JP2017055665A

JP2017055665A - 有用産物の生産方法

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Publication number: JP2017055665A
Application number: JP2015180554A
Authority: JP
Inventors: 幸三古門; Kozo Furukado; 実也古見; Saneya Furumi; 今田　千秋; Chiaki Imada; 千秋今田; 五十嵐　康弘; Yasuhiro Igarashi; 康弘五十嵐
Original assignee: INTORON KK; POINT PYURU KK
Current assignee: INTORON KK; POINT PYURU KK
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2017-03-23

Abstract

【課題】海洋微生物を、沖縄皇金ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、春ウコン、ギムネマシルベスタ等の薬草や豆乳中の成分を含む培地で培養することによって、有用産物を産生する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】薬草を含む豆乳培地を調製する培地調製工程と；前記豆乳培地に海洋由来乳酸菌を植菌する植菌工程と；前記海洋由来乳酸菌を所定の条件で増殖させる培養工程と；前記培養工程において前記海洋由来乳酸菌が前記薬草に含まれる化合物の構造を変換する変換工程と；を備える有用産物の生産方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、乳酸菌を用いた有用産物の生産方法に関する。より詳細には、海洋由来の乳酸菌を、薬草を含有する培地中で培養し、抗酸化活性その他の複数の生理活性を有する産物を生産する方法に関する。

海産物には種々の微生物が生存することが知られている。微生物の種類によっては、毒素を産生するものもあるが、ヒトにとって有用な生理活性を有する化合物を産生するものもある。
近年、高齢者の人口の増加に伴う医療費の上昇を抑制するために、予防医学的見地から、健康を維持することについての呼びかけが行われ、健康志向が強まっている。

栄養状態が向上する一方で、運動量が減少したことに伴って、肥満が問題となっている。肥満は、高血圧、高コレステロール血症、糖尿病等の主要な要因である。逆に言えば、肥満を解消できれば、こうした疾患の患者数を大きく減少させることができることになる。

また、肉類の摂取量が増加すると、血中の尿酸値が上昇し、痛風を発症したり、腎障害のリスクが上がることも知られている。さらに、欧米型の食事には、和食よりも脂質が多く含まれるため、脂肪の摂取量が増加するが、脂肪は生体内で代謝（酸化）される際に、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル等の活性酸素が発生することも知られている。こうした活性酸素は正常細胞を障害し、また、癌、糖尿病その他の疾患を惹起したり、老化の原因となることも知られている。

健康志向の高まりにつれて、発症後に治療するのではなく、病気の発症を抑制するために特定の食品（以下、「健康食品等」という。）を摂取するという流れとなっている。こうした健康食品等の例としては、脂肪分や糖分の吸収を抑制するもの、脂肪の分解を促進するもの等を挙げることができる。これは、医食同源という考え方に基づくものである。

ところで、日本の各地には、伝統的に使用されてきた多くの生薬があるが、沖縄には、沖縄薬草と総称される種々の薬草がある。例えば、クワンソウ、沖縄皇金ウコン、春ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、ギムネマシルベスタ等を挙げることができる。

こうした生薬には、種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、ねむり薬、腎臓病、水虫、関節炎、湿潤効果、発毛抑制、健胃、糖尿病、便秘、解熱・鎮静、高血圧等に効果があるとして使用されてきている。これらの生薬は植物性であり、そうした植物が生育した環境によって含まれる生理活性物質にも相違があることも知られている（非特許文献１）。

また、環境中に生存する微生物としては、土壌微生物（陸生の微生物）がよく知られており、発酵食品の生産に、コウジ菌（Aspergillus oryzae）、ショウユコウジカビ（Aspergillus sojae）、乳酸菌等が使用されてきた。また、土壌中ばかりではなく海洋中にも様々な微生物が生存していることも知られており（非特許文献２）、こうした海洋性の微生物の中には、例えば、美白性を有する化合物を産生するカビ等があることも知られている（非特許文献３）。

