JP2002519023A

JP2002519023A - ３’−エキソヌクレアーゼ、その調製および使用

Info

Publication number: JP2002519023A
Application number: JP2000557349A
Authority: JP
Inventors: ノイマン，トーマス; ヒュルス，クリストフ; ガレルト，カルル−クリスティアン; ヴィルタネン，アンデルス; アストレム，ヨナス; マルティネス，ヤビエル; ツレッソン，アンーシャルロット; レン，ヤングオ
Original assignee: アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
Priority date: 1998-06-29
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2002-07-02
Also published as: AU762101B2; CA2334046A1; KR20010053255A; WO2000000596A1; EP1092013A1; HUP0103860A2; PL345319A1; US6451307B1; AU4612599A

Abstract

(57)【要約】本発明は、動物またはヒト細胞の粗抽出物をクロマトグラフィで精製して得られる、ポリ（Ａ）−特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物、および核酸の３’−ポリ（Ａ）尾部の脱アデニル化への使用、および薬剤または診断薬としての使用または機能性相互作用物質（functional interactors）の同定のための使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】詳細な説明本発明は、動物またはヒト細胞の粗抽出物をクロマトグラフィで精製して得ら
れる、ポリ（Ａ）−特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物、および核酸の３’
−ポリ（Ａ）尾部の脱アデニル化への使用、および薬剤または診断薬としての使
用または機能性相互作用物質（functional interactors）の同定のための使用に
関する。

【０００２】真核生物のｍＲＮＡの大半は、その３’末端に所定の長さのおよそ２００のア
デノシン残基のポリ（Ａ）尾部をもっている。これらポリ（Ａ）尾部はｍＲＮＡ
の半減期または細胞内輸送だけでなく、対応するタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳
にも影響するようである。詳細なメカニズムは解明されていないが、ポリ（Ａ）
尾部の合成および分解は直接的または間接的に尾部の機能と関係があるようであ
る（例えば、Wichens, M.ら、(1977)Curr.Opin.Genet.Dev.,7,220-232参照）。

【０００３】ポリ（Ａ）分解ヌクレアーゼ活性物は、既に幾つかの真核生物系において研究
されている（例えば、Virtanen,A. およびAstroem,J. (1997) Prog.Mol.Subcell
.Biol.(Jeanteur, P., ed）Vol. 16,199-220, Springer-Verlag,Berlin-Heidelb
erg参照）。かくして、例えば２つの反応経路が酵母について同定されている。
そのうち１つの反応経路は、すなわちいわゆる脱アデニル化依存性脱キャッピン
グ（decapping）経路であり、ポリ（Ａ）尾部の除去により開始し、そしてＸｍ
１ｐ５’−エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの５’−３’−エキソヌクレアー
ゼ溶解性分解に関係する。他の反応経路は、すなわちいわゆる３’−５’−崩壊
経路（3'-5'-decay passway）であり、ｍＲＮＡの脱アデニル化により開始し、
ｍＲＮＡの３’−５’−エキソリボヌクレアーゼ溶解性分解に関係する。エキソ
ソームといわれる多成分系複合体は、近年、３’−５’−崩壊経路に関与してい
ると同定された（Mitchell, P.ら、(1997), Cell 91, 457-466）。エキソソーム
は幾つかの３’−５’−エキソリボヌクレアーゼからなり、５．８ｒＲＮＡ３’
プロセシングとｍＲＮＡの３’−５’分解との双方に関与している（Anderson,
J.S.J.およびParker, R.(1998), EMBO J. 17,1497-1506）。しかしエキソソーム
のエキソリボヌクレアーゼの全てがポリ（Ａ）優先的に分解するかどうかは不明
である。これに加えて、ポリ（Ａ）結合タンパク質Ｉ（ＰＡＢＩ）依存性ポリ（
Ａ）特異的ヌクレアーゼ（ＰＡＮ）が酵母において同定されている（例えば、Lo
well, J.E. ら、(1992), Genes Dev. 6,2088-2099参照）。ＰＡＮは３’−５’
−エキソリボヌクレアーゼであり、少なくとも２つのポリペプチド、すなわちＰ
ａｎ２ｐとＰａｎ３ｐとから構成される（例えば、Brown, C.E.Jr. ら、(1996),
Mol. Cell. Biol.,16,5744-5753参照）。

【０００４】少なくとも３つの異なるポリ（Ａ）分解活性物が哺乳動物細胞において特性を
示している。例えば、Ｈｅｌａ細胞において見つかった活性物は３’位に位置す
るポリ（Ａ）尾部の分解に対して高い選択性を有し、３’位に位置するヒドロキ
シル基を必要とし、モノヌクレオチド反応生成物として５’−ＡＭＰを形成する
（例えば、Astroem, J. ら、(1992), J.Biol.Chem.267(25), 18154-18159および
J. Astroem,A. AstroemおよびA. Virtanen, 「ＨｅＬａ細胞３’エキソヌクレア
ーゼによる哺乳動物ｍＲＮＡのインビトロ脱アデニル化」、EMBO J., (1991), V
ol.10, 3067参照）。さらに分子量７４ｋＤａを有するＭｇ²⁺−依存性ポリ（Ａ
）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼが子牛胸腺において説明されている（Ko
erner, C,G.およびWahle, E. (1997) J.Biol.Chem., 272(16),10448-10456）。
分子量３３ｋＤａを有するポリリボソーム関連（a polyribosome-associated）
３’−エキソリボヌクレアーゼも説明されているが、この３’−エキソリボヌク
レアーゼはポリ（Ａ）特異的ではない（Caruccio, N. およびRoss, J. (1994),
J.Biol. Chem.269(50), 31814-31821）。分子量６０ｋＤａを有するもう一つの
ポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物が子牛胸腺で同定された。し
かしそれ以降このタンパク質はｈｎＲＮＰＬタンパク質であり、したがって測
定されたポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼ活性物とは関係がない
ことが判明した。

【０００５】したがって本発明の目的は、特異的に３’位に位置するポリ（Ａ）尾部を分解
する３’−エキソリボヌクレアーゼを提供することである。したがって本発明はポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物を分離
する方法に関し、その方法は、以下の工程：（ａ）動物またはヒト細胞から粗抽出物を調製し；（ｂ）工程（ａ）で得られる粗抽出物に存在するタンパク質を沈殿させ；（ｃ）工程（ｂ）で得られる沈殿物を塩基性アニオン交換体上でクロマトグラフ
ィにかけ；（ｄ）工程（ｃ）からの活性画分をアフィニティクロマトグラフィにかけ；（ｅ）工程（ｄ）からの活性画分を塩基性アニオン交換体上でクロマトグラフィ
にかけ；（ｆ）工程（ｅ）からの活性画分をアフィニティクロマトグラフィにかけ；（ｇ）工程（ｆ）からの活性画分をポリ（Ａ）−アフィニティクロマトグラフィ
にかけ；（ｈ）工程（ｇ）からの活性画分を塩基性アニオン交換体上でクロマトグラフィ
にかけ；そして、ここで適切な場合、（ｉ）工程（ｇ）からの活性画分をゲル濾過にかけるか；あるいは（ｊ）工程（ｆ）からの活性画分を２ラウンドのアフィニティクロマトグラフィ
にかける；からなる。

