CN114796310B - 一种含有atcc9080菌种发酵产物的药物组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

一种含有atcc9080菌种发酵产物的药物组合物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物发酵领域，具体而言，涉及一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物、其制备方法及应用。一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，包括：用含有地椒的ATCC9080菌种培养基培养ATCC9080，然后收集发酵产物。发明人实验后发现在ATCC9080菌种的培养基中加入地椒，有利于提高发酵产物在美白、抗氧化和抗炎方面的性能，可以用于制备护肤品、抗炎药物、清除DPPH自由基的药物以及抑制络氨酸酶的药物。

Description

一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物、其制备方法及应用
本申请是2020年12月31日提交的、申请日为2020年12月31日、发明名称为“一种药物组合物、其制备方法及应用”、申请号为2020116444953的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物发酵领域，具体而言，涉及一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物、其制备方法及应用。
背景技术
微生物转化可用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为生物催化剂，其区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少，且能完成一些有机化学合成难以进行的反应。发酵产物中含有丰富的小分子肽、游离氨基酸、维生素、核酸、核苷酸等活性成分；不同菌种发酵后的产物有不同的作用。
本申请旨在提供一种药物组合物的制备方法，其旨在增加发酵产物在护肤方面的性能。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种药物组合物、其制备方法及应用，其旨在提供一种有益于护肤的药物组合物。
本申请提供一种药物组合物的制备方法，包括：
用含有地椒的ATCC8014菌种培养基培养ATCC8014，然后收集发酵产物。
或者，用含有地椒的ATCC9080菌种培养基培养ATCC9080，然后收集发酵产物。
发明人实验后发现在ATCC9080菌种培养基中加入地椒，有利于提高发酵产物在美白、抗氧化和抗炎方面的性能，可以用于制备护肤品、抗炎药物、清除DPPH自由基的药物以及抑制络氨酸酶的药物。
发明人实验后发现在ATCC8014菌种培养基中加入地椒，有利于提高发酵产物在美白、抗氧化和抗炎方面的性能，可以用于制备护肤品、抗炎药物、清除DPPH自由基的药物以及抑制络氨酸酶的药物。
在本申请第一方面的一些实施例中，培养ATCC8014的培养条件为：在200-240rpm、35-40℃下培养20-35小时。
可选地，培养ATCC9080的培养条件为：在200-240rpm、35-40℃下培养20-35小时。
在本申请第一方面的一些实施例中，所述收集发酵产物的步骤包括：采用0.2-0.3μm的滤膜过滤，取滤液。
可选地，采用0.2-0.3μm的滤膜过滤之前还包括离心分离去除滤渣。
在本申请第一方面的一些实施例中，含有地椒的ATCC8014菌种培养基中所述地椒的质量百分比为0.5-8％。
可选地，所述含有地椒的ATCC8014菌种培养基中所述地椒的质量百分比为4-8％。
在本申请第一方面的一些实施例中，含有地椒的ATCC9080菌种培养基中所述地椒的质量百分比为0.5-9％。
可选地，所述含有地椒的ATCC9080菌种培养基中所述地椒的质量百分比为7-9％。
本申请第二方面还提供一种药物组合物，药物组合物通过上述的制备方法制得。
本申请还提供一种上述药物组合物在制备护肤品中的应用。
本申请还提供一种上述药物组合物在制备抑制络氨酸酶的药物中的应用。
本申请还提供一种上述药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
本申请还提供一种上述药物组合物在制备清除DPPH自由基的药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了实施例1-2、对比例1-2培养24h后发酵后的混合液菌体密度。
