KR100307460B1 - 활성단백질제조균주의애플로톡신생성억제식품조성물 - Google Patents

활성단백질제조균주의애플로톡신생성억제식품조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물에 관한 것이다. 본 식품조성물은 리조프스 올리고스포러스균(Rhizopus Oligosporus)을 접종하여 발효시켜 이루어지는 발효생성물에 있어서, 상기 발효물은 뽕나무잎과 양잠 부산물을 동일한 비율로 혼합하고, 상기 혼합물을 24시간 침지한 후 수분을 제거하여 121℃에서 15분간 가압멸균하여, 상기 혼합물에 사면 배양한 리조프스 올리고스 포러스 종국을 첨가하고 30℃에서 48시간 배양하여 55℃에서 24시간 통풍건조하여 분말화 한 것을 특징으로 한다. 이와같이, 본 발명인 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물은 발효과정에서 생성될 수 있는 애플로톡신의 생성을 억제할 수 있어 발효식품의 안정성을 높일 수 있으며, 상기 발효조성물에 함유된 콜라겐(Collagen)은 고혈압등 각종성인병 예방효과가 있어 건강 보조식품으로 호라용이 가능하여 사용자의 사용상 효율성을 극대화한다.
[색인어]
애플로톡신, 활성단백질

Description

활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물
본 발명은 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 조성물에 관한 것이다.
예로부터 음식물의 장기간 보관을 위해 발효법을 많이 사용하였다. 즉, 곰팡이, 효모 및 세균을 이용하여 여러 가지 곡류등을 발효시켜 섭취하였는데, 이러한 식문화는 우리나라를 비롯하여 아세아, 아프리카, 중동의 여러나라에서 사용되었고 각종 향신료 또는 인체에 이로운 전통식품으로써 그 활용도를 높였다.
그러나, 이러한 식품에는 미생물 독인 애플로톡신(Aflatoxin) 이 생성되는 경우가 많아 인체에 섭취시 해를 입게 되는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출 한 것으로써, 단백지 ㄹ분해능력이 뛰어난 미생물 리조프스 올리고스포러스(Rhizopus oligosporus)를 이용하여 이미 함유되어 있는 애플로톡신(Aflatoxin)의 양을 발효과정을 통하여 50%까지 감소시킴으로서 식품의 가치를 높이는 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 30℃에서 8일간 배양한 후 애플로톡신(Aflatoxin) 생성량의 비교 그래프이고,
도 2 는 본 발명에 따른 식물발효균주의 애플로톡신 분해반응 그래프이며,
도 3 은 본 발명에 따른 PHA자극실험 그래프이고,
도 4 은 본 발명에 의한 조성물을 성인병환자에게 전처리 한 경우와 안한 경우의 자극지수 그래프이다.
상기 목적은 본 발명에 따라, 리조프스 올리고스포러스균(Rhizopus oligosporus)을 접종하여 발효시켜 이루어지는 발효생성물에 있어서, 상기 발효물은 뽕나무잎과 양잠부산물을 동일한 비율로 혼합하고, 상기 혼합물을 24시간 침지한 후 수분을 제거하여 121℃에서 15분간 가압멸균하여, 상기 혼합물에 사면 배양한 리조프스 올리고스포러스 종국을 첨가하고 30℃에서 48시간 배양하여 55℃에서 24시간 동풍건조하여 분말화 한 것을 특징으로하는 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물에 의해 달성된다.
이하 첨부한 일 실시예 도면을 참고적으로 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다. 도 1 은 본 발명에 따른 30℃에서 8일간 배양한 후 애플로톡신(Aflatoxin) 생성량의 비교 그래프이며, 도 2 는 본 발명에 따른 식물발효균주의 애플로톡신 분해반응 그래프이며, 도 3 은 본 발명에 따른 PHA자극실험 그래프이며, 도 4 는 본 발명에 의한 조성물을 성인병환자에게 전처리 한 경우와 안한 경우의 자극지수 그래프이다.
