EP1092013A1 - 3'-exonuklease, deren herstellung und verwendung - Google Patents

3'-exonuklease, deren herstellung und verwendung

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Publication number
EP1092013A1
EP1092013A1 EP99929256A EP99929256A EP1092013A1 EP 1092013 A1 EP1092013 A1 EP 1092013A1 EP 99929256 A EP99929256 A EP 99929256A EP 99929256 A EP99929256 A EP 99929256A EP 1092013 A1 EP1092013 A1 EP 1092013A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chromatography
active fractions
poly
eluted
composition according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99929256A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Neumann
Christoph Hüls
Karl-Christian Gallert
Anders Virtanen
Jonas Aström
Javier Martinez
Ann-Charlotte Thuresson
Yanguo Ren
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Original Assignee
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG filed Critical Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Publication of EP1092013A1 publication Critical patent/EP1092013A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a poly (A) -specific 3'-exonuclease activity, obtainable by chromatographic purification of a crude extract from animal or human cells, and the use thereof for the deadenylation of 3'-poly (A) tails of nucleic acids and as a medicament, diagnostic agent or to identify functional interactors.
  • poly (A) tails seem to influence not only the half-life or the intracellular transport of mRNAs, but also the translation of the mRNA into the corresponding protein. The exact mechanism has not yet been elucidated, although the assembly and disassembly of poly (A) tails appears to be directly or indirectly linked to their function (see, for example, Wickens, M. et al. (1997) Curr. Opin Genet Dev. 7, 220-232).
  • the other reaction path is started by a deadenylation of the mRNA and concerns a 3'-5'-exoribonucleolytic degradation of mRNA.
  • a multicomponent complex called exosome
  • the exosome consists of multiple 3'-5'-exoribonucleases and is involved in both the 5.8S rRNA 3'-processing and the 3'-5'-degradation of mRNA ( derson, JSJ & Parker, R. (1998) EMBO J. 17, 1497-1506).
  • PAN poly (A) -binding protein I (PABI) -dependent Poiy (A) -specific nuclease (PAN) was identified in yeasts (see, for example, Lowell, JE et al. (1992) Genes Dev. 6, 2088-2099) .
  • PAN is a 3'-5 'exoribonuclease and is composed of at least two polypeptides, Pan2p and Pan3p (see, for example, Brown, CE Jr. et al. (1996) Mol. Cell. Biol., 16, 5744-5753).
  • At least three different, poly (A) -degrading activities have been characterized in mammalian cells.
  • a Hela cell activity has a high selectivity for the degradation of 3'-localized poly (A) tails, requires 3'-localized hydroxyl groups and forms 5'-AMP as a mononucleotide reaction product (see, for example, Aström, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (25), 18154-18159 and J. Aström, A. Aström and A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 3 ' exonuclease, EMBO J., (1991 ), Vol 10, 3067).
  • Another poly (A) -specific 3'-exonuclease activity which has a molecular weight of 60 kDa, was also identified from calf thymus. However, it subsequently turned out that this protein is the hnRNP L protein and thus has no relation to the measured poly (A) -specific 3'-exoribonuclease activity.
  • the object of the present invention was therefore to provide a 3'-exoribonuclease which specifically degrades 3'-localized poly (A) tails.
  • the present invention therefore relates to a process for obtaining a poly (A) -specific 3'-exonuclease activity, comprising the following steps: a) producing a crude extract from animal or human cells; b) protein precipitation of the crude extract obtainable from step (a); c) chromatography of the precipitate obtainable from step (b) on a basic anion exchanger; d) affinity chromatography of the active fractions from step (c); e) chromatography of the active fractions from step (d) on a basic anion exchanger; f) affinity chromatography of the active fractions from step (e); g) poly (A) affinity chromatography of the active fractions from step (f); h) chromatography of the active fractions from step (g) on a basic anion exchanger; and optionally i) gel filtration of the active fractions from step (g). Or j) twice affinity chromatography of the active fractions from step (f);
  • the 3'-exonuclease activity obtainable according to the described method is specific for 3'-localized poly (A) tails, a 3'-localized hydroxyl group being necessary and 5'-AMP being formed as a mononucleotide reaction product.
  • the 3'-exonuclease activity according to the invention has a molecular weight of approximately 50 kDa under denaturing conditions.
  • the 3'-exonuclease activity according to the invention is not stimulated by spermidine at low salt concentrations, but rather is inhibited at both low and high salt concentrations.
  • the 3'-exonuclease according to the invention interacts relatively strongly with heparin-Sepharose in contrast to the 74 kDa protein from calf thymus. That 74 kDa protein is also not found in the SDS page - FIGS. 1B and 2B.
  • the exonuclease according to the invention is also active in the presence of Mn 2+ . It is also surprising that the exonuclease according to the invention works in a process-related manner - ie the exonuclease binds to the 3 ' end of the poly (A) tail and builds from nucleotide without the exonuclease-poly (A) complex disintegrating - while the 74 kDa protein works distributively, in which the complex disintegrates and has to be regenerated after one working step.
  • the poly (A) -specific 3'-exonuclease activity according to the invention can preferably be obtained from thymus cells of animal or human cells, in particular from calf thymus.
  • a whole cell extract is generally produced, from which protein is preferably precipitated using ammonium sulfate.
  • the saturation concentration is preferably about 45% ammonium sulfate. It has proven to be particularly advantageous here if, prior to the actual protein precipitation, foreign proteins are separated off by precipitation at a saturation concentration of preferably approx. 25% ammonium sulfate, so that in a subsequent step the desired 3'-exonuclease activity from the supernatant at approx. 45% -saturation of ammonium sulfate can be precipitated. This protein fractionation already separates a substantial part from unwanted foreign proteins.
  • the precipitate is then chromatographed on a basic anion exchanger, preferably on a weakly basic anion exchanger, in particular on DEAE, such as, for example, on DEAE-Sepharose.
  • the active fraction elutes at about 0.17 M of a salt, preferably a monohydric salt, such as KCI.
  • affinity chromatography of the eluted and usually dialyzed active fraction, preferably on heparin, since it has surprisingly been found that the active fraction binds particularly well to heparin, for example heparin-Sepharose.
  • the active fractions are therefore usually eluted at high salt concentrations, such as about 1.0 M of a monohydric salt, such as KCI.
  • the active fractions are then chromatographed on a basic anion exchanger, preferably on a strongly basic anion exchanger, in particular on Mono Q, such as Mono Q HR 16/10.
  • the proteins are preferably eluted using a linear gradient, the active fractions at approximately 10% concentration of an approximately 1.0 M salt, in particular a monovalent salt, such as KCI, can be eluted.
  • affinity chromatography of the active fractions preferably on a dye, in particular on a blue dye, especially on Blue Sepharose.
  • the proteins are preferably eluted using a multi-stage, in particular two-stage, salt gradient, the active fractions preferably eluting well at a high salt concentration, in particular at high monovalent salt concentrations, especially at about 1.0 M, such as 1.0 M KCI.
  • an affinity chromatography is then carried out on poly (A), the active fractions being able to be eluted at about 0.35 to about 0.55 M of a salt, in particular a monohydric salt, such as KCI.
  • the active fractions are chromatographed on a further basic anion exchanger, preferably on a strongly basic anion exchanger, in particular on Mono Q, such as SMART Mono Q.
  • the activity is preferably at about 0.17 M of a salt, especially a monovalent salt, such as KCI, eluted.
  • the last purification step according to the method according to the invention is, if appropriate, gel filtration of the active fractions, preferably Superdex 200 gel filtration, in particular SMART Superdex 200 gel filtration, the active fractions generally being present in the presence of about 0.1 M of a salt, in particular one monovalent salt, such as KCI, are easily fractionated.
  • a salt in particular one monovalent salt, such as KCI
  • a poly (A) -specific 3'-exonuclease activity can be purified approximately 600-fold with a yield of approximately 13% (see Table I). It was particularly surprising here that the poly (A) affinity chromatography in step (g) resulted in an approximately 14-fold purification of the activity according to the invention.
  • the proteins are subjected to a double affinity chromatography after the dye chromatography, preferably an ssDNA agarose with subsequent 5 ' AMP Sepharose.
  • the active ones Fractions are usually eluted at high salt concentrations, such as approximately 2.0 M of a monohydric salt, such as KCI.
  • a poly (A) -specific 3'-exonuclease activity is now obtained which, under denaturing conditions, for example in an SDS-PAGE gel, at approx. 50 kDa and under native conditions, for example on Superdex 200, at approx 180 to 220 kDa is running.
  • the invention therefore also relates to an approximately 50 kDa protein and possibly associates (tetramer), which has a poly (A) -specific exonuclease activity, obtainable by the process according to the invention.
  • Another object of the present invention is therefore a composition containing a poly (A) -specific 3'-exonuclease activity, obtainable by the process according to the invention.
  • the composition may also contain additives and auxiliary substances.
  • the present invention further provides a process for the deadenylation of nucleic acids, in particular for the deadenylation of 3'-localized poly (A) tails of preferably mRNA in the presence of a composition according to the invention.
  • the deadenylation reaction preferably takes place in the presence of monovalent cations, such as K + and / or Na + , in particular at concentrations of approximately 0.1 M of the monovalent cation. It is further preferred if the deadenylation reaction takes place at a pH of about 7.
  • Another object of the present invention also relates to antibodies which react specifically with the composition according to the invention and / or a component thereof, the composition being either itself immunogenic or made immunogenic or by coupling to suitable carriers such as, for example, bovine serum albumin can be increased in their immunogenicity.
  • the antibodies are either polyclonal or monoclonal.
  • the preparation which is also an object of the present invention, is carried out, for example, by generally known methods by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the composition according to the invention, if appropriate in the presence of, for example, Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see, for example, Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344).
  • polyclonal antibodies produced in the animal as a result of an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and purified, for example, by column chromatography. Preference is given to affinity purification of the antibodies, in which, for example, the composition according to the invention has been coupled to an NHS-activated HiTrap column.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, using the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293).
  • Another object of the present invention is also a medicament which contains a composition according to the invention and optionally suitable additives or auxiliaries and a method for producing a medicament for the treatment of cancer, autoimmune diseases, in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis, Alzheimer's disease, allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and / or diabetes and / or for influencing cell metabolism, in particular in immunosuppression, especially in transplants, in which one composition according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and / or auxiliaries.
  • autoimmune diseases in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis
  • Alzheimer's disease allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and / or diabetes and / or for influencing cell metabolism, in particular in immunosuppression, especially in transplants
  • Suitable additives and / or auxiliary substances are, for example, a physiological saline solution, stabilizers, proteinase inhibitors, etc.