【０００６】驚くべくことに、上述の方法にて得られる３’−エキソヌクレアーゼ活性物は
３’位に位置するポリ（Ａ）尾部に特異的であり、３’位に位置するヒドロキシ
ル基が必要であり、そしてモノヌクレオチド反応生成物として５’−ＡＭＰが形
成される。既知の３’−ヌクレアーゼ活性物とは対照的に、本発明の３’−ヌク
レアーゼ活性物は変性条件下で分子量およそ５０ｋＤａを有する。子牛胸腺から
の７４ｋＤａタンパク質とは対照的に、本発明の３’−エキソヌクレアーゼ活性
物は低塩濃度においてスペルミジンにより刺激されず、反対に、低塩濃度および
高塩濃度の両方においてかえって阻害される。さらに子牛胸腺７４ｋＤａタンパ
ク質とは対照的に、本発明の３’−エキソヌクレアーゼ活性物はヘパリンセファ
ロースと比較的強く相互作用する。さらに子牛胸腺７４ｋＤａタンパク質は、SD
S-Page（図.1Bおよび2B）では見つかっていない。加えて、ＨｅＬａ細胞エキソ
ヌクレアーゼ活性物とは対照的に、本発明のエキソヌクレアーゼはＭｎ²⁺存在下
でも活性であることは驚くべきことである。さらに驚くべきことに本発明のエキ
ソヌクレアーゼ活性物は進行的に（progressively）作動し、すなわちエキソヌ
クレアーゼがポリ（Ａ）尾部の３’末端と結合し、エキソヌクレアーゼ−ポリ（
Ａ）複合体が解離することなしにヌクレオチド単位でこれを分解するのであるが
、これは、７４ｋＤａタンパク質が配分的に（distributively）作動し、複合体
が１の作動ステップの後に解離し、再生されなければならないのとは異なる。

【０００７】本発明のポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物は、好ましくは動
物またはヒトの胸腺細胞、特に子牛胸腺から分離される。一般に、この目的のた
めに全細胞抽出物を、好ましくはこの抽出物から硫酸アンモニウムで沈殿させた
タンパク質と共に調製する。この点に関連して、飽和濃度およそ４５％の硫酸ア
ンモニウムが好ましい。この点に関連して特に有利なのは、真のタンパク質の沈
殿の前に、好ましくはおよそ２５％の飽和濃度の硫酸アンモニウムで異質の（fo
reign）タンパク質を沈殿させて分離する場合には、以降のステップで所望の３
’−エキソヌクレアーゼ活性物をおよそ４５％の飽和濃度の硫酸アンモニウムで
上清から沈殿させるようにすることである。このタンパク質分画自体は望ましく
ない異質タンパク質を多量に分離する。

【０００８】次いで、沈殿物を塩基性アニオン交換体、好ましくは弱塩基性アニオン交換体
、特にＤＥＡＥ（例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の上でクロマトグラフ
ィにかける。一般に、活性画分はおよそ０．１７Ｍ塩（好ましくは１価の塩、Ｋ
Ｃｌなど）濃度で溶出する。溶出した活性画分を、常法により透析して、ついで
好ましくはヘパリン上でアフィニティクロマトグラフィにかける。これは、驚く
べきことに活性画分が特にヘパリン、例えばヘパリンセファロースによく結合す
ることがわかったからである。したがって活性画分は普通、高い塩濃度（例えば
およそ１．０Ｍ濃度の１価の塩、ＫＣｌなど）で溶出する。ついで活性画分を塩
基性アニオン交換体、好ましくは強塩基性アニオン交換体、特にＭｏｎｏＱ（Ｍ
ｏｎｏＱＨＲ１６／１０など）の上でクロマトグラフィにかける。好ましくはタ
ンパク質をリニア勾配を用いて溶出し、これは活性画分をおよそ１０％の塩濃度
（特におよそ１．０Ｍ濃度の１価の塩、ＫＣｌなど）で溶出することが可能であ
る。この後、活性画分を、好ましくは染料、特に青色染料、特に好ましくはBlue
Sepharoseの上でアフィニティクロマトグラフィにかける。多段階、好ましくは
２段階の塩勾配を用いて、タンパク質を溶出するのが好ましく、活性画分は好ま
しくは高い塩濃度（特に高い濃度の１価の塩、特に好ましくはおよそ１．０Ｍ濃
度の塩、１．０ＭのＫＣｌなど）で溶出する。

【０００９】本発明によると、この後にポリ（Ａ）に対してアフィニティクロマトグラフィ
にかけ、活性画分をおよそ０．３５〜およそ０．５５Ｍ塩濃度（特に１価の塩、
ＫＣｌなど）で溶出することが可能である。加えて、本発明の方法に整合させて
、活性画分を別の塩基性アニオン交換体、好ましくは強塩基性アニオン交換体、
特にＭｏｎｏＱ（ＳＭＡＲＴＭｏｎｏＱなど）の上でクロマトグラフィにかけ
る。この点に関連して、好ましくは活性物をおよそ０．１７Ｍ塩濃度（特に１価
の塩、ＫＣｌなど）で溶出する。本発明の方法に整合させて、最終精製工程は、
適切な場合、活性画分をゲル濾過、好ましくはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾
過、特にＳＭＡＲＴＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過にかけ、一般におよそ０
．１Ｍ塩濃度（特に１価の塩、ＫＣｌなど）の存在下に、活性画分を充分に分別
することができる。

【００１０】本発明の方法に整合させて、収率およそ１３％（表１参照）で、およそ６００
倍のポリ（Ａ）特異的エキソヌクレアーゼ活性物を精製することが可能である。
この点に関連して、特に驚くべきことは、本発明によると、工程（ｇ）のポリ（
Ａ）アフィニティクロマトグラフィによりおよそ１４倍の活性の精製を与えるこ
とである。

【００１１】他の態様において、タンパク質を染料クロマトグラフィの後に、ダブルアフィ
ニティクロマトグラフィ、好ましくはｓｓＤＮＡＡｇａｒｏｓｅ上でのクロマ
トグラフィの後、５’ＡＭＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ上でのクロマトグラフィにか
ける。活性画分は普通は、およそ２．０Ｍ濃度などの１価の塩（ＫＣｌなど）の
高い塩濃度で溶出する。

【００１２】本発明の方法により、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内で変性条件下およそ５
０ｋＤａになり、例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ２００上で天然条件下およそ１８０
〜２２０ｋＤａになるポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物を生じ
る。

【００１３】したがって本発明はおよそ５０ｋＤａのタンパク質にも関連し、ここで適切な
らば、本発明の方法により得ることができるポリ（Ａ）特異的エキソヌクレアー
ゼ活性物を有する結合タンパク質（テトラマー）にも関連する。