Bulletin of the Hokkaido Forestry Research Institute, No.27.November, 1989 海洋微生物の分子生態学入門―生態学の基礎から分子まで、2001年4月20日発行、石田祐三郎著、（株）培風館海の微生物の利用−未知なる宝探し−、2009年2月18日発行、今田千秋著、（株）成山堂書店

従来、発酵食品の製造には、陸生の微生物が使用されてきたが、海洋微生物はほとんど使用されていない。これは、試料採取の困難性等によって海洋微生物の研究が、陸生の微生物に比べると立ち遅れていることに起因する。

食品・医薬品・化粧品等に配合する化合物については、化学合成することもできるが、微生物を利用することによる幾つかの利点があることが知られている。例えば、化学合成を行なうと、ラセミ体が製造されてしまうが、微生物に産生させると、Ｄ体又はＬ体の一方だけを選択的に効率よく製造することができる。そして、ラセミ体ではないことから、Ｄ体とＬ体との分離・精製が不要となり、コストも少なくて済むという利点がある。

このため、これまでにない化合物を産生できるような新たな微生物に対する強い社会的な要請があった。また、ある属に属する微生物としては公知であっても、これまでには知られていない新たな特性を有しており、それが有用産物の産生につながるものである場合には、微生物自体の性質をある程度推定することができるため、全く新規に発見された微生物の培養に比べれば、培養法の確立又はスケールアップ等はそれほど困難ではないと考えられる。このため、こうした特性を有する微生物に対する強い社会的な要請があった。

本発明は、以上のような状況の下で完成されたものである。すなわち、本発明は、海洋微生物をある種の成分を含む培地で培養することによって、有用産物を産生する方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明のある実施態様は、薬草を含む豆乳培地を調製する培地調製工程と；前記豆乳培地に海洋由来乳酸菌を植菌する植菌工程と；前記海洋由来乳酸菌を所定の条件で増殖させる培養工程と；前記培養工程において前記海洋由来乳酸菌が前記薬草に含まれる化合物の構造を変換する変換工程と；を備える有用産物の生産方法である。

ここで、前記薬草は、沖縄皇金ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、春ウコン、ギムネマシルベスタからなる群から選ばれるいずれかの植物である、ことが好ましい。また、前記培地中の前記薬草の含有量は、豆乳の容量に対して1/1000〜5/1000であることが好ましい。

前記海洋由来乳酸菌は、久米島の海洋由来のラクトバチルス・デルブリッキ KM-2（Lb.delbrueckii KM-2）であることが好ましい。また、前記培養工程における所定の条件は、前記海洋由来乳酸菌を37℃にて24〜72時間培養するものであることが好ましい。

本発明の別の態様は、上記の方法によって産生された有用産物を含む豆乳発酵液である。ここで、前記豆乳発酵液は、少なくともスーパーオキシド消去活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、及びアミラーゼ阻害活性を有することが好ましい。

本発明のさらに別の態様は、上記の豆乳発酵液を含有する食品である。ここで、前記食品は、ヨーグルト、サプリメント、ドリンク及び栄養調整食品からなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。

また、本発明のさらに別の態様は、上述した豆乳発酵液を含有する化粧品である。ここで、前記化粧品は、仕上用化粧品、皮膚用化粧品及び頭髪用化粧品からなる群から選ばれるものであることが好ましい。前記仕上用化粧品は、口紅用化粧品または化粧下であることがより好ましい。前記皮膚用化粧品は、クリーム、乳液、洗顔料、化粧水、化粧液及びパックからなる群から選ばれるいずれかのものであることがより好ましい。前記頭髪用化粧品は、洗髪料または整髪料であることが好ましい。
本明細書中で、上記化粧品は、総務庁総務局統計基準部発表の日本標準商品分類（平成２年６月改訂）に記載の分類に準拠している。

本発明によれば、海洋由来の微生物を利用して、沖縄産の薬草に含まれる化合物の構造を変換することにより、有用産物を産生する方法を提供する。また、この方法によって、スーパーオキシド消去活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性及びアミラーゼ阻害活性を有する豆乳発酵液を産生することができる。

