CN117100666A - 一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的应用，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。本发明发现乳酸菌/水仙鳞茎发酵液具有良好的抗炎和抗敏作用，以及具有保湿作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的应用。
背景技术
随着化妆品在日常生活中越来越不可或缺，人们对化妆品的安全性提出了更高的要求。化妆品市场更多的关注于自然、温和、不刺激、安全性高的天然化妆品原料。
水仙不仅具有很高的观赏价值，在《本草纲目》、《中药学大辞典》和《植物大辞典》中均记载水仙具有较好的药用价值，同时，水仙鳞茎水提物是《已使用化妆品原料目录(2021年版)》收录的植物原料之一。目前，对于水仙的研究、开发及应用主要集中在生物碱类活性成分，除此之外，水仙鳞茎的水提物中含有富含多糖。正常情况下，水仙鳞茎含有多种生物碱，例如石蒜碱和秋水仙碱。其中秋水仙碱就是在水仙鳞茎中被发现。秋水仙碱能够阻断有丝分裂、抑制细胞增殖、影响微管稳定性和促使细胞凋亡。因此，一般作为特殊用途，例如科研或药用。由于秋水仙碱是水溶性的，直接采用水仙鳞茎水提物作为化妆品原料使用容易让一些消费者不放心。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在制备抗炎组合物中的应用，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
本发明的另一目的，在于提供一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在制备抗敏的组合物中的应用，其中，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
本发明的再一目的，在于提供一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在保湿组合物中的应用，其中，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。保湿组合物可以是保湿化妆品。
优选地，将干净新鲜的水仙球茎粉碎匀浆，加0.5倍-1.5倍体积95％乙醇，50-70℃加热浸提1-3h，过滤，弃去上清，取渣，加入15-25倍体积的纯水，4℃过夜浸提，离心，取上清液，检测糖度至3-3.5，待接菌发酵。
优选地，加0.5倍-1.5倍体积95％乙醇，50-70℃加热浸提1-3h的步骤重复1-3次。
优选地，离心为1000rpm-10000rpm，10min-60min。
优选地，发酵时间为48h-96h。
优选地，将活化好的乳酸乳球菌以4％-6％接种量加入制备好的水仙鳞茎水提物中，36-38℃恒温培养。
优选地，恒温培养摇床50-500rpm。
本发明还提供抗炎组合物，包括乳酸菌/水仙鳞茎发酵液，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
本发明还提供抗敏组合物，其包括乳酸菌/水仙鳞茎发酵液，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
本发明发现乳酸菌/水仙鳞茎发酵液具有良好的抗炎和抗敏作用。本发明发现乳酸菌/水仙鳞茎发酵液无石蒜碱和秋水仙碱，安全性较高。本发明还发现发酵之后，保湿作用提升。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为不同浓度样品对细胞活力的影响：(a)RAW264.7细胞活力(b)HaCaT细胞活力.
图2为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对AQP3含量的影响：(a)保湿模型中AQP3含量(b)干燥模型中AQP3含量。
图3为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对AQP3和FLG相对表达量的影响。
图4为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对RAW264.7细胞形态的影响。
图5为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对RAW264.7细胞NO释放量的影响。
图6为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对RAW264.7细胞TNF-α和IL-6释放量的影响。
图7为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对透明质酸酶的影响。
具体实施方式
为证实本发明所提出的乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的安全性与功效性，进行下述实施例中的实验，并对实验结果进行详细的分析讨论。
试剂材料如下所列，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
水仙球茎、购于漳州水仙养殖基地。
乳酸菌，编号：BNCC195305，购于北纳生物
HaCaT细胞完全培养基：10％ FBS+90％ DMEM高糖培养基