【００１４】したがって本発明は本発明の方法で得られるポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌ
クレアーゼ活性物を含む組成物にも関連する。ここで適切ならば、組成物は他の
添加剤および補助剤を含む。

【００１５】本発明は核酸の脱アデニル化方法にも関連し、好ましくはｍＲＮＡに属する、
特に３’位に位置するポリ（Ａ）尾部を本発明の組成物の存在下に脱アデニル化
する方法に関連する。脱アデニル化反応は好ましくは１価のカチオン（Ｋ⁺およ
び／またはＮａ⁺など）の存在下、特に１価カチオンの濃度およそ０．１Ｍで起
こる。さらに好適なのは、脱アデニル化反応がｐＨおよそ７で起こることである
。

【００１６】本発明は本発明の組成物と特異的に反応する抗体および／またはそれらの成分
にも関連し、組成物それ自体が免疫原的であるか、あるいはウシ血清アルブミン
などの好適なキャリヤにカップリングすることによって成分を免疫原的にするこ
とが可能であるか、あるいは組成物の免疫原性を増加させることが可能である。

【００１７】抗体はポリクローナル抗体かあるいはモノクローナル抗体のいずれかである。
その調製法も本発明の主題事項の一部であるが、例えば周知の方法（適切ならば
例えばFreund's 補助剤および／またはアルミニウムヒドロキシドゲルの存在下
で哺乳動物、例えばウサギの免疫化）によって行われる（例えば、Diamond, B.A
.ら、(1981)The New England Journal of Medicine,1344参照）。免疫的反応に
より動物に生産されるポリクローナル抗体は、かくして周知の方法により血液か
ら直ちに分離することができ、そして例えばカラムクロマトグラフィにより精製
することができる。抗体をアフィニティクロマトグラフィで精製するのが好まし
く、ここにおいて本発明の組成物はＮＨＳ活性化ＨｉＴｒａｐカラムとカップリ
ングしている。

【００１８】モノクローナル抗体は、例えばWinterおよびMilstein（Winter, G.およびMils
tein, C.(1991) Nature,349,293）の既知の方法に従って調製できる。さらに本発明は、本発明の組成物、そしてここで適切ならば、好適な添加剤ま
たは補助剤を含む薬剤にも関連し、そしてガン、自己免疫性疾患、特に複合的硬
化症またはリウマチ性関節炎、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎
、タイプＩアレルギーまたはタイプＩＶアレルギー、関節、関節硬化症、骨粗鬆
症、急性または慢性の感染症および／または糖尿病の治療のため、および／また
は特に免疫抑制、さらに特に臓器移植に関連する細胞の新陳代謝に対する作用の
ための、本発明の組成物と薬剤学的に受容可能な添加剤および／または補助剤と
を共に処方した薬剤の製造方法にも関連する。

【００１９】好適な添加剤および／または補助剤の例は、生理的食塩水、安定剤、プロテイ
ナーゼ阻害剤などである。さらに本発明は本発明の組成物、そしてここで適切ならば、好適な添加剤およ
び／または補助剤を含む診断薬にも関連し、そしてガン、自己免疫性疾患、特に
複合的硬化症またはリウマチ性関節炎、アルツハイマー病、アレルギー、特に神
経皮膚炎、タイプＩアレルギーまたはタイプＩＶアレルギー、関節、関節硬化症
、骨粗鬆症、急性または慢性の感染症および／または糖尿病の治療のため、およ
び／または特に免疫抑制、さらに特に臓器移植に関連する細胞の新陳代謝に対す
る作用のための、薬剤学的に受容可能な添加剤および／または補助剤を本発明の
組成物に加えた診断薬の製造方法にも関連する。

【００２０】例えば、本発明によると、本発明の組成物は固相（例えばニトロセルロースま
たはナイロン）に結合することができ、そしてこの方法で、インビトロで例えば
研究すべき体液（例えば血液）と接触させることができ、これにより例えば自己
免疫性抗体と反応させることができる。次いで抗体−タンパク質複合体を、例え
ば標識したＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭ抗体を使用して検出することができる。標
識は例えばペルオキシダーゼなどの酵素であり、着色反応を触媒する。自己免疫
性抗体の存在および存在する抗体の量は、こうして直ちに迅速に着色反応により
測定することができる。

【００２１】もう一つの診断薬は、本発明の抗体それ自体を含む。これらの抗体を使用して
、例えば、直ちに迅速にヒト組織試料を研究して本発明の組成物および／または
それらの成分が存在するかどうかを測定することができる。この場合、本発明の
抗体は、例えば上述したような酵素で標識されている。これにより、酵素着色反
応によって直ちに迅速に特異的抗体−タンパク質複合体を測定することが可能に
なる。

【００２２】本発明は、本発明の組成物または本発明の抗体およびここで適切ならば、好適
な添加剤および／または補助剤を含む機能性相互作用物質（阻害剤または刺激剤
など）の同定試験にも関連する。このために、例えばいわゆる化学ライブラリー
から選択される基質は上に既に詳細に説明した脱アデニル化反応に用いられ、そ
して本発明の組成物の活性はこの基質の存在下および／又は非存在下で測定され
る。好適な基質の例は、ｍＲＮＡまたはポリ（Ａ）である。試験は、実施例に詳
細に説明する、例えばインビトロ脱アデニル化類似反応により行うことができる
。

【００２３】したがって、本発明の組成物の別の一般的な使用の可能性も、ポリ（Ａ）特異
的な方法で、核酸、特にｍＲＮＡの分解である。核酸のポリ（Ａ）特異的分解は
研究所において特に使用することができる。

【００２４】以下の表、図面および実施例は本発明を制限することなく明確にすることを意
図したものである。表の説明表１はウシポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物の精製を要約し
たものである。インビトロ転写の間に［α³²Ｐ］ＡＴＰで標識したＬ３（Ａ₃₀）
ＲＮＡとともにクロマトグラフィ画分をインビトロ脱アデニル化条件下にインキ
ュベートして、脱アデニル化活性を定量した。１分当たり１ｐｍｏｌのＡＭＰを
放出することを１ユニットと定義する。

【００２５】

【表１】

【００２６】表２はポリ（Ａ）特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物の基質特異性を示す
ものである。

【００２７】

【表２】

【００２８】本文中使用される略号Ｌ３：ヒトアデノウィルス２の後期部位（late region）にあるポリ（Ａ）部
位（長さ：５４ヌクレオチド）（J.Astroem, A. Astroem およびA. Virtanen,
「ＨｅＬａ細胞３’−エキソヌクレアーゼによる哺乳動物ｍＲＮＡのインビトロ
脱アデニル化」,EMBO, (1991),Vol 10, 3067）Ｘｎ：ｎヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ）

