CN100540650C

CN100540650C - 用酶工程技术生物合成谷胱甘肽的方法

Info

Publication number: CN100540650C
Application number: CNB2007100209021A
Authority: CN
Inventors: 吴梧桐; 劳兴珍; 郑珩; 李薇
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2027-04-03
Also published as: CN101054560A

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种用固定化细胞酶工程技术生物合成谷胱甘肽的方法。该方法采用发明人筛选出的具有高产谷胱甘肽的菌株(CGMCC No.1917)，通过固定化细胞技术，并以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸作为底物，并辅以葡萄糖和镁离子，制备出与天然谷胱甘肽特性相同的谷胱甘肽。

Description

用酶工程技术生物合成谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微生物突变株，它具有高产谷胱甘肽能力，本发明还公开了用这个菌株生物合成谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种重要的含有硫氢基的活性三肽，广泛存在于动植物和微生物细胞中。谷胱甘肽无论在临床和医药还是在食品领域都有广泛的应用。

谷胱甘肽是人体代谢酶如甘油醛磷酸脱氢酶、乙二醛酸等的辅酶，参与体内三羧酸循环及糖代谢，并具有激活各种酶的作用。谷胱甘肽是体内的自由基清除剂，可抑制脂质过氧化，保护细胞膜，恢复细胞功能。谷胱甘肽对于丙烯腈、氟化物、CO、重金属、有机溶剂等外源性有毒物质具有解除功效。谷胱甘肽可加强转甲基、转甲氨基反应，维持肝细胞正常功能，其还可以抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的发展，阻止黑色体形成，并且可减轻由于放射线照射、放射性药物或肿瘤药物引起的白血球症状减少或由于放射性引起的骨髓组织炎与口腔黏膜炎症状。此外，其对药物性肾损伤、糖尿病、神经病变、肿瘤等也颇为有效。

谷胱甘肽在食品加工工业中也有着广泛的应用。发达国家如美国将谷胱甘肽作为生物活性添加剂，可起到抗氧化、增强食品风味、保鲜、强化氨基酸等多方面作用，并大量用于保健食品中，正好切合帮助人体排毒和泻毒的功能性食品的发展主流。

因此谷胱甘肽具有很大的潜在应用市场。多年以来，谷胱甘肽的需求主要依赖进口，供需矛盾突出。

现有的生产谷胱甘肽的方法有萃取法、化学合成法、微生物发酵法等。

萃取法主要是通过溶剂萃取的方法从富含谷胱甘肽的动植物组织等原料中进行分离提取，该方法生产工艺落后、规模小、产量低。

化学合成法制备谷胱甘肽则成本高、反应步骤多、时间长、需光学拆分且存在三废污染等问题。

微生物发酵法制备谷胱甘肽，则后处理麻烦、成本高、体积大、工业化有一定的困难。因此需要发明一种操作简便、收率高、成本低、易于工业化大规模生产谷胱甘肽的制备方法。

发明内容

本发明公开了一种含有谷胱甘肽合成酶的菌株，具有高产谷胱甘肽能力，其含有高活力的谷胱甘肽合成酶I(GSH I)和谷胱甘肽合成酶II(GSH II)，是发明人采用诱变育种的方法筛选到的一株具有高谷胱甘肽合成能力的酿酒酵母(Saccharomyces cerebisiae)。此菌株已于2007年1月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号是：CGMCCNo.1917。

本发明还公开了诱变育种的方法，该方法包括：取酿酒酵母制备菌悬液；诱变处理；筛选出形成最强紫色的菌落，摇瓶培养，检验其谷胱甘肽合成酶活力，筛选出具有高产谷胱甘肽能力的菌株。

上述制备方法中，菌悬液的制备法包括：取待筛选的市售酿酒酵母或酒厂发酵用的酿酒酵母转入摇瓶培养，28℃振荡培养24～36h，再取1ml培养液转接于新鲜培养基中，28℃振荡培养，使细胞处于对数生长期后离心回收菌体，加入5ml 0.1～0.5mol/L pH6.0磷酸缓冲液，制成菌悬液。