図１は、低温環境（15℃）における乳酸菌KM-2と標準菌株（NBRC3202）との増殖性の相違を示す図である。図２は、培養前（Ａ）、培養開始24時間後（Ｂ）、及び同48時間後（Ｃ）における培養ビンの状態を示す写真である。図３は、本発明の豆乳発酵液のスーパーオキシド消去活性を示す図である。

図４は、本発明の豆乳発酵液のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示すグラフである。図５は、本発明の豆乳発酵液のアミラーゼ阻害活性を示すグラフである。図６Ａは、本発明の豆乳発酵液を添加した場合と添加していない場合との線維芽細胞の増殖状態の相違を示す顕微鏡写真である。図６Ｂは、本発明の豆乳発酵液を添加した場合と添加していない場合とのコラーゲン合成促進活性を示すグラフである。

図７は、本発明の豆乳発酵液の細胞活性効果を示すグラフである。図８は、本発明の豆乳発酵液のヒアルロン酸産生促進効果を示すグラフである。図９は、本発明の豆乳発酵液（10倍希釈）のチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。

以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、沖縄産の薬草を含む豆乳培地に海洋由来乳酸菌を植菌し、所定の条件で増殖させる過程で、前記海洋由来乳酸菌が前記沖縄産の薬草に含まれる化合物から有用産物を生産する方法である。

沖縄産の薬草としては、春ウコン、秋ウコン、沖縄皇金ウコン、グァバ、クミスクチン、ノニ、クワンソウ、シークワァーサー、黒人参、レモングラス、長命草、キダチアロエ、ギムネマシルベスタ等を挙げることができる。

これらのうち、沖縄皇金ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、春ウコン、ギムネムシルベスタからなる群から選ばれるいずれかの沖縄薬草を使用することが、各々の薬理活性を上昇させる理由から好ましい。これらの中でも、ギムネマシルベスタ、春ウコン及びレモングラスを使用することが、後述するスーパーオキシド消去活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性及びアミラーゼ阻害活性を有する豆乳発酵液を得ることができることから好ましい。以下に、これらの生薬の性状及び用途を簡単に説明する。

生薬名クミスクチン（和名：ネコノヒゲ、ラテン名：Orthosiphon stamineus）は、東南アジア原産の多年草である。葉は対生、楕円形であり、高さは約１ｍに達する。茎は赤紫色、花は白または淡いピンク色で、茎の先に散状をなして咲き、美しい。沖縄では腎臓病や膀胱炎、むくみ、水虫、関節炎などに、全草を煎じたものを服用されてきた。

生薬名春鬱金(和名：ウコン、ラテン名：Curcuma aromatica)は、インドが原産であり、伝統医学のアーユルヴェーダやインド料理に使われ、また、根茎に含まれるクルクミンは黄色い染料の原料としても広く用いられてきた。沖縄では、黄色の着色料として用いられ、また湿潤効果や発毛抑制作用があり、健康食品として利用されている。
生薬名沖縄皇金ウコン（和名：秋ウコン、ラテン名：Curcuma longa）は、苦みが無いオレンジ色の生薬である。利胆、健胃作用があり、肝機能を増進する。

生薬名ギムネマシルベスタ（ラテン名：Gymnema sylvestre）は、インドの南部、中央部又はスリランカの熱帯林を原産とするハーブである。この植物の葉を噛み続けると甘味を感じなくなる。古来、インドでは糖尿病の治療用薬草として使用されている。
生薬名キダチアロエ（ラテン名：Aloe arborescens）は、普通観賞用に栽培され、茎が伸びて立ち上がる。暖地では戸外でも育ち冬に赤橙色の花をつける。葉の外皮は苦味が強いが、葉内部のゼリー質は苦味はない。葉肉の内服で健胃効果があるとされ、また含有するバルバロインの下剤効果により便秘に効果がある。