【００２９】

【実施例】

【００３０】

【実施例】

実施例１細胞フリー抽出物の準備粗全細胞抽出物を、Wahle, E. (1991) J. Biol. Chem. 266, 3131-3139に記述
される方法で子牛の胸腺から準備した。このため、3〜15 kgの子牛胸腺を氷上で
解凍して細かく切り、バッファー1（50 mM Tris-HCl、10 mM K₃PO₄、1mM EDTA、
10％グリセロール、50 mM KCl、0.1 mM DTT、pH7.9）の量とほぼ等体積量で、低
速で50秒間および高速で50秒間Waringブレンダーでホモジナイズした。固体材料
をSorwall GSAローターで16,000 g、4℃、60分間で遠心分離することにより沈殿
させた。そして、粗抽出物を7（普通）の網目孔のあるふるい（Pascal Eng. Co.
Ltd.）を通して濾過して；そして0.134 gの硫酸アンモニウム（25％飽和）を加
えて、抽出物を2時間氷上で撹拌し、そして沈殿物をSorwall GSAローターで16,0
00 g、4℃、60分間で遠心分離することにより沈殿させた。そして、さらに0.115
gの硫酸アンモニウムを上清（45％飽和）1 ml毎に加えて、そして上清を既に上
記したように処理した。遠心分離後に得られたペレットを2〜4体積のバッファー
D（20 mM HEPES (KOH)、100 mM KCl、1.5 mM Mg Cl₂、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT
、20％グリセロール、pH 8.2）に溶解し、この溶液を6000から8000までの分子量
除外限度（a molecular weight exclusion limit）を持つ透析バッグで4℃、10
時間透析した。透析後、45％硫酸アンモニウム画分（A.S. 45）を液体窒素で凍
結して-70℃で保存した。出発材料として45 kgの子牛胸腺を使用した場合、A.S.
45画分（約960 ml）はその時1 ml毎に約68 mgのタンパク質を含有し、総タンパ
ク質量は65 gであった。タンパク質濃度はBioradタンパク質アッセイキット（No
. 500-0001）で、基準物質として牛ガンマグロブリンを使用して決定した。

【００３１】実施例２ポリ(A)特異的3'エキソヌクレアーゼ活性物の部分的精製 960 mlの粗A.S. 45画分（65 gのタンパク質）を部分的精製のための出発材料
として使用した（表1参照）。2つの本質的同定的（two essentially identical
）DEAEセファロースクロマトグラフィーを行った。最初、160 mlのA.S. 45抽出
物をバッファーDで平衡化したDEAEセファロースCL-6B（Pharmacia No. 17-0710-
01）イオン交換器（球形では240 mlのマトリクス）に加えた。懸濁液を4℃で30
分間ゆっくりと撹拌した。非結合材料をバッファーDで3回洗浄して遠心分離（So
rwall H4000ローターで800 rpm、3分間）することで除去した。そしてDEAEセフ
ァロースマトリクスをカラム（直径50 mm）内にパックし、バッファーDを用いて
流速毎時9 cmで洗浄した。2段階塩勾配（a two-step salt gradient）（各々0.1
7 Mおよび1.0 M KClを含むバッファーD）を行い、溶出タンパク質を回収した。
他の800 mlのA.S. 45画分を同じ方法で分別した。しかし、この場合、240 mlの
パックしたDEAEセファロースを使用し、カラムの直径は70 mmとした。0.17 M KC
lで溶出した、画分IIと呼ぶタンパク質をバッファーDに対して10時間透析し、液
体窒素で凍結して-70℃で保存した。続いて、画分IIをヘパリンセファロースCl-
6B（Pharmacia No. 17-0467-01）でクロマトグラフィーにより分別した。床体積
（bed volume）が100 mlで直径50 mmのカラムを、バッファーDを用いて流速毎時
9 cmで平衡化した。2つの本質的同定的ヘパリンセファロース分別を行った。画
分II（210 ml）をヘパリンセファロースCl-6Bカラムに流速毎時9 cmでロードし
た。非結合材料を溶出した後、結合タンパク質を1.0 M KClを含むバッファーDを
用いてカラムを洗浄することにより溶出した。ヘパリンセファロースカラムは画
分IIの残余（270 ml）を分離するために2回使用した。溶出画分（IIBと呼ぶ）を
4℃で10時間バッファーDに対して透析し、液体窒素で凍結して-70℃で保存した
。そして画分IIBを、Mono Q HR 16/10（Pharmacia No. 17-0506-01）での4つの
本質的同定的FPLC（Pharmacia）クロマトグラフィーにより分別した。このため
、バッファーDで平衡化したMono Qカラムを50 mlスーパーループ（Superloop）
（Pharmacia No. 19-7850-01）を使用してタンパク質とともにロードした（サイ
クル毎、約30 mlの画分IIB）。タンパク質を2段階リニア勾配（バッファーD 250
mlにおいて0〜20％の1.0 M KClおよびバッファーD 150 mlにおいて20から50％
の1.0 M KCl）を使用して溶出し、9 mlの画分を回収し、10％ 1.0 M KClで溶出
した活性画分を合わせて（画分MQと呼ぶ）、4℃で10時間バッファーDに対して透
析し、液体窒素で凍結して-70℃で保存した。Blue Sepharose CL-6B（Pharmacia
No. 17-0830-01）でパックした直径26 mmの21 mlカラムを、製造業者の説明に
従って準備した。カラムはバッファーDを用いて流速毎時34 cmで平衡化した。MQ
画分（108 ml）をカラム内にロードし、結合したタンパク質を2段階塩勾配（各
々0.17 Mおよび1.0 M KClを含むバッファーD）を使用して溶出した。1.0 M KCl
を用いて溶出することで得られる活性画分（Cと呼ぶ）を4℃で10時間バッファー
Dに対して透析し、液体窒素で凍結して-70℃で保存した。

【００３２】実施例３ポリ(A)セファロースクロマトグラフィーポリ(A)セファロースCL-6Bを製造業者の説明に従って準備した。床体積が8 ml
のHR 10/10カラムをpH 7で25 mM KClを含むバッファーDで平衡化した。12 mg（1
2 ml）の画分CをpH 7で25 mM KClを含むバッファーDの2×2 lに対して4時間透析
した。透析した画分を流速毎分1 mlのカラムにロードした。そして第一にカラム
をpH 7で25 mM KClを含むバッファーDの5床体積で洗浄し、その後 pH 6で200 mM
KClを含むバッファーDの5床体積で洗浄し、そして続いてpH 6で280 mM KClを含
むバッファーDの5床体積で洗浄した。そしてpH 6で280から600 mM KClの勾配（5
床体積）を適用した。ポリ(A)特異的エキソヌクレアーゼ活性を350および550 mM
の間で溶出した。これは14倍のヌクレアーゼ活性の精製を達成した。