上述制备方法中，诱变处理法包括：开启紫外灯预热10min；制备好的菌悬液4ml移入无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒、置磁力搅拌器上，30W紫外灯下方20～30cm处；打开皿盖，在搅拌状态下进行紫外照射，剂量为2min或3min。照射完毕后立即离心，回收细胞，并避光保存。

上述制备方法中，具有高产谷胱甘肽能力的菌株的检出法包括：将诱变处理过的细胞接入摇瓶培养，至对数生长期，离心收集细胞。0.1～0.5mol/L pH6.0磷酸缓冲液加以悬浮，取0.1～0.2ml稀释菌液，涂布于含有硝普盐的固体平板上，28℃培养24～36h，筛选出形成最强紫色的菌落，进行摇瓶培养，检验其谷胱甘肽合成酶活力，从而筛选出具有高产谷胱甘肽能力的菌株，经酶反应试验，该菌株稳定性较好，可反复使用多次，每克湿菌体可收获约200mg谷胱甘肽。

本发明的菌株可以用于制备谷胱甘肽。

本发明还公开了用本发明的菌株生物合成谷胱甘肽的方法，该方法包括：将菌株用海藻酸钠包埋法制备固定化细胞；固定化细胞在含有0.1～1％胆酸钠的底物溶液中进行活化、转化、分离，即得。

上述制备方法中，海藻酸钠包埋法包括：筛选菌株经培养2～3天收集的湿菌体细胞悬浮于生理盐水中，另取海藻酸钠溶于生理盐水中，加热融解，将两者按1∶1～2∶1的比例混合搅拌均匀，以5～12号针头将混合物挤入0.1～lmol/L氯化钙溶液中，同时缓慢搅拌使成形，4℃静置4～24小时，用生理盐水洗涤。

上述制备方法中固定化细胞的活化过程中，优选的方法：取制备好的固定化细胞，加入0.1～1％胆酸的底物溶液，37℃保温处理8小时或24小时，然后用生理盐水进行洗涤。底物溶液的优选含：L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸浓度各为0.01～0.1mol/L、硫酸镁为0.01～0.2mol/L、葡萄糖浓度为2～10％和0.1mol/L的Tris缓冲液(pH8.0)

上述制备方法中，转化过程优选：将活化的固定化细胞装柱，在37℃下恒温水循环，形成连续柱反应器，将底物溶液逆行通过连续反应器，使底物转化成产物谷胱甘肽。

转化反应液中主要成分为谷胱甘肽及未转化的氨基酸底物、无机盐等杂质，优选利用732阳离子交换树脂和707阴离子交换树脂分离的方法纯化谷胱甘肽。首先需将转化液调节pH至2.0～3.0，上732阳离子交换柱，以0.3～0.8mol/L硫酸洗脱；洗脱液调节pH至4.5～5.5，再通过707阴离子交换柱，并以0.3～0.8mol/L NH₄OH洗脱，收集洗脱液，浓缩、结晶、真空干燥即得。

本发明采用固定化细胞酶工程技术制备谷胱甘肽，具有工艺稳定、操作简便、产品后处理简单，易于工业化生产等特点，产品特征与天然谷胱甘肽一致，纯度可达98％以上。

主要工艺技术指标：

(1)固定化细胞酶表现活力为120μmol/h.g湿菌。

(2)连续柱反应器使用半衰期为9天(37℃)

(3)产品的收率，以半胱氨酸计，产品的总收率为85％以上。

具体实施方式

实施例1

取待筛选的市售酿酒酵母转入摇瓶培养，摇瓶培养基为：培养基为蛋白胨3％，酵母膏0.5％，酪蛋白水解物0.5％，葡萄糖4％，硫酸锌1.4％，pH自然，117℃灭菌10分钟。28℃振荡培养24h，再取lml培养液转接于新鲜培养基中，28℃振荡培养，至对数生长期。离心回收菌体，加入5ml 0.2mol/L pH6.0磷酸缓冲液，制成菌悬液。