[1. 실험예]
1) 수분 및 당 정량
수분은 상압건조법으로, 수용성당 및 총당은 사모지(Somogyi) 변법으로 정량하였다. 1015 다이제스터(digester)를 사용하여 분해하였다. 즉 발효식물단백질 분말 20g을 200㎖의 증류수를 넣고 워링브렌터(waring blender)로 5분간 균질화 시킨후 90℃까지 가열하여 효소활성을 불활성시키고 이 균질액 약 2g을 정평하고 진한 황산 10㎖, 촉매1정을 가하고 420℃에서 40분 분해후 1028디스틸링유니트(distilling unit)를 사용하여 분해액에 증류수50㎖와 40% NaO1150㎖를 가하여 증류하고 다른 수기에는 4% 브로모크레졸그린/메틸레드(bromocresol green/methylred)의 혼합지시약을 가한 포화 붕산수 25㎖을 취하여 증류한 후 0.5N HCL로 적정하여 회색을 종말점으로 하여 조단백질량을 계산하였다.
2) 수용성 질소
조단백을 위한 시료균질액을 11,000rpm으로 90분간 원심분리시킨 후 상등액을 여과지(Topy filter paper No. 1)로 여과하여 부유하는 유리지방을 제거하고 다시 상등액을 초고속 원심분리기에서 38,500rpm으로 90분간 원심분리후 부유하는 유리지방을 여과지(Whatman filter paer No.52)로 여과한 후 여액을 시료로 사용하여 테케터(Tecator)사의 켈텍시스템(Kjeltec ststem) 1018 다이제스트(digester),와 1028 디스틸링유니트(distilling unit)를 사용하여 0.1N HCL로 정량하였다.
3) 아미노산
아미노산의 양은 지방질 및 색소를 제거한 후 아미노산(amino acid) 자동분석기(Amino acid autoanalyzer)에 주입하여 표1과 같은 조건으로 분석하였다.
[표 1]
아미노산 분석기의 작용조건
(Operation conditions of amind acid autoanalyzer)
장치(Instrument) 히타치모델(Hitachi model) 835
행(Column) 2.5 150mm
이온교환수지(Ion-exchange resin) #2619
분석시간(Analysis time) 70 min
완충제유동속도(Buffer flow rate) 0.225ml/min
닌하드린플로워레이트(Ninhydrin flow rate) 0.3ml/min
칼럼 프레져(Column pressure) 80-13kg/cm
버퍼치인지스텝(Buffer change steps) 5 steps
컬럼템퍼러져(Column temperature) 53
옵티늄샘플캔티디(Optimum sample quantity) 3 mol/50 l
질소가스압력(N gas pressure) 0.28kg/cm
4) 조지방
삭스헬트(Soxhlet) 추출법으로 정량하였다.
5) 무기성분
발효엑시스 분말 2g을 정평하여 도가니에 넣고 회화시킨 후 건조기(desiccator)에서 방냉 후 개의 비산을 주의하면서 이온수로 적신 후 HCL(1:1) 약 10㎖을 가하여 증발건조시키고 다시 HCL(1:3) 약 8㎖을 가하여 유리봉으로 저으면서 탕욕 상에서 데운 다음 여지(Whatman filter paper No. 2)를 사용하여 여과하고 증발접시와 여과지를 잘 씻어 100㎖ 정용플라스크에 정용후 원자흡수 분광기(Instrumental Laboratory Inc. Model AAsp457)fH 표2와 같은 조건으로 분석하였다.
