CN1246450C - 壳聚糖酶生产菌及低聚壳聚糖的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用微生物培养得到壳聚糖酶和生产低聚壳聚糖(或称氨基寡糖素、壳寡聚糖)的方法，所述的微生物是从海滩上获得的芽孢杆菌，获得菌种后诱导产酶发酵的方法是加入适量壳聚糖和氮源、无机营养盐的溶液中，在常温下培养30-40小时即可得到具有高活性的壳聚糖酶制剂，酶解产糖的方法是将酶液与壳聚糖溶液按一定比例混匀，在十分温和的条件下进行酶解反应，短时间内(4-12小时)即可将壳聚糖转化为低聚壳聚糖，浓缩或干燥得到产品。该方法的菌种遗传性稳定，产酶率高，发酵及酶解条件常规化、速度快，产品质量好。

Description

壳聚糖酶生产菌及低聚壳聚糖的生产方法

技术领域

本发明涉及壳聚糖的降解方法，特别是能产生高活性壳聚糖酶的微生物以及利用该微生物和其产生的高活性壳聚糖酶对壳聚糖进行降解，使之得到性能优异的水溶性低聚壳聚糖的生产方法。

技术背景

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基的产物，它在工业、农业、特别是食品、医药等领域都具有重要的应用价值。但由于壳聚糖分子量大、水溶性差、不易被人体或动物吸收，使其应用受到限制。而壳聚糖经降解后得到的低聚壳聚糖(又称甲壳低聚糖、壳寡糖、氨基寡糖素等)，其聚合度(D.P.)一般为2-20。这种低聚合度的水溶性壳聚糖具有多种优异的性能，除了作为人体的功能性食品和作为纺织、造纸等轻工业原料外，近年来发现其更具有促进脾脏抗体生成、抑制肿瘤细胞生长的生理功能；可有效地降低肝脏和血清中的胆固醇以及降低血压、血糖和血脂；增强免疫力和抗疾病的能力；强化肝脏功能，防止痛风和胃溃疡；促进双歧杆菌的增殖，抑制大肠杆菌及引起肠内感染的一些其它细菌的生长；抑制成人病的发生等。

在农业上，低聚合度的壳聚糖可作为性能良好的水果和食物保鲜剂，有专利文献报道，将降解的壳聚糖加入适量的杀菌剂，能使荔枝、芒果、草莓、龙眼等难保鲜的水果在常温下保鲜10-15天；将其单独使用或与一些农药组合，可作为植物诱导抗病剂和植物生长调节剂。

在日用工业上，将低聚合度的壳聚糖与聚乙烯、聚丙烯等塑料混炼，可得到生物降解塑料，这种降解塑料强度和生物降解性能优于掺入变性淀粉的降解塑料；低聚合度的壳聚糖还可以作为优良的纺织助剂和造纸助留剂等。总之随着科学的进步，低聚壳聚糖将会得到越来越广泛的应用。

怎样制备性能优异的低聚壳聚糖，多年来一直是化学家和生物学家的研究热点，通常的降解壳聚糖的方法有化学法、物理法和生物法。生物法又通常称为酶法，它优于化学法和物理法，其原因是酶法降解可特异性地、选择性地切断β-(1，4)-糖苷键，降解过程和降解产物的分子量易于控制，条件也比较温和，因而可以方便地对降解过程进行监控，得到所需分子量分布范围的低聚壳聚糖。降解过程不需要加入大量的试剂，对环境基本不会造成污染。目前已发现多种酶可降解壳聚糖，其中包括专一性酶如壳聚糖酶、非专一性酶如纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等。

公开文献报道了一些壳聚糖酶的制备，主要是从一些微生物中经过筛选，选择那些能以壳聚糖为原料的，培养条件不复杂的，又可得到高活性壳聚糖酶的菌种，如《工业微生物》2002年第12期公开了经过筛选出的假单孢菌作为产生壳聚糖酶的菌种，以及培养条件包括温度、PH、时间、接种量对产酶的影响，其酶活力一般可达0.4u/ml左右。《中国海洋药物》1999年第2期以球孢白僵菌作为产生壳聚糖酶的菌种，其种子培养基为PDA培养基，固体诱导培养基采用蛋白胨、胶体壳聚糖、马铃薯、琼脂等，复筛液体培养基采用硫酸盐、胶体壳聚糖以及蛋白胨、酵母膏等。按此方法得到的壳聚糖酶活力为0.2u/ml。

