DE1517860B

DE1517860B - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von Inosinsaure

Info

Publication number: DE1517860B
Authority: DE
Inventors: Ikuo Kyoto Hemmi Teluji Amagasaki Yoneda Mashiko Suita Nogami, (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd

Description

Als Träger für verwertbaren Kohlenstoff können beispielsweise Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose, Maltose, Glucose, Glycerin usw. aliein oder zu mehreren verwendet werden. Verschiedene organische Verbindungen oder organische Stoffe, z. B. organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoffe usw., eignen sich nicht nur als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Quellen für verwertbaren Stickstoff mit der gleichen Wirkung wie anorganische Stickstoffquellen, z. B. anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat oder verschiedene Arten von Nitraten, wie Natriumnitrat, Kaliumnitrat usw. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, z. B. Natriumchlorid, Phosphate, Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan oder Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Gegebenenfalls können auch andere übliche Wuchsstuffe, z. B. Vitamine, zugesetzt werden.

Das Medium muß auch primäres, sekundäres oder tertiäres Calciumphosphat oder ein Gemisch dieser Calciumphosphate in einer Menge von 0,2 bis 5,0, vorzugsweise 0,5 bis 3,0 Gewichts-/Volumprozent enthalten, weil eine größere Menge Inosinsäure im Medium angereichert wird, wenn die erfindungsgemäß verwendeten, gleichzeitig Adenin und Biotin benötigenden Mutanten in einem solchen Medium gezüchtet werden, als wenn die Züchtung in einem gewöhnlichen Nährmedium vorgenommen wird, wie sich deutlich aus der folgenden Tabelle 3 ergibt.

In Tabelle 1 sind die Inosinsäuremengen in dem Fermentationsmedium des gleichzeitig Adenin und Biotin benötigenden Mutanten Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21015 genannt, wenn dieser Mutant im Nährmedium A (10% Glucose, 0,8% K₂HPO₄, 0,8% KH₂PO₄, 1% Harnstoff und 1% Hefeextrakt) und im Nährmedium B, das durch Zusatz von 1% sekundärem Calciumphosphat zum Kulturmedium A erhalten wird, gezüchtet wird.

	A B	Tabelle	1	Angereicherte Menge an Inosinsäure
			1160 5160
Nährmedium Nährmedium

Das primäre, sekundäre oder tertiäre Calciumsalz der Phosphorsäure kann dem beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Nährmedium als einzige Phosphatquelle zugesetzt oder zusammen mit gewöhnlichen Phosphatquellen verwendet werden.

Das Wachstum der erfindungsgemäßen Mutanten und ihre Fähigkeit, Inosinsäure zu bilden, wird durch die Anwesenheit von Aminosäure im Nährmedium gesteigert.

Als Aminosäureträger eignen sich Aminosäure selbst, z. B. Histidin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan, Asparaginsäure, Lysin, Threonin, Valin, Alanin, Cystin und Leucin, Peptid, oder natürliche Substanzen, die eine solche Aminosäure und/oder Peptid enthalten, z. B. Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, Polypepton und Hefeextrakt. Diese Aminosäureträger werden dem Nährmedium vorteilhaft in einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentration etwa 50 mg bis 0,5 g/l beträgt, gerechnet als Aminosäure.

Die Fermentationsbedingungen, z. B. der pH-Wert des Mediums und die Temperatur für eine maximale Ausbeute an Inosinsäure, liegen im allgemeinen bei einem Anfangs-pH-Wert des Nährmediums von etwa 6,0 bis 9,0 und die Fermentationstemperatur bei etwa 20 bis 45° C.

Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die maximale Inosinsäuremenge im Fermentationsmedium gebildet ist. Die zur maximalen Anreicherung von Insoinsäure

ίο erforderliche Zeit ist verschieden in Abhängigkeit von den verschiedenen Faktoren, im allgemeinen erreicht jedoch die im Fermentationsmedium angereicherte Menge gewöhnlich ihr Maximum zwischen dem 2. und 10. Tag nach Beginn der Züchtung.

Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung von Inosinsäure in guten Ausbeuten läßt sich wirksam im großtechnischen Maßstab durchführen. Beim Verfahren der Erfindung wird Inosinsäure angereichert, während keine anderen 5'-Nucleotide in nennenswerter Menge im Fermentationsmedium gebildet werden. Die Insosinsäure wird daher, in freier Form oder in Form eines Salzes, z. B. als Dinatriumsalz oder Dikaliumsalz, nach einfachen Methoden beispielsweise -unter Verwendung von Aktivkohle oder Anionenaustauschharzen gewonnen.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird die Inosinsäure auf mikrobiologischem Wege direkt im Fermentationsmedium angereichert, ohne daß dabei im Gegensatz zum Stand der Technik dem Nährmedium z. B.

Hypoxanthin als Synthesevorstufe zugesetzt werden muß.

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Mengenangaben auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

B ei s ρ i el 1

Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21015 wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 19240 durch» Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (15 W) aus einer Höhe von 50 cm für eine Dauer von 5 Minuten und anschließende Isolierung nach der Penicillintechnik (Experientia, 6, S. 41 [1950]) und Replica-Plattierung (Journal of Bacteriology, 63, S. 399 [1952]) erzeugt. Der so erhaltene Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21015 wird in 11 des Nährmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammen-Setzung geimpft, worauf 18 Stunden bei 30° C unter Schütteln bebrütet wird.

Tabelle 2

Glucose 100 g

CaCO₃ 20 g

Primäres Calciumphosphat 10 g

K₂HPO₄ 6 g

KH₂PO₄ 4 g

MgSO₄ · 7 H₂O 6 g

Harnstoff 8 g

Hefeextrakt 10 g

Wasser: Zur Auffüllung auf 1 Liter erforderlicher Menge pH 7,5

Das erhaltene Fermentationsmedium wird in 501 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung geimpft und unter Belüftung und unter Bewegung 76 Stunden bei 28° C fermentiert, wobei 3600 μg

5 6

Inosinsäure und 100 μg Hypoxanthin pro Milliliter 120 Stunden bei 28 ⁰C fermentiert wird. Hierbei

und eine Spur Inosin gebildet werden. werden 5100 μg Inosinsäure pro Milliliter gebildet.

Nach Einstellung auf pH 2,5 wird das Fermentationsmedium filtriert. Das erhaltene Filtrat wird Tabelle 3
durch eine Aktivkohlesäule (10 X 150 cm) gegeben. 5 Glucose 80 g

Die Säule wird mit 501 eines Gemisches von Aceton, CaCO 10 g

Ammoniak und Wasser (Volumverhältnis 50+1: 49) Primäres cälciumphosphat '.'.'.'.'.'.'..'. 20 g

eluiert. Nach Einengung unter vermindertem Druck Sekundäres Cälciumphosphat 30 g

und Einstellung auf pH 8,0 wird das Eluat durch eine jr jjpQ ·-.-,■-„: g Z

Säule (10 X 100 cm) geleitet, die mit einem stark io M²gSO * 7 HO ' ' 4 " 5 g

basischen Anionenaustauschharz (Formiat-Typ) ge- Harnstoff * '" ■"%·"■' '.·■■■'".■'■'.' ^ ^- -6ig ' ·ν

füllt ist. Nach einer Wäsche mit Wasser und 0,02 η Hefeextrakt' " " " "T'.'.'.''' '-7^V- «!gi|-- -J Γ

Ameisensäure wird die Säule mit 301 0,01 normaler Biotin " "^ 0 5 ms

Ameisensäure eluiert, die 0,05 normaler Natrium- _Wasser; z^'Ä^fülhiiig auf' i Liter pH 8,0
formiat enthalt, wobei 151 einer Fraktion erhalten 15

werden, die 5'-Inosinsäure enthält. Nach Neutralisation Das so erhaltene Fermentationsmedium wird auf

mit 2 normalem Natriumhydroxyd wird die Fraktion die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet,

unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt. Heißes wobei 450 g "Kristalle von Dinatrium-5'-inosat erhalten

Methanol (etwa 60° C) wird in einer solchen Menge werden.

zugesetzt, daß die Methanolkonzentration 50 %> ^ao - B e i s ü i e 1 3
bezogen auf das Gesamtvolumen, beträgt. Die

erhaltene Lösung wird auf 5⁰C gekühlt, wobei 140,8 g Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende

Kristalle von Dinatrium-5'-inosinat gebildet werden. Mutant Brevibactrium thiogenitalis ATCC-Nr. 21017

wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC-Nr. 19240

Beispiel2 ²5 durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht aus einer Höhe

von 50 cm für eine Dauer von 4 Minuten und an-

Der gleichzeitig Adenin und Biotin benötigende schließende Isolierung nach der Penicillintechnik und

Mutant Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21016 Replica Plattierung erzeugt. Der so erhaltene Mutant

wird aus Brevibacterium thiogenitalis ATCC-Nr. 19240 wird in 21 des Nährmediums der in Tabelle 2 vom

durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (15 W) für 30 Beispiel 1 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf

eine Dauer von 3 Minuten aus einer Höhe von 50 cm 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln fermentiert wird,

und anschließende Isolierung nach der Penicillin- Das erhaltene Fermentationsmedium wird in 1001

technik und Replica-Plattierung erzeugt. Der so des Nährmediums der in Tabelle 3 von Beispiel 2

erhaltene Mutant ATCC 21016 wird in 21 des Nähr- genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 90 Stun-

mediums der in Tabelle 2 vom Beispiel 1 genannten 35 den bei 28⁰C unter Belüftung und Bewegung fermen-

Zusammensetzung geimpft, worauf 20 Stunden bei tiert wird. Hierbei werden 2550 μg Inosinsäure pro

28° C unter Schütteln fermentiert wird. Das erhaltene Milliliter gebildet. Das Fermentationsmedium wird

Fermantationsmedium wird in 1001 eines Nähr- auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet,

mediums der in Tabelle 3 genannten Zusammen- wobei 195,5 g Kristalle von Dinatrium-5'-inosinat

Setzung geimpft, worauf unter Belüftung und Schütteln 40 erhalten werden.

Claims

1 Öl V ÖÖU 1 2

Minimalkulturmedium

Glucose 10,0 g

Patentanspruch: K₂HPO₄ 1,0 g

KH₂PO₄ 3,0 g

⁵ Na₂SO₄ 1,0 g

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Eisen(III)-citrat 0,1 g

Inosinsäure durch Züchten von Mikroorganismen MgSO₄ · 7 H₂O 0,'l g

in einem Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen, Mine- Natriumglutamat 6,5 g

ralsalze, Aminosäuren, Biotin und Adenin ent- Vitamin B 3,0 mg

haltenden Nährmedium bei üblichen pH-Werten io Destilliertes Wasser an 1 Liter fehlende Menge
und Temperaturen, dadurch -gekenn- pH 7,2

zeichnet, daß man als Mikroorganismus ■

Brevibacterium ,thiogenitalis ATCC 21015, Die gemäß der Erfindung verwendeten, gleichzeitig

-ATCC 21016 oder-ATCC 21017 einsetzt und Adenin und Biotin zum Wachstum benötigenden das Nährmedium an Mineralsalzen auch primäres, 15 Mutanten wurden erhalten, indem die Mutation von sekundäres und/oder tertiäres Calciumphosphat in Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 nach einer einer Menge von 0,2 bis 5,0 Gewichts-/Volum- ^{an sicü} bekannten Methode hervorgerufen wurde, prozent enthält, ί ' Die Mutation-wurde erreicht, indem Brevibacterium

thiogenitalis ATCC 19240 beispielsweise mit Ultra-

20 violettlicht, Röntgenstrahlen, y-Strahlen, N-Senfgas,

salpetriger Säure, Nitrosoguanidin usw. behandelt

wurde.

Bezüglich der erfindungsgemäß verwendeten, gleichzeitig Adenin und Biotin zu ihrem Wachstum benöti-35" genden Mutanten Brevibacterium thiogenitalis ATCC Nr. 21017 — ATCC Nr. 21015 und — ATCC

Inosinsäure spielt eine große Rolle als Vorstufe in Nr. 21016 ist zu sagen, daß die Zahlen hinter der Beder Biosynthese von Purinnucleotiden und ist in der zeichnung »ATCC« die Zugangsnummern bei der Lage, den Geschmack und das Aroma von Nahrungs- American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, und Genußmitteln zu steigern. 30 Maryland, USA., sind.