RAW264.7完全培养基：10％ FBS+90％ DMEM高糖培养基
1000U/mL透明质酸酶溶液：称取3.3mg透明质酸酶，用1.0mL醋酸缓冲溶液完全溶解，现用现配。
醋酸缓冲溶液：取4.8mL的0.2mol/L醋酸溶液与45.2mL的0.2mol/L醋酸钠溶液，混合，调pH＝5.6定容至100mL。
乙酰丙酮溶液：50mL 1mol/L碳酸钠溶液和3.5mL乙酰丙酮溶液混匀，现用现配。
P-DAB显色剂：0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇，混合均匀，现用现配
实验方法如下描述，如无特殊说明，均为常规方法。
①水仙鳞茎水提取制备：挑选新鲜未发芽的水仙球茎，清洗并剥除外皮，将干净新鲜的水仙球茎粉碎匀浆，加1倍体积95％乙醇，60℃加热浸提2h，相同条件下重复1次，过滤，弃去上清，取渣，加入20倍体积的纯水，4℃过夜浸提，离心(6000rpm，30min)，取上清液，检测糖度至3-3.5，待接菌发酵。
②乳酸菌株活化与培养：配制固体培养基，制备平板，将冻存的乳酸乳球菌快速解冻，用接种环蘸取菌液在平板培养基上划线，30℃恒温培养箱中培养24～48h。配制液体培养基，用接种环挑取平板上的单独菌落，将其接种于液体培养基中，37℃恒温摇床培养12～24h。继续扩大培养，至检测菌体数量达到108/mL即可得到活化后的菌种种子液。
③乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液制备：将活化好的乳酸乳球菌以5％接种量加入制备好的水仙鳞茎粗多糖中，37℃恒温摇床150rpm培养72h。121℃灭菌15min，离心(9000rpm，30min)，取上清，0.22μm滤膜过滤，即为乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液。
④利用HPLC(高效液相色谱)检测乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液中生物碱的含量。
⑤细胞培养：购置细胞HaCaT和RAW264.7细胞，复苏，于37℃、5％ CO2条件下培养，弃去培养基，PBS清洗残余的培养基，胰酶消化，加入与胰酶等体积的FBS终止消化，加入两倍体积PBS，吹打收集细胞悬液，1500rpm，离心5min，完全培养基重悬细胞，传代培养，取生长对数期且状态良好的细胞用于下一步试验。
⑥CCK法检测细胞活率：实验设计阴性对照组和样品组，样品设计6个浓度梯度组，浓度从高至低为C1组、C2组、C3组、C4组、C5组和C6组，每组3个平行孔。将生长对数期且状态良好的细胞消化下来，离心，以相应的细胞培养液悬浮，细胞计数，根据不同细胞大小、培养经验和实验需求制备为一定细胞浓度的细胞悬液，向96孔板的每孔中加入95μL细胞悬液(经验值：HaCaT细胞数量3*104/孔，RAW264.7细胞数量4*104/孔)，37℃、5％ CO2条件下过夜培养(14±2)h，加样(阴性对照组每孔分别加入5μL PBS，样品组每孔分别加入5μL对应浓度的样品)，37℃、5％ CO2条件下培养24h，按照CCK试剂盒说明添加CCK试剂并检测吸光值，计算细胞活率。
⑦Hacat细胞检测保湿活性：保湿模型——将生长对数期且状态良好的细胞消化下来，离心，以相应的细胞培养液悬浮，细胞计数，制备为一定细胞浓度的细胞悬液，实验设计空白组和样品组，每组3个平行孔，向48孔板的每孔中接种200μL细胞悬液，37℃、5％ CO2条件下培养过夜(14±2)h，弃去培养液，用200μL/孔生理盐水或PBS清洗细胞，空白组每孔加入190μL培养基和10μL PBS，样品组每孔加入190μL培养基和10μL样品，37℃、5％ CO2条件下培养24h，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书检测并计算AQP3含量，干燥模型——将生长对数期且状态良好的细胞消化下来，离心，以相应的细胞培养液悬浮，细胞计数，制备为一定细胞浓度的细胞悬液，实验设计空白组、干燥组和样品组，每组3个平行孔，向48孔板的每孔中接种200μL细胞悬液，37℃、5％ CO2条件下培养24h，弃去培养液，用200μL/孔生理盐水或PBS清洗细胞，空白组和干燥组每孔加入190μL培养基和10μL PBS，样品组每孔加入190μL培养基和10μL样品，37℃、5％ CO2条件下培养24h，将干燥组和样品组的细胞置于超净工作台中，以风速0.31m/s进行干燥处理，37℃、5％CO2条件下继续培养24h，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书检测并计算AQP3含量；消化并收集细胞，按照qPCR试剂盒检测AQP3和FLG的相对表达量。
⑧RAW264.7细胞检测抗炎活性：将生长对数期且状态良好的细胞消化下来，离心，以相应的细胞培养液悬浮，细胞计数，制备为一定细胞浓度的细胞悬液，实验设计空白组(PBS组)、对照组(LPS组)和样品组，每组3个平行孔，向48孔板的每孔中接种200μL细胞悬液，37℃、5％ CO2条件下过夜培养(14±2)h，弃去培养液，用200μL/孔生理盐水或PBS清洗细胞。空白组每孔加入195μL培养基和5μLPBS，对照组组每孔加入191μL培养基和4μL的LPS工作液(LPS终浓度为1μg/mL)和5μLPBS，样品组每孔加入191μL培养基和4μL的LPS工作液(LPS终浓度为1μg/mL)和5μL待检测样品，37℃，5％ CO2条件下培养24h，观察细胞形态，收集细胞上清，按照试剂盒说明书检测并计算NO、IL-6和TNF-a含量。