图2示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物中总酮含量。
图3示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物中总蛋白含量。
图4示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对酪氨酸酶体外抑制率。
图5为示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对DPPH的清除率。
图6为实施例1和实施例2的药物组合物对B16细胞的毒性分析。
图7为实施例1和实施例2的药物组合物对Hacat细胞的毒性分析。
图8为实施例1和实施例2的药物组合物对3T3细胞的毒性分析。
图9为实施例1和实施例2的药物组合物对3T3细胞内Collagen1和HO-1的影响。
图10示出了实施例1和实施例2的药物组合物在B16细胞上对络氨酸酶抑制的分析。
图11示出了实施例1和实施例2的药物组合物在HaCat细胞上对IL-8的抗炎分析。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的药物组合物、其制备方法及应用进行具体说明。
本申请主要提供两种药物组合物；第一种药物组合物和第二种药物组合物。
其中，第一种药物组合物的制备方法如下：
用含有地椒的ATCC8014菌种培养基培养ATCC8014，然后收集发酵产物。
在ATCC8014菌种的基础培养基中加入地椒，然后用于培养ATCC8014，培养一段时间后收集发酵产物。
地椒(thymus quinquecostatus celak)是唇形科百里香属植物。地椒主要活性成分为挥发油和黄酮类成分。地椒提取物具有肿瘤、抗菌、抗氧化、降血糖及改善心脑血管缺血等作用。地椒有祛风解表，行气止痛，清热解毒的功能，临床中用于多种疾病的治疗。地椒作为一种天然药物及食物，具有较强的抗氧化作用，可有效预防和治疗心脑血管疾病以及潜在的祛黑眼圈作用。
在本申请中，含有地椒的ATCC8014菌种培养基包括基础培养基和地椒，其中，地椒的质量百分比为0.5-8％，例如可以为0.5％、0.6％、1％、1.2％、1.6％、2.0％、2.5％、3％、3.6％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％等等。除地椒之外的基础培养基可以进行市购或者可以进行现场配置，可以根据ATCC8014菌种的生长和代谢属性进行配置。
在本申请的实施例中，地椒可以采用地椒的根、茎以及叶中的至少一个部位。在本申请中，培养基中加入地椒粉末，可以理解的是，在本申请的其他实施例中，培养基中可以加入地椒的水提物、醇提物等。本申请的地椒选用宁夏地椒，在本申请的其他实施例中，可以选用其他产地的地椒。
作为示例性地，在一些实施例中，培养ATCC8014的培养条件为：在200-240rpm、35-40℃下培养20-35小时。
在一些实施例中，在含有地椒的ATCC8014菌种培养基中以菌体密度OD为1.5-1.9(例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9)接种ATCC8014菌种；然后以转速为200-240rpm(例如可以为200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm)，在温度为35-40℃(例如可以为35℃、36℃、37℃、39℃、40℃)下培养20-35小时；培养时间例如可以为20小时、22小时、24小时、28小时、30小时或者35小时等等。
在本申请的其他实施例中，如果不考虑收率以及培养效率等因素，培养条件中的温度、时间以及转速可以不在上述范围内，相应地，含有地椒的ATCC8014菌种培养基中地椒的占比也可以不在上述范围内。
培养完成后，收集发酵产物。
在本申请的一些实施例中，收集发酵产物的手段包括过滤培养后的产物，去除不能通过0.2-0.3μm滤空的滤渣。例如，采用0.2-0.3μm(例如可以为0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.28μm、0.3μm等)的滤膜过滤，取滤液。
在本申请的一些实施例中，收集发酵产物的过程中，为了提高过滤效率，节约过滤时间，过滤之前还包括离心分离去除滤渣。例如，以4000rpm、离心10min。
