CN102586328B

CN102586328B - 利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法

Info

Publication number: CN102586328B
Application number: CN 201210021828
Authority: CN
Inventors: 张然; 牛天贵; 薛俊; 张兰真; 刘戈
Original assignee: BEIJING YUANTIANCAI BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Zhuhai Silk Color Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: CN102586328A

Abstract

本发明提供一种利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法，其是利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的含有酪氨酸酶的复合酶，以酪氨酸和/或其衍生物为底物，通过酶促反应生成黑色素及其前体物质。本发明使用的复合酶来源稳定，酶活力高，生产效率高；通过酶促反应法生产系列黑色素前体物质简便易行，并进一步通过载体固定化的方法，可使酶反复使用，进一步降低了成本，提高了生产效率，制得的黑色素前体物质可作为有效的染发剂和抗氧化剂使用。

Description

利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法

技术领域

本发明涉及发酵领域和酶固定化领域，具体地说，涉及一种利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法。

背景技术

黑色素(melanin)是广泛存在于动、植物和微生物中的一类重要的天然色素，具有复杂结构，一般为非均质的类多酚聚合体。动物体组织中的黑色素并不是以单一的黑色素形式存在，而是真黑素和脱黑素两种类型的混合色素，所以表现出了皮肤及被毛的多种色泽。黑色素在生物体内是通过酪氨酸酶，互变异构酶等复合酶，进行一系列酶促反应，将酪氨酸及半胱氨酸等氧化成真黑素和脱黑素混合而成的天然黑色素(图1和2)。黑色素的前体物质包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸等，具有抗氧化、抗辐射等功能，并且可以用于制备新型高效的天然黑色素染发剂。

现常用的永久性染发剂多为氧化性染发剂，常采用的染料是对苯二胺，对氨基苯酚，邻氨基苯酚，对甲苯二胺和邻甲苯二胺，对人体具有很大的潜在危害。而现在研制开发的天然染发剂多来源于植物提取物。目前制取黑色素有两种方法，一是从粮食如黑豆、黑芝麻、高粱等种皮经酸洗法制取的，产量小，成本高；二是发酵黑酵母从酵母菌体分离制取的，菌种分离困难，设备复杂，投资较大。

CN1420144A中从植物中提取酪氨酸氧化酶，以酪氨酸一元酚衍生物为底物，控制酶促合成反应条件合成黑色素，其使用的酶比较单一，影响酶促效率，且无法反复使用，另外，从植物中提取酪氨酸酶，成本较高。

使用微生物生产黑色素，尤其是利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的复合酶制备天然黑色素，从而制备染发剂尚未见报道。

发明内容

本发明旨在克服现有制备黑色素工艺的不足，提供一种利用复合酶制备黑色素的新方法。

为了实现本发明目的，本发明使用一种利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法，其是利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的含有酪氨酸酶的复合酶，以酪氨酸和/或其衍生物为底物，通过酶促反应生成黑色素及其前体物质。

前述方法中，所述复合酶中还含有互变异构酶等。

前述方法中使用的底物包括：(1)D型或L型酪氨酸；(2)D型或L型多巴(3-(3，4-二羟基苯基)丙氨酸)；(3)多巴胺(Dopamine；3，4-二羟基苯基乙胺)；其中优选使用L型酪氨酸。

前述方法中，为了进一步促进含酪氨酸酶、互变异构酶等的复合酶的转化能力，还包括向酶及底物的反应体系中加入蛋白酶的步骤。优选所述蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等中的一种或多种。

前述方法中，从芽孢杆菌发酵液中提取复合酶所采用的方法为超滤或离心等。

前述方法中，还包括对复合酶进行固定化的步骤。所述固定化是使复合酶结合到载体上，以便下一步对酪氨酸和/或其衍生物进行酶促转化。所述载体为海藻酸钠、聚乙烯醇、硅藻土、分子筛等中的一种或多种。

前述方法中，所述产黑色素的芽孢杆菌从人类头发中筛选得到，并通过发酵法复筛，确定目标菌株为芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)PMR02，已于2011年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5640。

芽孢杆菌PMR02是以酪氨酸为底物，最终合成黑色素，发酵过程中，如不添加酪氨酸，则不会有黑色素生成，该菌产生黑色素的紫外可见光谱结果显示在210nm左右具有紫外吸收峰，红外光谱具有吲哚结构吸收峰和电子自旋波谱显示该黑色素含有大量的自由基，认为该菌产生的黑色素为吲哚型黑色素，与人体毛发黑色素结构一致。

