JPS6359886A - 胎児型精製チミジンキナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新しい工業製品としての胎児型精製チミジン
キナーゼに関するものである。本発明は、また、本製品
の製法、特にその精製方法に関するものでもある。木製
品は、（ｉ）定量分析の分野□特に抗原抗体反応を伴う
免疫学的分析に関して、及び（１１）治療においては薬
剤として使用される抗体の製造に有益である。

〔従来の技術〕

チミジンキナーゼ（以下ＴＫと略す）は、チミジンがチ
ミジン５′−一リン酸（以下ｄ−ＴＭＰ　と略す）にな
るリン酸化反応を触媒する酵素であり、ＤＮＡ合成に、
従って細胞繁殖に重要な役割を果たすことが公知である
。その酵素活性は、増殖又は再生過程にあるＭｉ織やウ
ィルス感染細胞において、高い６また、ＴＫの二つのア
イソザイムが、真核細胞で検出されたことも公知である
。すなわち、胎児型チミジンキナーゼ（以下“胎児チミ
ジンキナーゼ”又はＴＫ−Ｆと言う）と、成人型チミジ
ンキナーゼ（以下１成人チミジンキナーゼ°又はＴＫ−
Ａと言う）である。

ＴＫ−Ｆは胚Ｍｉ織内に存在し１ホルモン依存癌、特に
、乳癌や前立腺癌の癌＆ｌｉ織で検出されている。

この点については、Ｊ、Ｌ、Ｊａｖｒ６その他の、Ｂｕ
ｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ　（Ｐａｒｉｓ）　７３（Ｎｏ、１
）　、　ｐ、　８−　ｐ　、１６（１９８６）に掲載の
論文「乳癌における胎児型チミジンキナーゼの検出」お
よび、Ｊ、Ｌｊａｖｒｆｉその他による癌研究所で発表
するために提出された論文「ヒトの乳癌における胎児チ
ミジンキナーゼの存在」を参照。

また、生体内のＴＫ−Ｆ合或は、性ホルモンによってそ
れらの標的器官、つまり前立腺や子宮内で大いに増加す
る。この点については、Ｍ、１ｉｏｕｒｔｏｕｒａｕＩ
ｔその他のＪ、５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　
２１（ｌｉｏ、５　）、　ｐ。

６１３−６２０（１９８４）に掲載の論文「ラットの子
宮におけるチミジンキナーゼ活性の１７β−エストラジ
オールによる！ｌＩ激」およびＧ、ＧａｙｅＬその他の
ＴｈｅＰｒｏｓｔａｔｅ　７　、　　ｐ、２６１−２７
０　（１９８５）に掲載の論文「ラットの前立腺におけ
る胎児型チミジンキナーゼのアンドロゲンによる誘導」
を参照。

電気泳動あるいは陰イオン交換樹脂を使ったクロマトグ
ラフィー〔例えば、アクリルアミドゲルの電気泳動か、
好ましくは、ＤＥＡＥ−セルロースゲル又はＤＥＡＥ−
セファデックスゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より販売さ
れている）のクロマトグラフィー］によって、ＴＫ−Ｆ
をＴＫ−Ａから分離する。この時、胎児アイソザイムの
易動度は０か、もしくはゆっくりしているが、成人アイ
ソザイムの易動度は速い。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このように単諦したＴＫ−Ｆは、Ｉ■当たり２国際華位
のオーダーの酵素活性を有し、（ｉ）高度に正確な定量
分析の実行に不適当であり、また特に（１１）診断の分
野や治療の分野で役立つ多クローン性抗ＴＫ−Ｆ抗体、
特に単りローン性抗ＴＫ−Ｆ抗体の製造に不適当である
。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明の第１の特徴は、従来の方法により単離されたＴ
Ｋ−Ｆに比べてはるかに大きな酵素活性を有する精製Ｔ
Ｋ−Ｆを、新しい工業製品として提供することにある。