本申请还提供一种药物组合物，主要通过上述第一种药物组合物的制备方法制得。
本申请实施例提供的上述药物组合物在美白、抗氧化、抗炎、抑制络氨酸酶方面有较佳的效果。发明人实验后发现在ATCC8014菌种培养基中加入地椒，有利于提高发酵产物在美白、抗氧化和抗炎方面的性能，可以用于制备护肤品、抗炎药物、清除DPPH自由基的药物以及抑制络氨酸酶的药物。
本申请还提供第二种药物组合物，第二种药物组合物的制备方法制如下：
用含有地椒的ATCC9080菌种培养基培养ATCC9080，然后收集发酵产物。
在本申请中，含有地椒的ATCC9080菌种培养基包括基础培养基和地椒，其中，地椒的质量百分比为0.5-9％，例如可以为0.5％、0.7％、1％、1.3％、1.5％、2.0％、2.6％、3％、3.5％、4％、4.7％、5％、7％、9％等等。除地椒之外的基础培养基可以进行市购或者可以进行现场配置，可以根据ATCC9080菌种的生长和代谢属性进行配置。
相应地，可以采用地椒的根、茎以及叶中的至少一个部位加入基础培养基中。
作为示例性地，在一些实施例中，培养ATCC9080菌种的培养条件为：在200-240rpm、25-30℃下培养20-35小时。
在一些实施例中，在含有地椒的ATCC9080菌种培养基中以菌体密度OD为1.5-1.9(例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9)接种ATCC9080菌种；然后以转速为200-240rpm(例如可以为200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm)，在温度为35-40℃(例如可以为35℃、36℃、37℃、39℃、40℃)下培养20-35小时；培养时间例如可以为20小时、22小时、24小时、28小时、30小时或者35小时等等。
在本申请的其他实施例中，如果不考虑收率以及培养效率等因素，培养条件中的温度、时间以及转速可以不在上述范围内，相应地，含有地椒的ATCC9080菌种培养基中地椒的占比也可以不在上述范围内。
培养完成后，收集发酵产物。
在本申请的一些实施例中，收集发酵产物的手段包括过滤培养后的产物，去除不能通过0.2-0.3μm滤空的滤渣。例如，采用0.2-0.3μm(例如可以为0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.28μm、0.3μm等)的滤膜过滤，取滤液。
在本申请的一些实施例中，收集发酵产物的过程中，为了提高过滤效率，节约过滤时间，过滤之前还包括离心分离去除滤渣。例如，以4000rpm、离心10min去除滤渣。
本申请还提供一种药物组合物，主要通过上述第一种药物组合物的制备方法制得。
本申请实施例提供的上述药物组合物(第二种药物组合物)在美白、抗氧化、抗炎、抑制络氨酸酶方面有较佳的效果。发明人实验后发现在ATCC9080菌种培养基中加入地椒，有利于提高发酵产物在美白、抗氧化和抗炎方面的性能，可以用于制备护肤品、抗炎药物、清除DPPH自由基的药物以及抑制络氨酸酶的药物。
本申请还提供一种应用，上述第一种药物组合物在制备护肤品中的应用。或者，上述第二种药物组合物在制备护肤品中的应用。
本申请还提供一种应用，上述第一种药物组合物在制备抑制络氨酸酶的药物中的应用。或者，上述第二种药物组合物在制备抑制络氨酸酶的药物中的应用。
本申请还提供一种应用，上述第一种药物组合物在制备抗炎药物中的应用。或者，上述第二种药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
本申请还提供一种应用，上述第一种药物组合物在制备清除DPPH自由基的药物中的应用。或者，上述第二种药物组合物在制备清除DPPH自由基的药物中的应用。
本申请提供的第一种药物组合物以及第二种药物组合物均在抗炎症、清除DPPH自由基、抑制络氨酸酶中有较好的作用。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
以下列举各个实施例中菌株和培养基的来源：
ATCC1.91菌株：购于北纳创联，文中以及附图中均简称LJ03。
ATCC204508菌株：购于北纳创联，文中以及附图中均简称ZL03。
ATCC8014菌株：购于北纳创联，以下简称MRS。
ATCC9080菌株：购于北纳创联，以下简称YPD。
ATCC1.91菌株和ATCC204508菌株的基础培养基为LB培养基；购于Sangon Biotech的A507002。
ATCC8014菌株的基础培养基为MRS培养基；购于Solarbio的M8540-250g。