本发明通过提取芽孢杆菌PMR02菌种发酵液中含酪氨酸酶、互变异构酶等的复合酶，以L-酪氨酸和/或其衍生物为底物，通过固定化酶的方法制备得到包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、吲哚-5，6醌、5，6-二羟基吲哚-2羧酸等系列黑色素前体物质。

种子培养基：PDA培养基或牛肉膏蛋白胨培养基，接入芽孢杆菌PMR02菌种，置于恒温摇床上，转速为100～200r/min，于34℃～42℃培养6～24h，至630nm下OD值0.8时接种入发酵培养基。

发酵培养基：葡萄糖1～3g/L、(NH₄)₂SO₄1～3g/L、K₂HPO₄0.5～2g/L、CaCO₃1～3g/L、MgSO₄0.5～1g/L，按2％～10％接种量接种后，控制培养温度34℃～42℃，摇床转速100～200r/min，发酵16～24h后取出发酵液，在离心机中3000rpm离心10～15min，取上清液进行产物检测，测定发酵液中复合酶的含量和酶活力。

本发明中，复合酶的含量测定采用考马斯亮蓝法，首先配制不同标准浓度的牛血清蛋白溶液，分别吸取1ml加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min，采用紫外分光光度计测定595nm的吸光值，绘制标准曲线，然后取发酵液上清1ml加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min，测定595nm吸光值，根据标准曲线得到复合酶的含量。

本发明中，酶活力的测定采用邻苯二酚反应体系，在3ml反应体系中加入1.8ml 0.1mol/l(pH7.0)磷酸缓冲溶液，1ml 0.1mol/l邻苯二酚溶液，0.2ml酶液，从酶液加入后15s开始，每隔30s记录420nm吸光值，连续测量5min，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位(U)，酶活性表示为U/ml·min。

使用超滤膜分离发酵液上清中分子量在3000～50000范围之内的活性酶；或者将发酵液上清在高速离心机中5000～10000rpm进行离心，取上清液，然后加入70％的饱和硫酸铵溶液，离心收集沉淀，用去离子水清洗沉淀，可得到含酪氨酸酶、互变异构酶等的复合酶。

将活性酶溶解后置于盛有载体(载体可包括海藻酸钠、硅藻土、分子筛等)的三角瓶内，用无菌水稀释以至没过载体颗粒，同时加入蛋白酶溶液(包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等)，将三角瓶置于30～40℃恒温培养箱内震摇6～24h后取出清洗干净，将载体颗粒填充入柱，恒流泵循环送液(0.01％～1％酪氨酸溶液及其衍生物，pH6～8)，得到系列黑色素前体产物。

以酪氨酸溶液为对照，通过吸光度的变化，来控制系列黑色素前体物质的转化情况。当波长在5，6-二羟基吲哚的吸收峰300nm处的吸光度不再变化时，可认为酪氨酸已完全被转化。在高速离心机中5000～10000rpm进行离心，取上清液浓缩得到系列黑色素前体物质。

本发明使用的复合酶从芽孢杆菌发酵液中提取，来源稳定，酶活力高，生产效率高；通过酶促反应法生产系列黑色素前体物质简便易行，并通过载体固定化的方法，使得酶可以反复使用，进一步降低了成本，提高了生产效率，制得的黑色素前体物质可以作为有效的染发剂、防辐射剂和抗氧化剂使用。

附图说明

图1为生物体内天然真黑色素合成示意图。

图2为生物体内天然脱黑色素合成示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1黑色素前体物质的制备

1)液体种子培养：在250ml三角瓶中装50ml种子培养基，牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。接入芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)PMR02，保藏号为CGMCC No.5640，置于恒温摇床上，转速为140r/min，于37℃培养8～12h，至630nm下OD值0.8时接种入发酵培养基。

2)液体发酵培养：在300ml三角瓶中装50ml发酵培养基，葡萄糖1.2g、(NH₄)₂SO₄ 1.3g、K₂HPO₄ 1g、CaCO₃ 3g、MgSO₄ 0.56g，蒸馏水定容至1L，121℃蒸汽灭菌20min，按4％接种量接种后，控制培养温度37℃，摇床转速140r/min，发酵18h后取出发酵液，3000rpm离心15min，取上清液进行产物检测，具体为：收集发酵液上清，在冰浴中用硫酸铵盐析蛋白，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度为70％，待硫酸铵完全溶解后，将容器放至4℃冰箱中静置过夜。取出后离心，20mM PBS缓冲液溶解沉淀，转入透析袋中，进行透析除盐后，再进行冷冻干燥，即为粗酶。称取适量粗酶，溶于pH为7.0的磷酸缓冲液，4℃冰箱保藏，为供试粗酶液。将粗酶液与5×样品缓冲液等体积混合均匀后，离心甩样，采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶系统进行电泳分离，产用邻苯二酚及多巴进行染色，根据条带颜色深浅及宽窄确定酶活性高低。电泳结果表明，经提取的发酵液中含有酪氨酸酶及其同工酶。

