選別して発酵種を得る。本発明の方法に用いる種培地の配合は特に限定されず、炭素源、窒素源、リン源及び微量栄養素を含有する様々な通常の培地であってもよい。例えば、前記種培地は、ＣＮ１０５４８３１７１Ａに開示されているように、培地１Ｌ当たりにはＦｅ２＋０．１〜０．５ｍｏｌに加え、酵母粉末１ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、クエン酸鉄０．００２８ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇがさらに含まれ、ｐＨ値が７．０に調節された。
本願発明において、発酵過程におけるロドバクター・スフェロイデスの菌成長段階において、好ましくはさらにコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の初期及び／又は中期において、当業界の通常手段に本願の手段を組み合わせて行うことができる。好ましくは、特許ＣＮ１０５４２０４１７Ａを参照し、酸素消費速度及び電気伝導率のオンライン制御と本願の手段と併用して実施する。ここで、酸素消費速度は攪拌の回転速度および空気導入量によって調整し、前記電気導電率は流加供給または回分供給によって調整する。具体的には、ロドバクター・スフェロイデス菌の成長段階で、酸素消費速度を３０〜１５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御するとともに、電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに維持する。コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階では、酸素消費速度を６０〜１２０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御するとともに、電気伝導率を８．０〜１５．０ｍｓ／ｃｍに維持する。発酵段階で用いる培地は、炭素源、窒素源、リン源及び微量栄養素を含有する当業界の通常培地である。例えば、培地１Ｌ当たりにおいて、酵母粉末８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇであり、ｐＨ値が７．０である。
ロドバクター・スフェロイデスの例
受託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９であり、受託機関は中国微生物菌種受託管理委員会普通微生物センターであり、受託機関のアドレスは北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所であり、受託日は２０１２年４月１３日であり、公開特許はＣＮ１０５４２０４１７（Ａ）であり、公開日は２０１６年０３月２３日である。
受託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９であり、受託機関は中国微生物菌種受託管理委員会普通微生物センターであり、受託機関のアドレスは北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所であり、受託日は２０１２年４月１３日であり、公開特許はＣＮ１０５４２０４１７（Ａ）であり、公開日は２０１６年０３月２３日である。
また、上記３つの菌株はＣＮ１０５４８３１７１Ａ（２０１６年０４月１３日）にも開示されている。ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８はＣＮ１０３５０９７２９Ａ（２０１４年０１月１５日）に開示されている。
以下は、具体的な実施例を用いて本発明をさらに詳述する。しかし、本発明は、下記実施例によって制限されない。
菌種及び発酵前培養
菌種：ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）で、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８、又はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９である菌株。
菌種：ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）で、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８、又はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９である菌株。
発酵前培養：培養済みの斜面を無菌水で洗浄し、菌濃度が１ｍｌあたりに１０８〜１０９個細胞である細菌懸濁液を調製し、マザーフラスコの培地１００ｍｌに２ｍｌ接種し、３２℃、回転速度１８０ｒｐｍで種培養を２８〜３０時間行った。
種培地（ｇ／Ｌ）：酵母粉末１ｇ、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、クエン酸鉄２．８ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．２５ｇ、ＣａＣｌ２ ０．１ｇ、ビオチン０．５μｇ、ｐＨ７．０。
上記種培養により得られたロドバクター・スフェロイデス菌株を発酵タンクに接種する接種量は、当業界での通常量とすればよく、例えば、１０〜３００ｍｌであり、好ましくは２５〜２００ｍｌであり、より好ましくは５０〜１００ｍｌである。必要に応じて接種量を調整することができる。
力価の測定：試料の調製：窒素雰囲気下で、発酵液１ｍｌを取って１０ｍｌの遠心分離管に入れて、１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌを１８０μｌ添加し、均一に混合し、３〜５分間静置した後、９２℃の水浴下に放置して３０分間加熱した。遠心して上清を除去し、抽出液（酢酸エチル：エタノール＝５：３）を８ｍｌ加え、抽出を２時間行い、逆相ＨＰＬＣ測定を行った。高速液体クロマトグラフィー条件：Ｃ１８カラム：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、移動相：メタノール：イソプロパノール＝７５：２５（体積基準で）、流量：１．００ｍｌ／分、検出波長：２７５ｎｍ、注入量：４０μｌ。保持時間は１２分であった。