技术内容

本发明人多年来一直从事对壳聚糖酶的研究，1993年在《微生物学通报》上发表了对球孢白僵菌产生酶的文章，最早认识到球孢白僵菌对壳聚糖的降解作用，但这种菌由于产生的壳聚糖酶活力较低，还不能应用于酶解法制备低聚壳聚糖的工业化生产。本发明人于是又重新寻找适合壳聚糖作为培养基诱导物的菌种，经过多年的艰苦探索和试验，终于在自然界(我国沿海地区的海滩上)寻找到一些菌株，采集后进行了初步试验，终于发现了一株能在以壳聚糖和甲壳素为唯一碳、氮源的培养基中生长，并分泌出几丁质酶(chitinase)和壳聚糖酶(chitosanase)的优良菌株来。

经对上述筛选出来的优良菌株在诱导培养基中培养，其诱导物为壳聚糖，发现其分泌出的壳聚糖酶具有较高的活性和十分稳定的遗传性，初步鉴定为芽孢杆菌。

本申请人目前已将该菌种送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2002年8月16日，保藏编号为0790，建议的分类命名为芽孢杆菌。

该芽孢杆菌的表面特征是：芽孢囊膨大，芽孢椭圆形，芽孢一般次端生，革兰氏阳性。在PDA培养基上生长，菌落的颜色由白色转变为棕黄色。

本发明的壳聚糖酶生产菌的菌种培养以及低聚壳聚糖的生产方法如下：

先将上述提及的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为0790的壳聚糖酶产生菌扩大培养，再用两步法制备低聚壳聚糖：第一步使用诱导产酶发酵，制备粗制液体型壳聚糖酶制剂；第二步使用第一步产生的粗制壳聚糖液体型酶制剂对壳聚糖溶液进行降解，制备低聚壳聚糖。

上述所说壳聚糖酶产生菌的扩大培养是将筛选的菌种在介质中培养，培养的介质可以是固体培养基或液体培养基。所述的固体培养基为PDA培养基，或者由豆饼粉、麸皮、壳聚糖和无机盐组成的培养基，其中重量百分含量为：豆饼粉1-5％，麸皮1-3％，玉米粉或薯类淀粉1-5％，钙、铁、铵盐，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％，其余为壳聚糖粉。

所述的液体培养基为CTNP培养基：氯化钾、氯化钠、硫酸镁各0.05-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％及适量的钙、铁、铵盐，其含量各占0.01-0.1％，壳聚糖0.5-2.0％，其PH为6-8。或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1钠盐配制的pH6--8的肉汁胨培养基。

在扩大培养基培养的温度为25-38℃，时间为1-3天。

从扩大培养得到的菌种选少量留种保存于4℃的冰箱中，大部分可直接用于工业化发酵生产壳聚糖酶制剂。工业化生产壳聚糖酶制剂的设备采用带搅拌器和加热器装置的发酵罐，生产过程首先是配制诱导产酶发酵培养基，方法是在CTNP培养基的基础上，再加入0.5-2％的其它氮源，如氯化铵、硫酸铵、尿素等，并加入促酶释放因子(ZSY)0.01-0.1％，然后加入扩大培养的菌种，加入菌种的量按总壳聚糖总量的0.5-1％。调节PH为6-8，最佳为6.5-7.5，温度保持20-40℃，发酵时间24-48小时，发酵过程定时对物料进行分析，一般当发酵液中出现芽孢时，发酵液中的壳聚糖酶活力达到高峰时即可结束发酵。离心除渣除菌后的发酵液即为粗制液体型壳聚糖酶制剂。

将此粗酶液与3％-6％壳聚糖溶液按一定比例(如1∶10V/V)混匀，在40℃-50℃，pH5-6条件下进行壳聚糖的酶解反应，由于底物壳聚糖的分子量不同，酶解反应终止的时间不同，一般不超过4-12小时，壳聚糖即已全部转化为水溶性低聚壳聚糖。利用不同的酶底比和酶解反应时间，可获得不同分子量分布范围的低聚壳聚糖产物。