采用考马斯亮蓝法测定复合酶的含量为20.4μg/ml；采用邻苯二酚反应体系测定发酵液中复合酶的酶活力为1.0U/(mL·min)。

3)在高速离心机中10000rpm进行离心，取上清液，然后加入70％的饱和硫酸铵溶液，离心收集沉淀，用去离子水清洗数次，得到活性酶。

4)将活性酶溶解置于盛有载体5％海藻酸钠的三角瓶内(用无菌水稀释以至没过载体颗粒)，将三角瓶置于30℃恒温培养箱内震摇12h后取出清洗干净，将载体颗粒填充入柱，恒流泵循环送液100ml(0.1％酪氨酸溶液及多巴，pH6.5)，得到系列黑色素前体产物，循环送液，以蒸馏水溶液为对照，测定反应后溶液的吸光度。

反应至30h后，300nm处的吸光度不再上升，可以认为酪氨酸转化完毕，黑色素前体物质的溶液最大吸收峰为300nm，主要成分为5，6-二羟基吲哚。黑色素前体物质具有抗氧化、抗辐射等功能，可以用于制备新型高效的天然黑色素染发剂。

实施例2黑色素前体物质的制备

2)液体发酵培养：在300ml三角瓶中装50ml发酵培养基，葡萄糖1.2g、(NH₄)₂SO₄ 1.3g、K₂HPO₄ 1g、CaCO₃ 3g、MgSO₄ 0.56g，蒸馏水定容至1L，121℃蒸汽灭菌20min，按4％接种量接种后，控制培养温度37℃，摇床转速140r/min，发酵18h后取出发酵液，3000rpm离心15min，取上清液进行产物检测，产物检测方法同实施例1。采用考马斯亮蓝法测定复合酶的含量为21.5μg/ml；采用邻苯二酚反应体系测定发酵液中复合酶的酶活力为1.1U/(mL·min)。

4)将活性酶溶解置于盛有载体5％海藻酸钠的三角瓶内(用无菌水稀释以至没过载体颗粒)，将三角瓶置于30℃恒温培养箱内震摇12h后取出清洗干净，加入20mg/ml胰蛋白酶溶液5ml，将载体颗粒填充入柱，恒流泵循环送液100ml(0.1％酪氨酸溶液及多巴胺，pH6.5)，得到系列黑色素前体产物，循环送液，以蒸馏水溶液为对照，测定反应后溶液的吸光度。

反应至20h后，300nm处的吸光度不再上升，可以认为酪氨酸转化完毕，黑色素前体物质的溶液最大吸收峰为300nm，主要成分为5，6-二羟基吲哚。黑色素前体物质具有抗氧化、抗辐射等功能，可以用于制备新型高效的天然黑色素染发剂。

蛋白酶可以促进酪氨酸酶的活性，添加蛋白酶溶液可以使反应时间缩短33％。

实施例3黑色素前体物质的制备

1)液体种子培养：在250ml三角瓶中装50ml种子培养基，马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)20g，蒸馏水1000ml，pH自然，121℃蒸汽灭菌20min。接入芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)PMR02，保藏号为CGMCC No.5640，置于恒温摇床上，转速为140r/min，于37℃培养8～12h，至630nm下OD值0.8时接种入发酵培养基。

2)液体发酵培养：在300ml三角瓶中装50ml发酵培养基，马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)20g，蒸馏水1000ml，pH自然，121℃蒸汽灭菌20min，按5％接种量接种后，控制培养温度37℃，摇床转速140r/min，发酵18h后取出发酵液，3000rpm进行离心，取上清液进行产物检测，产物检测方法同实施例1。采用考马斯亮蓝法测定复合酶的含量为22.1μg/ml；采用邻苯二酚反应体系测定发酵液中的复合酶的酶活力为1.2U/(mL·min)。