开启紫外灯预热10min；制备好的菌悬液4ml移入无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒、置磁力搅拌器上，30W紫外灯下方30cm处；打开皿盖，在搅拌状态下进行紫外照射，剂量为2min，进行诱变育种。照射完毕后立即离心，回收细胞，并避光保存。

将诱变处理过的细胞接入摇瓶培养，至对数生长期，离心收集细胞。0.2mol/L pH6.0磷酸缓冲液加以悬浮，取0.1ml稀释菌液，涂布于含有硝普盐的固体平板上，培养基为蛋白胨2％，酵母膏1％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH6.0；28℃培养36h，筛选出形成最强紫色的菌落，进行摇瓶培养。检验其谷胱甘肽合成酶活力，筛选出具有高产谷胱甘肽能力的菌株，经酶反应实验该菌株可反复使用15次，每克湿菌体可收获224mg谷胱甘肽。

实施例2

斜面培养：培养基为蛋白胨2％，酵母膏1％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH6.0，121℃灭菌30分钟，冷却后接种实施例1筛选得到的菌株，28℃培养24h，作为斜面活化种子。

摇瓶培养：培养基为蛋白胨3％，酵母膏0.5％，酪蛋白水解物0.5％，葡萄糖4％，硫酸锌1.4％，pH自然，117℃灭菌10分钟，冷却后，无菌操作接入斜面种子，置摇床28℃，200r/min培养2天，离心得到湿菌体。

固定化细胞制备：取1克湿菌体悬浮于10毫升生理盐水中，另取1克海藻酸钠溶于40毫升生理盐水中，加热溶解，冷却后搅拌均匀，以6号针头将混合物挤入0.1mol/L氯化钙溶液中，静置4小时，后以生理盐水洗涤备用。

实施例3

底物溶液含有0.02mol/L甘氨酸，0.02mol/L的L-谷氨酸、0.02mol/L的L-半胱氨酸，0.2mol/L硫酸镁，葡萄糖浓度为10％，0.1mol/L的Tris缓冲液(pH8.0)。底物溶液以80ml/h流过50ml连续柱反应器，温度维持在37℃，反应器中固定化细胞依实例2方法制备。然后收集转化液进行分离纯化。先将500ml转化液调节pH至2.8～3.0，减压浓缩，通过732阳离子交换柱，用0.5mol/L硫酸洗脱，洗脱液调节pH至5.0，再通过707阴离子交换柱，并以0.5mol/L NH₄OH洗脱，收集洗脱液，浓缩、结晶、真空干燥，得到0.95克白色谷胱甘肽晶状粉末。

Claims

1、一种含有谷胱甘肽合成酶的菌株，保藏号是：CGMCC No.1917。

2、权利要求1的菌株用于制备谷胱甘肽的用途。

3、一种生物合成谷胱甘肽的方法，包括：将权利要求1的菌株用海藻酸钠包埋法制备固定化细胞；固定化细胞在含有0.1～1％胆酸钠的底物溶液中进行活化、转化、分离。

4、权利要求3的方法，其中海藻酸钠包埋法包括：筛选菌株经培养2～3天，收集湿菌体细胞悬浮于生理盐水中，另取海藻酸钠溶于生理盐水中，加热溶解，将两者按1∶1～2∶1的比例混合搅拌均匀，以5～12号针头将混合物挤入0.1～1mol/L氯化钙溶液中，同时缓慢搅拌使成形，4℃静置4～24小时，用生理盐水洗涤。

5、权利要求3的方法，其中反应底物含：L-谷氨酸0.01～0.1mol/L、L-半胱氨酸0.01～0.1mol/L、L-甘氨酸0.01～0.1mol/L、葡萄糖1～10％、氯化镁0.01～0.2mol/L、pH8.0的Tris缓冲液0.1mol/L。

6、权利要求3的方法，其中转化包括：将活化的固定化细胞装柱，在37℃下恒温水循环，形成连续柱反应器，将底物溶液逆行通过连续反应器，使底物转化成产物谷胱甘肽。

7、权利要求3的方法，其中分离时先后用732阳离子交换树脂和707阴离子交换树脂进行分离纯化。