診断の分野では、精製ＴＫ−Ｆが特に不足している。

事実、ＴＫ−Ｆ活性は癌のタイプによってさまざまであ
る。ＴＫ−Ｆ活性はＧｏ！ＩＩの細胞では低く３期の細
胞では高いから、低ＴＫ−Ｆ活性を示す癌は休止状態に
あり、高ＴＫ−Ｆ活性を示す癌は増殖しつつあると考え
るべき十分な理由がある。それゆえに乳癌や前立腺癌に
おけるＴＫ−Ｆの定量分析は、癌の増殖状態を測定する
上で非常に重要である。さらに、精製ＴＫＪ、一対して
生じた抗ＴＫ−Ｆ抗体を使ってＴＫ−Ｆを定量分析する
ことは、癌疾患の進行状態を判断するための、従ってそ
の治療を方向づけるための一因子である。

本発明の第２の特徴は、上述の精製ＴＫ−Ｆのある製法
を推奨することにある。この製法は、精製すべきＴＫ−
Ｆをチミジンとカンプリングし、生じた複合体（チミジ
ン／ＴＫ−Ｆ）を分解して精製ＴＫ−Ｆを集めることよ
りなる。

本発明のもう一つの特徴は、抗ＴＫ−Ｆ抗体を調製する
ために、精製ＴＫ−Ｆの使用を勧めることにある。

これらの抗体は診断に使用される一方、治療でも使用さ
れている。驚いたことに、ホルモン依存癌（特に乳癌又
は前立腺癌）をわずらっているΦ者に、抗ｔＫ−Ｆ抗体
を投与すると、治療上有益な効果があることが解った。

〔作用〕

本発明によって、現在まで得られたことのない精製ＴＫ
−Ｐを新しい工業製品として勧める。このＴＫ−Ｆは、
定量分析の分野や抗ＴＫ−Ｆ抗体の調製分野で有益であ
り、１ｍｇ当りの比酵素活性は５０００ユニット以上で
あり、好ましくは、８０００ユニット以上である。さら
に好ましくは１０，０００ユニット以上である。

非変性媒質（例えば下記の緩衝液ＡとＢ）中で（ｐＨ約
８．６の時）電気泳動のＲｆ値は、１ｍｇ当たり約１１
８００ユニットのオーダーの比酵素活性をもつ精製ＴＫ
−Ｆについて、約０．１５である。

慣例に従って、比酵素活性はタンパク質１ｍｇ当りの酵
素（活性の）単位で示す。ＴＫ−Ｆのいわゆる国際単位
は、１分間にタンパク質１ｍｇ当りで合成されるヌクレ
オチド１ナノモル（ｎａｎｏｍｏ＋）に相当する。言い
換えれば、酵素活性は、ｎｍｏｌ／タンパク’ｄｍｇ／
ｍｉｎで表示しうるちのである。比較すると、下記の実
施例１で次のことがわかる。

□最初の生物学的媒質中の活性は、１．０３ｎｍｏｌ／
タンパク質ｍｇ／ｍｉｎである。

−ＤＥＡＥ−セファデックスでクロマトグラフィーを行
った後の活性は、２．０８　ｎｍｏｌ／タンパク質■／
ｍｉｎである。

□精製ＴＫ−Ｆの活性は、１１，８７５ｎｍｏ！／タン
パク質可／ｍｉｎである。

精製すべきＴＫ−Ｆをチミジンとカップリングさせ、生
したチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体を分裂させる、本発明の
推奨する、精製ＴＫ−Ｆの製法は、以下より成る。

（ａｌ精製すべきＴＫ−Ｆを、あらかじめ第１の適当な
支持体（第１支持体）に固定させたチミジンと接触させ
ることにより、ＴＫ−Ｆとチミジンを力、プリングさせ
る。

山）このように結合させたＴＫ−Ｆを、チミジンを含む
適当な）容離ン夜で？容出させる。

（ｃ）このように溶出させたチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体
を、第１支持体と異なる第２支持体を使って分裂させ、
上記のチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体からチミジンを選択的
に吸着させる。

この製法を実行する最良の流儀は、いわゆる競争機構を
含むアフィニティークロマトグラフィーから成る。そこ
で、段階＋ａ＋では、精製すべきＴＫ−Ｆを、あらかじ
めチミジンとカップリングさせた適当な樹脂上を通過さ
せる。この樹脂に結合したチミジンは、ＴＫ−Ｆを固定
し、それを保持するが、ＴＫ−ｐをｌするタンパク質型
不純物は、デミジンに固定されず、保持されない。