ATCC9080菌株的基础培养基为YPD培养基；购于Solarbio的LA0250-250g。
实施例1
本实施例提供了一种药物组合物，主要通过以下步骤制得：
将MRS菌株接种至10mlMRS培养基培养一天得到MRS菌种；
分别按照质量比为1:25、1:50、1:100混合地椒茎叶粉末和MRS培养基制得三种培养基；然后分别将第一天培养得到的MRS菌种以OD＝1.7的菌体密度接种至混合后的三种培养基；于220rpm、37℃条件下培养24h；收集发酵后的混合液，检测其菌体密度以评价生长状况。并以4000rpm、离心10min后取上清液并用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，SLGP033RB)过滤，收集备用。
实施例2
本实施例提供了一种药物组合物，主要通过以下步骤制得：
将YPD菌株接种至10mlYPD培养基培养一天得到YPD菌种。
分别按照质量比为1:25、1:50、1:100混合地椒茎叶粉末和YPD培养基制得三种培养基；然后分别将第一天培养得到的YPD菌种以OD＝1.7的菌体密度接种至混合后的三个培养基；于220rpm、37℃条件下培养24h；收集发酵后的混合液，检测其菌体密度来评价生长状况。并以4000rpm、离心10min。取上清并用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，SLGP033RB)过滤，收集备用。
对比例1
本对比例提供了一种药物组合物，主要通过以下步骤制得：
将LJ03菌株接种至10ml LB培养基培养一天得到LJ03菌种；
分别按照质量比为1:25、1:50、1:100混合地椒茎叶粉末和LB培养基制得三种培养基；然后分别将第一天培养得到的LJ03菌种以OD＝1.7的菌体密度接种至混合后的三种培养基；于220rpm、37℃条件下培养24h；收集发酵后的混合液，检测其菌体密度来评价生长状况。并以4000rpm、离心10min。取上清并用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，SLGP033RB)过滤，收集备用。
对比例2
本对比例提供了一种药物组合物，主要通过以下步骤制得：
将ZL03菌株接种至10ml LB培养基培养一天得到ZL03菌种；
分别按照质量比为1:25、1:50、1:100混合地椒茎叶粉末和LB培养基制得三种培养基；然后分别将第一天培养得到的ZL03菌种以OD＝1.7的菌体密度接种至混合后的三种培养基；于220rpm、37℃条件下培养24h；收集发酵后的混合液，检测其菌体密度来评价生长状况。并以4000rpm、离心10min。取上清并用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，SLGP033RB)过滤，收集备用。
对比例3
本对比例提供了一种药物组合物，本对比例与实施例1的区别在于培养基中未混合地椒。
对比例4
本对比例提供了一种药物组合物，本对比例与实施例2的区别在于培养基中未混合地椒。
图1-图9中：LJ03代表对比例1的药物组合物；ZL03代表对比例2的药物组合物；YPD代表实施例2的药物组合物；MRS代表实施例1的药物组合物。
试验例1
实施例1-2培养24h后发酵后的混合液菌体密度的检测结果如图1所示。
从图1可以看出，实施例1-2的菌体生长状况均较佳，说明地椒未影响相应的菌种的生长状况。
试验例2
测量实施例1-2的药物组合物中的总酮含量
以芦丁(购于Solarbio，SR8250-100mg)作为标准品，用60％的乙醇(购于天津大茂，3852)配制1000μg/mL、800μg/mL、600μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、0μg/mL的芦丁标准液，分别取300μL芦丁标准液以及发酵样品到2mL EP(eppendorf)管，再分别加入100μL 5％的NaNO2(购于Macklin，S818033)，混匀，静置6min，再加入100μL 10％的Al(NO3)3(购于天津大茂)溶液，混匀，静置6min，再加入500μL 4％的NaOH(购于Macklin，S835850)溶液，涡旋混匀，静置15min，吸取200μL混合液于96孔酶标板中，并于510nm波长处测得其OD值。根据标准曲线，计算出各发酵样品中总酮含量。图2示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物中总酮含量。
试验例3