  • Another object of the present invention is also a diagnostic agent containing a composition according to the invention and optionally suitable additives and / or auxiliary substances and a method for producing a diagnostic agent for diagnosing cancer, autoimmune diseases, in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis, Alzheimer's disease, allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and / or diabetes and / or for analyzing cell metabolism, in particular the immune status, especially in the case of transplants, in which an inventive method Suitable additives and / or auxiliaries are added to the composition.
  • the composition according to the invention can be applied to a solid phase, e.g. made of nitrocellulose or nylon, bound and so for example with the body fluid to be examined e.g. Blood, are brought into contact in vitro in order to be able to react with autoimmune antibodies, for example.
  • the antibody-peptide complex can then be detected, for example, using labeled anti-human IgG or anti-human IgM antibodies.
  • the label is, for example, an enzyme, such as peroxidase, that catalyzes a color reaction. The presence and the amount of autoimmune antibodies present can thus be easily and quickly detected via the color reaction.
  • Another diagnostic agent itself contains the antibodies according to the invention.
  • a human tissue sample can be easily and quickly examined to determine whether the composition according to the invention and / or a component thereof is present.
  • the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as already described above.
  • the specific antibody-peptide complex can thus be detected easily and just as quickly via an enzymatic color reaction.
  • Another object of the present invention also relates to a test for identifying functional interactors, such as inhibitors or stimulators, containing a composition according to the invention or antibodies according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • RNA or poly (A) is suitable as a substrate.
  • the test can be carried out, for example, analogously to the in vitro deadenylation, as shown in more detail in the examples.
  • composition according to the invention is therefore also the poly (A) -specific degradation of nucleic acids, in particular of mRNA.
  • the poly (A) -specific degradation of nucleic acids can be used in particular in research laboratories.
  • Table 1 shows an overview of the purification of the bovine poly (A) -specific 3'-exonuclease activity.
  • the deadenylation activity was quantified by incubating the chromatographic fractions with L3 (A 30 ) RNA substrate, which was labeled with [ ⁇ - 32 P] ATP during the in vitro transcription, under conditions for the in vitro deadenylation.
  • One unit is defined as the release of 1 pmol AMP per minute.
  • Table 2 shows the substrate specificity of the poly (A) -specific 3'-exonuclease activity.
  • Figure 1A shows the identification of the 50 kDa polypeptide by SMART Mono Q chromatography.
  • the poly (A) -sepharose fraction was fractionated by SMART Mono Q chromatography and the fractions obtained were incubated together with uniformly labeled RNA substrate L3 (A 30 ) under conditions of in vitro deadenylation for 90 minutes.
  • the reaction products were fractionated by electrophoresis in a 10% polyacrylamide: bisacrylamide 19: 1-7 M urea gel.
  • the resulting fluorogram is shown in Figure 1A.
  • Lane S means RNA substrate incubated in the absence of a fraction.
  • Lane "Load MQ" means RNA substrate incubated with a poly (A) -sepharose fraction.
  • Lanes 6 to 18 mean RNA substrate incubated in the presence of the fractions obtained. Only even fractions were marked.
  • Figure 1 B shows an SDS-PAGE of the SMART Mono Q fractions. Aliquots of the fractions were separated on an SDS-PAGE. The resulting gel became stained with silver. The fraction numbers are displayed. Only straight fractions were marked. The molecular weight markers were separated in lane M. The numbers on the left indicate the molecular weights of the marker proteins in kDa.
  • Figure 2A shows the identification of the 50 kDa polypeptide by SMART Superdex 200 chromatography.
  • the fractions obtained were incubated together with uniformly labeled RNA substrate L3 (A 30 ) under conditions of in vitro deadenylation for 120 minutes.
  • the reaction products were fractionated on a 10% polyacrylamide: bisacrylamide 19: 1-7 M urea gel.
  • the resulting fluorogram is shown in Figure 2A.
  • Lane L3 (A 30 ) shows the RNA substrate incubated in the absence of a fraction.
  • Lane “Load” shows the RNA substrate incubated with Mono Q-concentrated poly (A) -sepharose fraction.
  • Lanes 15 to 25 show RNA substrate incubated in the presence of the fractions obtained.
  • S and P indicate the running points of the RNA substrate (S) and products (P).
  • the elution profile of the molecular weight markers for the calibration of the Superdex 200 column are shown above.
  • Figure 2B shows an SDS-PAGE of SMART Superdex 200 fractions. The resulting gel was stained with silver. The fraction numbers are displayed. Only straight fractions were marked. The molecular weight markers were separated in lane M. The numbers on the left indicate the molecular weights of the marker proteins in kDa.
  • FIG. 2C shows 5'AMP Sepharose 4B affinity fractionation on specific poly (A) exonuclease activity. Labeled fractions were 5 min. incubated with radioactive RNA substrate L3 (A30). The reaction products were fractionated on a 10% polyacrylamide: bisacrylamide 19: 1-7 M urea gel. The resulting fluorogram is shown in Figure 2C.
  • RNA substrate was incubated with 5'AMP Sepharose 4B affinity of purified exonuclease.
  • Figure 2D shows an SDS-PAGE of 5 ' AMP affinity chromatography on Sepharose 4B. The resulting gel was stained with silver. The fraction numbers are displayed. Only straight fractions were marked. The molecular weight markers were separated in lane M. The numbers on the left show the molecular weights of the marker proteins in kDa.
  • Figure 3 shows the specificity of the exonuclease for 3'-end localized poly (A) tails.
  • the poly (A) -sepharose fractions were, under conditions of in vitro deadenylation, as indicated for 0, 5, 10, 20, 30, 60 or 90 minutes together with RNA substrate L3 (A 30 ), L3 (A 30 ) Incubate X 15 , L3 (A 30 ) X 49 and L3 (A 30 ) X 164 as indicated.
  • the reaction products were fractionated in a 10% polyacrylamide: bisacrylamide 19: 1-7 molar urea gel.
  • the resulting fluorogram is shown in Fig. 3.
  • S and P indicate the running points of the RNA substrates (S) and products (P).
  • Figure 4 shows the released reaction product 5'-AMP during the deadenylation.
  • the poly (A) -sepharose fraction was incubated under conditions of in vitro deadenylation for 20 minutes together with RNA substrate L3 (A 30 ), which was labeled with [ ⁇ - 32 P] ATP during in vitro transcription. 3 ⁇ l of the reaction was subjected to 2-D TLC. The resulting autoradiogram on the dried PEI cellulose plate is shown in Fig. 4. The running points of 2'-AMP, 3'-AMP and 5'-AMP markers that were separated together with the radioactive sample are indicated.
  • Figures 5A-C show the continuous degradation of poly (A).
  • Sepharose fraction was incubated with X fmol of the RNA substrate L3 (A 30 ), which was labeled by means of [ ⁇ - 32 P] UTP during in vitro transcription, under conditions for in vitro deadenylation.
  • the reaction products were fractionated in a 10% polyacrylamide: bisacrylamide 19: 1-7 M urea gel.
  • the resulting fluorogram is shown in Figures 5A-C.
  • S and P indicate the running points of the RNA substrate (S) and product (P).
  • 5A shows reactions which in application 0.5 ⁇ l poly (A) -sepharose fractions were carried out and terminated at the indicated times.
  • FIG. 5B shows reactions which were carried out in the presence of 0.5 ⁇ l of poly (A) -sepharose fractions and terminated after 20 minutes. The indicated amounts of poly (A) in ng were added to the reactions.
  • FIG. 5C shows reactions which were carried out in the presence of the indicated amounts of the poly (A) -sepharose fraction in ⁇ l and were terminated after 20 minutes.
  • Figure 6A SDS-PAGE for the refolding experiment according to Dayle A. Hager, Richard R. Burgess, Anal. Biochem. (1980), 109, 76. The resulting gel was stained with silver. The numbers on the left indicate the molecular weights of the marker proteins in kDa. The resulting bands were cut out as indicated in Figure 6A (A, 110, B, C, D and E).
  • Denaturing RNA polyacrylamide gel The gel pieces obtained in FIG. 6A were after Hager et al. Eluted. The eluted proteins obtained were incubated with the substrate L3 (A 30 ) according to Example 9 and the reaction batches were separated on a polyacrylamide gel. The activity could be detected in the gel piece C (approx. 50 kDa).
  • FIG. 7 shows the chromatographic steps of the method according to the invention.
  • L3 Poly (A) site of the late region of human adenovirus 2 (length: 54 nucleotides, (J. Aström, A. Aström and A. Virtanen, in vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 3 ' exonuclease, EMBO, (1991), Vol 10, 3067)
  • X n n nucleotides (A, G, T, C) Examples
  • Raw whole cell extracts were prepared from calf thymus according to Wahl, E. (1991) J. Biol. Chem. 266, 3131-3139. For this purpose, 3 to 15 kg of frozen calf thymus were thawed on ice, cut into pieces and in an approximately equal amount of volume of buffer 1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM K 3 PO 4 , 1 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Homogenized KCI, 0.1mM DTT, pH 7.9) in a Waring blender for 50 seconds at low speed and 50 seconds at high speed. The solid material was precipitated by centrifugation in a Sorwall GSA rotor at 16,000 g at 4 ° C for 60 minutes.
  • buffer 1 50 mM Tris-HCl, 10 mM K 3 PO 4 , 1 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Homogenized KCI, 0.1mM DTT, pH 7.9
  • the crude extract was then filtered through a 7-mesh sieve (Pascal Eng. Co. Ltd.), added, 0.134 g / ml ammonium sulfate (25% saturation), stirred on ice for 2 hours and the precipitate by centrifugation in a Sorwall GSA rotor precipitated at 16000 g at 4 ° C for 60 minutes. A further 0.115 g per ml of ammonium sulfate (45% saturation) was added to the supernatant and treated as already described above.
  • the pellet obtained after centrifugation was in 2 to 4 volumes of buffer D (20 mM HEPES (KOH), 100 mM KCI, 1, 5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 20% glycerol, pH 8.2) and dialyzed for 10 hours at 4 ° C in a dialysis tube with a molecular weight cut-off of 6000 to 8000.
  • the 45% ammonium sulfate fraction (AS 45) was frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • AS 45 fraction (approx. 960 ml) contained approx. 68 mg protein per ml, which resulted in a total amount of 65 g protein.
  • the protein concentration was determined using a Biorad protein assay kit (No. 500-0001) with bovine gamma-globulin as reference substance.