生薬名黒人参（ラテン名：Daucus carota）は、オレンジ色のニンジンにはあまり含まれていないアントシアニジンやポリフェノールを非常に多く含んでいる、黒紫のニンジンである。抗酸化作用があり、健康食品として利用されている。
生薬名レモングラス（ラテン名：Cymbopogon citratus）は、東南アジアに多く生息する。レモンの香味成分であるシトラールを含有しているため、アジア料理にハーブとして利用される。香料としても利用されており、インドでは、伝染病、発熱、鎮静剤、殺虫剤として用いられる。
生薬名長命草（和名：牡丹防風（ボタンボウフウ）、ラテン名：Peucedanum japonicum）は、高血圧、動脈硬化、リュウマチ、神経痛、喘息、風邪に効くと言われ、あらゆる病気の予防に良いと言われている。

以上の生薬は、乾燥させたものを使用することが、気象条件に左右されることなく、安定的に供給できることから好ましい。
豆乳培地は、市販の豆乳（成分無調整）に、上記の沖縄生薬の乾燥粉末を、それぞれ、約1/2000〜1/100の割合で添加することが好ましく、約1/1000〜5/1000で添加することがさらに好ましい。

また、上記のようにして調整した豆乳培地には、海洋由来乳酸菌を、1ｘ10⁵〜1ｘ10⁶個/mLとなるように植菌することが、活性，品質の面で安定した発酵産物を得る理由から好ましく、約４ｘ10⁵個/mLを植菌することが、産生される有用産物の特性を確認する上で好ましい。ここで使用する海洋由来乳酸菌は、久米島の海岸に生息するアマモという海草から得られたものであることが、後述するような特性を有する有用産物の産生量が高いことから好ましい。

こうした海洋由来乳酸菌は、定法に従って分離・同定することができる。具体的には、乳酸菌選択分離培地（炭酸カルシウム含有MRS培地）を用いて得ることができる。得られた海洋由来乳酸菌を、16S rRNA遺伝子の塩基配列を解析に基づく方法によって同定し、命名する。例えば、これらの低温での増殖性を確認することにより（図１参照）、培養時に培養タンクを加熱する必要がない低温増殖性の株を選択することができる。

上記のようにして植菌した培養ボトルは、添加した薬草によって、図２に示すように培地の色が変わることがある。植菌後所定の温度で所定の時間静置培養することが、活性，品質の面で安定した発酵産物を得る理由から好ましい。例えば、約30〜38℃で、36〜72時間培養することができ、約37℃で約48時間培養することが、発酵により有効成分を得る理由から好ましい。

培養終了後に得られた豆乳発酵物を低温殺菌することが、過剰に発酵が進行することにより発酵物中の有効成分を変化させない理由から好ましい。この低温殺菌は、約60〜70℃で15〜45分間行うことが、この発酵物中に含まれるタンパク質の変性等を防ぐ上で好ましく、約60℃で約30分とすることが効率的な処置ができることからさらに好ましい。

低温殺菌後、上記の豆乳発酵物を遠心して上清を分離する。毎分約1万回転で、約10分間、約４℃で遠心することが、発酵産物中の有効成分を変化させない理由から好ましい。以上のように処理をして得られた培養上清を、以下、「豆乳発酵液」という。

豆乳発酵液は、HPLCに供し成分を分析するとともに、生理活性の評価を行うことが、発酵が再現性よく行われ，活性成分が生成していることを確認する理由から好ましい。HPLCとしては、各種の分取カラムを使用した分取クロマトグラフィーを行なうことが、この豆乳発酵液に含まれている有効成分を特定する上で好ましい。

また、評価する生理活性としては、例えば、抗菌活性、抗酸化活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、アミラーゼ阻害活性、コラーゲン合成促進活性、ヒアルロン酸合成促進活性、チロシナーゼ阻害活性、脂肪分解阻害活性、グルコース吸収阻害活性、アディポネクチン分泌促進活性等を挙げることができ、抗酸化活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、アミラーゼ阻害活性、コラーゲン合成促進活性、ヒアルロン酸合成促進活性、チロシナーゼ阻害活性を評価することが、以下の理由から好ましい。