[표 2]
미넬랄함유에 대한 자동흡수 분광광도게(측광기)의 적용조건
(Operating condition of atomic absorption spectrophotometer for minerals)
웨이브(Wave) 422.7 324.7 248.3 766.5 285.2 279.5 589.0 213.9
길이{length(nm)}
스펙트럴(Spectral)1.0 1.0 0.3 1.0 1.0 0.5 0.5 1.0
밴드패스{band pass(nm)}
램프커런트(Lamp current) 7 5 8 7 3 5 8 3
퓨얼과 서포트(Fuel & Support) 공기-아세틸렌(Air - acetylene)
[2. 생체실험의 적정선]
옛부터 동의보감과 경험의학에서 태양이 뜨는 동방의 나무라고 불려온 뽕나무는 성인병에 효험이 있다고 하였다. 첫째, 1회 투여량 엑기스(고형분 50%)는 1g씩 1일 3회-4회 투여하였고, 둘째, 건조분말은 5g-10g 1일 3회 투여하였으나, 아무런 부작용이 없었으며 변기가 해소되고 피부가 좋아졌다고 하였고, 발효과정중 유기성 호라성성분이라 함은 수분에 용해되어 있는 단백질과 무기질을 통칭한 것이며 호라겅단백질이라함은 식물에는 소화되지 않은 성분이 비교적 많아서 발효과정을 통하여 작용할 수 있도록 품질이 향상되어서 단백질 지질 및 다른 성분들의 소화가 용이하게 되었고 동시에 풍미도 양호하게 되었으며 무기성분에는 Ca, Fe, K, Ma함량이 많았으며 양질의 단백질 함량도 많았다.
[실시예1]
1) 오염되지 않은 식물의 잎 또는 뿌리 100%
2) 리조프스올리고스포러스(RHIZOPUS OLIGOSPORUS)균주
3) 발효에 필요한 미약성 인자(Vitamin Mineral Amido 산등)를 첨가
4) 무공해 단백질이 풍부한 식물을 채취하여 RHIZOPUS OLIGOSPORUS 접종 미생물이 생성하는 아밀레제프로타이제(Amylase Protease), 리파제(Lipase)등의 각종 효소력의 작용으로 당질 및 단백질 발효 숙성시켜 활성 단백질로 변화시켜 추출한다.
5) 증류수를 용출용매로 하여 온도 37±0.5℃, 회전수 100rpm에서 용출시험을 실시하였다. 시료투입후 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120분마다 용출액을 취하여 흡광도를 측정, 용출률을 구하였다.
6) 사용기기
배기는 Difco 제품을 Aflatoxin 추출 및 TLC 전개용 Chloroform과 Aceton은 Merck 사계를 TLC 전개용 Chloroform과 Aceton은 Merck 사계를 TLC Plate는 Merck사계0.25mm60F254를 사용하였고 Aflatoxin 표준품으로 SIGMA제 AflatoxinB1를 사용하였으며 그와의 시약은 특급시약을 기준으로 사용하였다.
[3. 제조실험적용예]
1) 분말로한 식물(중부내륙지방 구릉지에서 자란 뽕나무잎)40g 24시간 물에 불린후 채로바치면서 여분의 수분을 제거한 후 500㎖ 용기에 취하여 감자 옥수수견분이 각1%가 되도록 가한 뒤 121℃, 15분간 가압멸균한 후 상온이 되게 하고 사면 배양한 리조프스올리고스포러스(Rhizopus Oligosporus)를 접종하였다. 잘 혼합한 뒤 30℃배양기에서 2일간 배양하였다. 분말로 하기 위해 건열멸균시킨 식물(뽕나무잎) 분말을 20g씩 첨가하여 분말화한 것을 종국으로 사용하였다.
2) 분쇄한 뽕잎분말을 40g을 24시간 물에 불린 후 물기를 빼고 전분질원료를 1%첨가하고 121℃에서 15분간 가압멸균하여 상온에서 5%의 종국을 첨가하고 30℃배양기에서 배양하면서 12, 24, 32, 36, 48시간 간격으로 취하여 55℃에서 하룻밤 통풍건조시킨 후 몰타르에 갈아서 분말화 한 후 시료로 사용하였다. 활성단백질제조균주의 애플로톡신(Aflatoxin)분해 등 측정균체외 분비되는 애플로톡신(Aflatoxin) 분해산물의 효과를 보기위하여 와이에스(YES)배지에서 1-7일간 30℃에서 배양된 배양액을 Watean No.4여과지에 여과시키고 이 여과액 10㎖을 애플로톡신(Aflatoxin)B1200g의 애브솔므트에테놀(Absolmte ethanol), 900㎖의 0.2 소듐아세테이트버퍼(Msodium acetate buffer)와 혼합하여 샤커(shaker)에서 10rpm의 속도로 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응후 즉시 끓은 물에 3분간 가열하여 반응을 정지시킨 다음 대조구로서 배양여과액 대신 증류수 10㎖를 반응시켜서 사용 하였다.