  • Example 2 The protein concentration was determined using a Biorad protein assay kit (No. 500-0001) with bovine
  • the DEAE-Sepharose matrix was then packed into a column (diameter 50 mm) and washed with buffers D and a flow rate of 9 cm per hour.
  • a two-stage salt level gradient (buffer D with 0.17 M or 1.0 M KCI) was carried out and the eluted protein was collected.
  • An additional 800 ml of the AS 45 fraction was fractionated in the same way.
  • 240 ml of packed DEAE-Sepharose and a column diameter of 70 mm were used in this case.
  • the protein eluted at 0.17 M KCI, fraction II, was dialyzed against buffer D for 10 hours, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • Fraction II was then fractionated by a heparin-Sepharose CI-6B (Pharmacia No. 17-0467-01) chromatography.
  • the column with a bed volume of 100 ml and a diameter of 50 mm was equilibrated with buffer D and a flow rate of 9 cm per hour.
  • Two essentially identical heparin-Sepharose fractionations were carried out.
  • Fraction II (210 ml) was applied to a heparin-Sepharose CI-6B column at a flow rate of 9 cm per hour. After the non-binding material was eluted, bound protein was eluted by washing the column with buffer D with 1.0 M KCI.
  • heparin-Sepharose column was used again to separate the rest of Fraction II (270 ml).
  • the eluted fractions (called NB) were dialyzed against buffer D for 10 hours at 4 ° C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • fraction IIB was obtained by four essentially the same FPLC (Pharmacia) Mono Q HR 16/10 (Pharmacia No. 17-0506-01) chromatographed.
  • a Mono Q column equilibrated with buffer D was loaded with protein using a 50 ml Superloop (Pharmacia No. 19-7850-01) (approx. 30 ml fraction MB per cycle).
  • the protein was eluted using a two-stage linear gradient (0 to 20% in 250 ml and 20 to 50% in 150 ml of buffer D with 1.0 M KCI), 9 ml fractions were collected and the active fractions, which were at 10% 1, 0 M KCI eluted, combined (called fraction MQ), dialyzed against buffer D for 10 hours at 4 ° C., frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • fraction MQ 10% 1, 0 M KCI eluted, combined
  • a 21 ml packed Blue-Sepharose CL-6B (Pharmacia No. 17-0830-01) column with a diameter of 26 mm was prepared according to the manufacturer's instructions. The column was equilibrated with buffer D and a flow rate of 34 cm per hour.
  • the MQ fraction (108 ml) was applied to the column and bound protein was eluted using a two-stage salt gradient (buffer D with 0.17 M or 1.0 M KCI).
  • the active fraction, called C which was obtained on elution with 1.0 M KCI, was dialyzed against buffer D for 10 hours at 4 ° C., frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • Poly (A) -Sepharose CL-6B was prepared according to the manufacturer's instructions.
  • An HR 10/10 column with a bed volume of 8 ml was equilibrated with buffer D with 25 mM KCI at pH 7.
  • 12 mg (12 ml) of fraction C was dialyzed against 2 x 2 I buffer D with 25 mM KCI at pH 7 for 4 hours.
  • the dialyzed fraction was applied to the column at a flow rate of 1 ml per minute.
  • the column was then first washed with 5 bed volumes of buffer D with 25 mM KCI at pH 7 and then again with 5 bed volumes of buffer D with 200 mM KCI at pH 6 and then with 5 bed volumes of buffer D with 280 mM KCI at pH 6.
  • Sepharose fraction (60 ⁇ g protein) was dialyzed against buffer D with 50 mM KCI at pH 7 and applied to the column at the same flow rate. The column was charged with a 1.5 ml gradient from 50 to 500 mM KCI. 50 ⁇ l fraction was collected and the exonuclease activity was identified by means of an in vitro deadenylation test (see below). The exonuclease activity eluted at approximately 170 mM KCI.
  • the poly (A) -sepharose fraction (0.7 ml, 0.06 mg per ml protein) was first extracted using a SMART Mono Q PC 1.6 / 5 (Pharmacia No. 17-0671 - 01) Chromatography concentrated according to the following procedure.
  • the column was equilibrated with buffer D at pH 7 with 50 mM KCI.
  • the poly (A) -sepharose fraction was dialyzed against buffer D with 50 mM KCI at pH 7 and applied to a Mono Q column at a flow rate of 50 ⁇ l per minute.
  • Bound material was eluted using a linear gradient up to 500 mM KCI and 25 ⁇ l fractions were collected. The active fractions (total volume 100 ⁇ l) were identified and pooled. Then 50 ⁇ l of the concentrated poly (A) -sepharose fraction were fractionated by means of gel filtration on a SMART Superdex 200 PC 3.2 / 30 column, which was equilibrated with buffer D at pH 7 with 100 mM KCI. The flow rate was 40 ul per minute. The active fractions were identified using an in vitro deadenylation test (see below). The molecular weight markers were fractionated on a Superdex 200 column according to the same procedure.
  • the molecular weight markers were ferritin, catalase, aldolase and BSA with molecular weights of 440, 232, 158 and 67 kDa.
  • Example 6 ssDNA Agarose Affinity Chromatography ssDNA agarose was prepared according to the manufacturer's instructions (Pharmacia 27-5575-02). A 0.6 ml column was packed. The column was loaded with the active fraction C (10 ml) from Example 3 in buffer D with 50 ml KCI (pH 7.0). The fraction passed through was collected.
  • 5 ' AMP affinity chromatography 5 ' AMP Sepharose (Pharmacia 17-0620-01) was prepared according to the manufacturer's instructions and the fraction which had passed through from Example 6 was applied to the column in buffer D with 50 ml of KCI (pH 7.0). The mixture was then washed with 5 ml of buffer D in 50 ml of KCI (pH 7.0). The mixture was then washed with 5 ml of buffer D with 200 ml of mM KCI (pH 7.0). Finally, the activity was eluted from the column with 2 ml of buffer D with 2 M KCI (pH 7.0).
  • SDS-polyacrylamide (acrylamide: bisacrylamide 30: 0.8) gels (5% acrylamide in the spacer and 7.5% acrylamide in the separating gel) were, according to Laemmli, UK (1970) Nature 227, 680-685, using a Mini-Protean II Gel apparatus (Bio-Rad No. 125BR). The appropriate amounts of protein were fractionated directly on the gel or precipitated prior to loading the gel by adding 1 volume of 20% TCA followed by centrifugation at 13000g for 30 minutes at 4 ° C.
  • RNA substrates L3 (A 30 ), L3 (A 30 ) X 15 , L3 (A 30 ) X 49 , L3 (A 30 ) X 164 ) were transcribed in vitro with T3 RNA- Polymerase (Promega No. P208C) and the plasmid pT3L3 (A 30 ) (Aström, J. et al. (1991) EMBO J. 10 (10), 3067-3071) as a DNA template, which is associated with Nsil, Hinc II, Eco Rl and Pvu II were digested, synthesized.
  • RNA substrates ML (G 30 ), ML (C 32 ) and ML (U 30 ) were as described in Aström, J. et al. (1991), supra.
  • the RNA substrates were labeled either as a whole or on their homopolymeric tails by incorporating radioactively labeled mononucleotides during in vitro transcription (see Aström, J. (1991), supra, Aström, J. et al. (1992), supra) .
  • the specific radio activities of the incorporated radioactive mononucleotides were 40 Ci / mmol in the transcription mixture for the entire label or 4 Ci / mmol in the transcription mixture for the tail label.
  • Transcribed RNA was purified according to Moore, C. L & Sharp, PA (1985) Cell, 41, 845-855.
  • test conditions for in vitro deadenylation were as follows: 1 mM MgCl 2 , 2.5% (w / v) poly (vinyl alcohol) (Sigma P-8136, Mw 10000), 100 mM KCI, 0.15 Unit RNAguard, 5 to 20 fmol RNA substrate, 20 to 48% (v / v) buffer (20 mM HEPES (KOH), 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 25% glycerol, pH 7) and the corresponding protein fraction ( Aström, J. et al. (1992), supra).
  • the reaction volume was 15 or 25 ul and the incubations were carried out at 30 ° C.
  • the two-dimensional (2-D thin-layer chromatography) was carried out on PEI cellulose F plates (Merck No. 5579) according to Konarska, MM et al. (1985) Nature 313 (6003), 552-557.
  • the products released in the deadenylation reactions were analyzed by two-dimensional thin-layer chromatography (2-D TLC) in a chamber.
  • the first solvent (I) was isobutanoic acid / concentrated NH 4 OH / H 2 O; 577/38/385 (v / v) and the second eluent (II) was saturated (NH 4) 2 SO 4 / 1M sodium acetate / isopropanol; 80/18/12 (v / v).
  • the plates were dried at room temperature for 8 hours to evaporate the isobutanoic acid.
  • 5'-AMP Sigma A-1752
  • 2'-AMP Sigma A-9396
  • 3'-AMP Sigma A-0386
  • the position of the markers was determined by means of UV light (Mineralight lamp UVG-54, Ultra-Violet Prod. Inc.).
  • the radioactive molecules were determined by autoradiography of the resulting PEI cellulose F plate.
  • Deadenylation activity was quantified as follows: L3 (A 30 ) RNA substrate, labeled with [ ⁇ 32 P] ATP, was incubated in an in vitro deadenylation reaction. The reaction products were analyzed by 1-D TLC with mobile solvent III (0.75 MK 2 HPO 4) pH 3.5 (H 3 PO 4 )). The resulting PEI cellulose F plate was dried and scanned in a 400 S phosphor imager (Molecular Dynamics). The fractions with released [ ⁇ 32 P] AMP were determined. Based on the known specific activity of [ ⁇ 3 P] AMP in the RNA substrate, the amount in moles of released AMP was calculated. One unit of deadenylation activity corresponds to the release of 1 pmol AMP / minute.
  • the activity was determined on the basis of the release of the mononucleotides in the 1 D TLC test (see above). To this end, the need for monovalent (potassium and sodium) and divalent (magnesium, manganese, zinc and calcium) ions was examined.
  • magnesium ion is the preferred divalent ion and the optimal concentration is 1 mM. It has also been found that manganese, zinc and calcium ions can replace magnesium ions to a certain degree. In the presence of 1 mM Mn 2+ , Zn 2+ and Ca 2+ , the activity decreases from 17% over 2% to 0.7% compared to Mg 2+ .
  • RNA substrate specificity of the activity was examined in two experiments.
  • the radioactivity on their homopolymer tails was incubated iv labeled RNA substrates L3 (A 30 ), ML45 (U 30 ), ML40 (C 32 ) and ML43 (G 30 ) in an in vitro deadenylation test (see above).