段階（ｂｌでは、あらかしめ支持体にカップリングさせ
たチミジンよって、前記支持体に固定したＴＫ−Ｆを、
遊離チミジンを含む／８離液で溶出する。段階（ｂｌは
いわゆる競争機構から成り、支持体に固定されたチミジ
ンと結合したＴＫ−Ｆは、ｉ＆　Ｈ？＆中の遊離チミジ
ンとカップリングする。このように集めた溶出液には、
形成されたチミジン／ＴＫ−Ｆ？３！合体が含まれてい
る。

段階ｔｅｌでは、チミジンに対して選択性をもつ第２支
持体にチミジンを吸着させて、前記のチミジン１０−ｐ
？ｊ（合体を非安定化する。

実際上、段階ＦＣ＋における好ましい支持体は、エポキ
シ−セファロース６Ｂの商品名でＰｈａｒｍａｃｉａ社
から市販されているエポキシ−セファロースゲルである
。このゲルを、公知の方法、特にＰ、Ｇｒｉｉｂｎｅｒ
その他がＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９　、ｐ、８
０１２−８０１４（１９８４）に記述した方法もしくは
類似の方法によって、まずチミジンとカップリングさせ
る。チミジンを固定するための、段階［Ｃ１での好まし
い支持体は、木炭、デキストランおよびゼラチンから成
る組成物である。つぎに、段階（ｃ）で使った前記の第
２支持体と共に精製ＴＫ−Ｆを含む溶出液を、特に、遠
心分離して、精製ＴＫ−Ｆを単離する。

出発のＴＫ−Ｆは、動物由来のタンパク物質（ｆＪＪ吻
の胎児Ｍｉ織から得たもの、特にラットのような；圧歯
動物の胎児の肝臓）か、ヒト由来のタンパク物質（ヒト
の癌Ｍｉ織から得たもの）か、又は合成由来のタンパク
物質（特に、遺伝子工学によって得たもの）かを用いる
。

本発明によれば、このように精製したＴＫ−Ｆは、抗Ｔ
Ｋ−Ｆ抗体（多クローン性よりむしろ単クローン性）の
製造に有益である。

これらの抗体は、公知の従来技術で得られる。

例えば、前記の精製ＴＫ−Ｆをマウスに接種し、免疫の
できたマウスから肺臓を除去して、肺臓からリンパ球を
抽出する。

このリンパ球を指数的増殖期にあるマウスの骨髄腫細胞
に融合させる。その割合はｌ骨髄腫細胞当り５〜２０リ
ンパ球であり、１０リンパ球が好ましい。このようにし
て得た分泌性ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）
を選別して、ＴＫ−Ａではなく　ＴＫ−Ｆと選択的に反
応する単クローン性抗体を得る０選んだクローンをもつ
マウスで腹水腫瘍を発生させ、前記抗体を含んだ腹水を
回収し、その結果得た単クローン性抗体を精製する。

組織中のＴＫ−Ｆの有無を検出したり、または前記組織
中のＴＫ−Ｆの含有度を定量的に評価したりする目的で
、分析を行なうために、抗ＴＫ−Ｆ抗体を適当な支持体
（ガラスピーズ、ポリスチンレンビーズ、容器の内壁な
ど）に固定すると、次の材料が得られる。

＋１１　　支持体／抗ＴＫ−Ｆ 次に、この材料をＴＫ−Ｆを含んでいる可能性のある媒
質と接触させる。ＴＫ−Ｆがあれば次の複合体が得られ
る。

（２）支持体／抗ＴＫ−Ｆ／ＴＫ−Ｐ この７１体は、一つの“シグナル”を構成し、このシグ
ナルは、可視化するためおよび／もしくは抗ＴＫ−Ｆ”
でラベルされた抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と共に検
出するために、公知の方法によって“増幅”される。〔
たとえば、ＥＩＡ法（特にＥＩＡ−サンドイノ千法又は
ＥＩＡ−競争法）では、複合体２を、適当な酵素抱合体
とカップリングさせる。