애플로톡신(Aflatoxin)정량에 관해 설명하면 다음과 같다. 애플로톡신(Aflatoxin) 반응액은 세페레이터리 패널리(seperatory funneldmf) 사용하여 클로트프롬(choloroform) 30㎖로 1회 15㎖씩 2회 추출하였다. 이 추출물은 무수Nax SO4를 사용하여 수분을 제거하고 감압에서 농축시켰다. 이액과 대조구를 각각 TLC 플레이트(Plate)에 스팟팅(spotting)하여 애플로톡신(Aflatoxin)의 분해율을 비교하였다.
사용한 모든 기구는 5% 소듐 하이퍼쉬로레이트(Sodium Hypochlorite)를 사용하여 제독하였다.
3) 화학성분분석수분 및 당정량측정, PH측정, 조단백질측정, 수용성질소, 조지방 등은 식품공전에 따라 분석하였다.
아미노산 : 아미노산양은 지방질 및 색소를 제거한 후 아미노산(amino acid) 자동 분석기로 주입하여 분석하였다.
4) 활성단백질 제조 과정중 화학 성분의 변화 및 애플로톡신(Aflatoxin)의 오염여부와 호라성단백질 제조 균주의 애플로톡신(Aflatoxin) 생성억제 및 분해작용에 관한 실험을 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
가. 담금 48시간 수분함량은 모든 시험구에서 3%정도식 증가하였으며 총당은 10.72-16.58%에서 2.66-5.16%로 감소하였고 조지방은 7.57-8.94%에서 6.94-7.24%가 되었고 PH는 5.12-6.07에서 6.20-6.38로 등가하였다.
나. 조단백질의 양은 담금히우 거의 변하지 않았으며 수용성질소는 3.0-5.0ug%에서 2.0-2.6ug%가 되었고 글루타민산(glutamic acid)과 아스파틱산(aspartic acid) 및 아르기닌(arginine) 등의 함량이 많았다.
다. 무기성분중에는 K, Ca, Mg, Zn, Cu, Fe함량이 많았으며 주입시킨 무기질, 아미노산비타민의 량은 증가하였다.
라. 리조프스올리고스포러스(R. oligosporus)를 이용하여 제조한 활성단백질에는 애플로톡신(Aflatoxin)의 생성을 볼 수 없었다.
마. 활성단백질 제조균주인 리조프스올리고스포러스(R. oligosporus)를 생성 균주인 플라버스(Asp. flavus)와 혼합배양한 결과 플라버스(Asp. flavus) 단독 배양시에 비하여 애플로톡신(Aflatoxin) 생성량이 28-40%로 감소하였으며 제조균주의 배양여액을 애플로톡신(Aflatoxin)과 30분간 반응시켰더니 애플로톡신(Aflatoxin)의 33%을 분해시켰다. 그리고 양질의 수용성 섬유소가 존재하고 있다.