  • the release of radioactive mononucleotides was measured in the 1-D TLC test (see above). Based on the measured results, the Km and Vmax values for each RNA substrate were determined in accordance with the Lineweaver-Burke (see Table II).
  • RNA substrates with internal poly (A) sections were used to measure substrate specificity. It was found that the RNA substrates L3 (A 30 ) X 15 , L3 (A 30 ) X 49 and L3 (A 30 ) X 164 were completely resistant to degradation in contrast to the RNA substrate L3 (A 30 ) ( see Fig. 3). It follows that RNA tails from adenosine residues are the preferred substrate and that only 3'-end localized poly (A) tails are effectively degraded.
  • the released mononucleotide reaction product was determined by means of 2-D TLC.
  • the poly (A) -sepharose fraction was incubated together with RNA substrate L3 (A 30 ), which was labeled by means of [ ⁇ 32 P] AMP during the in vitro transcription, in an in vitro deadenylation test.
  • the reaction products were analyzed by 2-D TLC using unlabeled 2'-AMP, 3'-AMP and 5'-AMP as markers. The result (see Fig. 4) showed that 5'-AMP is released during the in vitro deadenylation reaction enzyme.
  • Figure 5B shows that the addition of poly (A) inhibits the reaction and that both undeadenylated and fully deadenylated RNA substrates were present at the highest measured concentration of added poly (A).
  • the amount of nuclease activity was changed. The incubation period was 20 minutes.
  • Figure 5C shows that both non-deadenylated and deadenylated RNA substrates were present even with the smallest amount of nuclease activity added. It follows from this that the exonuclease activity is highly processive, ie the enzyme does not dissociate from the substrate until the adenosine tail is completely degraded.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität, erhältlich durch chromatografische Reinigung eines Rohextraktes aus tierischen oder menschlichen Zellen, sowie deren Verwendung zur Deadenylierung von 3'-Poly(A)-Schwänzen von Nukleinsäuren als Arzneimittel, Diagnostikum oder zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren.

Description

3'-Exonuklease, deren Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität, erhältlich durch chromatographische Reinigung eines Rohextraktes aus tierischen oder menschlichen Zellen, sowie deren Verwendung zur Deadenylierung von 3'- Poly(A)-Schwänzen von Nukleinsäuren und als Arzneimittel, Diagnostikum oder zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren.
Die meisten eukaryotischen mRNAs tragen ca. 200 Adenosinreste-Iange Poly(A)- Schwänze an ihren 3'-Enden. Poly(A)-Schwänze scheinen hierbei nicht nur die Halbwertszeit oder den intrazellulären Transport von mRNAs zu beeinflussen, sondern auch die Translation der mRNA in das entsprechende Protein. Der genaue Me- chanismus ist bis heute unaufgeklärt, wobei jedoch der Auf- und Abbau von Poly(A)- Schwänzen direkt oder indirekt mit deren Funktion verbunden zu sein scheint (siehe z.B. Wickens, M. et al. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 220-232).
Poly(A)-abbauende Nukleaseaktivitäten sind bereits in mehreren eukaryotischen Systemen untersucht worden (siehe z.B. Virtanen, A. & Aström, J. (1997) in Prog. Mol. Subcell. Biol. (Jeanteur, P., ed.) Vol. 16, 199-220, Springer-Verlag, Berlin- Heidelberg). So wurden beispielsweise in Hefen zwei Reaktionswege identifiziert. Ein Reaktionsweg, der sogenannte "deadenylation dependent decapping passway" wird durch die Entfernung des Poly(A)-Schwanzes gestartet und betrifft einen 5'-3'- exonukleolytischen Abbau von mRNA durch eine Xm1 p5'-Exonuklease. Der andere Reaktionsweg, der sogenannte "3'-5'-decay passway", wird durch eine Deadenylierung der mRNA gestartet und betrifft einen 3'-5'-exoribonukleolytischen Abbau von mRNA. In bezug auf den "3'-5'-decay passway" wurde kürzlich ein Multikomponen- tenkomplex, Exosom genannt, identifiziert (Mitchell, P. et al. (1997), Cell 91 , 457- 466). Das Exosom besteht aus mehrfachen 3'-5'-Exoribonukleasen und ist sowohl bei der 5.8S rRNA 3'-Prozessierung und dem 3'-5'-Abbau von mRNA beteiligt (An- derson, J. S. J. & Parker, R. (1998) EMBO J. 17, 1497-1506). Es ist jedoch nicht bekannt, ob irgendeine der Exoribonukleasen des Exosoms vorzugsweise Poly(A) abbaut. Daneben wurde eine Poly(A)-bindendes Protein I (PABI)-abhängige Poiy(A)- spezifische Nuklease (PAN) in Hefen identifiziert (siehe z.B. Lowell, J. E. et al. (1992) Genes Dev. 6, 2088-2099). PAN ist eine 3'-5'-Exoribonuklease und ist aus wenigstens zwei Polypeptiden, Pan2p und Pan3p zusammengesetzt (siehe z.B. Brown, C. E. Jr. et al. (1996) Mol. Cell. Biol., 16, 5744-5753).
In Säugerzellen wurden wenigstens drei verschiedene, Poly(A)-abbauende Aktivitä- ten charakterisiert. Beispielsweise besitzt eine Hela-Zellaktivität eine hohe Selektivität für den Abbau von 3'-lokalisierten Poly(A)-Schwänzen, verlangt 3'-lokalisierte Hydroxylgruppen und bildet 5'-AMP als Mononukleotid-Reaktionsprodukt (siehe z.B. Aström, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (25), 18154-18159 und J. Aström, A. Aström und A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 3' exonuclease, EMBO J., (1991), Vol 10, 3067). Des weiteren wurde eine Mg2+- abhängige Poly(A)-spezifische 3'-Exoribonuklease aus Kalbsthymus mit einem Molekulargewicht von 74 kDa beschrieben (Körner, C. G. & Wähle, E. (1997) J. Biol. Chem., 272 (16), 10448-10456). Ferner wurde eine Polyribosomen-assoziierte 3'- Exoribonuklease mit einem Molekulargewicht von 33 kDa beschrieben, welche je- doch nicht für Poly(A) spezifisch ist (Caruccio, N. & Ross, J. (1994) J. Biol. Chem. 269 (50), 31814-31821). Aus Kalbsthymus konnte auch eine weitere Poly(A)- spezifische 3'-Exonukleaseaktivität identifiziert werden, die ein Molekulargewicht von 60 kDa besitzt. Es stellte sich jedoch nachträglich heraus, daß dieses Protein das hnRNP L-Protein ist und somit keinen Bezug zu der gemessenen Poly(A)- spezifischen 3'-Exoribonukleaseaktivität besitzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine 3'-Exoribonuklease bereitzustellen, die spezifisch 3'-lokalisierte Poly(A)-Schwänze abbaut.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung einer Poly(A)-spezifischen 3'-Exonukleaseaktivität enthaltend folgende Schritte: a) Herstellen eines Rohextraktes aus tierischen oder menschlichen Zellen; b) Proteinfällung des Rohextraktes erhältlich aus Schritt (a); c) Chromatographie des Präzipitates erhältlich aus Schritt (b) an einem basischen Anionenaustauscher; d) Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (c); e) Chromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (d) an einem basischen Anionenaustauscher; f) Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (e); g) Poly(A)-Afflnitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (f); h) Chromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (g) an einem basischen Anionenaustauscher; und gegebenenfalls i) Gelfiltration der aktiven Fraktionen aus Schritt (g). Oder j) Zweimalige Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (f);
Überraschenderweise ist die gemäß dem beschriebenen Verfahren erhältliche 3'- Exonukleaseaktivität spezifisch für 3'-lokalisierte Poly(A)-Schwänze, wobei eine 3'- lokalisierte Hydroxylgruppe notwenig ist und 5'-AMP als Mononukleotid- Reaktionsprodukt gebildet wird. Im Gegensatz zu den bereits bekannten 3'- Exonukleaseaktivitäten besitzt die erfindungsgemäße 3'-Exonukleaseaktivität ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa unter denaturierenden Bedingungen. Im Gegensatz zu dem 74 kDa-Protein aus Kalbsthymus wird die erfindungsgemäße 3'- Exonukleaseaktivität durch Spermidin bei niedrigen Salzkonzentrationen nicht stimuliert, sondern eher bei niedrigen wie auch bei hohen Salzkonzentrationen inhi- biert. Zudem interagiert die erfindungsgemäße 3'-Exonuklease relativ stark mit He- parin-Sepharose im Gegensatz zu dem 74 kDa-Protein aus Kalbsthymus. Jenes 74 kDa-Protein wird zudem im SDS-Page - Fig. 1 B und 2B - nicht gefunden. Des weiteren war es überraschend, daß im Gegensatz zu der Exonukleaseaktivität aus Heia- Zellen die erfindungsgemäße Exonuklease auch in Anwesenheit von Mn2+ aktiv ist. Zudem ist überraschend, daß die erfindungsgemäße Exonuklease prozessiv arbeitet - d.h. die Exonuklease bindet an das 3'-Ende des Poly(A)-Schwanzes und baut Nu- kleotid für Nukleotid ab, ohne das der Exonuclease-Poly(A)-Komplex zerfällt - während das 74 kDa Protein distributiv arbeitet, bei welchem der Komplex nach einem Arbeitsschritt zerfällt und regeneriert werden muß.
Die erfindungsgemäße Poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität kann vorzugsweise aus Thymuszellen tierischer oder menschlicher Zellen gewonnen werden, insbesondere aus Kalbsthymus. Hierzu wird im allgemeinen ein Ganzzellextrakt hergestellt, aus dem Protein vorzugsweise mittels Ammoniumsulfat ausgefällt wird. Die Sättigungskonzentration ist hierbei vorzugsweise ca. 45% Ammoniumsulfat. Es hat sich hierbei als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn vor der eigentlichen Proteinfällung Fremdproteine bei einer Sättigungskonzentration von vorzugsweise ca. 25% Ammoniumsulfat durch Fällung abgetrennt werden, so daß in einem anschließenden Schritt die gewünschte 3'-Exonukleaseaktivität aus dem Überstand bei ca. 45%-iger Ammoniumsuifatsättigung ausgefällt werden kann. Durch diese Pro- teinfraktionierung wird bereits ein wesentlicher Teil von unerwünschten Fremdproteinen abgetrennt.