酸化型コエンザイムＱ１０の含有量の測定：試料の調製：窒素雰囲気下で、発酵液１ｍｌを取って〜１０ｍｌの遠心分離管に入れて、１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌを１８０μｌ添加し、均一に混合し、３〜５分間静置した後、９２℃の水浴下に放置して３０分間加熱した。遠心して上清を除去し、抽出液（酢酸エチル：エタノール＝５：３）を８ｍｌ加え、抽出を２時間行い、逆相ＨＰＬＣ測定を行った。高速液体クロマトグラフィー条件：カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、移動相：メタノール／ｎ−ヘキサン＝８５：１５（体積基準で）、流量：１ｍＬ／分、検出波長：２７５ｎｍ、注入量：４０μｌ。保持時間は、還元型コエンザイムＱ１０が１３．５分であり、酸化型コエンザイムＱ１０が２２．０分であった。
（実施例１）
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９８を、発酵培地が添加された５Ｌの発酵タンクに５０ｍｌ接種して発酵を開始し、発酵タンクの酸素供給条件として、発酵液単位体積当たりの空気導入量を１．０ｖｖｍに制御し、単位体積当たりの攪拌動力を０．２５ｋｗ／ｍ３に制御し、発酵タンクの内圧を０．１ＭＰａに制御しながら、液体アンモニアを流加して発酵液のｐＨ値を７．０程度に制御した。
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９８を、発酵培地が添加された５Ｌの発酵タンクに５０ｍｌ接種して発酵を開始し、発酵タンクの酸素供給条件として、発酵液単位体積当たりの空気導入量を１．０ｖｖｍに制御し、単位体積当たりの攪拌動力を０．２５ｋｗ／ｍ３に制御し、発酵タンクの内圧を０．１ＭＰａに制御しながら、液体アンモニアを流加して発酵液のｐＨ値を７．０程度に制御した。
発酵培地は、培地１Ｌあたりに酵母粉末８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
流加培地によって、発酵過程にわたって導電率を１２ｍｓ／ｃｍ程度に制御した。前記流加培地は、流加液１Ｌあたりに酵母粉末８ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、硫酸マグネシウム１ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇ、塩化カルシウム１ｇ、ビオチン０．０１３ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
１５時間連続発酵後、発酵液のＯＲＰ値を測定したところ、−３５ｍｖであった。発酵液の一部を取り、不活性ガス雰囲気下で抽出及び測定（前述の力価の測定及び含有量の測定を参照）を行ったところ、細胞中の酸化型コエンザイムＱ１０と還元型コエンザイムＱ１０との含有率の比は９６．５：３．５であった。
本実施例において、高い酸素供給量を常に維持し、かつ高い撹拌動力及びタンク圧を維持することで、発酵液中の溶存酸素は常に高い値に維持され、発酵液のＯＲＰ値は常に−３５ｍｖ以上であり、発酵液中の微生物は常に成長増殖の状態にあった。測定結果により、発酵液のＯＲＰ値が一定値以上に維持されている場合、菌の成長段階で発酵微生物が生産するのは酸化型高含有コエンザイムＱ１０であることが確認された。
（実施例２）
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９を、発酵培地が添加された５Ｌの発酵タンクに４０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．４５ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９を、発酵培地が添加された５Ｌの発酵タンクに４０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．４５ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
発酵培地は、培地１Ｌあたりに酵母粉末８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
流加培地は、流加液１Ｌあたりに酵母粉末１０ｇ、硫酸アンモニウム８ｇ、硫酸マグネシウム１．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、塩化カルシウム１ｇ、ビオチン０．０２０ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
発酵液中の溶存酸素が低減しなくなることを検出した後、発酵液のｐＨが４．０程度になるように一定量のリン酸を１時間かけて徐々に連続添加した後、液体アンモニアを流加してｐＨを４．０程度に安定し、発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量、単位体積あたりの撹拌動力、タンク圧をそのまま保ち、発酵液の電気伝導率が１２ｍｓ／ｃｍであった。ｐＨが安定した後、発酵液のＯＲＰ値を測定したところ、５８〜１３５ｍｖであった。
１０時間後、発酵液の一部を取り、不活性ガス雰囲気下で抽出及び測定を行ったところ、細胞中の酸化型コエンザイムＱ１０と還元型コエンザイムＱ１０との含有率の比は９７．３：２．７であった。
本実施例において、発酵液中の溶存酸素が低減しなくなった後、発酵過程はコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階に入った。コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の初期において、ｐＨ値の調節を行った。最終測定結果によって、ｐＨ値の調節によりＯＲＰ値を制御することで、発酵微生物がコエンザイムＱ１０の合成・蓄積の初期において酸化型高含有コエンザイムＱ１０を効率的に生産することを可能にすることは示された。
（実施例３）
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７を、発酵培地が添加された１０Ｌの発酵タンクに９０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．６ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７を、発酵培地が添加された１０Ｌの発酵タンクに９０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．６ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