3)在高速离心机中9000rpm进行离心，取上清液，然后加入70％的饱和硫酸铵溶液，离心收集沉淀，用去离子水清洗数次，得到活性酶。

4)将活性酶溶解置于盛有载体3％海藻酸钠+2％聚乙烯醇的三角瓶内(用无菌水稀释以至没过载体颗粒)，将三角瓶置于30℃恒温培养箱内震摇12h后取出清洗干净，加入20mg/ml木瓜蛋白酶溶液5ml，将载体颗粒填充入柱，恒流泵循环送液100ml(0.02％酪氨酸溶液及多巴和多巴胺，pH7.5)，得到系列黑色素前体产物，循环送液，以酪氨酸溶液为对照，测定反应后溶液的吸光度。

反应至10h后，300nm处的吸光度不再上升，可以认为酪氨酸转化完毕，黑色素前体物质的溶液最大吸收峰为300nm，主要成分为5，6-二羟基吲哚。黑色素前体物质具有抗氧化、抗辐射等功能，可以用于制备新型高效的天然黑色素染发剂。

实施例4天然黑色素的制备

2)液体发酵培养：在300ml三角瓶中装50ml发酵培养基，葡萄糖1.2g、(NH₄)₂SO₄ 1.3g、K₂HPO₄ 1g、CaCO₃ 3g、MgSO₄ 0.56g，蒸馏水定容至1L，121℃蒸汽灭菌20min，按4％接种量接种后，控制培养温度37℃，摇床转速140r/min。

发酵24h后加入酪氨酸0.01g，继续培养8h后，8000r/min离心10min，取上清，继续在摇床条件下发生酶催化反应6h。取出发酵终止产物4000r/min离心，取澄清液体，以未接种澄清发酵培养基为空白对照，在400nm下测其吸光值，根据Sigma公司的黑色素标准品绘制的标准曲线，测得发酵液中黑色素浓度为0.15g/L。

实施例1-3中产生的黑色素前体物质是指分子量为3000以上的高分子化合物(黑色素)之前的状态，即具有吲哚骨架的各种单体至低聚物状态(分子量小于3000)，主要包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸。实施例1～3中通过固定化复合酶，并产用恒流泵循环送液的方法，可以控制反应速度，使反应停留在黑色素前体物质的某个阶段，通过吸光度的变化来进行检测。而实施例4中未采用固定化复合酶恒流泵循环送液的方法，直接在发酵液中加入酪氨酸，黑色素前体则通过聚合反应生成高分子物黑色素。由于黑色素及黑色素前体物质在性能和使用方法上有所不同，可根据不同的需要采用不同的生产方式。

本发明人共筛选出了若干株产黑色素的芽孢杆菌，均可以采用本发明的方法生产黑色素及前体物质，并从中优选出RMR02菌株。可通过从产黑色素的芽孢杆菌中提取活性酶，生产黑色素及前体物质，并进一步应用于染发及防晒产品中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.利用复合酶制备黑色素及其前体物质的方法，其特征在于，利用从产黑色素的芽孢杆菌发酵液中提取的含有酪氨酸酶的复合酶，以酪氨酸及其衍生物为底物，通过酶促反应生成黑色素及其前体物质；所述酪氨酸的衍生物为多巴或多巴胺；

所述产黑色素的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）PMR02，保藏号CGMCC No.5640；

对枯草芽孢杆菌PMR02进行发酵培养采用的培养基为：葡萄糖1～3g/L、(NH₄)₂SO₄1～3g/L、K₂HPO₄0.5～2g/L、CaCO₃1～3g/L、MgSO₄0.5～1g/L，培养条件为：按2%～10%接种量接种种子培养液，34℃～42℃，摇床转速100～200r/min，发酵16～24h；所述种子培养液在630nm的OD值为0.8；

从枯草芽孢杆菌发酵液中提取含有酪氨酸酶的复合酶所采用的方法为超滤或离心；

还包括在进行酶促反应之前对复合酶进行固定化的步骤；并通过恒流泵循环送液的方法，控制反应速度，使反应停留在黑色素前体物质阶段；所述前体物质为多巴色素、5,6-二羟基吲哚、5,6-二羟基吲哚-2-羧酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括向酶及底物的反应体系中加入蛋白酶的步骤，所述蛋白酶为胰蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化是使复合酶结合到载体上，所述载体为海藻酸钠、聚乙烯醇、硅藻土中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化是使复合酶结合到载体上，所述载体为分子筛。

5.一种产黑色素的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）PMR02，保藏号为CGMCC No.5640。