Anschließend erfolgt eine Chromatographie des Präzipitates an einem basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem schwach basischen Anionenaustau- scher, insbesondere an DEAE, wie zum Beispiel an DEAE-Sepharose. Im allgemeinen eluiert die aktive Fraktion bei ca. 0,17 M eines Salzes, vorzugsweise eines einwertigen Salzes, wie z.B. KCI. Anschließend erfolgt eine Affinitätschromatographie der eluierten und üblicherweise dialysierten aktiven Fraktion, vorzugsweise an Heparin, da überraschenderweise gefunden wurde, daß die aktive Fraktion besonders gut an Heparin, z.B. Heparin-Sepharose, bindet. Die aktiven Fraktionen werden daher üblicherweise bei hohen Salzkonzentrationen, wie z.B. ca. 1 ,0 M eines einwertigen Salzes, wie KCI, eluiert. Anschließend erfolgt eine Chromatographie der aktiven Fraktionen an einem basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem stark basischen Anionenaustauscher, insbesondere an Mono Q, wie z.B. Mono Q HR 16/10. Vorzugsweise werden die Proteine mittels eines linearen Gradienten eluiert, wobei die aktiven Fraktionen bei ca. 10%-iger Konzentration eines ca. 1 ,0 M Salzes, insbesondere eines einwertigen Salzes, wie KCI, eluierbar sind. Danach erfolgt eine Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen, vorzugsweise an einem Farbstoff, insbesondere an einem blauen Farbstoff, vor allem an Blue-Sepharose. Vorzugsweise werden die Proteine anhand eines mehrstufigen, insbesondere zweistufigen Salzgradienten eluiert, wobei die aktiven Fraktionen vorzugsweise bei hoher Salzkonzentration, insbesondere bei hohen einwertigen Salzkonzentrationen, vor allem bei ca. 1 ,0 M, wie z.B. 1 ,0 M KCI, gut eluieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt anschließend eine Affinitätschromatogra- phie an Poly(A), wobei die aktiven Fraktionen bei ca. 0,35 bis ca. 0,55 M eines Salzes, insbesondere eines einwertigen Salzes, wie KCI, eluierbar sind. Des weiteren erfolgt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Chromatographie der aktiven Fraktionen an einem weiteren basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem stark basischen Anionenaustauscher, insbesondere an Mono Q, wie SMART Mono Q. Hierbei wird die Aktivität vorzugsweise bei ca. 0,17 M eines Salzes, insbesondere eines einwertigen Salzes, wie z.B. KCI, eluiert. Als letzter Reinigungsschritt erfolgt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gegebenenfalls eine Gelfiltration der aktiven Fraktionen, vorzugsweise eine Superdex 200 Gelfiltration, insbesondere eine SMART Superdex 200 Gelfiltration, wobei im allgemeinen die aktiven Fraktio- nen in Anwesenheit von ca. 0,1 M eines Salzes, insbesondere eines einwertigen Salzes, wie z.B. KCI, gut fraktionierbar sind.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Poly(A)-spezifische 3'- Exonukleaseaktivität ca. 600-fach mit einer Ausbeute von ca. 13% aufgereinigt wer- den (siehe Tabelle I). Hierbei war es besonders überraschend, daß die Poly(A)- Affinitätschromatographie gemäß Schritt (g) eine ca. 14-fache Reinigung der erfindungsgemäßen Aktivität ergab.
In einer weiteren Ausführungsformen werden die Proteine nach der Farbstoff- Chromatographie einer zweifachen Affinitätschromatographie unterzogen, vorzugsweise eine ssDNA Agarose mit anschließender 5'AMP Sepharose. Die aktiven Fraktionen werden üblicherweise bei hohen Salzkonzentrationen, wie z.B. ca. 2,0 M eines einwertigen Salzes, wie KCI, eluiert.
Anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun eine Poly(A)-spezifιsche 3'- Exonukleaseaktivität gewonnen, die unter denaturierenden Bedingungen, beispielsweise in einem SDS-PAGE-Gel, bei ca. 50 kDa und unter nativen Bedingungen, beispielsweise an Superdex 200, bei ca. 180 bis 220 kDa läuft.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein ca. 50 kDa Protein und ggf. Assoziate (Te- tramer), welches eine poly(A)-spezifische Exonukleaseaktivität inne hat, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zusammensetzung enthaltend eine Poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die Zusammensetzung enthält ggf. weiter Zusatz- und Hilfsstoffe.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Deadenylierung von Nukleinsäuren, insbesondere zur Deadenylierung von 3'-lokalisierten Poly(A)-Schwänzen von vorzugsweise mRNA in Anwesenheit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Vorzugsweise findet die Deadenylierungsreaktion in Anwesenheit von einwertigen Kationen, wie z.B. K+ und/oder Na+, statt, insbesondere bei Konzentrationen von ca. 0,1 M des einwertigen Kations. Des weiteren ist es bevorzugt, wenn die Deadenylierungsreaktion bei einem pH von ca. 7 stattfindet.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper, die mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder einer Komponente davon spezifisch reagieren, wobei die Zusammensetzung entweder selbst immuno- gen ist oder durch Koppelung an geeignete Träger, wie z.B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden kann. Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, gegebenen- falls in Anwesenheit von z.B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (s. z.B. Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z.B. über Säulenchromatographie reinigen. Bevorzugt wird eine Affinitätsreinigung der Antikörper, bei der beispielsweise die erfindungsgemäße Zusammensetzung an eine NHS-aktivierte HiTrap-Säule gekoppelt wurde.
Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293) hergestellt wer- den.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine erfindungsgemäße Zusammensetzung und gegebenenfalls geeignete Zusatzoder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Auto-immunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neuro- dermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporo- se, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und /oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Zusammensetzung mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.
Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z.B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, etc. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum enthaltend eine erfindungsgemäße Zusammensetzung und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neuro- dermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporo- se, akute und chronische Infektionskrankheiten und /oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Zusammensetzung mit geeig- neten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen versetzt werden.
Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße Zusammensetzung an eine Festphase, z.B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden und so beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit z.B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Per- oxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an an- wesenden Autoimmunantikörpern kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.
Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Menschen leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder eine Komponente davon vorhanden ist. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen wer- den. in anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren, wie z.B. Inhibitoren oder Stimulatoren, enthaltend eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder erfindungsgemäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe. Hierzu werden ausgewählte Substanzen beispielsweise aus einer sog. "chemical library" in der bereits oben näher beschriebenen Deadenylierungsreaktion eingesetzt und die Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in An- bzw. Abwesenheit der Substanzen gemessen. Als Substrat eignet sich beispielsweise mRNA oder Poly(A). Der Test kann beispielsweise analog der In-vitro-Deadenylierung, wie in den Beispielen näher dargestellt, durchgeführt werden.
Eine weitere allgemeine Anwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist daher auch der Poly(A)-spezifische Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere von mRNA. Der Poly(A)-spezifische Abbau von Nukleinsäuren kann insbesondere in Forschungslabors Verwendung finden.
Die nachfolgenden Tabellen, Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beschreibung der Tabellen und Figuren
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über die Reinigung der bovinen Poly(A)-spezifischen 3'-Exo-nukleaseaktivität. Die Deadenylierungsaktivität wurde durch Inkubation der chromatographischen Fraktionen mit L3(A30) RNA-Substrat, welches während der in vitro-Transkription mittels [α-32P]ATP markiert wurde, unter Bedingungen für die in vitro-Deadenylierung quantifiziert. Eine Unit ist definiert als die Freisetzung von einem 1 pmol AMP pro Minute.
Tabelle
Tabelle 2 zeigt die Substratspezifität der Poly(A)-spezifischen 3'- Exonukleaseaktivität.
Tabelle II
Figur 1A zeigt die Identifizierung des 50 kDa Polypeptids durch SMART Mono Q- Chromatographie. Hierbei wurde die Poly(A)-Sepharosefraktion durch SMART Mono Q-Chromatographie fraktioniert und die erhaltenen Fraktionen zusammen mit einheitlich markiertem RNA-Substrat L3 (A30) unter Bedingungen der in vitro- Deadenylierung für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese in einem 10%-igen Polyacrylamid : Bisacrylamid 19 : 1 - 7 M Harnstoffgel fraktioniert. Das sich ergebende Fluorogramm ist in Figur 1A dargestellt. Spur S bedeutet RNA-Substrat inkubiert in Abwesenheit einer Fraktion. Spur "Load MQ" bedeutet RNA-Substrat inkubiert mit einer Poly(A)-Sepharosefraktion. Spuren 6 bis 18 bedeuten RNA-Substrat inkubiert in Anwesenheit der erhaltenen Fraktionen. Nur geradzahlige Fraktionen wurden markiert.
Figur 1 B zeigt ein SDS-PAGE der SMART Mono Q-Fraktionen. Hierbei wurden Ali- quots der Fraktionen auf einem SDS-PAGE separiert. Das resultierende Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Fraktionsnummern sind angezeigt. Nur gerade Fraktionen wurden markiert. Die Molekulargewichtsmarker wurden in der Spur M aufgetrennt. Die Zahlen an der linken Seite geben die Molekulargewichte der Markerproteine in kDa an.
Figur 2A zeigt die Identifizierung des 50 kDa Polypeptids durch SMART Superdex 200-Chromatographie. Die erhaltenen Fraktionen wurden zusammen mit einheitlich markiertem RNA-Substrat L3 (A30) unter Bedingungen der in vitro-Deadenylierung 120 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 10%-igen Po- lyacrylamid : Bisacrylamid 19 : 1 - 7 M Harnstoffgel fraktioniert. Das resultierende Fluorogramm ist in Figur 2A dargestellt. Spur L3 (A30) zeigt das RNA-Substrat, inkubiert in Abwesenheit einer Fraktion. Spur "Load" zeigt das RNA-Substrat inkubiert mit Mono Q-konzentrierter Poly(A)-Sepharose-fraktion. Die Spuren 15 bis 25 zeigen RNA-Substrat inkubiert in Anwesenheit der erhaltenen Fraktionen. S und P zeigen die Laufstellen von RNA-Substrat (S) und Produkte (P) an. Das Elutionsprofil der Molekulargewichtsmarker zur Kalibrierung der Superdex 200-Säule sind oben dargestellt.
Figur 2B zeigt ein SDS-PAGE von SMART Superdex 200-Fraktionen. Das resultie- rende Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Fraktionsnummern sind angezeigt. Nur gerade Fraktionen wurden markiert. Die Molekulargewichtsmarker wurden in der Spur M separiert. Die Zahlen an der linken Seite zeigen die Molekulargewichte der Markerproteine in kDa an.