⑨透明质酸酶抑制实验检测抗敏活性：参照Elson-Morgan改良法检测透明质酸酶抑制率，按照下表中分别设置A——样品组、B——样品对照组、C——阴性组、D——阴性对照组，并按表中的步骤进行实验。样品用蒸馏水稀释20倍。
表1透明质酸酶抑制实验过程
计算透明质酸酶抑制率(％)＝[l-(A管-B管)/(C管-D管)]*100％
实验结果描述如下
①分别以石蒜碱和秋水仙碱标准品作为对照，相同条件下检测乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液中石蒜碱和秋水仙碱的含量，结果如下表2所示，乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液中并无对应的秋水仙碱和石蒜碱峰出现。
表2乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的安全性检测
②细胞活力——为了保证后期实验数据的可靠性，本发明在探究乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的功效前，通过CCK实验检测了水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液在不同浓度对细胞活力的影响，结果如图1(a)所示，水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液在不同浓度下对RAW264.7细胞均未表现出细胞毒性，细胞活率均在90％以上。水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液在5％浓度下对HaCaT细胞有轻微的毒性，细胞活率分别为89％和84％。综合考虑，选择2.5％这一样品浓度进行功效实验探究。
③保湿——水通道蛋白(AQP)是穿透生物膜形成水通道的完整膜蛋白，主要负责协助将水、甘油等小分子运输至皮肤组织的不同层，以表皮的水合作用息息相关。诸多研究显示，AQP3是皮肤中含量最为丰富，与皮肤水合作用相关性最强的AQP亚型。丝聚蛋白(FLG)是角质形成细胞分泌的组氨酸蛋白质，在表皮降解为氨基酸小分子吸收水分，保持表皮水分含量，减少经皮失水，而达到表皮保湿效果。研究显示，FLG可作为评价皮肤保湿和皮肤屏障的关键因子之一。
本发明选择AQP3和FLG作为评价指标，探究乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的保湿功效。由图1(a)可知，水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液可以有效促进HACATHaCaT细胞分泌AQP3，分别由0.92ng/mL上升到3.71ng/mL和3.24ng/mL(P＜0.01)。再次利用干燥模型探究水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对AQP3的影响，结果显示，0.31m/s风速干燥处理后，细胞上清中AQP3含量明显降低(图1(b))，而水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液可以促进干燥模型中细胞分泌AQP3(P＜0.01)。收集细胞，进一步探究水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液对干燥模型中细胞AQP3和FLG表达量的影响，结果显示，干燥处理后AQP3和FLG的表达量均明显低于未干燥处理的空白组，水仙鳞茎水提物对干燥处理后细胞AQP3和FLG的表达影响不大，但乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液可以有效促进干燥处理后细胞AQP3和FLG的表达(P＜0.01)。
④抗炎舒缓——炎症是机体应对有有害因素的防御反应，在整个防御过程中会涉及到机体的多种细胞，并且伴随着炎症介质的释放。一氧化氮、肿瘤坏死因子和白介素等炎症介质的增加常常也被作为判断炎症的指标和缓解炎症的作用靶点。在炎症反应过程中，一氧化氮合酶(iNOS)被激活后会产生高浓度的NO，激活NF-κB信号通路，进一步诱导促炎因子释放，加剧炎症反应，因此，抑制iNOS和NO的产生是缓解炎症途径之一。TNF-α作为促炎细胞因子，可以诱导炎症型细胞的产生，促进炎症介质产生，导致炎症因子发生“瀑布效应”，因此，TNF-α抑制剂可以有效缓解炎症反应。IL-6参与多种慢性炎症性疾病的发病机制，在多种炎症反应中有明显的增加，因此，IL-6常被作为炎症反应的判断指标之一。
本发明利用LPS诱导RAW264.7细胞模型，选择NO、TNF-α和IL-6作为评价指标，探究乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的抗炎活性，从而评价该活性成分潜在的舒缓功效。如图3所示，显微镜观察LPS刺激会使RAW264.7细胞形态发生明显变化，有放射状的触角伸出，而水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液可以有效缓解LPS刺激引起的细胞变化。为了进一步探究乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的抗炎机理，本发明继续收集细胞上清检测炎症介质