【００３３】実施例４ SMART Mono Qクロマトグラフィー SMART Mono Q PC 1.6/5カラムをpH 7で50 mM KClを含むバッファーDを用いて
、流速毎分50μlで平衡化した。1 mlのポリ(A)セファロース画分（60μgのタン
パク質）をpH 7で50 mM KClを含むバッファーDに対して透析し、同じ流速でカラ
ムに適用した。そしてカラムを50から500 mM KClの1.5 ml勾配とともにロードし
た。50μlの画分を回収し、エキソヌクレアーゼ活性をin-vitro脱アデニル化試
験（deadenylation test）（以下参照）を使用して同定した。エキソヌクレアー
ゼ活性物を約170 mM KClで溶出した。

【００３４】実施例５ SMART（Pharmacia, Uppsala）Superdex 200ゲル濾過ポリ(A)セファロース画分（1 mlあたり、0.7 ml、0.06 mgのタンパク質）をま
ず、以下の方法に従って行ったSMART Mono Q PC 1.6/5（Pharmacia No. 17-0671
-01）クロマトグラフィーにより濃縮した。カラムをpH 7で50 mM KClを含むバッ
ファーDで平衡化した。ポリ(A)セファロース画分をpH 7で50 mM KClを含むバッ
ファーDに対して透析し、流速毎分50μlのMono Qカラムにロードした。結合材料
を500 mM KClまでのリニア勾配を用いて溶出し、25μl画分を回収した。活性画
分（総量100μl）を同定して合わせた。そして50μlの濃縮ポリ(A)セファロース
画分を、pH 7で100 mM KClを含むバッファーDで平衡化したSMART Superdex 200
PC 3.2/30カラムでのゲル濾過により分別した。流速は毎分40μlとした。活性画
分をin-vitro脱アデニル化試験（以下参照）を使用して同定した。分子量マーカ
ーを同じ方法を使用してSuperdex 200カラムで分別した。分子量マーカーは各々
440、232、158および 67 kDaの分子量を持つフェリチン、カタラーゼ、アルドラ
ーゼおよびBSAとした。

【００３５】実施例６ ssDNAアガロースアフィニティークロマトグラフィー ssDNAアガロースを製造業者の説明に従って準備した（Pharmacia 27-5575-02
）。0.6 mlカラムをパックした。カラムを50 mlのKCl（pH 7.0）を含むバッファ
ーD中の実施例３由来の活性画分C（10 ml）を用いてロードした。通過（run-thr
ough）画分を回収した。

【００３６】実施例７ 5'-AMPアフィニティークロマトグラフィー 5'-AMPセファロース（Pharmacia 17-0620-01）を製造業者の説明の従って準備
し、実施例６の通過画分を50 mlのKCl（pH 7.0）を含むバッファーD中のカラム
にロードした。そしてカラムを50 mlのKCl（pH 7.0）中の5 mlのバッファーDで
洗浄した。その後、200 mlのmM KCl（pH 7.0）を含む5 mlのバッファーDで洗浄
した。最後に、活性を2 M KCl（pH 7.0）を含む2 mlのバッファーDを用いてカラ
ムから溶出した。

【００３７】実施例８ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図1B、2Bおよび2Dのために行った） SDS-ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド 30：0.8）
ゲル（スペーサー（spacer）では5％アクリルアミドおよび分析（resolving）ゲ
ルでは7.5％アクリルアミド）を、Mini-protean IIゲルアプライアンス（Bio-Ra
d No. 125BR）を使用したLaemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685に記述さ
れるように準備した。適当な量のタンパク質を直接ゲルで、あるいはゲルをロー
ドする前のどちらかで分別し20％ TCAの1体積の添加に続く30分間4℃における13
,000 gでの遠心分離により沈殿させた。生じた沈殿物をアセトンで洗浄し、10μ
lの試料バッファー（50 mMトリスHCl、pH 6.8、1％ (w/v) SDS、100 mM DTT、8
％ (v/v)グリセロール、0.025％ (w/v)ブロモフェノールブルー）に懸濁させて
、ゲル電気泳動により分別した。生じたゲルを固定し染色した。Oakley, B.R.ら
(1980) Anal. Biochem. 105, 361-363による記述のように銀染色を行った。ク
マシーブリリアントブルー（Commassie Brilliant Blue）染色をMerryl, C.R. (
1990) Meth. Enzymol. 182, 477-488による記述のように行った。

【００３８】実施例９ RNA基質の準備 5'-キャップRNA基質（L3(A₃₀)、L3(A₃₀)X₁₅、L3(A₃₀)X₄₉およびL3(A₃₀)X₁₆₄）
を、T3 RNAポリメラーゼ（Promega No. P208C）およびDNAテンプレートしてNsiI
、Hinc II、EcoRIおよびPvu IIで消化したプラスミドpT3L3(A₃₀)（Astroem, J.
ら (1991) EMBO J. 10(10), 3067-3071）を使用してin-vitro転写により合成し
た。RNA基質ML(G₃₀)、ML(C₃₂)およびML(U₃₀)を上記のようにAstroem, J.ら (199
1)に記述されるように準備した。RNA基質を全体にあるいはそれらのホモポリメ
リック（homopolymeric）な尾部のどちらかに、in-vitro転写中に放射性標識モ
ノヌクレオチドを結合することにより標識した（Astroem, J. (1991), 上記、As
troem, J.ら(1992), 上記を参照）。結合した放射活性モノヌクレオチドの特異
的な放射活性は、全体標識に関しては転写混合物の場合40 Ci/mmolであり、ある
いは尾部標識に関しては転写混合物の場合4 Ci/mmolであった。転写RNAをMoore,
C.L & Sharp, P.A. (1985) Cell, 41, 845-855によって記述されるように精製
した。

【００３９】実施例１０ In-vitro脱アデニル化 in-vitro脱アデニル化のための試験条件は以下の通りである：1 mM MgCl₂、 2.5％ (w/v)ポリ（ビニルアルコール）（Sigma P-8136、Mw 10,000）、100 mM
KCl、0.15 Unit RNAguard、5〜20 fmolのRNA基質、20〜48％ (v/v)のバッファ
ー（20 mM HEPES (KOH)、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、25％グリセロール、pH 7）
および適当なタンパク質画分（Astroem, J.ら (1992),上記参照）。反応量は15
〜25μlで、インキベーションは30℃で行った。そして反応を終了して、Moore,
C.L. & Sharpe, P.A. (1985), 上記参照に記述されるにように精製した。RNAを1
0％ポリアクリルアミド（19:1アクリルアミド／ビスアクリルアミド）-7 M尿素
ゲルでの電気泳動に続き、結果のゲルのオートラジオグラフィーにより解析した
。

【００４０】実施例１１ 2D-薄層クロマトグラフィー２次元（2D薄層クロマトグラフィー）を、Konarska, M.M.ら (1985) Nature 3
13 (6003), 552-557の方法に従い、PEI-セルロースFプレート（Merck No. 5579
）で行った。脱アデニル化反応で放出された生成物を、チャンバー内で行われた
2次元薄層クロマトグラフィー（2D TLC）により解析した。第一の移動溶媒（mob
ile solvent）（I）をイソ酪酸/濃縮NH₄OH/H₂O；577/38/385（v/v）、および第
二の移動溶媒（II）を飽和(NH₄)₂SO₄/1 Mナトリウム酢酸/イソプロパノール；80
/18/12（v/v）とした。第一の分別後、プレートを室温で8時間乾燥させ、イソ酪
酸を蒸発させた。5'-AMP（Sigma A-1752）、2'-AMP（Sigma A-9396）および3'-A
MP（Sigma A-0386）をマーカーとして使用した。マーカーの位置をUV光（鉱質光
ランプUVG-54、Ultra Violet Prod. Inc.）を使用して決定した。放射活性分子
は結果のPEI-セルロースFプレートをオートラジオグラフィーにかけることで決
定した。