Figur 2C zeigt 5'AMP Sepharose 4B Affinitätsfraktionierung an spezifischer po- ly(A)Exonukleaseaktivität. Markierte Fraktionen wurden 5 min. mit radioaktivem RNA-Substrat L3 (A30) inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 10%- igen Polyacrylamid : Bisacrylamid 19 : 1 -7 M Harnstoffgel fraktioniert. Das resultierende Fluorogramm ist in Figur 2C dargestellt. In Spur A wurde RNA Substrat mit 5'AMP Sepharose 4B Affinität gereinigter Exonuklease inkubiert. In Spur „-„ wurde in Abwesenheit der aktiven Fraktion nur Puffer inkubiert. Figur 2D zeigt ein SDS-PAGE von 5'AMP Affinitätschromatographie an Sepharose 4B. Das resultierende Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Fraktionsnummern sind angezeigt. Nur gerade Fraktionen wurden markiert. Die Molekulargewichtsmarker wurden in der Spur M separiert. Die Zahlen an der linken Seite zeigen die Moleku- largewichte der Markerproteine in kDa an.
Figur 3 zeigt die Spezifität der Exonuklease für 3'-Enden-lokalisierte Poly(A)- Schwänze. Die Poly(A)-Sepharosefraktionen wurden unter Bedingungen der in vitro- Deadenylierung 0, 5, 10, 20, 30, 60 oder 90 Minuten lang, wie angezeigt, zusammen mit RNA-Substrat L3 (A30), L3 (A30) X15, L3 (A30) X49 und L3 (A30) X164, wie angezeigt, inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 10%-igen Polyacrylamid : Bisacrylamid 19 : 1 - 7 molaren Harnstoffgel fraktioniert. Das resultierende Fluorogramm ist in Fig. 3 gezeigt. S und P zeigen die Laufstellen der RNA-Substrate (S) und Produkte (P) an.
Figur 4 zeigt das freigesetzte Reaktionsprodukt 5'-AMP während der Deadenylierung. Die Poly(A)-Sepharosefraktion wurde unter Bedingungen der in vitro- Deadenylierung 20 Minuten lang zusammen mit RNA-Substrat L3 (A30), welches während der in vitro-Transkription mittels [α-32P]ATP markiert wurde, inkubiert. 3 μl der Reaktion wurden einer 2-D TLC unterworfen. Das resultierende Autoradiogramm auf der getrockneten PEI-Celluloseplatte ist in Fig. 4 gezeigt. Die Laufstellen von 2'- AMP, 3'-AMP und 5'-AMP Markern, die zusammen mit der radioaktiven Probe aufgetrennt wurden, sind angezeigt.
Figuren 5A-C zeigen den fortlaufenden Abbau von Poly(A). Die Poly(A)-
Sepharosefraktion wurde mit X fmol des RNA-Substrates L3 (A30), welches während der in vitro-Transkription mittels [α-32P]UTP markiert wurde, unter Bedingungen für die in vitro-Deadenylierung inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 10%- igen Polyacrylamid : Bisacrylamid 19 : 1 - 7 M Harnstoffgel fraktioniert. Das resultie- rende Fluorgramm ist in Fig. 5A-C gezeigt. S und P zeigen die Laufstellen des RNA- Substrates (S) und Produktes (P) an. Hierbei zeigt Fig. 5A Reaktionen, die in Anwe- senheit von 0,5 μl Poly(A)-Sepharosefraktionen durchgeführt und zu den angezeigten Zeiten terminiert wurden. Figur 5B zeigt Reaktionen, die in Anwesenheit von 0,5 μl Poly(A)-Sepharosefraktionen durchgeführt und nach 20 Minuten terminiert wurden. Die angezeigten Mengen an Poly(A) in ng wurden den Reaktionen hinzugege- ben. Figur 5C zeigt Reaktionen, die in Anwesenheit der angezeigten Mengen der Poly(A)-Sepharose-fraktion in μl durchgeführt und nach 20 Minuten terminiert wurden.
Figur 6A: SDS-PAGE für das Rückfaltungsexperiment nach Dayle A. Hager, Richard R. Bur- gess, Anal. Biochem. (1980), 109, 76. Das resultierende Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Zahlen an der linken Seite zeigen die Molekulargewichte der Markerproteine in kDa an. Die resultiemde Banden wurden ausgeschnitten, wie in Fig. 6A angeben (A, 110, B, C, D und E).
Figur 6B:
Denaturierndes RNA Polyacrylamid-Gel: Die in Fig. 6A erhaltenen Gelstücke wurden nach Hager et al. Eluiert. Die erhaltenen eluierten Proteine wurden mit dem Substrat L3 (A30) nach Bsp. 9 inkubiert und die Reakzionsansätze auf einem Polyacrylamid- Gel aufgetrennt. Die Aktivität konnte in dem Gelstück C (ca. 50 kDa) nachgewiesen werden.
Figur 7 zeigt die chromatographischen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahren.
Im Text verwendete Abkürzungen
L3: Poly(A)-site der späten Region des humanen Adenovirus 2 (Länge: 54 Nukleoti- de, (J. Aström, A. Aström und A. Virtanen, In vitro deadenylation of mammilian mRNA by a HeLa cell 3' exonuclease, EMBO, (1991), Vol 10, 3067) Xn: n-Nukleotide (A, G, T, C) Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von zellfreien Extrakten.
Rohe Ganzzellextrakte wurden aus Kalbsthymus gemäß Wähle, E. (1991) J. Biol. Chem. 266, 3131-3139 hergestellt. Hierzu wurden 3 bis 15 kg gefrorener Kalbsthymus auf Eis aufgetaut, in Stücke geschnitten und in einer etwa gleichen Menge an Volumen von Puffer 1 (50 mM Tris-HCI, 10 mM K3PO4, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 50 mM KCI, 0,1 mM DTT, pH 7,9) in einem Waring-Blender 50 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit und 50 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit homogenisiert. Das feste Material wurde durch Zentrifugation in einem Sorwall GSA-Rotor bei 16000 g bei 4°C 60 Minuten lang präzipitiert. Der Rohextrakt wurde anschließend durch ein Sieb mit Maschenweite 7 - normal (Pascal Eng. Co. Ltd.), filtriert, 0,134 g/ml Ammoniumsulfat (25% Sättigung) hinzugegeben, auf Eis 2 Stunden lang gerührt und das Präzipitat durch Zentrifugation in einem Sorwall GSA-Rotor bei 16000 g bei 4°C 60 Minuten lang präzipitiert. Zu dem Überstand wurden weitere 0,115 g pro ml Ammoniumsulfat (45% Sättigung) hinzugegeben und wie oben bereits beschrieben, behandelt. Das nach der Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in 2 bis 4 Volumen Puffer D (20 mM HEPES (KOH), 100 mM KCI, 1 ,5 mM MgCI2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 20% Glycerin, pH 8,2) gelöst und 10 Stunden lang bei 4°C in einem Dialyseschiauch mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 6000 bis 8000 dialysiert. Nach der Dialyse wurde die 45% Ammoniumsulfatfraktion (A.S. 45) in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Ausgehend von 4,5 kg Kalbsthymus enthielt die A.S. 45-Fraktion (ca. 960 ml) ca. 68 mg Protein pro ml, das eine Gesamtmenge von 65 g Protein ergab. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Biorad-Protein-Assay-Kit (Nr. 500-0001) mit bovines Gamma-Glo-bulin als Referenzsubstanz bestimmt. Beispiel 2
Teilreinigung einer Poly(A)-spezifischen 3'-Exonukleaseaktivität
Für die Teilreinigung ging man von 960 ml rohe A.S. 45-Fraktion (65 g Protein) aus (siehe Tabelle I). Zwei im wesentlichen gleiche DEAE-Sepharose-Chromatographien wurden durchgeführt. Bei der ersten wurden 160 ml des A.S. 45-Extraktes zu DEAE- Sepharose CL-6B (Pharmacia Nr. 17-0710-01) Ionenaustauscher (240 ml zusammengeballte Matrix), welcher mit Puffer D äquilibriert wurde, hinzugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4°C langsam gerührt. Nicht gebundenes Material wurde durch dreimaliges Waschen mit Puffer D und anschließender Zentrifugation (Sorwall H 4000-Rotor bei 800 upm 3 Minuten lang) entfernt. Die DEAE- Sepharosematrix wurde dann in eine Säule gepackt (Durchmesser 50 mm) und mit Puffern D und einer Fließrate von 9 cm pro Stunde gewaschen. Ein zweistufiger Salzstufengradient (Puffer D mit 0,17 M bzw. 1 ,0 M KCI) wurden durchgeführt und das eluierte Protein gesammelt. Zusätzliche 800 ml der A.S. 45-Fraktion wurden auf die gleiche Art und Weise fraktioniert. Jedoch wurde in diesem Fall 240 ml gepackte DEAE-Sepharose und ein Säulendurchmesser von 70 mm verwendet. Das bei 0,17 M KCI, Fraktion II genannt, eluierte Protein wurde gegen Puffer D 10 Stunden lang dialysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Anschließend wurde Fraktion II durch eine Heparin-Sepharose CI-6B (Pharmacia Nr. 17-0467-01)- Chromatographie fraktioniert. Die Säule mit einem Bettvolumen von 100 ml und einem Durchmesser von 50 mm wurde mit Puffer D und einer Fließrate von 9 cm pro Stunde äquilibriert. Zwei im wesentlichen gleiche Heparin-Sepharose- Fraktionierungen wurden durchgeführt. Fraktion II (210 ml) wurde auf eine Heparin- Sepharose CI-6B-Säule mit einer Fließrate von 9 cm pro Stunde aufgebracht. Nachdem das nicht bindende Material eluiert wurde, wurde gebundenes Protein durch Waschen der Säule mit Puffer D mit 1 ,0 M KCI eluiert. Um den Rest der Fraktion II (270 ml) zu trennen, wurde die Heparin-Sepharose-Säule ein weiteres Mal eingesetzt. Die eluierten Fraktionen (genannt NB) wurden gegen Puffer D 10 Stunden lang bei 4°C dialysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Anschließend wurde die Fraktion IIB durch vier im wesentlichen gleiche FPLC (Pharmacia) Mono Q HR 16/10 (Pharmacia Nr. 17-0506-01 )-Chromatographien fraktioniert. Hierzu wurde eine mit Puffer D äquilibrierte Mono Q-Säuie mittels eines 50 ml Superloop (Pharmacia Nr. 19-7850-01) mit Protein beladen (ca. 30 ml Fraktion MB pro Umlauf). Das Protein wurde mittels eines zweistufigen linearen Gradienten (0 bis 20% in 250 ml und 20 bis 50% in 150 ml Puffer D mit 1 ,0 M KCI) eluiert, 9 ml Fraktionen gesammelt und die aktiven Fraktionen, die bei 10% 1 ,0 M KCI eluierten, vereinigt (Fraktion MQ genannt), gegen Puffer D 10 Stunden lang bei 4°C dialysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Eine 21 ml gepackte Blue-Sepharose CL-6B (Pharmacia Nr. 17-0830-01 )-Säule mit einem Durchmesser von 26 mm wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers vorbereitet. Die Säule wurde mit Puffer D und einer Fiießrate von 34 cm pro Stunde äquilibriert. Die Fraktion MQ (108 ml) wurde auf die Säule aufgegeben und gebundenes Protein mittels eines zweistufigen Salzgradienten (Puffer D mit 0,17 M bzw. 1 ,0 M KCI) eluiert. Die aktive Fraktion, genannt C, die bei Elution mit 1 ,0 M KCI erhalten wurde, wurde ge- gen Puffer D 10 Stunden lang bei 4°C dialysiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.