発酵培地は、培地１Ｌあたりに酵母粉末８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
流加培地は、流加液１Ｌあたりに酵母粉末１２ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ、塩化ナトリウム６ｇ、リン酸二水素カリウム４ｇ、リン酸水素二カリウム４ｇ、塩化カルシウム２ｇ、ビオチン０．０２５ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
発酵液中の溶存酸素が低減しなくなることを検出した後、発酵液のｐＨが５．０程度になるように一定量のリン酸を１時間かけて徐々に連続添加した後、液体アンモニアを流加してｐＨを５．０程度に安定しながら、発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を５．０ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．３ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０８ＭＰａに制御した。ｐＨが安定した後、発酵液のＯＲＰ値は１００〜２１０ｍＶに維持された。
１０時間後、発酵液の一部を取り、不活性ガス雰囲気下で抽出及び測定を行ったところ、細胞中の酸化型コエンザイムＱ１０と還元型コエンザイムＱ１０との含有率の比は９９．１：０．９であった。
本実施例において、発酵液の酸素供給条件及び発酵液のｐＨ値をともに制御することによって発酵液のＯＲＰ値を制御した。同様に、本実施例では、発酵過程のコエンザイムＱ１０合成・蓄積段階で制御が行われ、生産された酸化型コエンザイムＱ１０の割合が９９．１％に達した。
（実施例４）
１）３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９を、発酵培地が添加された１０Ｌの発酵タンクに１２０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．４ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。酸素消費速度を５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
１）３０℃で、種培養から得られたロドバクター・スフェロイデス菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９を、発酵培地が添加された１０Ｌの発酵タンクに１２０ｍｌ接種して発酵を開始した（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．４ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．１ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０２ＭＰａに制御した）。酸素消費速度を５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０程度に制御した。
発酵培地は、培地１Ｌあたりに酵母粉末８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、リン酸二水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素二カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
流加培地は、流加液１Ｌあたりに酵母粉１２ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ、塩化ナトリウム６ｇ、リン酸二水素カリウム４ｇ、リン酸水素二カリウム４ｇ、塩化カルシウム２ｇ、ビオチン０．０２５ｇに含有し、ｐＨ値は７．０に調節した。
２）１５時間後、酸素供給を増加させ（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．６ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．２ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０４ＭＰａに制御した）、酸素消費速度が７０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に上昇した後安定しており、発酵液の電気伝導率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０に制御し、発酵を継続した。このとき、発酵は菌の成長段階にあった。
３）２０時間後、酸素供給を再度増加させ（発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を０．８ｖｖｍに制御し、単位容積あたりの撹拌動力を０．２ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．０５ＭＰａに制御した）、酸素消費速度が９０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に上昇した後安定しており、発酵液の電気導電率は１２ｍｓ／ｃｍであり、ｐＨ値は７．０に制御して発酵を継続した。このとき、発酵は菌の成長段階にあった。
４）１０時間後、酸素消費速度を７０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）程度に維持し、発酵液の電気伝導率を１２ｍｓ／ｃｍに制御し、ｐＨを６．０程度に制御し、発酵を継続した。このとき、発酵はコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の初期にあった。
５）２０時間後、このときの発酵力価は一定になる傾向にあり、発酵はコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の後期に入った。発酵タンクの発酵液の単位体積あたりの空気導入量を６．０ｖｖｍに制御し、単位体積あたりの撹拌動力を０．２ｋｗ／ｍ３に制御し、タンク圧を０．１ＭＰａに制御した。リン酸を連続的に添加することによって、約２時間かけてｐＨを３．５程度に調節し、発酵液の電気伝導率を１２ｍｓ／ｃｍに制御し、発酵を継続した。安定になった後、発酵液のＯＲＰ値は１００〜２００ｍＶに維持された。
