CN117752572A - 唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了唐古特铁线莲的两种提取物在制备促黑色素生成剂中的用途，本发明首次发现唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物可以显著促进酪氨酸酶活性，并显著提高黑色素的生成水平，本发明将为唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物应用于促黑发/防白发的头发洗护用品、美黑化妆品组合物、护肤品组合物、食品以及促进黑色素生成的药品的应用奠定理论基础和应用参考。

Description

唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物的用途

技术领域

本涉及提取物的应用技术领域，具体涉及一种唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物的用途，特别涉及一种唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物在制备促黑色素生成剂中的用途。

背景技术

黑色素是生物体内存在的天然色素，在人体内具有多种功能，例如保护皮肤、保护神经系统、调节机体温度以及保护视觉。

黑色素形成过少，将导致人体发生多种不良后果：例如因遗传等问题而缺乏黑色素导致白癜风；毛发黑色素形成不足，也会导致白发增多影响美观；而皮肤黑色素形成不足皮肤对紫外线的抵抗力下降，进而提升皮肤癌的风险；另外黑色素可以帮助保护眼睛免受过度光线的伤害，眼睛黑色素不足的人可能对光线更敏感，有时可能会导致视力问题，甚至是眼盲。

在外界环境刺激下，如紫外线照射，可以经过一系列的信号传导促进皮肤中的黑色素细胞中小眼畸形相关转录因子MITF(Microphthalmia-associated TranscriptionFactor)的表达，MITF可以进一步促进酪氨酸酶的激活，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴，进而经过一系列氧化反应生成黑色素。黑色素合成后，会被细胞包装成黑色素颗粒，进而被转移到周围的角质形成细胞中，这些细胞构成了皮肤的外层。在这个过程中，黑色素颗粒分布在细胞内，为皮肤、毛发提供颜色，并吸收紫外线以保护DNA免受损伤。

因为黑色素合成不足将导致上述出现的各种问题，因此针对上述问题开发相关的促黑色素生成剂具有广阔的市场前景。

发明内容

本申请之目的在于提供一种唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物在制备促进黑色素生成剂的用途，经实验验证唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物能够促进黑色素细胞MITF的表达，进而促进酪氨酸酶活性，并促进黑色素的生成，以达到促黑效果。

为了解决上述技术问题，本申请提供下述技术方案：

本申请提供一种唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物在制备促黑色素生成剂中的用途。本申请所述的莲叶提取物/莲茎提取物是指莲叶提取物或莲茎提取物。本申请所述的促黑色素生成剂是指能够促进黑色素生成的产品。在一些实施例中，所述促黑色素生成剂除了包括莲叶提取物和/或莲茎提取物，还可以根据需求添加其他组分。

优选地，所述促黑色素生成剂用于促进黑色素细胞中小眼畸形相关转录因子的表达水平。

优选地，所述促黑色素生成剂用于促进细胞酪氨酸酶活性。

优选地，所述促黑色素生成剂用于促进黑色素细胞产生黑色素。

优选地，在所述促黑色素生成剂中，所述莲叶提取物和所述莲茎提取物的浓度分别为25μg/mL-100μg/mL。

优选地，所述促黑色素生成剂为头发洗护产品、化妆品组合物、护肤品组合物、食品或药品中的一种。

优选地，所述头发洗护产品用于促黑发和/或防白发。

优选地，所述化妆品用于美黑。

优选地，所述药品用于治疗生物体黑色素缺乏的生理性病变。例如，所述生理性病变为包括但不限于白癜风、白化病等。

优选地，所述促黑色素生成剂为水剂、膏剂或乳液。

与现有技术相比，本申请具有如下的有益效果：

本申请首次发现唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物能够促进黑色素细胞MITF的表达，促进其酪氨酸酶活性，促进黑色素细胞生成更多黑色素，其莲叶提取物和莲茎提取物可用于制备促黑色素生成剂，可应用于洗护用品、化妆品、食品以及药品。

进一步地，本申请首次发现唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物能够显著促进黑色素细胞产生黑色素的浓度，为将来唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物应用于促进黑色素生成的洗护用品、化妆品、食品以及药品中奠定理论基础和应用参考。