抗酸化活性は、生体内に過剰に発生したスーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等の活性酸素を除去する活性をいう。活性酸素は、本来、体内に侵入した病原菌、腫瘍の原因又は誘因となる異常細胞等の非自己と認識される異物を除去する生体防御機構の１つである。しかし、過剰に発生した活性酸素は、タンパクやDNAを損傷させるために、自己の細胞を障害する原因物質として作用するものとなる。このため、糖尿病や腫瘍等その他の種々の疾病の原因となるほか、老化を早める原因ともなるからである。ポリフェノールやビタミンＣ等が活性酸素を消去する作用を有する化合物として知られており、これらを豊富に含む食品が、活性酸素の除去に有効であるとされている。

また、キサンチンオキシダーゼ(XOD)は、ヒポキサンチンからキサンチン、さらにキサンチンから尿酸という代謝に関わる酵素である。そして、血中の尿酸量が増えると，痛風や腎障害のリスクが高まる。このため、XODを阻害することによって尿酸の生成量を減少させることができるからである。実際に、アロプリノール、トピロキソスタット等のXOD阻害剤は高尿酸血症、痛風の治療に使われている。

アミラーゼは、唾液や膵液に含まれる酵素であり、食事中のデンプンを分解して麦芽糖を生成する。麦芽糖はマルターゼによりさらにグルコース（ブドウ糖）へと分解される。デンプンから生成されたグルコースは、小腸で血液中へ吸収され、細胞のエネルギー源となる。しかし、グルコースが過剰に生成されると、脂肪へと変換されて貯蔵されるため、肥満の原因となる。また、血中グルコース濃度が高い状態が続くとタンパク質の糖化が起こり、老化や様々な疾病の原因となる。アカルボース等のアミラーゼ阻害剤を食事前に摂取すると、食餌中のデンプン（米、小麦粉、イモ類の主成分）の分解を抑制し、小腸からの糖吸収を防ぐことにより、結果として低血糖を保つため、糖尿病治療薬として使用されている。こうしたアミラーゼ阻害活性成分を含む健康食品やサプリメントは、糖尿病やその予備軍である高血糖の人の血糖値をコントロールする上で有効である。

加齢とともに真皮のコラーゲン量が減少し、肌のハリがなくなったり、しわが多くなったりする。逆に言えば、真皮のコラーゲン量を増やすことができれば、ハリのあるしわのない肌を維持することができる。このため、コラーゲンの産生促進効果を評価することによって、化粧品等に使用できるかどうかを判断することができる。

また、ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンであり、皮膚の水分量の維持に大きな役割を果たす化合物である。加齢とともに減少することから関節炎などに対する効果、美肌効果などが期待されており、俗に、「関節痛を和らげる」「美肌効果がある」といわれている。ヒアルロン酸の産生促進効果を評価することで、健康食品や化粧品等に使用できるかどうかを判断することができる。

チロシナーゼは、メラニン色素産生の原因となる酵素である。紫外線によってフリーラジカル（活性酸素）が発生すると、その刺激によって表皮のメラノサイト（色素細胞）が活性化される。そして、活性化されたメラノサイトは、チロシナーゼを活性化させ、メラノサイト内のチロシンメラニン色素に変換されシミ・ソバカスができる。スキンケアにとって、シミ・ソバカスへの有効な対処が求められており、チロシナーゼ阻害活性を評価することで化粧品として使用できるかどうかを判断することができる。

（実施例１）海洋由来乳酸菌の取得
久米島の海岸で採取した海草（アマモ）を、ソースとして使用した。
採取した海草２ｇ（湿重量）、滅菌海水20mLを遠心管に入れ、ボルテックスミキサーで攪拌した。攪拌して得られた液を、１％炭酸カルシウム含有MRS寒天培地に0.1ｍL塗抹し、27℃、７日間培養した。培養後、培地上に出現したコロニーから炭酸カルシウムの溶解（ハロー）が確認できたコロニーを釣菌した。釣菌した株は３％過酸化水素水を滴下し、発泡が見られなかった株を乳酸菌候補株とした。すなわち、乳酸菌は乳酸をはじめとする酸を代謝して炭酸カルシウムを溶解させ、カタラーゼ陰性であることが特徴としてあげられる。乳酸菌候補株は16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析に基づく同定方法により、Lactobacillus delbrueckii KM-2と名付けた。