In der französischen Patentschrift 1 321118 wird ein Für die Großproduktion von Inosinsäure durch

mikrobiologisches Verfahren zur gleichzeitigen Her- Züchtung der genannten gleichzeitig Adenin und stellung von Inosin.und Guanosin geschildert. Die Biotin benötigenden Mutanten gemäß der Erfindung französische Patentschrift 1 395 940 beschreibt ein wird im allgemeinen vorzugsweise ein flüssiges Nährmikrobiologisches Verfahren, bei dem Inosinsäure 35 medium verwendet.

durch Umwandlung von Hypoxanthin unter dem Die Züchtung wird im allgemeinen entweder ohne

Einfluß von Mikroorganismen gewonnen wird. In der Bewegung oder im Submersverfahren unter Belüftung belgischen Patentschrift 648 914 wird das gleiche und/oder Bewegung durchgeführt, wobei ein Nähr-Verfahren dahin abgewandelt, daß zunächst das medium verwendet wird, das unbedingt gleichzeitig Hypoxanthin ebenfalls auf mikrobiologischem Wege 40 eine Adeninquelle und eine Biotinquelle enthalten gewonnen und dann mikrobiologisch in Inosinsäure . muß. Außerdem enthält das Medium Quellen für umgewandelt wird. Die· vorliegende Erfindung betrifft assimilierbaren Kohlenstoff und verwertbaren Stickdemgegenüber ein Verfahren, bei dem auf mikro- stoff.

biologischem Wege die Inosinsäure unmittelbar als . Als Adeninquellen eignen sich beispielsweise Adenin Hauptprodukt des Verfahrens entsteht. 45 selbst, Verbindungen, die eine Adeninkomponente in

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein ihrem Molekül enthalten und sich leicht in Adenin Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosin- umwandeln lassen, oder natürliche Stoffe, die diese säure durch Züchten von Mikroorganismen in einem Verbindungen enthalten. Geeignet sind beispielsweise Kohlehydrate, '" Stickstoff substanzen, .; Mineralsalze, Adenin, Adenosin, 3'-Adenylsäure, Fleischextrakt, Aminosäuren, Biotin und Adenin enthaltenden Nähr- 50 Maisquellwasser, Polypepton und Hefeextrakt,
medium bei üblichen pH-Werten und Temperaturen, Als Biotinträger können Biotin selbst oder natürliche

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro- Stoffe, die Biotin enthalten, verwendet werden. Organismen Brevibacterium thiogenitalis ATCC 21015, Geeignet sind beispielsweise Fleischextrakt, Polypepton — ATCC 21016 oder — ATCC 21017 einsetzt und und Hefeextrakt. Natürliche Stoffe, die Adenin sowie das Nährmedium an Mineralsalzen auch primäres, 55 Biotin enthalten, z. B. Fleischextrakt usw., können als sekundären und/oder tertiäres Calciumphosphat in Quelle sowohl für Adenin als auch Biotin verwendet einer Menge von 0,2 bis 5,0 Gewichts-/Volumprozent werden.

enthält. Die Adenin- und Biotinquellen müssen dem Nähr-

Die genannten Mutanten, die von Brevibacterium medium in einer Menge zugesetzt werden, die für das thiogenitalis ATCC 19240 erzeugt wurden, können 60 Wachstum des erfindungsgemäß verwendeten, gleichnicht auf einem Minimalkulturmedium, beispielsweise zeitig Adenin und Biotin benötigenden Mutanten der nachstehend genannten Art, wachsen, auf dem genügt. Der Adeninträger wird dem Nährmedium im Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 zu wachsen allgemeinen in einer solchen Menge zugesetzt, daß die vermag, jedoch wachsen diese Mutanten auf einem Konzentration im Kulturmedium etwa 5 bis 500 mg/1, Minimal-Kulturmedium, dem eine Adeninquelle und 65 gerechnet als Adenin, beträgt. Die Biotinquelle wird eine Biotinquelle zugesetzt ist. Diese Mutanten dem Nährmedium vorzugsweise in einer solchen benötigen gleichzeitig Adenin und Biotin zum Wachs- Menge zugesetzt, daß die Konzentration etwa 0,5 bis tum. 500 mg/1, gerechnet als Biotin selbst, beträgt.