ＥＩＡ法では、前記複合体２と放射性同位元素でラベル
した抱合体とをカップリングさせる。また、螢光法は、
フルオレスシンでラベルした抱合体と前記複合体２をカ
ップリングさせる。〕また、増幅は、凝集によるか、ま
たは細胞を利用するＥＲＩＣＡ法のどちらか一方によっ
て行なうことができる。

本発明が勧奨する分析具は、抗原−抗体反応、特に以下
の反応を行なうために必要な試薬を含んでいる。

（ａｌ支持体／抗ＴＫ−Ｆ＋ＴＫ−Ｆ　　→支持体／抗
ＴＫ−Ｆ／ＴＫ−Ｆ （ｂｌ支持体／抗ＴＫ−Ｆ／ＴＫ−Ｆ＋抗ＴＫ−Ｐ”　
　−支持体／抗ＴＫ−Ｆ／ＴＫ−Ｆ／抗ＴＫ−Ｆ’″本
発明においては、生理学的に許容できる賦形剤と関連し
て、治療上有効量の抗ＴＫ−Ｆを含む治療用組成物を推
奨する。

本発明は、特に乳癌や前立腺癌の治療において用いられ
る抗癌剤を製造する目的で抗ＴＫ−Ｆ抗体を用いること
に関するものでもある。

（実施例〕 本発明の他の利点や特徴は、以下の実施例の記述から一
層明瞭に理解できるだろう。しかし、以下の記述は何ら
限定的なものではなく、実例として提示されるものにす
ぎない。

ラットの胎児の肝臓組織を次の緩衝液中でポリトロンで
均質化する。すなわち１０１のトリス（Ｔｒｉｓ）−Ｈ
ｃｌ　、１０ｍＭのＭｇＣｈ　、５　μＭのＮａＦおよ
び０゜４ｍＭのβ−メルカプトエタノールから成るｐＨ
７，５の緩衝液である６　（緩衝液Ａ） （２）シ　　ゾル（ｃｔＯ３ＯＩ）の工、。卸上記の方
法で得たホモジネートを冷却遠心分離機を使って、まず
８ＯＯＸｇで、次に１２，０ＯＯＸ　ｇで１０分間続け
て遠心分離し、得られた上澄液をＬ８−５５型Ｂｅｃｋ
ｍａｎ超遠心機により５℃で、４５分間１０５、ＯＯＯ
Ｘｇで遠心分離した。１０５，０００　Ｘ　ｇで得た上
澄液（細胞質ゾル）が、ＴＫ−Ｆの供給源となる。

ＴＫ−Ｆの比酵素活性の定量分析を細胞質ゾルの了りコ
ートで行なった。この活性は、１．０３ｎｍｏｌ／ｍｇ
／ｍｉｎであった。

（３１Ｔ　Ｋ　−Ｆの単離 ＴＫ−ＦをＤＥＡＥ−セファデフクスＡ５０ゲル（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社より市販）を使ったクロマトグラフィ
ーで単離した。セフアゾ７クスゲルは緩衝液Ａで膨潤さ
せる。沈降により微細粒子を除去した後、そのゲルを７
ｃ＋ｎＸ１ｃｍのミニカラムに沈着させた。ゲル８００
μｌをカラム中に挿入した。ゲルのカラムを調製した後
、細胞質ゾルのアリコートをゲルに吸着させた。４容（
４Ｘ５００μｍ）の緩衝液Ａを連続的に通すことによっ
てＴＫ−Ｆを溶出した。冷却遠心機を使い、２ＯＯＸｇ
でカラムを遠心分離することによって、連続溶出を行な
った。遠心分離によって溶出過程が加速され、ＴＫ−Ｆ
の変性が防止される。ＴＫ−Ｆ酵素活性の定量分析を溶
出液のアリコートで行ない、その結果得た溶出液を凍結
乾燥させた。この段階で酵素活性は２．０８ｎｍｏｌ／
ｍｇ／ｍｉｎであった。