附图说明

图1为实施例1中的MTT法测定的B16F10细胞增殖率结果示意图；

图2为实施例2中的不同浓度的植物提取物处理B16F10细胞后黑色素含量测定结果示意图；

图3为实施例3中的不同浓度的植物提取物对酪氨酸酶活性的影响的测定结果示意图；

图4和图5为实施例4中的不同浓度的植物提取物对MITF表达影响的测定结果示意图；

在上述附图中：

唐古特铁线莲莲叶提取物用LY表示，唐古特铁线莲莲茎提取物用LJ表示；

ns代表结果与阴性对照组相比无统计学显著性差异；

*代表p值<0.05，表示结果与阴性对照组相比有统计学显著性差异；

**代表p值<0.01，表示结果与阴性对照组相比有统计学显著性差异；

***代表p值<0.001，表示结果与阴性对照组相比有统计学显著性差异；

****代表p值<0.0001，表示结果与阴性对照组相比有统计学显著性差异。

具体实施方式

本发明所使用的各原材料来源或组成如下：

小鼠B16F10黑色素细胞：中国科学院上海。

唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物：来自中国科学院大连物化所，其制备方法为：将唐古特铁线莲植物分为叶、茎两部分，分别粉碎过60目筛，烘干，按照料液比1:5(g:mL)用石油醚冷浸过夜，过滤回收石油醚，滤渣再次烘干；用超声辅助方法提取唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物的皂苷，条件为提取温度30℃，料液比为1:20(g:mL)，时间30min，甲醇浓度70％，超声频率40kHz，超声功率100W；用萃取法对叶、茎粗提液分别进行处理除去部分杂质，再用AB-8大孔树脂除杂，去除蛋白质、糖类、无机盐、小分子亲水性的有机物等杂质，在树脂柱洗脱过程时用TLC显色分析流出液，直至流出液不含皂苷，最后对洗脱液进行浓缩至干，得到唐古特铁线莲的莲叶皂苷和莲茎皂苷，在本发明中将提取得到唐古特铁线莲的莲叶皂苷和莲茎皂苷称为唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物。

DMEM培养液/培养基：DMEM培养液购自Life Technology生物公司，按血清体积比为10％的比例加入胎牛血清形成DMEM培养基。

胎牛血清：购自Gibco公司。

MTT试剂盒：MTT为二苯基四氮唑溴盐，试剂盒购自碧云天公司。

DMSO：二甲基亚砜，购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚，购自上海泰坦科技股份有限公司

L-dopa：购自阿拉丁生化科技公司。

MITF抗体：购自proteintech生物公司。

β-actin抗体：购自Cell Signaling Technology公司。

HRP兔抗：购自Abclonal Technology公司。

HRP鼠抗：购自Abclonal Technology公司。

实施例：

下面将结合本申请的实施例，对本申请的技术方案进行清楚和完整的描述。如无特别说明，所用的试剂和原材料都可通过商业途径购买。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

MTT法测定唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物对B16F10细胞增殖率的影响

实验过程：

①细胞接种：取小鼠B16F10黑色素细胞长至其面积为10cm细胞培养皿的90％，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两遍，加入浓度比为0.25％胰酶消化2min，加入DMEM培养基2mL终止消化，1000转/分钟离心3min，弃上清，再加入5mL DMEM培养基悬浮B16F10黑色素细胞，并计数。取96孔板，每孔加入5.0×10³个B16F10黑色素细胞，每孔100μL DMEM培养基，接种后放入37℃培养箱培养24h。

②药物配制：使用DMSO将唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物分别配制成1mg/mL作为浓储试剂，在实验时各自用DMEM培养基稀释成500μg/mL、100μg/mL、50μg/mL，以含有体积比为5‰DMSO的DMEM培养基培养的B16F10细胞作为阴性对照组。