Beispiel 3 Poly(A)-Sepharose-Chromatographie
Poly(A)-Sepharose CL-6B wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers vorbereitet. Eine HR 10/10-Säule mit einem Bettvolumen von 8 ml wurde mit Puffer D mit 25 mM KCI bei pH 7 äquilibriert. 12 mg (12 ml) der Fraktion C wurde gegen 2 x 2 I Puffer D mit 25 mM KCI bei pH 7 4 Stunden lang dialysiert. Die dialysierte Fraktion wur- de auf die Säule mit einer Fließrate von 1 ml pro Minute aufgegeben. Die Säule wurde anschließend zuerst mit 5 Bettvolumen Puffer D mit 25 mM KCI bei pH 7 gewaschen und danach erneut mit 5 Bettvolumen Puffer D mit 200 mM KCI bei pH 6 und anschließend mit 5 Bettvolumen Puffer D mit 280 mM KCI bei pH 6 gewaschen. Anschließend wurde ein Gradient (5 Bettvolumen) von 280 bis 600 mM KCI bei pH 6 aufgebracht. Die Poly(A)-spezifische Exonukleaseaktivit eluierte zwischen 350 und 550 mM. Hierdurch wurde eine 14-fache Reinigung der Nukleaseaktivität erreicht. Beispiel 4
SMART Mono Q-Chromatographie
Eine SMART Mono Q PC 1.6/5-Säule wurde mit Puffer D bei pH 7 mit 50 mM KCI und einer Fließrate von 50 μl pro Minute äquilibriert. 1 ml der Poly(A)-
Sepharosefraktion (60 μg Protein) wurde gegen Puffer D mit 50 mM KCI bei pH 7 dialysiert und mit der gleichen Fließrate auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit einem 1 ,5 ml Gradienten von 50 bis 500 mM KCI beschickt. 50 μl Fraktion wurden gesammelt und die Exonukleaseaktivität mittels eines in vitro- Deadenylierungstests (s.u.) identifiziert. Die Exonukleaseaktivität eluierte bei ca. 170 mM KCI.
Beispiel 5
SMART (Pharmacia, Uppsala) Superdex 200-Gelfiltration Die Poly(A)-Sepharosefraktion (0,7 ml, 0,06 mg pro ml Protein) wurde zuerst mittels einer SMART Mono Q PC 1.6/5 (Pharmacia Nr. 17-0671 -01 )-Chromatographie gemäß folgendem Verfahren konzentriert. Die Säule wurde mit Puffer D bei pH 7 mit 50 mM KCI äquilibriert. Die Poly(A)-Sepharosefraktion wurde gegen Puffer D mit 50 mM KCI bei pH 7 dialysiert und auf eine Mono Q-Säule mit einer Fließrate von 50 μl pro Minute aufgebracht. Gebundenes Material wurde mittels eines linearen Gradienten bis 500 mM KCI eluiert und 25 μl Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen (Gesamtvolumen 100 μl) wurden identifiziert und vereinigt. Anschließend wurden 50 μl der konzentrierten Poly(A)-Sepharosefraktion mittels Gelfiltration an SMART Superdex 200 PC 3.2/30-Säule, die mit Puffer D bei pH 7 mit 100 mM KCI äquilibriert wurde, fraktioniert. Die Fließrate war 40 μl pro Minute. Die aktiven Fraktionen wurden mittels eines in vitro-Deadenylierungstests (s.u.) identifiziert. Die Molekulargewichtsmarker wurden gemäß demselben Verfahren an einer Superdex 200- Säule fraktioniert. Die Molekulargewichtsmarker waren Ferritin, Katalase, Aldolase und BSA mit Molekulargewichten von 440, 232, 158 und 67 kDa. Beispiel 6 ssDNA Agarose Affinitätschromatographie ssDNA Agarose wurde nach den Herstellerangaben (Pharmacia 27-5575-02) vorbereitet. Eine 0,6 ml Säule wurde gepackt. Die Säule wurde mit der aktiven Fraktion C (10 ml) aus Beispiel 3 im Puffer D mit 50 ml KCI (pH 7,0) beladen. Die durchgelaufene Fraktion wurde gesammelt.
Beispiel 7
5'AMP Affinitätschromatographie 5'AMP Sepharose (Pharmacia 17-0620-01) wurde nach Herstellerangaben vorbereitet und die durchgelaufene Fraktion aus Beispiel 6 wurde auf die Säule im Puffer D mit 50 ml KCI (pH 7,0) aufgetragen. Anschließend wurde mit 5 ml Puffer D in 50 ml KCI (pH 7,0) gewaschen. Daraufhin wurde mit 5 ml Puffer D mit 200 ml mM KCI (pH 7,0) gewaschen. Zum Schluß wurde mit 2 ml Puffer D mit 2 M KCI (pH 7,0) die Aktivität von der Säule eluiert.
Beispiel 8
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (durchgeführt für Fig. 1B, 2B und 2D)
SDS-Polyacrylamid (Acrylamid : Bisacrylamid 30 : 0,8)-Gele (5% Acrylamid im Spacer und 7,5% Acrylamid im Trenngel) wurden gemäß Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685 mittels eines Mini-Protean Il-Gelapparates (Bio-Rad Nr. 125BR) hergestellt. Die entsprechenden Mengen an Protein wurden direkt auf dem Gel fraktioniert oder vor dem Beladen des Gels durch Zugabe von 1 Volumen 20% TCA, gefolgt von einer Zentrifugation bei 13000g 30 Minuten lang bei 4°C präzipitiert. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und in 10 μl Probenpuffer (50 mM Tris-HCI pH 6,8, 1% (w/v) SDS, 100 mM DTT, 8% (v/v) Glycerin, 0,025% (w/v) Bromphenolblau) gelöst und durch Gelelektrophorese getrennt. Das erhaltene Gel wurde fixiert und gefärbt. Die Silberfärbung erfolgte gemäß Oakley, B. R. et al. (1980) Anal. Biochem. 105, 361-363. Die Commassie Brilliant Blue-Färbung wurde gemäß Merryl, C. R. (1990) Meth. Enzymol. 182, 477-488 durchgeführt. Beispiel 9
Herstellung von RNA-Substraten
Die am 5'-capped RNA-Substrate (L3 (A30), L3 (A30) X15, L3 (A30) X49, L3 (A30) X164) wurden mittels in vitro-Transkription mit T3 RNA-Polymerase (Promega Nr. P208C) und dem Plasmid pT3L3(A30) (Aström, J. et al. (1991) EMBO J. 10 (10), 3067-3071) als DNA-Matrize, die mit Nsil, Hinc II, Eco Rl und Pvu II verdaut wurden, synthetisiert. Die RNA-Substrate ML(G30), ML(C32) und ML(U30) wurden wie bei Aström, J. et al. (1991), supra, beschrieben, hergestellt. Die RNA-Substrate wurden entweder insgesamt oder an ihren homopolymeren Schwänzen durch Einbau von radioaktiv markierten Mononukleotiden während der in vitro-Transkription markiert (siehe Aström, J. (1991), supra, Aström, J. et al. (1992), supra). Die spezifischen Radioaktivitäten der eingebauten radioaktiven Mononukleotide waren 40 Ci/mmol in der Transkriptionsmischung für die gesamte Markierung oder 4 Ci/mmol in der Tran- skriptionsmischung für die Schwanzmarkierung. Transkribierte RNA wurde gemäß Moore, C. L & Sharp, P. A. (1985) Cell, 41 , 845-855 gereinigt. Beispiel tO In vitro-Deadenylierung
Die Testbedingungen für die in vitro-Deadenylierung waren wie folgt: 1 mM MgCI2, 2,5% (w/v) Poly(vinylalkohol) (Sigma P-8136, Mw 10000), 100 mM KCI, 0,15 Unit RNAguard, 5 bis 20 fmol RNA-Substrat, 20 bis 48% (v/v) Puffer (20 mM HEPES (KOH), 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 25% Glycerin, pH 7) und die entsprechende Proteinfraktion (Aström, J. et al. (1992), supra). Das Reaktionsvolumen war 15 oder 25 μl und die Inkubationen wurden bei 30°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden anschließend terminiert und RNA gemäß Moore, C. L. & Sharp, P. A. (1985), supra, gereinigt. Die RNA wurde durch Elektrophorese in einen 10% Polyacrylamid (19 : 1 Acrylamid/Bisacrylamid) - 7 M Hamstoffgelen, gefolgt von einer Autoradiographie der erhaltenen Gele analysiert. Beispiel 11
2D-Dünnschicht-Chromatography
Die zweidimensionale (2-D-Dünnschicht-Chromatographie) wurde auf PEI-Cellulose F-Platten (Merck Nr. 5579) gemäß Konarska, M. M. et al. (1985) Nature 313 (6003), 552-557, durchgeführt. Die in den Deadenylierungsreaktionen freigesetzten Produkte wurden durch eine zweidimensionale Dünnschicht-Chromatographie (2-D TLC) in einer Kammer analysiert. Das erste Laufmittel (I) war Isobutansäure/konzentriertes NH4OH/H2O; 577/38/385 (v/v) und das zweite Laufmittel (II) war gesättigtes (NH4)2SO4/1 M Natriumacetat/Isopropanol; 80/18/12 (v/v). Nach der ersten Auftrennung wurden die Platten bei Raumtemperatur 8 Stunden lang getrocknet, um die Isobutansäure zu verdampfen. Als Marker wurden 5'-AMP (Sigma A- 1752), 2'-AMP (Sigma A-9396), 3'-AMP (Sigma A-0386) verwendet. Die Position der Marker wurde mittels UV-Licht bestimmt (Mineralight lamp UVG-54, Ultra-Violet Prod. Inc.) bestimmt. Die radioaktiven Moleküle wurden mittels Autoradiographie der resultierenden PEI-Cellulose-F-Platte bestimmt.