——NO、TNF-α和IL-6。在LPS激活的RAW264.7细胞实验中，LPS激活后NO含量由4.41μM上升至21.98μM；水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的作用24h后，NO含量分别降至7.49μM和6.31μM。LPS激活细胞后促炎因子释放量也会明显上升，TNF-α由3383.41pg/mL上升至12067.96pg/mL，IL-6由14.38pg/mL上升至1441.92pg/mL，水仙鳞茎水提物和乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液作用下TNF-α释放量分别为2052.41pg/mL和4670.37pg/mL，IL-6的释放量分别为1090.96pg/mL和1051.22pg/mL。
⑤抗敏舒缓——透明质酸(HA)是细胞外基质和细胞间质的主要成分，在皮肤弹性、细胞粘附、创伤愈合和血管形成等过程中起到重要作用。研究显示，HA与过敏反应也密切相关，与皮肤敏感有很大关系。透明质酸酶(HAase)作为特异性分解HA的一种蛋白水解酶，也常用于过敏相关研究中。常见的过敏症状红肿痒痛主要是由组胺引起的，目前临床常见用药也以抗组胺药为主。研究显示，透明质酸酶活性抑制和肥大细胞释放组胺抑制活性之间具有很好的相关性，抑制组胺的活性成分常常也表现较为明显的透明质酸酶抑制活性。因此，透明质酸酶作为I型过敏反应的参与者，常被用于探究体外抗敏活性成分。
本发明利用透明质酸酶抑制实验探究乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的舒缓功效。从图7中可以看出，相同添加浓度下，水仙鳞茎水提物的透明质酸酶抑制率为9.75％，乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的透明质酸酶抑制率为79.36％，明显高于水仙鳞茎水提物(P＜0.01)，表明乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液可以通过抑制透明质酸酶活性的途径，减少透明质酸的分解，进而减少组胺及炎症因子的释放量，从而起到一定的抗敏舒缓的作用。
经过以上实施例实验证实，乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液的可以促进HaCaT细胞中AQP3的产生与表达，相比于水仙鳞茎水提物可以更有效地促进FLG的表达，也可以抑制RAW264.7细胞释放炎症介质，对NO和IL-6的抑制效果优于水仙鳞茎水提物，但是对TNF-α的抑制效果略逊于水仙鳞茎水提物，同时，对透明质酸酶的抑制率远高于水仙鳞茎水提物，抑制率达到79.36％。综上所述，乳酸菌/水仙鳞茎发酵滤液具有较好的保湿和舒缓功效。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在制备抗炎组合物中的应用，其特征在于：所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
2.一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在制备抗敏组合物中的应用，其特征在于：所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
3.一种乳酸菌/水仙鳞茎发酵液在制备保湿组合物中的应用，其特征在于：所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于：所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将干净新鲜的水仙球茎粉碎匀浆，加0.5倍-1.5倍体积95％乙醇，50-70℃加热浸提1-3h，过滤，弃去上清，取渣，加入15-25倍体积的纯水，4℃过夜浸提，离心，取上清液，检测糖度至3-3.5，待接菌发酵。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：加0.5倍-1.5倍体积95％乙醇，50-70℃加热浸提1-3h的步骤重复1-3次。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：发酵时间为48h-96h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将活化好的乳酸乳球菌以4％-6％接种量加入制备好的水仙鳞茎水提物中，36-38℃恒温培养，摇床50rpm-500rpm。
8.抗炎组合物，其特征在于，包括乳酸菌/水仙鳞茎发酵液，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
9.抗敏组合物，其特征在于，包括乳酸菌/水仙鳞茎发酵液，所述的乳酸菌/水仙鳞茎发酵液的制备方法包括：将乳酸菌接种至水仙鳞茎水提物中，充分发酵培养，收集水仙鳞茎发酵液。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其特征在于：乳酸菌/水仙鳞茎发酵液中，石蒜碱和秋水仙碱未检出。
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