得られた菌のうち、KM-2の特性を以下のようにして確認した。まず、MRS培地を用いた低温環境（15℃）における増殖性を検討した。対照菌株としては、陸上起源である乳酸菌NBRC3202（標準菌株）を使用した。結果を図１に示す。
対照菌株では、培養開始15日を経過しても増殖が見られなかったのに対し、KM-2は、培養開始８日目から増殖し、15日目まで順調に増殖した。

（実施例２）乳酸菌発酵条件の検討
沖縄皇金ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、春ウコン、ギムネマシルベスタを選定した。これらの植物は、全てが沖縄産であるため、台風その他の気象災害の影響を受けると、安定供給ができないという事態が生じ得る。こうした事態を防ぐために、これら全ての植物は生ではなく、乾燥粉末（（株）沖縄長生薬草製）を使用した。

成分無調整の市販の有機豆乳（マルサン社製）を、スクリューキャップ付きの滅菌済のガラス製培養ボトルに200mL入れた。ここに下記表１に示す沖縄産原料の乾燥粉末を、それぞれ１g/L、３g/L、５g/Lの濃度で添加し、4x10⁵個/mLのKM-2を稙菌して、37℃にて48時間静置培養した。結果を図２に示す。
培養開始48時間後に得られた各豆乳発酵物を、恒温インキュベーターを用いて60℃にて30分、低温殺菌し、４℃にて10分間遠心し（1万回転）、上清を得た。各生薬を添加した豆乳発酵物の上清の量及びpHを表１に示す。

得られた上清を２つに分けて、一方を下記の条件によるHPLC分析に供した。
HPLC条件：
カラム：Microsorb（アジレント・テクノロジー社製）
溶媒：MeCN/0.1% ギ酸
流速：1.2mL/分

また、もう一方は、抗酸化活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、アミラーゼ阻害活性、抗酸化活性、コラーゲン合成促進効果（正常ヒト皮膚由来線維芽細胞）、ヒアルロン酸合成促進効果（正常ヒト皮膚由来線維芽細胞）、及びチロシナーゼ活性阻害試験に供した。

（実施例３）抗酸化活性（スーパーオキシド消去活性）
上記実施例２で得られたそれぞれの薬草１ｇ入り豆乳発酵物を２．５倍と５倍に希釈した。下記表２に示すように試薬を混合し、SOD Assay Kit-WST（（株）同仁化学研究所製）を用いてアッセイを行った。すなわち、これらの溶液を37℃で20分間反応させ、450nmで吸光度を測定した。表中、*で示した試薬は、SOD Assay Kit-WSTに付属のものを使用した。

結果を図３に示す。図３に示した阻害率は、以下の式より求めた。
阻害率(%)=[(OD_blank1-OD_blank3)-(OD_sample-OD_blank2)]/ (OD_blank1-OD_blank3)×100 （式１）
式１中、ブランク１は阻害剤なしでの発色、ブランク２は試料対照、ブランク３は試薬対照とした。

図３から明らかなように、１gの薬草のみを蒸留水に添加して培養した場合には、沖縄皇金ウコン、春ウコン、ギムネマシルベスタ及びキダチアロエにはスーパーオキシド消去活性は見られなかった。これに対し、豆乳培地に１gの薬草を添加した豆乳発酵液では、２．５倍希釈液を使用すると、全ての試験区でスーパーオキシド消去活性が見られた。５倍希釈液で活性を検討すると、消去活性は低下するが、沖縄皇金ウコン、春ウコン、又はレモングラスをそれぞれ添加した豆乳発酵液の阻害には大幅な低下は見られなかった。５倍希釈液で消去活性を検討したときには、これらの生薬の中では、レモングラスが最も強い消去活性を示した。同じ希釈率の豆乳発酵液のみの活性を比較すると、薬草添加なしの場合の活性は弱いことから、ここで示された活性はレモングラスの成分に由来するものと考えられた。