③MTT测定：细胞接种24h后，吸弃培养基，用PBS洗涤后，每孔加入100μL实验药物工作液孵育，药物工作液的浓度即上述药物配制中用培养液配制的各个药物浓度。药物孵育24h后，每孔加入10μL MTT(二苯基四氮唑溴盐)溶液(5mg/mL)，然后放于培养箱继续孵育4h，再吸去上清，并加入100μL DMSO后，避光孵育10min。用酶标仪于570nm处检测每孔OD值(吸光度)。

细胞存活率计算方法：细胞存活率(％)＝(实验组OD值/空白对照组OD值)×100％。

结果如图1所示，由于500μg/mL的唐古特铁线莲莲叶提取物和500μg/mL的唐古特铁线莲莲茎提取物有细胞毒害效果，而100μg/mL的唐古特铁线莲的莲叶提取物和100μg/mL的唐古特铁线莲的莲茎提取物无细胞毒害作用，因此在细胞实验中，应选择100μg/mL以下的药物工作液浓度。由于黑色素细胞过度增殖会导致体系紊乱，所以在筛选促进黑色素活性的物质时，不能过度促细胞增殖，如图1、2所示，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物在100μg/mL以下的浓度时均不会导致黑色素细胞的过度增殖，且均没有显著细胞毒性，说明唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物在100μg/mL以下的浓度时对于黑色素细胞性质温和、健康安全。

实施例2

唐古特铁线莲的莲叶提取物和唐古特铁线莲的莲茎提取物影响B16F10细胞产生的黑色素含量测定。

实验过程：

①细胞接种：取小鼠B16F10黑色素细胞长至其面积为10cm细胞培养皿的90％，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两遍，加入浓度比为0.25％胰酶消化2min，加入2mL DMEM培养基终止消化，1000转/分钟离心3min，弃上清，再加入5mL DMEM培养基悬浮B16F10黑色素细胞，并计数。取96孔板，6cm培养皿，每皿加入13.0×10⁴个B16F10黑色素细胞，每皿加入3mL DMEM培养基，接种后放入37℃培养箱培养24h。

②药物配制：使用DMSO将唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物分别配制成1mg/mL作为浓储试剂，在实验时各自用DMEM培养基稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL，以含有体积比为1‰DMSO的DMEM培养基培养的B16F10黑色素细胞作为阴性对照组，以含有浓度为100nM的α-MSH的DMEM培养基培养的B16F10黑色素细胞作为阳性对照组。

③黑色素测定：细胞接种培养24h后，吸去培养基，用PBS洗涤后，每皿加入3mL药物工作液，药物工作液的浓度即上述药物配制中用培养液配制的各个药物浓度。药物孵育72h，每隔24h换一次药物工作液，72h后吸去培养基，用PBS洗涤两次，加入0.25％胰酶消化2min，加入2mL DMEM培养基终止消化，1000转/分钟离心3min，弃上清，再加入5mL DMEM培养基悬浮细胞，并分别计数，最终每皿取5×10⁶细胞量，再1000转/分钟离心3min，弃上清，每管细胞加入200μL体积比为1％的TritonX-100溶液裂解细胞，随后再离心，离心结束后去上清，再向细胞团块中加入50μL的2mol/L的NaOH溶液(含体积比为10％的DMSO)，95℃金属浴2.5h，混匀后再次离心，上清转移至96孔板中，40μL/孔，用酶标仪于405nm处检测每孔OD值。

黑色素生成率计算方法：黑色素生成率(％)＝(实验组OD值/阴性对照组OD值)×100％。

结果如图2所示，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物在工作浓度范围内均具有显著提高B16F10细胞黑色素产量的效果，并且两种提取物的黑色素提升效果均有显著的浓度依赖效应，在25μg/mL-100μg/mL范围内，植物提取物浓度越高，促黑效果越显著。

实施例3

唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物对B16F10细胞酪氨酸酶活性影响的测定

实验过程：

①细胞接种：同实施例1。

②药物配制：同实施例2。

酪氨酸酶活性测定：细胞接种培养24h后，吸去培养液，用PBS洗涤，每孔加入100μL药物工作液，药物工作液的浓度即实施例2药物配制中用培养液配制的各个药物浓度，药物孵育24h后，吸去培养基，用PBS缓冲液洗涤2次。每孔加入体积比为1％的TritonX-100 100μL，将96孔板置于-80℃冰箱30min。取出室温融化，重复两次，使细胞充分裂解。放入37℃培养箱预热，然后加入1mg/mL L-dopa的PBS溶液100μL，置于37℃培养箱2h，用酶标仪于490nm处检测每孔OD值。