测量实施例1-2的药物组合物中的总蛋白含量
以BSA为标准品，根据蛋白定量试剂盒(购于Thermo，23225)，用1×PBS(购于Gibco,10010023)配制2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL BSA标准液。根据试剂盒说明，以50:1的比例避光配制工作液，同时，96孔酶标板每孔10μL加入标准液以及相应的药物组合物；再加入200μL的工作液，在37℃孵育30min。再将96孔酶标板于562nm波长处测得其OD值。根据标准曲线，计算出各发酵样品中总蛋白含量。图3示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物中总蛋白含量。
试验例4
测量实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对酪氨酸酶体外抑制效率
设立多个平行的实验组、标准对照组、样品本底组以及空白对照组。
取96孔酶标板，向实验组、标准对照组、样品本底组以及空白对照组分别加入80μL、120μL、160μL、200μL pH＝6.8 0.2M的PBS缓冲液；
向实验组的多个孔中分别加入40μL实施例1-2、对比例1-2的药物组合物；然后向实验组的每个孔中加入80μL的1.5mmol/L L-络氨酸(购于索莱宝，T0010-25g)；
向样品本底组的多个孔中分别加入40μL实施例1-2、对比例1-2的药物组合物。
向标准对照组的每个孔中加入80μL的1.5mmol/L L-络氨酸(购于索莱宝，T0010-25g)。
最后每个孔中均加入40μL的500U/mL的酪氨酸酶(购于Solarbio，T8830-25KU)。
在37℃下孵育20min，在475nm波长处测得其OD值。酪氨酸酶体外抑制率＝(实验组OD值-样品本底组OD值)/(标准对照组OD值-空白对照组OD值)。
图4示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对酪氨酸酶体外抑制率。
从图4中可以看出，培养基中加入地椒可以使最终得到的发酵产物对酪氨酸酶体外抑制率有显著的提高。
试验例5
测量实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对DPPH自由基清除效率
96孔酶标板分为3组，D1组、D2组以及D3组，每组包括多个孔。
D1组的部分孔加入实施例1的药物组合物，部分孔加入实施例2的药物组合物，部分孔加入对比例1的药物组合物，部分孔加入对比例2的药物组合物；加入的量均为100μL；然后D1组每个孔均加入100μL 2×10-4mol/L的DPPH(购于TCI，D0909)无水乙醇溶液。
D2组的部分孔加入实施例1的药物组合物，部分孔加入实施例2的药物组合物，部分孔加入对比例1的药物组合物，部分孔加入对比例2的药物组合物；加入的量均为100μL；然后D2组的每个孔均加入100μL无水乙醇溶液。
D3组每个孔均加入100μL 2×10-4mol/L的DPPH(购于TCI，D0909)无水乙醇溶液以及100μL无水乙醇溶液。
然后将96孔酶标板放在37℃环境下30min。在517nm波长处测得OD值(D1、D2、D3)。根据自由基清除率(％)＝(D2+D3-D1)/D3×100％算出自由基清除率。
图5为示出了实施例1-2、对比例1-2的药物组合物对DPPH的清除率。
根据试验例1-试验例5可以看出：实施例1与实施例2提供的药物组合物的上清中总黄酮的含量、总蛋白含量均远大于对比例1和对比例2的药物组合物；实施例1与实施例2提供的药物组合物对酪氨酸酶体外抑制率以及对DPPH的清除率均高于对比例1和对比例2的药物组合物。
说明地椒对ATCC8014菌种以及ATCC9080菌种的发酵物有影响，对发酵物中的抗氧化性能、自由基清除能力以及酪氨酸酶体外抑制性能有正面影响。
试验例6
实施例1和实施例2的药物组合物对B16、Hacat、3T3细胞的毒性分析
做两组实验，一组用于研究实施例1提供的药物组合物，取实施例1中以质量比为1:25混合地椒茎叶粉末和MRS培养基制得的培养基得到的药物组合物进行实验。一组用于研究实施例2提供的药物组合物。取实施例2中以质量比为1:50混合地椒茎叶粉末和YPD培养基制得的培养基得到的药物组合物进行实验。