塊−バぜ■亙盟 チミジンとカップリングしたエポキシ−セフ１０−ス６
Ｂゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社により販売されているも
の）を用いたアフィニティークロマトグラフィーで、精
製を実行した。チミジンは、上述のＰ、Ｇｒ６ｂｅｒそ
の他の方法に由来する技術を用いて、２４時間に亘り、
２５℃でｐＨ１２，０のアルカリ媒賃中セファロースゲ
ルとカップリングさせた。チミジンのカップリング度は
ゲル１ｍｌ当り９．ｕｍｏｌ　であった。ゲルを以下の
緩衝液で洗浄した。１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）　、
ｌ０１ＭのＭｇＣＩｚ　、５　μＭのＮａＦ　、、０．
４ｍＭのβ−メルカブトエクノールオゴよび１ｍＭのへ
丁Ｐから成るｐＨ７，５の緩衝液である。（緩衝液Ｂ）
。

ゲル３ｍｌを高さＩＱ、６ｃｍ、直径０．６ｃｍのカラ
ムに沈着させた。　ＴＫ−Ｆを含む凍結乾Ｓ物を茂留水
で吸収し、アフィニティーゲルに沈着させた。試料を、
１時間に１．２ｍの割合で浸透させた。

このアフィニティーゲルを１１衝液［３７′洗浄して、
ゲルに固定されていないタンパク質を除去した。

タンパク質は、１．２ｍｌ／ｈの速さで溶出し、その後
４　ｍｌ／ｈの速さで溶出した。ゲルに保持されないタ
ンパク質の総量を、緩衝液８２４ｍ１で溶出した。

以下の緩衝液４．５ｍｌをアフィニティーゲルに通して
ＴＫ−Ｆを溶出する。、１０ＩＩＩＭのトリス（Ｔｒｉ
ｓ）　、１０ｍＭのＭｇＣＴｚ　、５　、ＲＦＩのＮａ
Ｆ　、０．４ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ＩｍＭ
のＡＴＰ、および１０１の非放射性チミジンから成るｐ
Ｈ７，５の緩衝液である。溶出は０．５ｍｌ／ｈの速さ
で行なった。その結果得た）容出液は、チミジン／ＴＫ
−Ｐ複合体を含んでいる。

ｆ５）３　　　・　チミジンのＫ、 非放射性チミジンは、木炭／デキストラン／ゼラチン（
ｐＨ７，５の１０ｍＭのトリス（丁ｒｉｓ）−塩酸１妥
ｆＪｊ液中、木炭　１％−−、デキストラン７７０　０
゜１％鹸特、ゼラチン　０．２％−Ｗの割合で含まれる
）のプラグに、上で得た溶出液を通すことによって除去
した。この混合物を、渦をおこしながら、０℃で、１０
分間振盪した後、１０分間８００ｘｇで遠心分離した。

上澄液は精製ＴＫ−Ｆを含んでいた。上？Ｒ液のアリコ
ートを分析した。このように精製したＴＫ−Ｆの酵素活
性は１１，８７５　ｎｍｏｌ／　ｍｇ　／ｍｉｎであっ
た。

全活性収率は７，４％であった。精製係数（ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　）は、１１　、５３０
のオーダーであり、精製ＴＫ−Ｆの電気泳動によるＲｆ
値（非変性媒質中で測定した）はｐｔｌ８．６のとき０
．１５である。

７６ｍＭのＭｇｃｌｚ、１６０ｍＭのホスホグリセリン
酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）、４０ｍＭ
のＡＴＰおよび４０〜５０μ門のＣ２−”Ｃ）−チミジ
ン（比活性；５４〜５８ｍＣ１／ｍｍｏｌ、すなわち約
２　ｘｌＯ”　〜２．１５　ｘｌｏ”Ｂｑ／ｍｍｏｌ）
を含む２００ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）　−Ｈｃｌ　１
！を重液（ｐＨ　７．８）　　５μｍを、ＴＫ−Ｆを含
む抽出物２０μＩに加えた。反応媒質を３７℃で２５分
間温置した後、２゜ＩＭのＨＣｌ０４１０μｌを加えて
反応を止め、２４００×ｇで１０分間遠心分離する。そ
の後、遠心分離で得た上澄液１０μＩを高圧電気泳動に
かけ、合成ヌクレオチドを分離した。ｄ−ＴＭＰ　５ｄ
−ＴＤＰ　、　（１−ＴＴＰ（チミジン−リン酸、チミ
ジンニリン酸、チミジンニリン酸）の分離には、ワット
マン紙３ＭＭを使い、ｐＨ４，１のクエン酸緩衝液中、
濾紙の長さ１ｃｍ当り４７Ｖで、３０分間電気泳動を行
なった。電気床動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａ
ｍ）を乾燥させ、紫外ＶＡ（ＵＶ）で標準となるヌクレ
オチドの位置を調べた後、濾紙を２．５Ωｍ（幅）Ｘｌ
、５Ω（高）の細片に切る。