【００４１】実施例１２ 1D TLCおよびヌクレアーゼ活性の定量化脱アデニル化活性は以下のように定量した：[α³²P]ATPで標識したL3(A₃₀) RN
Aをin-vitro脱アデニル化反応においてインキベートした。反応生成物を移動溶
媒III（0.75 M K₂HPO₄、pH 3.5 (H₃PO₄)）を使用した1D TLCにより解析した。結
果のPEI-セルロースFプレートを乾燥させ、400S Phosphorimager（Molecular Dy
namics）でスキャンした。放出[α³²P]ATPを含む画分を決定した。放出AMPのmol
単位での定量は、RNA基質における[α³²P]ATPの既知の特異的活性に基づいて計
算した。脱アデニル化活性の1ユニットは1 pmol AMP/分の放出に対応している。

【００４２】実施例１３ in-vitro脱アデニル化のための条件上記の脱アデニル化試験に従ったポリ(A)脱アデニル化活性の測定のための条
件は、酵素源としてポリ(A)セファロース画分および基質としてポリ(A)尾部標識
L3(A₃₀) RNAを使用して決定した。活性は1D TLC試験におけるモノヌクレオチド
の放出に置き換えて測定した（上記参照）。このため一価（カリウムおよびナト
リウム）および二価（マグネシウム、マンガン、亜鉛およびカルシウム）のイオ
ンの必要量を調べた。

【００４３】脱アデニル化活性には二価陽イオンは必要ではなく、至適一価陽イオン濃度は
約100 mMであることが分かった。また、活性はナトリウムイオンの存在下よりも
カリウムイオンの存在下でより高くなることが分かった。また、スペルミジンは
その活性の影響を与えないことも分かった。

【００４４】さらに、マグネシウムイオンは好ましい二価イオンであり、至適濃度は1 mMで
あることが分かった。さらに、マグネシウム、亜鉛およびカルシウムイオンはあ
る程度マグネシウムイオンの代わりとなりうることも分かった。Mg²⁺の存在下で
の活性と比較すると、1 mMのMn²⁺、Zn²⁺およびCa²⁺の存在下では、活性が各々17
％、2％、0.7％低下する。

【００４５】 pH依存性に関して行った調査では、活性は約pH 7において最も高いことが示さ
れた。実施例１４基質特異性活性のRNA基質特異性は2つの実験で調べた。第一の実験では、ホモポリメリッ
ク尾部が放射活性的に標識されたRNA基質L3(A₃₀)、ML45(U₃₀)、 ML40(C₃₂)。お
よびML43(G₃₀)を、in-vitro脱アデニル化試験においてインキベートした（上記
参照）。放射活性モノヌクレオチドの放出は1D TLC試験において測定した（上記
参照）。測定結果を使用して、Lineweaver-Burkeプロットを用いて各々のRNA基
質にとってのKmおよびVmax値を計算した（表II参照）。第二の実験では、基質特
異性はin-vitro脱アデニル化試験のおけるポリ(A)セファロース画分を用いて、
内在ポリ(A)断片を含むRNA基質のインキベート、続いて長さが増加するプラスミ
ドコードRNA配列により測定した。RNA基質L3(A₃₀)X₁₅,、L3(A₃₀)X₄₉およびL3(A₃ ₀ )X₁₆₄はRNA基質L3(A₃₀)と比較して、低下に対して完全に抵抗性があることが分
かった（図3参照）。このことからアデノシン残基で構成されるRNA尾部は好まし
い基質であり、3'末端配置ポリ(A)尾部のみ効果的に低下することが導かれる。

【００４６】実施例１５放出するモノヌクレオチドの決定放出するモノヌクレオチド反応産物は2D TLCにより決定した。このため、ポリ
(A)セファロース画分を、in-vitro脱アデニル化試験において、in-vitro転写中
に[α³²P]ATPを用いて標識されたL3(A₃₀)RNA基質とともにインキベートした。20
分後、反応産物をマーカーとした非標識2'-AMP、3'-AMPおよび5'-AMPを使用して
2D TLCにより解析した。これより、5'-AMPはin-vitro脱アデニル化反応酵素中に
放出されることを示した（図4参照）。

【００４７】実施例１６ヌクレアーゼ活性の動態ヌクレアーゼ活性が進行的なあるいは分配的な様式でRNA基質を減少させるか
どうかを決定するために、動態を0.5μlのポリ(A)セファロース画分および全体
的に標識したx fmolのL3(A₃₀)RNA基質の存在下で、in-vitro脱アデニル化反応に
おいて決定した全ての初期（first）とした。図5Aは、全体のRNA基質が反応する
前に完全に減少したRNAが蓄積することを示す。このことから、これらの条件下
で、脱アデニル化反応は20分後に完全に終了したことが導かれる。他の反応では
、インキベーションを増加するポリ(A)の量の下で20分間行った。図5Bは、ポリ(
A)の追加が反応を阻害し、非脱アデニル化および完全に脱アデニル化された両RN
A基質が、最も高く測定された追加ポリ(A)濃度に関連して存在したことを示す。
第三の実験では、ヌクレアーゼ活性の量を変えた。インキベーション時間を20分
とした。図5Cは、非脱アデニル化および脱アデニル化された両RNA基質が最小量
の追加ヌクレアーゼ活性に関連してさえ存在することを示す。このことから、エ
キソヌクレアーゼ活性は高めに進行する、すなわち酵素はアデノシン尾部が完全
に減少して初めて基質から解離することが導かれる。

【００４８】実施例１７再折りたたみ（refolding）実験（図6）再折りたたみ実験は、再折りたたみは4℃で一晩のうちにゲル上でおこるとい
う事実を除いてDayleら（上記参照）により記述されたように行った。ポリ(A)セ
ファロースクロマトグラフィー（実施例３）における活性画分をこれらの実験に
使用した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、ＳＭＡＲＴＭｏｎｏＱクロマトグラフィによる５０ｋＤａポリ
ペプチドの同定を示すものである。これに関連してポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ画分をＳＭＡＲＴＭｏｎｏＱクロマトグラフィで分画し、そして生じた画分
を均一に標識したＲＮＡ基質Ｌ３（Ａ₃₀）とともにインビトロ脱アデニル化条件
下に９０分間インキュベートした。反応生成物を１０％ポリアクリルアミド：ビ
スアクリルアミド＝１９：１〜７Ｍ尿素ゲルの電気泳動により分画した。得られ
たフルオログラムを図１Ａに示した。レーン「ＬｏａｄＭＱ」はポリ（Ａ）Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ画分とともにインキュベートしたＲＮＡ基質を表している。レ
ーン６〜１８は得られた画分の存在下でインキュベートしたＲＮＡ基質を表す。
偶数番の画分のみが標識されていた。図１ＢはＳＭＡＲＴＭｏｎｏＱ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。この場合
、画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して得られたゲルを銀で染色
した。画分番号を示す。偶数番の画分のみを標識した。分子量マーカーをレーン
Ｍに分離した。左側の番号はマーカータンパク質をｋＤａで示したものである。