酶解反应混合物进行50-70℃的高温灭酶活，经超滤、纳滤浓缩和纯化，喷雾干燥得到低聚壳聚糖产品(壳寡糖，氨基寡糖素)，此产品可用作制药、农药、食品或轻工业原料等。

与目前所公开文献的技术相比，本发明具有突出的实质性特点和进步是：

1.本发明筛选的菌种为芽孢杆菌，其遗传性十分稳定；用PDA培养基传代培养5年，产酶能力不下降，在室温15-40℃的条件下密封保存半年以上不失活，产酶能力也不下降。

2.用诱导产酶发酵培养基培养本发明的菌种，其产酶能力高，单位发酵液所含壳聚糖酶活力高，并能抑制杂菌的生长，壳聚糖消耗少，培养条件容易控制。

3.产酶发酵及酶解反应的时间短，一般40-48小时即可完成发酵及酶解的全过程，对工业化生产很有利，表明可在短时间内提高生产效率，节约生产成本。

4.酶解反应条件温和，易于控制反应条件以获得不同的分子量分布范围的低聚壳聚糖产物。

5.产物好，用本发明菌种及方法获得的低聚壳聚糖，制备2-10聚合度的产率可达90％以上，基本不产生单糖。

以下是本发明的实施例：

实施例一

1、液体培养基扩大菌种。将菌种从PDA斜面接入液体CTNP培养基中，氯化钾、氯化钠、硫酸镁各0.05-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％及适量的钙、铁、铵盐，其含量占0.01-0.1％，壳聚糖0.5-2.0％，其PH为6-8。或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1钠盐配制的pH6--8的肉汁胨培养基，在扩大培养基培养的温度为25-38℃，时间为1-3天。

2.产酶发酵生产。将上述的扩大菌种培养液300ml加入600L发酵罐(罐内有上述产酶发酵培养基400升和硫酸铵2公斤，促酶释放因子(ZSY)0.01-0.1％)调节PH为6.0-7.8，温度20-40℃，发酵时间为36小时，此时发酵液中壳聚糖酶活性达到高峰，终止发酵，然后离心除渣除菌即得粗制液体型壳聚糖酶制剂。

3.酶解产糖生产。在5000升反应釜内，将上述粗酶液与3-6％壳聚糖溶液按1∶10的体积比混匀，4050℃，pH5-6条件下反应9小时，升温至60℃灭酶活，超滤浓缩10倍后喷雾干燥得到粗制低聚壳聚糖粉剂。

实施例二

1、固体培养基培养菌种。配制由豆饼粉、麸皮、壳聚糖和无机盐组成的培养基，其中重量百分含量为：豆饼粉1-5％，麸皮1-3％，玉米粉或薯类淀粉1-5％，钙、铁、铵盐，其含量占0.01-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％，促酶释放因子(ZSY)0.01-0.1％，其余为壳聚糖粉。将菌种接入此培养基上，26-30℃培养3-5天，得到扩大菌种。

2.产酶发酵生产。

将上述的扩大菌种50公斤加到事先放有产酶发酵培养基(罐内有上述产酶发酵培养基400升和氯化铵2公斤，促酶释放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含壳聚糖)的4吨的发酵罐中，调节PH在6.5-8.0，温度25-35℃，发酵时间为36小时，当分析产物中壳聚糖酶活性达到高峰时终止发酵，离心除渣除菌即得粗制液体型壳聚糖酶制剂。

3.酶解产糖生产。按实施例一的方法进行。

实施例三

1.液体培养基扩大菌种。将菌种由PDA斜面接入事先放有实施例一肉汁胨培养液的200L的种罐中，28-38℃通气培养24小时，得到液体扩大菌种。

2.产酶发酵生产。将上述的扩大菌种加到事先放有3吨产酶发酵培养基(罐内有上述产酶发酵培养基400升和尿素2公斤，促酶释放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含壳聚糖))的发酵罐中，调节PH为6.5-8.0，温度为20-40℃，发酵时间36小时，离心除渣除菌得到粗制液体型壳聚糖酶制剂。