そしてこれらの細片を液体シンチレータ−（Ｒｅａｄｙ
−ｓｏｌｖ　ＥＰ　、　Ｂｅｃｋｍａｎ　ＮＯｍ／を含
んだ放射活性計数バイアルに封入する。

電気泳動を、垂直板（ｖｅｒｔｉｃａｌ　ｐｌａｔｅ）
上で、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、
濃度が１０％から１５％までの直線的に変化するポリア
クリルアミドゲル中で行なった。タンパク質の泳動を以
下の緩衝液で行なった。つまり、トリス（Ｔｒｉｓ）　
　１２ｇ％。、グリシン　２８．８　ｇ％。、５０５　
０．１ｇχから成る緩衝液（ｐＨ８，７）で、１２時間
７０Ｖで行なう。

細胞質ゾルと、ＤＥＡＥ−セファデックス）容出液に由
来するタンパク質を、９０％メタノール２５０−中０．
５ｇ？３度のクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　
Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０溶液で染色した。アフィニティーク
ロマトグラフィーを実施した後、得たタンパク質を、Ｐ
。

Ｔｕｎｏｎ　とに、Ｅ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ　のＪ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　、　　９．　ｐ、１７１　１７９（１９８４）
に記載の方法による銀汚染法（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉ
ｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）で染色する。

天１」「（核上ず」一 実施例１で示した方法を実施して（ただし、ラットの胎
児の肝臓組織をヒトの乳癌および前立腺癌の癌組織と置
き換える）、ラットの胎児の肝臓から得られたＴＫ−Ｆ
と類似の精製ＴＫ−１”を得た。この精製ＴＫ−Ｆは、
ラットの胎児の肝臓から得た前記の精製ＴＫ−Ｆと、は
ぼ同じ性質（酵素活性、Ｒｆ）をもつ。

特に実施例１．４．５のすべての生成物について以下の
ことが認められた。すなわち、ＴＫ−Ａ活性とちがい、
ＴＫ−Ｆ活性はｄ−ＣＴＰによって阻害されないこと、
また、ｐｔｌ８．６のポリアクリルアミドゲル中でＴＫ
−Ｆの電気泳動易動度は０もしくは非常に低いのに、Ｔ
Ｋ−Ａの易動度は高いこと。さらに、この二つのアイソ
ザイムは、ＤＥＡＥ−セファデックスカラムもしくはＤ
ＥＡＥ−セルロースカラムで異なった挙動を示すこと。

ＴＫ−Ｆはこのタイプの樹脂に保持されず、イオン強度
の低い溶液で）容出される。ＴＫ−Ａはこれらの樹脂に
保持され、イオン強度の高い溶液でのみ）容出できる。

よって、電気泳動やクロマトグラフィーにおける挙動か
ら、ＴＫ−Ｆはアルカリ性を有し、ＴＫ−Ａは酸性を有
することがわかる。

現状の知見に従えば、ｔＫ−ＦのｐＨは９．０−９．７
であり、ＴＫ−Ａのｐｉは５．０−５．７であろう。

本発明に従っである種の源から得た精製ＴＫ−Ｆ、特に
動物由来またはヒト由来の精製ＴＫ−Ｆに対して生じた
抗ＴＫ−Ｆ抗体を、本発明では新しい工業製品として勧
める。