(1)将培养在100cm2细胞培养皿中的B16、Hacat、3T3细胞分别用1mL 0.25％胰蛋白酶溶液(购于Gibco，25200-072)消化，待细胞要从皿上脱落时，吸去胰蛋白酶溶液，然后用6mL含10％血清(购于Gibco，10270106)以及1％双抗的RPMI1640(购于Gibco，C11875500CP)终止消化B16细胞；用6mL含10％血清(购于Gibco，10270106)以及1％双抗的DMEM培养基(购于Gibco，C11995500BT)终止消化Hacat、3T3细胞。然后轻轻吹打使细胞分散，用离心管收集细胞并在800rpm下离心5min。离心去掉培养基，用2mL含0.02％的血清、10μg/mL人转铁蛋白(购于simga，T2252)以及200μg/mL的BSA(购于Macklin，B824162)DMEM/F12(1:1)(购于Gibco，C11330500BT)培养基重悬细胞，吸取20uL细胞悬液，与4％的台盼蓝溶液(购于索莱宝，C0040)以1:1比例混合，用countstar计数仪计数。每孔以80μL含5000细胞铺到96孔板中，其中96孔板最外围一圈加入100μL DMEM/F12(1:1)培养基。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱培养24h；然后其中一组以实施例1的药物组合物与DMEM/F12(1:1)培养基质量比为1:4混合稀释，每孔加入20μL样品，37℃、5％CO2培养箱培养48h；之后每孔加入10μL的CCK-8溶液(购于selleck，B34304)。另一组以实施例2的药物组合物与DMEM/F12(1:1)培养基质量比为1:4混合稀释，每孔加入20μL样品，37℃、5％CO2培养箱培养48h；之后每孔加入10μL的CCK-8溶液(购于selleck，B34304)。
(3)在37℃、5％CO2的培养箱避光孵育2h，之后测得其在450nm波长处的OD值以及630nm处的OD值，并求出差值。再根据公式：相对增殖率％＝(样品OD-空白对照)/(空白对照OD-培养基OD)得到相对增殖率。
图6为实施例1和实施例2的药物组合物对B16细胞的毒性分析。图7为实施例1和实施例2的药物组合物对Hacat细胞的毒性分析。图8为实施例1和实施例2的药物组合物对3T3细胞的毒性分析。从图6-图8可以看出，实施例1和实施例2的药物组合物对B16、Hacat、3T3药物毒性小。根据图6-8的结果，选取了毒性较小的三个浓度，分别为0.3125％(H)、0.078125(M)、0.019532(L)三个浓度进行试验例6和试验例7。
试验例7
实施例1和实施例2的药物组合物处理3T3细胞后的抗氧化分析
(1)将培养在100cm2细胞培养皿中的3T3细胞用1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化，待细胞要从皿上脱落时，吸去胰蛋白酶溶液，用6mL 10％血清、1％双抗DMEM培养基终止消化，并轻轻吹打使细胞分散，用离心管收集细胞并在800rpm下离心5min。离心去掉培养基，用2mL DMEM/F12(1:1)培养基重悬细胞，吸取20uL细胞悬液，与4％台盼蓝溶液以1:1比例混合，用countstar计数仪计数。以1.5×106个细胞每孔种于60cm2细胞培养皿中，并补充DMEM/F12(1:1)培养基至3mL。放于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)分别配制体积分数为0.3125％、0.078125％、0.019531％浓度的实施例1和实施例2的药物组合物；然后分别加入到不同的培养皿中，使得终体积为4mL。放于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h。之后去培养基，用PBS洗两次，再用300uL含1mM PMSF(购于碧云天，ST506)的RIPA(购于碧云天，P0013B)裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃、13000rpm离心30min。将离心后的上清转移至新的EP(eppendorf)管中。蛋白定量方法参照试验例2蛋白定量试剂盒(购于Thermo，23225)。
(3)将蛋白定量好的样品，等质量取样，并用PBS溶液补足到等体积，之后加入1/5体积的5×Loading buffer(购于索莱宝，P1040)，涡旋混匀，置于100℃水浴锅中加热10min。冷却后点样。
(4)使用预制胶(购于invitrogen，EC6025BOX)进行电泳，取制备好的样品20μL加入到预制胶中，80V电压30min使样品电泳至分离胶，然后120V电压电泳直到指示剂到底部停止电泳。