[실시예2(실제적용에 관한)]
암환자에서 세포성 면역기능의 결함 내지 저하는 주지의 사실로 받아들여 지고 있으며, 특정한 단백분해 효소가 암세포를 파괴시킨다는 것을 입증하였다. 성인병환자 고혈압 당뇨 신장질환은 병의 진행정도와 면역기능 정도와 시험관내(in vitro)에서의 면역능 의존성 임파구의 면역능 정도와 일치한다.(Ducos et al., 1970; Whittaker et all971; Harrish& Copeland 1974) 시험관 내에서 항원이나 자극 물질(mitogen)에 의한 임파구의 배아구 전환(blast transformation)을 보는 것이 임파구의 세포성 면역기능을 판단하는 지표로 사용됨이 보편적이다(teele et al., 1972; Levy and Kaplan. 1974) 유전학적 단백질은 숙주면역제를 발달시키고 유지시키는 기관으로서 인체의 세포와 상피에서 여러 "폴리펩타이드(Polypeptide)"을 생성함으로서 (Goldstein et al., 1972) 기관으로서 역할을 하고, 생성된 Polypeptide 성분은 시험관내에서와(Bach et al., 1971; Komaro & Boyse, 1973) 생체내(in vivo)에서(wara et al., 1975) 면역 의존성 임파구의 성분과 ㅜㄴ화를 유도하고 세포성 면역기능을 높이며 세포노화 유도로 암억제(생명공하 ㄱ연구소 신용득박사) 각종 유전자 단백질이 발견하였으나, 이것은 어느 특수한 종에만 특이하게 작용을 하였으며 모든 빌병발생원인은 제일 먼저 그 질병을 퇴치할 수 있는 면역체계의 파괴에서 오는 것으로 유전자의 손상 및 변이가 제일먼저 오는 것으로 사료된다. 유전공학을 이용 생산된 활성단백질을 원발성 면역결핍증과 성인병환자에서의 전T세포가 Tcell로 성숙되어 면역기능이 회복됨을 관찰하였고, 폐암환자에서 화학요법과 병용함으로서 생존율이 증가하였다. 본 활성단백질성분인 뽕잎발효엑시스 천연타우린, 구약정분, 비타민 B군이 정상대조군과 고혈압, 당뇨, 환자의 말초 임파구를 분리하여 전처리후 PHA자극시험을 실시하여 T세포의 면역기능에 변화를 비교 관찰하여 이들물질의 면역요법의 임상응용 가능성을 알아보면 다음과 같다.
[4. 실험재료 및 방법]
1). 관찰대상
1997년 04월부터 1998년 1월까지 리압구정크리닉에 내원하여 혈액학적으로 확진된 성인병환자25명(고혈압 15에, 당뇨10)를 대상으로 하였고, 이들 평균연령은 54 4.7세이고 정상대조근으로 선택된 정상인 17명의 평균 연령은 52 3.8세이었다.
2) 방법
(1) 임파구의 분리
프리러베이션 프리헤파린(Preservative free heparin)을 처가한 주사기로 상환 정맥혈액 15㎖를 무균적으로 채취하여 동량의 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Inatitute 1640, Difco, Nith, U. S. A.)으로 희석한 다음 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) 용액에 띄운 다음 실온에서 2,000rpm으로 40분간 원심분리 하여 형성되 임파구층을 분리한다. 분리된 임파구를 RPMI 1640으로 2회 씻어 낸 후 재 부유 한다.
(2) 활성단백질의 적정량을 결정하기 위하여 세포 수 2×106/㎖ 당 50ug 100ug, 250ug, 500ug으로 전처리한 후 PHA 자극실험한 결과 100ug가 적당하다고 판단하였기에 (그림1)과 같이 본 실험을 실시하였다. 분리한 임파구에 10% 우데 혈청은 첨가하여 각가그이 임파구 2×106/㎖로 2개의 시험관에 나누어 제1시험관에는 37℃에서 세포의 배양액만을 (A), 제2시험관에는 JUST THIS 100ug을 첨가한 후 CO2배양기에서 45분간 배양한 다음 1,000rpm으로 10분간 원심분리하여 2번 씻었다.
(3) (A), (B)에서 100ug을 취하여 림브로 마이크로플레이드 웰(LIMBRO MICROPLATE WELL)에 넣은 후 파이토글루틴닌(PHYTOHEMAGGLUTININ)(PHA-P, DIFCO LABORATORIES, BETROIT, MICH, U. S. A.)10ug을 넣어 48시간 배양하였다. 또 시험관내 환경을 조성하고자 (A)에서 100ug을 취하여 PHA를 첨가하지 않고 정확하게 100ug만 넣은 후 같은 시간 배양하였다.