酪氨酸酶活性计算方法：(实验组OD值/阴性对照组OD值)×100％。

酪氨酸酶活性是检测促黑效果的一个重要指标，结果如图3所示，在浓度范围内，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物均有促进酪氨酸酶活性的效果。

实施例4

唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物对B16F10细胞MITF表达影响的测定

实验过程：

①细胞接种：取小鼠B16F10黑色素细胞长至90％的10cm培养皿，PBS洗涤两遍，加入0.25％胰酶消化2min，加入含胎牛血清的其体积比为10％的DMEM培养基2mL终止消化，1000转/分钟离心3min，弃上清，再加入5mL DMEM培养基悬浮细胞，并计数。取24孔板，每孔加入16×10⁴个细胞，每皿加入3mL培养基，接种后放入37℃培养箱培养24h。

②药物配制：同实施例2

③MITF的Western-blot实验：细胞接种后，吸去培养液，用PBS洗涤，每孔加入100μL药物工作液，药物工作液的浓度即实施例2药物配制中用培养液配制的各个药物浓度，药物孵育3h后，吸去培养基，每孔加入50μL的1×SDS溶液裂解细胞，收集裂解液并于95℃金属浴10min，再用裂解液去跑10％SDS-PAGE电泳胶，先120V下10min，再160V下45min，电泳结束后再在400mA恒流条件下转膜1h，转膜结束后用浓度为5％的脱脂牛奶封闭PVDF膜，封闭结束后孵育MITF一抗以及β-actin一抗14h，β-actin作为内参，一抗孵育结束后孵育一抗对应的二抗，最后显影拍照，并用imageJ统计数据。

MITF的表达水平是检测促黑效果的一个重要指标，结果如图4、5所示，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物在其浓度为50μg/mL和100μg/mL时都有显著提高B16F10细胞表达的MITF水平。

综上可见，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物均有显著提高黑色素细胞活性的效果，可以大幅促进黑色素的产量。

虽然上述针对黑色素转换和黑素生成调节的研究主要是针对小鼠细胞进行的，但一般的结论可以适用于所有的产生黑色素的头发和皮肤，为了探究促进黑色素生成的方法，本发明采用小鼠B16F10黑色素细胞，发现唐古特铁线莲的莲叶提取物和莲茎提取物不会促进黑色素细胞的增殖，进而保证了其安全性，但同时可以促进酪氨酸酶的活性，并提高黑色素的产量。因此，唐古特铁线莲莲叶提取物和唐古特铁线莲莲茎提取物在促黑发/防白发的头发洗护用品、美黑化妆品与食品以及促进皮肤黑色素生成的医药品方面具有应用潜力。

上述实施例的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

上述对实施例的描述是为了便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本申请。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必付出创造性的劳动。因此，本申请不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本申请披露的内容，在不脱离本申请范围和精神的情况下做出的改进和修改都本申请的范围之内。

Claims (10)

1.唐古特铁线莲的莲叶提取物/莲茎提取物在制备促黑色素生成剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促黑色素生成剂用于促进黑色素细胞中小眼畸形相关转录因子的表达水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促黑色素生成剂用于促进酪氨酸酶活性。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促黑色素生成剂用于促进黑色素细胞产生黑色素。

5.权利要求1至4任一项所述的用途，其特征在于，在所述促黑色素生成剂中，所述莲叶提取物和所述莲茎提取物的浓度分别为25μg/mL-100μg/mL。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述促黑色素生成剂为头发洗护产品、化妆品组合物、护肤品组合物、食品或药品中的一种。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述头发洗护产品用于促黑发和/或防白发。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化妆品用于美黑。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药品用于治疗生物体黑色素缺乏的生理性病变。

10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述促黑色素生成剂为水剂、膏剂或乳液中的一种。