Beispiel 12
1-D TLC und Quantifizierung der Nukleaseaktivität
Die Deadenylierungsaktivität wurde wie folgt quantifiziert: L3 (A30)-RNA-Substrat, markiert mit [α32P]ATP, wurde in einer in vitro-Deadenylierungsreaktion inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch 1-D TLC mit dem Laufmittel III (0,75 M K2HPO4) pH 3,5 (H3PO4)) analysiert. Die resultierende PEI-Cellulose F-Platte wurde getrock- net und in einem 400 S Phosphorimager (Molecular Dynamics) gescannt. Die Fraktionen mit freigesetztem [α32P]AMP wurden bestimmt. Aufgrund der bekannten spezifischen Aktivität von [α3 P]AMP in dem RNA-Substrat wurde die Menge in Mol von freigesetztem AMP berechnet. Eine Unit Deadenylierungsaktivität entspricht der Freisetzung von 1 pmol AMP/Minute. Beispiel 13
Bedingungen für die in vitro-Deadenylierung
Die Bedingungen der Poly(A)-Deadenylierungsaktivität wurde gemäß dem oben be- schriebenen Deadenylierungstest unter Verwendung von Poly(A)-
Sepharosefraktionen als Enzymquelle und Poly(A)-Schwanz-markierter L3(A30)-RNA als Substrat bestimmt. Die Aktivität wurde anhand der Freisetzung der Mononukleo- tide in dem 1 D TLC-Test (siehe oben) bestimmt. Hierzu wurde die Notwendigkeit von einwertigen (Kalium und Natrium)- und zweiwertige (Magnesium, Mangan, Zink und Calcium)-lonen untersucht.
Es wurde gefunden, daß zweiwertige Kationen für die Aktivität nicht notwendig sind und die optimale einwertige Kationenkonzentration bei ca. 100 mM liegt. Es wurde auch gefunden, daß die Aktivität in Anwesenheit von Kaliumionen größer ist als in Anwesenheit von Natriumionen. Auch wurde gefunden, daß Spermidin keinen Einfluß auf die Aktivität hat.
Des weiteren wurde gefunden, daß Magnesiumionen das bevorzugte zweiwertige Ion ist und die optimale Konzentration bei 1 mM liegt. Weiter wurde gefunden, daß Mangan-, Zink- und Caiciumionen Magnesiumionen zu einem bestimmten Grad ersetzen können. In Anwesenheit von 1 mM Mn2+, Zn2+ und Ca2+ nimmt die Aktivität von 17% über 2% auf 0,7% im Vergleich zu Mg2+ ab.
Untersuchungen zur pH-Abhängigkeit ergaben, daß die Aktivität bei ca. pH 7 am größten ist.
Beispiel 14 Substrat-Spezifität
Die RNA-Substrat-Spezifität der Aktivität wurde in zwei Experimenten untersucht. In einem ersten Experiment wurden die an ihren homopolymeren Schwänzen radioak- iv markierten RNA-Substrate L3(A30), ML45(U30), ML40(C32) und ML43(G30) in einem in vitro-Deadenylierungstest (siehe oben) inkubiert. Die Freisetzung von radioaktiven Mononukleotiden wurde im 1-D TLC-Test (siehe oben) gemessen. Anhand der gemessenen Ergebnisse wurden die Km und Vmax-Werte für jedes RNA-Substrat ge- maß Lineweaver-Burke bestimmt (siehe Tabelle II). In einem zweiten Experiment wurde die Substrat-Spezifität gemessen, indem RNA-Substrate mit internen Poly(A)- Abschnitten, gefolgt von Plasmid-kodierten RNA-Sequenzen ansteigender Länge mit Poly(A)-Sepharose-Fraktionen in einem in vitro-Deadeny-lierungstest inkubiert wurden. Es wurde gefunden, daß die RNA-Substrate L3(A30)X15, L3(A30)X49 und L3(A30)X164 gegenüber einem Abbau vollkommen resistent im Gegensatz zum RNA- Substrat L3(A30) waren (siehe Fig. 3). Hieraus folgt, daß RNA-Schwänze aus Ade- nosinresten das bevorzugte Substrat sind und daß nur 3'-end lokalisierte Poly(A)- Schwänze effektiv abgebaut werden.
Beispiel 15
Bestimmung des freigesetzten Mononukleotids
Das freigesetzte Mononukleotid-Reaktionsprodukt wurde mittels 2-D TLC bestimmt. Hierzu wurde die Poly(A)-Sepharosefraktion zusammen mit RNA-Substrat L3(A30), welches mittels [α32P]AMP während der in vitro-Transkription markiert wurde, in einem in vitro-Deadenylierungstest inkubiert. Nach 20 Minuten wurden die Reaktionsprodukte mittels 2-D TLC unter Verwendung von nicht markierten 2'-AMP, 3'-AMP und 5'-AMP als Marker analysiert. Das Ergebnis (siehe Fig. 4) ergab, daß 5'-AMP während der in vitro-Deadenylierungsreaktion Enzym freigesetzt wird.
Beispiel 16
Kinetik der Nukleaseaktivität
Um zu bestimmen, ob die Nukleaseaktivität RNA-Substrate in einer prozessiven oder distributiven Weise abbaut, wurde zuerst die Kinetik einer in vitro- Deadenylierungsreaktion in Anwesenheit von 0,5 μl einer Poly(A)-Sepharosefraktion und x fmol L3 (A30) RNA-Substrat, ganzheitlich markiert, bestimmt. Figur 5A zeigt, daß vollständig abgebaute RNA akkumuliert, bevor das gesamte RNA-Substrat reagierte. Hieraus folgt, daß die Deadenylierungsreaktion nach 20 Minuten unter diesen Bedingungen vollständig beendet war. In einer weiteren Reaktion wurde 20 Minuten lang in Anwesenheit einer steigenden Menge von Poly(A) inkubiert. Figur 5B zeigt, daß die Zugabe von Poly(A) die Reaktion inhibiert und daß sowohl nicht- deadenylierte wie auch vollständig deadenylierte RNA-Substrate bei der größten gemessenen Konzentration von zugegebenem Poly(A) anwesend waren. In einem dritten Experiment wurde die Menge an Nukleaseaktivität geändert. Die Inkubations- zeit war 20 Minuten. Figur 5C zeigt, daß sowohl nicht-deadenylierte wie auch deadenylierte RNA-Substrate sogar bei der geringsten Menge an zugegebener Nukleaseaktivität anwesend waren. Hieraus folgt, daß die Exonukleaseaktivität hoch prozessiv ist, d.h. das Enzym dissoziiert nicht vom Substrat, bis der Adenosin-Schwanz vollständig abgebaut ist.
Beispiel 17 Rückfaltungsexperiment (Figur 6)
Die Rückfaltungsexperimente wurden nach Dayle et.al. (supra) durchgeführt. Mit der Ausnahme, daß die Rückfaltung auf dem Gel bei 4 Grad Celsius über Nacht erfolgt. Für diese Experimente wurden die aktiven Fraktionen aus der Poly(A)-Sepharose Chromatographie (Bsp. 3) verwendet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung einer Poly(A)-spezifischen 3'-Exonukleaseaktivität enthaltend folgende Schritte: (a) Herstellen eines Rohextraktes aus tierischen oder menschlichen Zellen;
(b) Proteinfällung des Rohextraktes erhältlich aus Schritt (a), vorzugsweise mit Ammoniumsulfat;
(c) Chromatographie des Präzipitates erhältlich aus Schritt (b) an einem basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem schwach basischen Anionenaustauscher, insbesondere an DEAE;
(d) Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (c), vorzugsweise an Heparin;
(e) Chromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (d) an einem basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem stark basischen Anionenaustauscher, insbesondere an Mono Q;
(f) Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (e), vorzugsweise an einem Farbstoff, insbesondere an einem blauen Farbstoff, vor allem an Blue-Sepharose;
(g) Poly(A)-Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (f); (h) Chromatographie der aktiven Fraktionen aus Schritt (g) an einem basischen Anionenaustauscher, vorzugsweise an einem stark basischen
Anionen-austauscher, insbesondere an Mono Q; und gegebenenfalls (i) Gelfiltration der aktiven Fraktionen aus Schritt (g). oder (j) Zweimalige Affinitätschromatographie der aktiven Fraktionen aus
Schritt (f); vor allem an ssDNA Agarose mit anschließender 5'AMP
Chromatograhpie.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen oder menschlichen Zellen Thymuszellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Ammonium-sulfatfällung gemäß Schritt (b) bei ca. 45% Sättigung durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß vor der genannten Ammoniumsulfatfällung eine Ammoniumsulfatfällung bei ca. 25% Sättigung durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (c) bei ca. 0,17 M eines
Salzes eluierbar sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (d) bei ca. 1,0 M eines Salzes eluierbar sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (e) bei ca. 10%iger 1 ,0 M eines Salzes eluierbar sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (f) bei ca. 1,0 M eines Salzes eluierbar sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (g) bei ca. 0,35-0,55 M eines Salzes eluierbar sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (j) bei ca. 2,0 M eines
Salzes eluierbar sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die aktiven Fraktionen der Chromatographie gemäß Schritt (h) bei ca. 0,17 M eines Salzes eluierbar sind.
12. Zusammensetzung enthaltend eine poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-11.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Aktivität unter denaturierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa besitzt.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Aktivität unter nativen Bedingungen ein Molekulargewicht von ca. 180-220 kDa besitzt.
15. Verfahren zur Deadenylierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß die Deadenylierungsreaktion in Anwesenheit einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12-14 durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die
Deadenylierungsreaktion 3'-Poly(A)-Schwänze vorzugsweise von mRNA abbaut.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Dea- denylierungsreaktion zusätzlich in Anwesenheit von einwertigen Kationen, insbesondere Kalium, vorzugsweise bei einem pH von ca. 7 abläuft.
18. Antikörper gegen eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12-14.
19. Verfahren zur Herstellung eines Antiköφers gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 immunisiert und gegebenenfalls die entstandenen Antiköφer isoliert werden.
20. Arzneimittel enthaltend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
21. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoff formuliert wird.
22. Diagnostikum enthaltend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 oder Antiköφer gemäß Anspruch 18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
23. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chro- nische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 oder Antiköφer gemäß Anspruch 18 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt werden.
24. Test zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren enthaltend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 oder Antiköφer gemäß Anspruch 18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
25. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12-14 oder Antiköφer gemäß Anspruch 17 zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.
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