(4) 표지 방법
48시간 후 3H-시미다인(THYMIDINE) 2uci를 가하고 다시 18시간 CO2항온기에서 배양하였다. 그후 마이크로하베스트(Microharvester)에서 하베스팅(harvesting)후 이에 신틸레이션 칵테일 벤젠(Scintillation cocktail benzene)100ug을 1L의 톨루엔(toluene)에 녹인 것 5㎖를 각각 가해서 방사능 계측병에 옮긴 후 이를 자동 방사능측정기로 측정하였다.
(5) PHA 자극지수
PHA 10ug을 가한 후 측정한 방사능계수(c.p.w)를 PHA를 가하지 않고 측정한 비교자료를 나누어 자극치수를 다음과 같이 계산하였다.
시험(TEST)(C.P.M)
자극지수(STMULATION INDEX) = 콘트롤(CONTROL)C.P.M)
일반적으로 중증 성인병환자는 면역기능 특히 T세포 면역등이 저하 되었음은 잘알려져 왔지만 이들 기능저하로 인하여 병이 발생되고 증식이 촉진되는지, 질병의 원인을 인하여 세포성면역이 감소되는지는 의문이다. 그러나 질병의 원인으로 성이병 중증환자의 세포성면역능을 저하시키고 이로 인하여 만성질환이 더욱더 촉진되는 악순환이 발생함은 분명하다. 따라서 세포성 면역 즉 T세포기능의 저하 정도는 만성환자의 임상상 및 애후와 밀접한 관계가 있다. 저자들이 성격에도 PHA자극지수가 만성환자에게 정상 대조군에 비해 현저히 낮아 성인병 만성환자에게는 세포기능저하를 재확인할 수 있으며 성인병 중증의 고혈압, 중증의 당뇨환자에서도 확인되었다. 활성단백질이 시험관에서 T세포기능을 항진시키는 것은 E-로세터(resette) 형성등 자극물질에 대한 반응, 혼합임파구 배양법 등으로 확인 되었다.
생체내에서의 활성단백질은 지연성 피부반응 및 조직부적합성 피수이식등의 세포성 면역반응을 향상시킨다. 원발성 면역결핍증, 바이러스 질환, 전신성홍빈성난창, 뇨독증, 후천성면역결핍증등 세포성면역 결함이 있는 질환군에서 활성단백질을 투여한 결과 세포성 면역기능이 회보고디고 임상상도 호정됨을 고무적인 사실로 이들 성분이 보조 면역증가세로 임상예의 응용가능성을 제시하고 있다. 특히 이들 시료는 타 약제와는 달리 종 특허성이 없으므로 광범이한 질환에 특수 영양식 및 보건식품으로 사용함이 가능하다. 저자들의 성적중 흥미 있는 점은 시료를 주어 시험관내에서 발효 단백질조성 환경과 같은 조건에서 의의 있는 방사능 계수의 증가, 즉 DNA합성 증가를 볼 수 있었는데 이는 정상대조군 보다 면역기능저하환자군에서 더욱 뚜렷하여 이들 물질을 통하여 T 세포의 성숙 및 분화를 유도함을 간접적으로 알 수 있었다.
본 발명인 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물은 발효과정에서 생성될 수 있는 애플로톡신의 생성을 억제할 수 있어 발효식품의 안정성을 높일 수 있으며, 상기 발효조성물에 함유된 콜라겐(Collagen)은 고혈압등 각종성인병 예방효과가 있어 건강 보조식품으로 활용이 가능하여 사용자의 사용상 효율성을 극대화 하는 매우 훌륭한 발명이다.

Claims (1)

  1. 리조프스 올리고스포러스균(Rhizopus Oligosporus)을 접종하여 발효시켜 이루어지는 발효생성물에 있어서, 상기 발효물은 뽕나무잎과 양잠부산물을 동일한 비율로 혼합하고, 상기 혼합물을 24시간 침지한 후 수분을 제거하여 121℃에서 15분간 가압멸균하여, 상기 혼합물에 사면 배양한 리조프스 올리고스포러스 종국을 첨가하고 30℃에서 48시간 배양하여 55℃에서 24시간 통풍건조하여 분말화 한 것을 특징으로 활성단백질 제조균주의 애플로톡신 생성억제 식품조성물.
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