〔効果〕

上述の通り、精製ＴＫ−Ｆに対して生じた抗ＴＫ−Ｆ抗
体、特に単クローン性抗ＴＫ−Ｆ抗体は、定量分析の分
野で特に有益である。前記の単クローン性抗体を調整す
るために使用する精製丁に−Ｆは、動物由来（特に１歯
動物の胎児の肝臓組織）のもの、又はヒト由来（特にヒ
トの癌組織）のものであることが望ましい。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）１ｍｇ当りの酵素活性が、５０００ユニット以上
   の、望ましくは８０００ユニット以上の、特に望ましく
   は１０，０００ユニット以上の胎児型精製チミジンキナ
   ーゼ（胎児型チミジンキナーゼを以下ＴＫ−Ｆと言う）
   。
2. （２）１ｍｇ当たりの酵素活性が約１１，８００ユニッ
   トのオーダーであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に記載の精製ＴＫ−Ｆ。
3. （３）非変性媒質中での電気泳動のＲｆ値が、ｐＨ約８
   ．６の時０．１５のオーダーであることを特徴とする特
   許請求の範囲第２項に記載の精製ＴＫ−Ｆ。
4. （４）精製すべきＴＫ−Ｆをチミジンとカップリングさ
   せ、生じたチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体を分裂させる、特
   許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の精
   製ＴＫ−Ｆの製法において、 （ａ）精製すべきＴＫ−Ｆを、適当な第１支持体に前も
   って固定したチミジンに接触させて、ＴＫ−Ｆをチミジ
   ンにカップリングさせ、 （ｂ）このように結合させたＴＫ−Ｆを、チミジンを含
   んだ適当な溶出液を用いて溶出させ、 （ｃ）このように溶出したチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体を
   、このチミジン／ＴＫ−Ｆ複合体からチミジンを選択的
   に吸着する、第１支持体とは異なる第２支持体を用いて
   、分裂させることを特徴とする精製ＴＫ−Ｆの製法。
5. （５）第１支持体がエポキシ−セファロースであること
   を特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の精製ＴＫ−
   Ｆの製法。
6. （６）チミジンとカップリングさせた第１支持体に保持
   されないタンパク質型不純物を、１０ｍＭのトリス（Ｔ
   ｒｉｓ）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、５μＭのフッ
   化ナトリウム、０．４ｍＭのβ−メルカプトエタノール
   、１０ｍＭのＡＴＰから成るｐＨ７．５の緩衝液で溶出
   することを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の精
   製ＴＫ−Ｆの製法。
7. （７）チミジンとカップリングした支持体のそのチミジ
   ンに固定させたＴＫ−Ｆを、１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉ
   ｓ）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、５μＭのフッ化ナ
   トリウム、０．４ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１
   ｍＭのＡＴＰおよび１０ｍＭのチミジンから成るｐＨ７
   ．５の緩衝液で溶出することを特徴と特許請求の範囲第
   ４項に記載の精製ＴＫ−Ｆの製法。
8. （８）第２支持体が、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−塩
   酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で木炭１％ｗ／ｗ、デキスト
   ラン０．１％ｗ／ｗ、ゼラチン０．２％ｗ／ｗを含む組
   成物より成ることを特徴とする特許請求の範囲第４項に
   記載の精製ＴＫ−Ｆの製法。
9. （９）抗ＴＫ−Ｆ抗体の調製のために前記ＴＫ−Ｆを使
   用し、望ましくは前記抗体が単クローン性抗体であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項のい
   ずれかに記載の精製ＴＫ−Ｆの使用。
10. （１０）前立腺癌および乳癌の治療に用いる抗ガン剤の
    製造に関係することを特徴とする特許請求の範囲第９項
    に記載の単クローン性抗ＴＫ−Ｆ抗体の使用。
11. （１１）特許請求の範囲第１項に記載の精製ＴＫ−Ｆに
    対して生じることを特徴とする抗ＴＫ−Ｆ抗体。
12. （１２）単クローン性であり、かつ動物原料もしくはヒ
    ト原料より得られた特許請求の範囲第１項に記載の精製
    ＴＫ−Ｆに対して生じた、定量分析において有益である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の抗Ｔ
    Ｋ−Ｆ抗体。