(5)将胶与大小适当的NC膜(购于Millipore，HATF00010)贴合在一块，采用三明治结构，加入转膜液，300mA恒流，进行转膜90min。之后加入5％脱脂奶粉(购于BD，232100)进行封闭，室温1h。用含有吐温-20(购于VETEC，V900548)的PBS溶液(购于Sangon Biotech，E607008)(浓度为0.1vol％PBST)以40rpm洗膜5min。根据被检查蛋白分子量，对NC进行裁剪。以体积比为1：1000的比列将Mouse anti-GAPDH(购于Proteintech，60004-1-Ig)稀释于0.1vol％PBST溶液中，覆盖于NC膜上；或者，以体积比为1：1000的比列将HO-1Rabbit mAb(购于CST,86806S)稀释于0.1vol％PBST溶液中，覆盖于NC膜上；或者，以体积比为1：1000的比列将Rabbit Anti-Collagen I antibody(购于bioss，bs-10423R)稀释于0.1vol％PBST溶液中，覆盖于NC膜上。在4℃下孵育12h。然后用0.1％PBST以40rpm洗膜5min，重复三次，洗去多余的抗体。然后以1：5000的比列稀释Anti-Rabbit IgG(L+H)HRP(购于Proteintech，SA00001-2)于0.1vol％PBST溶液中，孵育到相应的NC膜上；重复上述洗膜步骤将ECL化学发光液加入到NC膜表面，用凝胶成像仪(Bio-Rad)进行拍摄曝光。以1：5000的比列稀释Anti-Mouse IgG(L+H)HRP(购于Proteintech，SA00001-1)于0.1vol％PBST溶液中，孵育到相应的NC膜上；重复上述洗膜步骤将ECL化学发光液加入到NC膜表面，用凝胶成像仪(Bio-Rad)进行拍摄曝光。
图9为实施例1和实施例2的药物组合物对3T3细胞内Collagen1和HO-1的影响。图9中，L、M、H分别代表实施例1中以质量比为1:25混合地椒茎叶粉末和MRS培养基制得的培养基得到的药物组合物不同的浓度，10.3125％(H)、0.078125(M)、0.019532(L)。L、M、H分别代表实施例2中以质量比为1:50混合地椒茎叶粉末和YPD培养基制得的培养基得到的药物组合物不同的浓度，10.3125％(H)、0.078125(M)、0.019532(L)。
从图9中可以看出：collagen1(1型胶原蛋白)以及HO-1(血红素氧合酶-1)在GAPDH(内参)一致的前提下，其条带灰度越高，说明我们相应的蛋白越多，而collagen1(1型胶原蛋白)以及HO-1(血红素氧合酶-1)是抗氧化或抗衰检测中重要的检测指标，collagen1和HO-1蛋白含量越多说明药物的抗氧化性能越好，从图9中看出，实施例1和实施例2提供的三种药物组合物均具有较佳的抗氧化或抗衰效果。
试验例8
实施例1和实施例2的药物组合物在B16细胞上对络氨酸酶抑制的分析
(1)将培养在100cm2细胞培养皿中的B16细胞用1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化，待细胞要从皿上脱落时，吸去胰蛋白酶溶液，用6mL RPMI1640培养基终止消化，并轻轻吹打使细胞分散，用离心管收集细胞并在800rpm下离心5min。
去掉离心后培养基，用2mL DMEM/F12(1:1)培养基重悬细胞，吸取20uL细胞悬液，与4％台盼蓝溶液以1:1比例混合，用countstar计数仪计数。以1.5×106个细胞每孔种于60cm2细胞培养皿中，并补充DMEM/F12(1:1)培养基至3mL。
(2)放于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。培养24h后，准备好待测样品，并根据cck-8测毒性实验结果选择和试验例5一致的浓度，并用1mL DMEM/F12(1:1)培养基稀释药物。同时加入终浓度为0.5mMα-MSH(购于MCE，HY-P0252)溶液，其中空白对照不加。加药完成后。放于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h。
(3)吸去培养基，用PBS溶液洗一次，再用300uL 0.25％胰蛋白酶溶液消化，再加入1mL RPMI1640培养基终止消化并将细胞吹散均匀，收集细胞并在800rpm下离心5min，并用PBS溶液洗三次，最后留下细胞沉淀。用500uL RIPA强裂解液，参照试验例6中的(2)和(3)。