６）１５時間後、発酵を停止し、発酵液の一部を取り、不活性ガス雰囲気下で抽出及び測定を行ったところ、力価は３１８２ｍｇ／Ｌであり、酸化型コエンザイムＱ１０：還元型コエンザイムＱ１０は９９．３：０．７であった。
本実施例において、発酵過程のコエンザイムＱ１０合成・蓄積段階の後期において発酵液のＯＲＰ値を制御した。酸化型高含有コエンザイムＱ１０を効率的に生産したとともに、発酵微生物の力価も大幅に向上した。
本願の酸化型コエンザイムＱ１０の発酵生産方法では、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御することによって、微生物によって生産されたコエンザイムＱ１０中の酸化型コエンザイムＱ１０の含有率が９６％以上になることができ、後処理が容易である。
生産された酸化型高含有コエンザイムＱ１０は還元型コエンザイムＱ１０と比較して安定であり、食品、機能性栄養食品、特別健康食品、栄養補給剤、栄養品、動物用医薬品、飲料、飼料、化粧品、医薬品、薬剤、予防薬の製造に用いられることができる。
Claims (13)
- 受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９７のロドバクター・スフェロイデス菌株、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９８のロドバクター・スフェロイデス菌株、及び受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．５９９９のロドバクター・スフェロイデス菌株からなる群より選ばれるメンバーを含む発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを、発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力を０．２５〜０．５０ｋｗ／ｍ３に制御する方式と、発酵タンクにおける発酵液の単位体積あたりの空気導入量を１．０〜１５．０ｖｖｍに制御する方式と、発酵タンクの内圧を０．０５〜０．３ＭＰａに制御する方式との少なくとも１つによって、−５０〜３００ｍＶに制御すること、及び
ｐＨ値が７．０であり１Ｌあたり０．０１３〜０．０２５ｇのビオチンを含む流加培地を、前記発酵液に加えることによって、前記発酵液の電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに維持すること、を含む、
発酵タンクにおける酸化型コエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 発酵液の溶存酸素の量を調節する方式と、発酵液のｐＨを制御する方式の少なくとも一方により、
発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを制御する、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記発酵液のｐＨを３．５〜６．０に制御することによって前記発酵液のｐＨを制御する、
請求項２に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 発酵過程におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階において発酵液のＯＲＰを制御する、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記コエンザイムＱ１０が、酸化型高含有コエンザイムＱ１０である、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 生産菌の発酵過程において、発酵液の酸化還元電位ＯＲＰを５０〜２００ｍＶに制御する、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記発酵タンクの単位体積あたりの撹拌動力が０．３０〜０．４０ｋｗ／ｍ３であり、前記発酵液の単位体積あたりの空気導入量が５．０〜８．０ｖｖｍであり、及び／又は、前記発酵タンクの内圧が０．０８〜０．１５ＭＰａである、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記発酵液のｐＨを４．０〜５．０に制御することによって前記発酵液のｐＨを制御する、
請求項３に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 酸又はアルカリを段階的又は連続的に添加することによって前記発酵液のｐＨを制御する、
請求項３に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記酸がリン酸、塩酸、硫酸、乳酸、プロピオン酸、クエン酸、及びシュウ酸のうちの１種又は２種以上であり、及び／又は、前記アルカリがアンモニア水、水酸化ナトリウム、および液体アンモニアのうちの１種又は２種以上である、
請求項９に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 前記酸がリン酸、乳酸、又はクエン酸であり、及び／又は、前記アルカリがアンモニア水、又は液体アンモニアである、
請求項１０に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 発酵過程におけるコエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階の中期又は後期において発酵液のＯＲＰを制御する、
請求項４に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。 - 菌の成長段階において、酸素消費速度を３０〜１５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、かつ前記発酵液の電気伝導率を５．０〜３０．０ｍｓ／ｃｍに制御する、及び／又は、
コエンザイムＱ１０の合成・蓄積段階において、酸素消費速度を６０〜１２０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）に制御し、かつ前記発酵液の電気伝導率を８．０〜１５．０ｍｓ／ｃｍに制御する、
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵生産方法。
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