【図２】図２ＡはＳＭＡＲＴＳｕｐｅｒｄｅｘ２００クロマトグラフィによる５０
ｋＤａのポリペプチドの同定を示すものである。生じた画分を均一に標識したＲ
ＮＡ基質Ｌ３（Ａ₃₀）とともにインビトロ脱アデニル化条件下に１２０分間イン
キュベートした。反応生成物を１０％ポリアクリルアミド：ビスアクリルアミド
＝１９：１〜７Ｍ尿素ゲルで分画した。生じたフルオログラムを図２Ａに示した
。Ｌ３（Ａ₃₀）レーンは、画分の非存在下でインキュベートしたＲＮＡ基質を示
す。ＬｏａｄレーンはＭｏｎｏＱ濃縮ポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分とと
もにインキュベートしたＲＮＡ基質を示す。ＳおよびＰはＲＮＡ基質（Ｓ）と、
および生成物（Ｐ）の移動部位を表す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの校正
のための分子量マーカーの溶出プロフィールは、上部に示す。図２ＢはＳＭＡＲＴＳｕｐｅｒｄｅｘ２００画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示
す。得られたゲルは銀で染色した。画分番号を示す。偶数番の画分のみ標識した
。分子量マーカーをレーンＭに分離した。左側の番号はマーカータンパク質の分
子量をｋＤａで表したものである。図２Ｃは特異的ポリ（Ａ）エキソヌクレアーゼ活性物の５’ＡＭＰＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ４Ｂアフィニティ画分を示す。標識された画分は５分間放射性Ｌ３
（Ａ₃₀）ＲＮＡとともにインキュベートした。反応生成物を１０％ポリアクリル
アミド：ビスアクリルアミド＝１９：１〜７Ｍ尿素ゲル上で分画した。得られた
フルオログラムを図２Ｃに示す。レーンＡは、ＲＮＡ基質を５’ＡＭＰＳｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂアフィニティ精製エキソヌクレアーゼとともにインキュベー
トしたものである。レーン”−”では、インキュベートは活性画分の非存在下で
緩衝液のみとともに行った。図２ＤはＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上での５’−ＡＭＰアフィニティクロマト
グラフィのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。得られたゲルは銀で染色した。画分番号を
示す。偶数番の画分のみ標識した。分子量マーカーをレーンＭに分離した。左側
の番号はマーカータンパク質の分子量をｋＤａで表したものである。

【図３】図３は３’末端位ポリ（Ａ）尾部に対するエキソヌクレアーゼの特異性を示す
。ポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分をインビトロ脱アデニル化条件下に、ＲＮ
Ａ基質Ｌ３（Ａ₃₀），Ｌ３（Ａ₃₀）Ｘ₁₅，Ｌ３（Ａ₃₀）Ｘ₄₉およびＬ３（Ａ₃₀）
Ｘ₁₆₄とともに、示されたように０，５，１０，２０，３０，６０または９０分
間インキュベートした。反応生成物を１０％ポリアクリルアミド：ビスアクリル
アミド＝１９：１〜７モル尿素ゲル上で分画した。生じたフルオログラムを図３
に示す。ＳおよびＰはＲＮＡ基質（Ｓ）と生成物（Ｐ）の移動部位を表す。

【図４】図４は脱アデニル化の間放出された５’−ＡＭＰ反応生成物を示す。ポリ（Ａ
）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を、２０分間インビトロ脱アデニル化条件下で、イン
ビトロ転写の間に［α−³²Ｐ］ＡＴＰで標識しておいたＬ３（Ａ₃₀）ＲＮＡ基質
とともにインキュベートした。３μｌの反応混合物を２−ＤＴＬＣにかけた。
乾燥ＰＥＩセルロースプレート上に生じたオートラジオグラムを図４に示す。２
’−ＡＭＰ，３’−ＡＭＰおよび５’−ＡＭＰマーカーの移動部位は放射性試料
とともに分画したものであり、これを示す。

【図５】図５Ａ−Ｃはポリ（Ａ）の分解の進行を示す。ポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
画分をインビトロ脱アデニル化条件下に、インビトロ転写の間に［α−³²Ｐ］Ｕ
ＴＰで標識しておいたＬ３（Ａ３０）ＲＮＡ基質Ｘｆｍｏｌとともにインキュ
ベートした。反応生成物を１０％ポリアクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１
９：１〜７Ｍ尿素ゲルじょうで分画した。生じたフルオログラムを図５Ａ−Ｃに
示す。ＳおよびＰは、ＲＮＡ基質（Ｓ）と生成物（Ｐ）の移動部位を表す。図５
Ａは０．５μｌポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分の存在下で反応を行い、示さ
れた時間の後に終了したものを示している。図５Ｂは０．５μｌポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分の存在下で反応を行い
、２０分後に終了したものを示している。示されたポリ（Ａ）の量（ｎｇ）を反
応に加えた。図５Ｃは示された量（μｌ）のポリ（Ａ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分の存在下で
反応を行い、２０分後に終了したものを示している。

【図６】 Dayle A. HagerおよびRichard R. Burgess, Anal. Biochem.(1980), 109, 7
6にしたがった再折りたたみ（リフォールディング、refolding）実験のＳＤＳ−
ＰＡＧＥを示す。生じたゲルは銀で染色した。左側の番号はマーカータンパク質
の分子量をｋＤａで表したものである。得られるバンドは図６Ａに示すように励
起させた（Ａ，１１０，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ）。変性ＲＮＡポリアクリルアミドゲル：図６Ａで得られたゲル片をHagerらによ
り説明された方法により溶出した。得られた溶出タンパク質を実施例９にしたが
ってＬ３（Ａ₃₀）基質と共にインキュベートし、反応混合物をポリアクリルアミ
ドゲル上で分画した。活性はゲル片Ｃ（およそ５０ｋＤａ）に存在するべきもの
と証明された。