（実施例４）キサンチンオキシダーゼ阻害活性
キサンチンオキシダーゼは、下記表３に示す試薬を96穴プレートに入れてボルテックスミキサーで混合し、37℃にて３分間インキュベートし、295nmで吸光度を測定した。結果を図４に示す。阻害活性は、陽性対照（アロプリノール）を100％としたときの阻害率で示した。阻害率は、下記の式１より求めた。
阻害率（％）=100-[(OD_sample-OD_blank3)/(OD_blank1-OD_blank2)×100] （式２）
上記式２中、ブランク１は試薬対照、ブランク２は阻害剤なしでの発色、ブランク３は試料対照とした。下記の表３中のブランク１〜３は、上記式１と同様である。

表１に示した薬草のみを培地に加えた区では、春ウコン、ギムネマシルベスタ及びキダチアロエはいずれもキサンチンオキシダーゼ活性は見られなかった。これに対し、薬草の添加量が増えるにしたがって、いずれの区でも阻害活性に上昇がみられた。
豆乳発酵液に薬草１gを添加した群では、ギムネマシルベスタを添加した区で約50％の阻害が観察された。薬草３gを添加した群では、黒人参添加区を除いた区において、約50％以上の阻害が見られた。薬草５gを添加した群では、春ウコン添加区とキダチアロエ添加区とが100％以上の阻害を示した。また、ギムネマシルベスタ添加区も約80％という高い阻害活性を示した。

ギムネマシルベスタでは、１g添加区と３g添加区の阻害活性の上昇を比べると、５g添加区での阻害活性の上昇率が低くなっていた。これに対し、春ウコン及びキダチアロエはほぼ添加量に比例した阻害活性の上昇がみられた。
以上より、これらの阻害活性は、薬草の成分に由来するものと考えられた。

（実施例５）アミラーゼ阻害活性
次いで、アミラーゼ阻害活性を検討した。下記の表４に示す試薬を混合し、37℃で１時間反応させた後に620nｍの吸光度を測定した。結果を図５に示す。阻害率は、以下の式３から求めた。
阻害率（％）=(OD_B-OD_S)/OD_B×100 （式３）
式中、OD_Bは、反応後の対照区の吸光度、OD_Sは、反応後の被検区の吸光度である。

未発酵豆乳及び薬草のみを添加した群では、アミラーゼ阻害活性は見られなかった。また、薬草を添加した群では、１g又は３gのギムネマシルベスタがほぼ100％以上の阻害活性を示し、３gを添加した区では150％を超える阻害活性を示した。

（実施例６）コラーゲン合成促進等の評価試験
（１）コラーゲン合成促進の評価
コラーゲン合成促進の評価には、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を使用した。20,000細胞／wellで96ウェルプレートに播種し、10％FBS含有イーグルMEM培地中で24時間、前培養を行なった。培地中の豆乳発酵液の濃度が５％になるように添加して、評価培養は、0.5％FBS含有イーグルMEM培地中で48時間行った。陽性コントロールとして、リン酸L-アスコルビルマグネシウム（以下、「APMg」と略すことがある。）を使用した。
判定には、コラーゲンステインキット（コスモバイオ社製）を使用し、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度を使用し、コラーゲン量を求めた。結果を図６（Ａ）及び６（Ｂ）に示す。

図６（Ａ）に示すように、豆乳発酵液を添加したか否かによって、線維芽細胞の増殖が促進されていることが確認された。また、図６（Ｂ）に示すように、コラーゲンの産生量は、薬草の添加量が増加するにしたがって、増加する傾向が見られた。

（２）細胞活性に及ぼす影響の評価
細胞活性に及ぼす影響の評価は、上記（１）と同様に培養した培養上清を用いて、MTT還元法により行った。MTT還元法は、MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 黄色のテトラゾール）が、紫色のホルマザン色素へ還元されるという現象を利用した酵素活性を測定する比色定量法である。結果を図７に示す。
図７に示すように、細胞の活性化については、いずれの薬草でも高い活性化効果は見られず、また、活性化抑制効果も見られなかった。

（３）ヒアルロン酸産生促進の評価
ヒアルロン酸産生促進効果の評価には、上記（１）と同様に培養した培養上清を用いた。QnE Hyaluronic Acid (HA) ELISA Assay（Biotech Trading Partners社製USA）を用いて、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。結果を図８に示す。