(4)每孔加入60uL裂解上清到96孔板中，同时做好空白对照组。接着加入140uL的2mM L-Dopa(购于Macklin，L807435)溶液。37℃孵育30min，并在475nm波长处测样品的OD值，数据处理。在相等蛋白量的条件下，在475nm波长处测样品的OD值越大，说明络氨酸酶活性越高。反之亦然。故络氨酸酶相对活性＝实验组每单位蛋白中络氨酸酶活性/α-MSH组每单位蛋白中络氨酸酶活性，即以0.5μMα-MSH模型组的络氨酸酶相对活性为100％。
图10示出了实施例1和实施例2的药物组合物在B16细胞上对络氨酸酶抑制的分析。图10中，Ctrl代表空白对照组，L、M、H代表的意义与图9中的意义相同。
在图10中可以看出，加了实施例1和实施例2的药物组合物的实验组络氨酸酶相对活性小于0.5mMα-MSH模型组，小于空白对照组，说明上述药物组合物对络氨酸酶抑制具有较佳的抑制作用。
试验例9
实施例1和实施例2的药物组合物在HaCat细胞上对IL-8的抗炎分析
(1)参考试验例5中的(1)、(2)，将不同浓度的药物处理的HaCat细胞上清收集后。
(2)采用IL-8Elisa Kit(购于联科生物，EK108)进行检测。每孔加入300uL的WashBuffer，静置30s，倒去Wash Buffer，拍干Elisa板。分别加入50uL不同实施例提供的药物组合物以及不同浓度IL-8标准品，再每孔加入50uL的检测抗体。贴上封口膜，置于37℃孵育1.5h。
(3)去上清，每孔加入300uL的Wash Buffer，每次静置30s，重复洗6次。每孔加入100uL的anti-streptomycin HRP抗体，贴上封口膜，置于37℃孵育1h。
(4)去上清，每孔加入300uL的Wash Buffer，每次静置30s，重复洗6次。每孔避光加入100uL的TMB显色液，贴上封口膜，置于37℃孵育10min。之后每孔加入100uL的NaOH溶液终止显示反应。
(5)之后测得其在450nm波长处的OD值以及630nm处的OD值，并求出差值。并根据标准品得到标准曲线以及公式，并根据样品OD计算出样品IL-8的浓度或质量。
图11示出了实施例1和实施例2的药物组合物在HaCat细胞上对IL-8的抗炎分析。从图11中可以看出：IL-8在皮肤中过多的分泌，会加速皮肤的衰老以及加速皮肤松弛，与空白对照组相比较，本申请的两种药物在不同浓度下均能够很好的抑制IL-8的分泌。
从试验例1-试验例8可以看出：在ATCC8014菌种、ATCC9080菌种的培养基中加入地椒，有利于正向增强发酵产物在抗炎药物、清除DPPH自由基以及抑制络氨酸酶的性能；相应地，在ATCC1.91菌种、ATCC204508菌种的培养基中加入地椒，在抗炎药物、清除DPPH自由基以及抑制络氨酸酶的性能较弱。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括：
用含有地椒的ATCC9080菌种培养基培养ATCC9080，然后收集发酵产物；
所述含有地椒的ATCC9080菌种培养基中所述地椒的质量百分比为1-4％。
2.根据权利要求1所述的含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，其特征在于，
培养ATCC9080的培养条件为：在200-240rpm、35-40℃下培养20-35小时。
3.根据权利要求1所述的含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，其特征在于，
所述收集发酵产物的步骤包括：采用0.2-0.3μm的滤膜过滤，取滤液。
4.根据权利要求3所述的含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，其特征在于，
采用0.2-0.3μm的滤膜过滤之前还包括离心分离去除滤渣。
5.根据权利要求1-4任一项所述的含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述含有地椒的ATCC9080菌种培养基中所述地椒的质量百分比为2-4％。
6.一种含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过权利要求1-5任一项所述的制备方法制得。
7.权利要求6所述的含有ATCC9080菌种发酵产物的药物组合物在制备护肤品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述护肤品为美白护肤品。
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