【図７】図７は本発明の方法に関連するクロマトグラフィ工程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/10 19/10 25/28 25/28 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/22 16/40 16/40 Ａ６１Ｋ 37/48 (72)発明者ガレルト，カルル−クリスティアンドイツ連邦共和国デー−61184 カルベン，レンデラー・シュトラーセ 91 (72)発明者ヴィルタネン，アンデルススウェーデン王国エス−752 67 ウプサラ，サンドステンヴェーイェン７ (72)発明者アストレム，ヨナススウェーデン王国エス−752 39 ウプサラ，ノルビュヴェーイェン 59 (72)発明者マルティネス，ヤビエルスウェーデン王国エス−753 27 ウプサラ，ノルタルイェガタン 32 (72)発明者ツレッソン，アンーシャルロットスウェーデン王国エス−752 39 ウプサラ，テゲルガタン 56 (72)発明者レン，ヤングオスウェーデン王国エス−752 73 ウプサラ，フログスタヴェーイェン 33エフＦターム(参考） 4B050 DD07 FF04C FF11C FF12C FF14C LL01 LL03 4C084 AA01 DC01 NA14 ZA011 ZA012 ZA161 ZA162 ZA941 ZA942 ZA961 ZA962 ZA971 ZA972 ZB071 ZB072 ZB081 ZB082 ZB131 ZB132 ZB151 ZB152 ZB261 ZB262 ZB321 ZB322 ZC351 ZC352 4C085 AA13 AA14 CC03 DD33 DD34 DD38 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA75 DA89 EA22 EA28 EA50 GA06 GA22 GA23 GA26 HA04 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリ（Ａ）−特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物の分離方
法であって、以下の工程：（ａ）動物またはヒト細胞から粗抽出物を調製し；（ｂ）工程（ａ）で得られる粗抽出物に存在するタンパク質を、好ましくは硫酸
アンモニウムを用いて沈殿させ；（ｃ）工程（ｂ）で得られる沈殿物を塩基性アニオン交換体、好ましくは弱塩基
性アニオン交換体、特にＤＥＡＥ上でクロマトグラフィにかけ；（ｄ）工程（ｃ）からの活性画分を、好ましくはヘパリン上でクロマトグラフィ
にかけ；（ｅ）工程（ｄ）からの活性画分を塩基性アニオン交換体、好ましくは強塩基性
アニオン交換体、特にＭｏｎｏＱ上でクロマトグラフィにかけ；（ｆ）工程（ｅ）からの活性画分を、好ましくは染料、特に青色染料、さらに特
にBlue Sepharose上でアフィニティクロマトグラフィにかけ；（ｇ）工程（ｆ）からの活性画分をポリ（Ａ）−アフィニティクロマトグラフィ
にかけ；（ｈ）工程（ｇ）からの活性画分を塩基性アニオン交換体、好ましくは強塩基性
アニオン交換体、特にＭｏｎｏＱ上でクロマトグラフィにかけ；そして、ここで
適切な場合、（ｉ）工程（ｇ）方の活性画分をゲル濾過にかけるか；あるいは（ｊ）工程（ｆ）からの活性画分を、好ましくは、ｓｓＤＮＡＡｇａｒｏｓｅ
の後、５’ＡＭＰクロマトグラフィ上で２ラウンドのアフィニティクロマトグラ
フィにかける；からなる、前記方法。
【請求項２】前記動物またはヒト細胞が、胸腺細胞である、請求項１に記載
の方法。
【請求項３】工程（ｂ）で、前記硫酸アンモニウムによる沈殿を、およそ４
５％飽和状態で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】およそ２５％飽和状態での硫酸アンモニウムによる沈殿を、前
記硫酸アンモニウムによる沈殿の前に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】工程（ｃ）で、クロマトグラフィ活性画分を、およそ０．１７
Ｍ塩濃度で溶出しうる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】工程（ｄ）で、クロマトグラフィ活性画分を、およそ１．０Ｍ
塩濃度で溶出しうる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】工程（ｅ）で、クロマトグラフィ活性画分を、１．０Ｍ塩濃度
のおよそ１０％濃度で溶出しうる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】工程（ｆ）で、クロマトグラフィ活性画分を、およそ１．０Ｍ
塩濃度で溶出しうる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】工程（ｇ）で、クロマトグラフィ活性画分をおよそ０．３５−
０．５５Ｍ塩濃度で溶出しうる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】工程（ｊ）で、クロマトグラフィ活性画分を、およそ２．０
Ｍ塩濃度で溶出しうる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】工程（ｈ）で、クロマトグラフィ活性画分を、およそ０．１
７Ｍ塩濃度で溶出しうる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により得られた
ポリ（Ａ）−特異的３’−エキソヌクレアーゼ活性物を含む組成物。
【請求項１３】前記活性物が変性条件下でおよそ５０ｋＤａの分子量を有す
る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】前記活性物が天然条件下でおよそ１８０−２２０ｋＤａの分
子量を有する、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】核酸の脱アデニル化方法であって、脱アデニル化反応が請求
項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物の存在下で起こることを特徴とする
、前記方法。
【請求項１６】前記脱アデニル化反応が、好ましくはｍＲＮＡに属する３’
−ポリ（Ａ）尾部を分解する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記脱アデニル化反応が１価のカチオン、好ましくはカリウ
ムの存在下で、好ましくはｐＨおよそ７でさらに進行する、請求項１５または１
６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物に指向性を
もつ抗体。
【請求項１９】哺乳動物を請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物
で免疫性にし、適切な場合、得られる抗体を分離することを特徴とする、請求項
１８に記載の抗体の調製方法。
【請求項２０】請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物、および適
切な場合薬剤学的に受容可能な添加剤および／または補助剤を含む、薬剤組成物
。
【請求項２１】ガン、自己免疫性疾患、特に複合的硬化症またはリウマチ性
関節炎、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、タイプＩアレルギー
またはタイプＩＶアレルギー、関節、関節硬化症、骨粗鬆症、急性または慢性の
感染症および／または糖尿病の治療のため、および／または特に免疫抑制、さら
に特に臓器移植に関連する細胞の新陳代謝に対する作用のための薬剤の製造方法
であって、請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物を薬剤学的に受容可
能な添加剤および／または補助剤とともに処方することを特徴とする、前記方法
。
【請求項２２】請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物または請求
項１８に記載の抗体および適切な場合、好適な添加剤および／または補助剤を含
む診断薬。
【請求項２３】ガン、自己免疫性疾患、特に複合的硬化症またはリウマチ性
関節炎、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、タイプＩアレルギー
またはタイプＩＶアレルギー、関節、関節硬化症、骨粗鬆症、急性または慢性の
感染症および／または糖尿病の治療のため、および／または特に免疫抑制、さら
に特に臓器移植に関連する細胞の新陳代謝に対する作用のための診断薬の製造方
法であって、請求項１２−１４のいずれか１項に記載の組成物または請求項１８
に記載の抗体に薬剤学的に受容可能な賦形剤を加えることを特徴とする、前記方
法。
【請求項２４】機能性相互作用物質を同定するための、請求項１２−１４の
いずれか１項に記載の組成物または請求項１８に記載の抗体および適切な場合、
好適な添加剤および／または補助剤を含む試験。
【請求項２５】機能的相互作用物質を同定するための、請求項１２−１４の
いずれか１項に記載の組成物または請求項１７に記載の抗体の使用。