図８に示したように、生薬添加群では、いずれも、沖縄皇金ウコン区及び春ウコン区で促進効果が見られた。５g添加群では、沖縄皇金ウコンと春ウコン以外に、ギムネマシルベスタ添加区で高い産生促進効果が見られた。

（実施例７）チロシナーゼ活性阻害作用
チロシナーゼ活性阻害作用は、下記表５に示す試薬を混合し、37℃で42分間反応させた後に490nmの吸光度を測定した。阻害率は、以下の式４から求めた。
阻害率（％）=((B-Bc)-(S-Sc))/(B-Bc)×100 （式４）
式中、Bは、反応後の対照区の吸光度、Bcは、反応前の対照区の吸光度、Sは、反応後の試験区の吸光度、Scは、反応前の試験区の吸光度である。結果を図９に示す。

図９に示したように、未発酵豆乳液及び豆乳発酵液のみでは、チロシナーゼ阻害活性は見られなかった。これに対し、長命草、ギムネマシルベスタは、１〜３gのいずれの量を添加した場合でも高い阻害活性を示した。その他の生薬では、添加量によるばらつきが大きかった。

以上より、薬草を添加せずに培養した場合、及び薬草のみを蒸留水に添加して培養した場合には見られない活性が、薬草を添加した豆乳培地を使用した場合には見られることが明らかになった。また、この活性が１つの薬草に限られるものではなく、必ずしも濃度依存性があるわけでもない。このことは、KM-2がこうした薬草に含まれる成分（化合物）を、こうした活性を示す化合物に変換していることを示すものである。

（実施例８）
豆乳発酵液を含有する化粧品の製造例を以下に示す。
（１）製造例１
下記表６に示す組成のスキンローション１を製造した。

（２）製造例２
下記表７に示す組成のスキンローション２を製造した。

本発明は、医薬品、健康食品及び化粧品の分野において有用である。

Claims

薬草を含む豆乳培地を調製する培地調製工程と；
前記豆乳培地に海洋由来乳酸菌を植菌する植菌工程と；
前記海洋由来乳酸菌を所定の条件で増殖させる培養工程と；
前記培養工程において前記海洋由来乳酸菌が前記薬草に含まれる化合物の構造を変換する変換工程と；
を備える有用産物の生産方法。
前記薬草は、沖縄皇金ウコン、黒人参、キダチアロエ、長命草、レモングラス、クミスクチン、春ウコン、ギムネムシルベスタからなる群から選ばれるいずれかの植物である、ことを特徴とする請求項１に記載の有用産物の生産方法。
前記培地中の前記薬草の含有量は、豆乳の容量に対して1/1000〜5/1000であることを特徴とする請求項１又は２に記載の有用産物の生産方法。
前記海洋由来乳酸菌は、久米島の海洋由来のラクトバチルス・デルブリッキ KM-2（Lb.delbrueckii KM-2）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の有用産物の生産方法。
前記培養工程における所定の条件は、前記海洋由来乳酸菌を37℃にて24〜72時間培養するものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の有用産物の生産方法。
前記請求項１〜５の方法によって産生された有用産物を含む豆乳発酵液。
前期豆乳発酵液は、少なくともスーパーオキシド消去活性、キサンチンオキシダーゼ阻害活性、及びアミラーゼ阻害活性を有することを特徴とする、請求項６に記載の豆乳発酵液。
請求項６又は７に記載の豆乳発酵液を含有する食品。
前記食品は、ヨーグルト、サプリメント、ドリンク及び栄養調整食品からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項８に記載の食品。
請求項６又は７に記載の豆乳発酵液を含有する化粧品。
前記化粧品は、仕上用化粧品、皮膚用化粧品及び頭髪用化粧品からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項１０に記載の化粧品。
前記仕上用化粧品は、口紅用化粧品または化粧下であることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品。
前記皮膚用化粧品は、クリーム、乳液、洗顔料、化粧水、化粧液及びパックからなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品。
前記頭髪用化粧品は、洗髪料または整髪料であることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品。