3.酶解产糖生产。按实施例一的方法进行。

实施例四

1.固体培养基扩大菌种。将PDA培养基在500毫升的茄形瓶内铺成斜面，将菌种由试管PDA斜面接入茄形瓶PDA斜面，28℃-30℃培养3-5天，得到固体扩大菌种。

2.产酶发酵生产。将上述的一个茄形瓶的扩大菌种接入有400L诱导产酶培养基的0.6吨发酵罐中，调节PH7-8，温度为30-40℃，发酵36小时后终止发酵。离心除渣除菌，经硫酸胺盐析、透析除盐后得到较为纯化的液体型壳聚糖酶制剂。

3.酶解产糖生产。将上述酶液与6％纯化壳聚糖溶液混匀，40-50℃，pH5-6条件下酶解4小时，调pH值至8.0终止反应。离心除渣，超滤除蛋白质及浓缩糖液，纳滤除单糖及无机盐后，喷雾干燥或真空冷冻干燥制备纯净的低聚壳聚糖固体制剂。

应用实例

1.将上述制得的低聚壳聚糖作为生防农药的主成分，可将防治能力提高20％以上。

2.将上述制得的低聚壳聚糖作为医药用品，做成口服液糖浆，具有效控制肝炎、糖尿病的病情。

3.将上述制得的低聚壳聚糖加入5％的2，4-D，做成5-10％溶液，将采摘后的荔枝鲜果浸泡其中10分钟，晾干，自然放置，其保鲜期可延长7-10天。

Claims (5)

1、一种壳聚糖酶生产菌，其特征在于：它是芽孢杆菌，是将从自然界提取分离得到的菌株，用PDA或其它培养基培养，在4℃或常温下保存，菌种的送保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏日为2002年8月16日，保藏号为0790。

2、一种如权利要求1所述壳聚糖酶生产菌制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：先将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为0790的壳聚糖酶产生菌扩大培养，再用两步法制备低聚壳聚糖：第一步使用诱导产酶发酵，制备粗制液体型壳聚糖酶制剂；第二步使用第一步产生的粗制壳聚糖液体型酶制剂对壳聚糖溶液进行降解，制备低聚壳聚糖。

3、根据权利要求2所述的壳聚糖酶生产菌制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：壳聚糖酶生产菌的扩大菌种方法是将采集得到的菌种加入到固体培养基或液体培养基中，温度为25-38℃，时间为1-3天，得到扩大菌种；

所述的固体培养基为PDA培养基，或者由豆饼粉、麸皮、壳聚糖和无机盐组成的培养基，其中重量百分含量为：豆饼粉1-5％，麸皮1-3％，玉米粉或薯类淀粉1-5％，钙、铁、铵盐，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％，其余为壳聚糖粉；

所述的液体培养基为CTNP培养基：氯化钾、氯化钠、硫酸镁各0.05-0.1％，磷酸二氢钾或磷酸氢钾0.1-0.5％及适量的钙、铁、铵盐，其含量各占0.01-0.1％，壳聚糖0.5-2.0％，其pH为6-8，或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1钠盐配制的pH6-8的肉汁胨培养基。

4、根据权利要求2所述的壳聚糖酶生产菌制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：使用诱导产酶发酵，制备粗制液体型壳聚糖酶制剂的过程是将扩大培养得到的菌种放到事先加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，在PH6-8，温度20-40℃的条件下发酵24-48小时，得到的发酵液经离心除渣除菌后得到粗制液体型壳聚糖酶制剂；

所述的诱导产酶培养基包括CTNP培养基并添加0.5-2％的氯化铵、硫酸铵、尿素和其它氮源物质以及0.01-0.1％的促酶释放因子；

5、根据权利要求2所述的壳聚糖酶生产菌制备低聚壳聚糖的方法，其特征在于：用粗制壳聚糖液体型酶制剂对壳聚糖溶液进行降解，制备低聚壳聚糖的过程是：按粗酶液与3％-6％壳聚糖溶液的体积比1∶10，混匀，在40℃-50℃，pH5-6条件下进行壳聚糖的酶解反应。