PT85406B

PT85406B - Processo para a preparacao de timidina quinase de tipo fetal purificada

Info

Publication number: PT85406B
Application number: PT85406A
Authority: PT
Inventors: Pierre Nicolas Jouan
Original assignee: Debat Lab
Priority date: 1986-07-31
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1990-04-30
Also published as: ES2038681T3; ZA875378B; IE872064L; AU594486B2; CN87105215A; FR2602242A1; FR2602242B1; AU7607587A; DK387387A; NZ221246A; DK387387D0; JPS6359886A; ATE68821T1; DE3774025D1; PT85406A; IE61237B1; EP0255431B1; JPH0438392B2; EP0255431A1; GR3003416T3

Description

A presente invenção diz respeito ao processo para a preparação de TK-F purificada por um processo que compreende a união da TK-F com timidina, e em seguida a clivagem do complexo TK-F-timidina resultante.

A TK-F purificada de acordo com a invenção é útil na preparação de anticorpos anti TK-F, devendo intervir, em particular, como reagente no dominio das dosagens e como medicamento no dominio terapêutico.

LABORATOIRES DEBAT,S.A.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TIMIDINA QUINASE DE TIPO FETAL PURIFICADA

DOMINIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito como produto industrial novo, a timidina quinase de tipo fetal purificada. Diz também respeito ao processo para a preparação deste produto, e, mais particularmente, ao seu processo de purificação. Este produto é útil (i) no dominio das dosagens, em particular o das dosagens imunológicas em que intervêm reacções antigene-anticorpos, e (ii) em terapêutica, na obtenção de anticorpos que intervêm como medicamentos.

TÉCNICA ANTERIOR

Sabe-se que a timidina quinase (abreviadamente TK), enzima responsável pela fosforilação da timidina em timidina-5¹-monofosfato (abreviadamente d.TMP) desempenha um papel importante na sintese do ADN, e, por conseguinte, na multiplicação celular. Tem grande actividade nos tecidos em via de proliferação ou regeneração e nas células infectadas por vírus. Sabe-se também que duas isoenzimas da TK foram postas em evidência nas células eucariotas: a timidina quinase de tipo fetal (designada a seguir por timidina quinase fetal ou TK-F) e a timidina quinase de tipo adulto (designada a seguir por timidina quinase adulta ou TK-A).

A TK-F está presente nos tecidos embrionários e foi descoberta nos tecidos cancerosos nos casos de cancros hormonais-dependentes, designadamente os cancros do seio e da próstata; ver a este respeito o artigo de J.L. Javré et al., Buli.Câncer (Paris) 73 (No.l), páginas

8-16 (1986) intitulado Evidenciação da timidina quinase de tipo fetal nos cancros do seio e o artigo de J.L. Javré et al., submetido para publicação em Câncer Research e intitulado Presença de timidina quinase fetal em cancros do seio humano.

Sabe-se também que a sintese da TK-F in vivo é muito aumentada pelas hormonas sexuais nos seus próprios orgãos-alvos, a próstata e o útero; ver a este respoeito o artigo de M. Bourtourault et al. , J. Steroid Biochem. , 21 (No.5), páginas 613-620, (1984) intitulado: Estimulação por 17|3-estradiol de actividade de timidina quinase no útero de rata, e o artigo de G. Gayet et al., The Prostate 7, páginas 261-270, (1985) intitulado: Indução de timidina quinase de tipo fetal por androgéneos na próstata de rato.

separa-se a TK-F da TK-A por electroforese ou cromatografia por meio de uma resina permutadora de aniões, por exemplo por electroforese sobre gel de acrilamida, e, melhor por cromatografia sobre gel DEAE-celulose ou gel DEAE-Sphadex vendido pela sociedade denominada Pharmacia, tendo a isoenzima fetal uma mobilidade nula ou pequena e a isoenzima adulta uma mobilidade rápida.

A TK-F assim isolada, que tem uma actividade enzimática por mg da ordem de 2 unidades internacionais, não convém para (i) realizar dosagens mais rigorosas, e sobretudo (ii) preparar anticorpos policlonais, e, melhor, monoclonais anti TK-F úteis no dominio do diagnóstico por um lado, e no dominio terapêutico, por outro lado.

-4I

OBJECTO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, propõe-se, como produto industrial novo, uma TK-F purificada que tem uma actividade enzimática clasamente superior à da TK-F isolada até agora de acordo com as modalidades da técnica anterior.

Existe necessidade de TK-F purificada, em particular no dominio do diagnóstico. De facto, a actividade da TK-F varia de um cancro para outro. Visto que a actividade da TK-F é pequena nas células em fase Go e grande nas células em fase S, há boas razões para pensar que os cancros que têm pequena actividade TK-F estão num estado quiescente, ao passo que os cancros que têm uma actividad^ TK-F grande estão em via de proliferação. A dosagem da TK-F nos cancros do seio e da próstata tem, portanto, grande interesse para medir o estado proliferativo dos cancros. Além disso, a dosagem da TK-F por meio de anticorpos anti TK-F germinados contra a TK-F purificada constitui um elemento de apreciação sobre a evolução da doença cancerosa, e, por conseguinte, de ajuda à orientação terapêutica.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, preconiza-se um processo para a preparação da referida TK-F purificada, processo este que compreende a união da TK-F, que se quer purificar, com a timidina, e em seguida a clivagem do complexo resultante (timidina -TK-F) para colher a TK-F purificada.

De acordo ainda com outro aspecto da invenção, preconiza-se a utilização da TK-F purificada para obter anticorpos anti TK-F, sendo estes anticorpos destinados a uma utilização diagnóstica, por um lado, e a uma utilização terapêutica, por outro lado. De facto, descobriu-se de maneira surpreendente que a administração de anticorpos anti TK-P em pacientes atacados de um cancro hormono-dependente (designadamente um cancro do seio ou da próstata) tem um efeito terapêutico benéfico.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção, preconiza-se, como produto industrial novo, uma TK-P purificada, que ainda não tinha sido obtida até agora, útil no dominio das dosagens e no da obtenção de anticorpos anti TK-P, sendo a referida TK-F purificada caracterizada pelo facto de ter uma actividade enzimática especifica por mg superior ou igual a 5000 unidades, preferivelmente superior ou igual a 8000 unidades, e ainda melhor superior ou igual a 10 000 unidades .

O Rf electroforético (com pH de aproximadamente 8,6) em meio não desnaturante (por exemplo nos tampões A e B descritos adiante) é de aproximadamente 0,15 para uma TK-F que tem uma actividade enzimática especifica por mg da ordem de aproximadamente 11.800 unidades .

A actividade enzimática especifica é expressa, como de costume, em unidades enzimáticas, por mg de proteina. Uma unidade de TK-F denominada internacional corresponde a 1 nanomole de nucleotídeos sintetizados por mg de proteina e por minuto. Por outras palavras, a actividade enzimática pode ser expressa em nmoles/mg de

proteina/min.

Para comparação, ver-se-à adiante no exemplo 1 que:

- a actividade em meio biológico de origem é de 1,03 nmoles/ /mg de proteina/min.;

- a actividade depois de cromatografia sobre DEA-Sphadex é de 2,08 nmoles/mg de proteína/min.;

- a actividade da TK-F purificada é de 11 875 nmoles/mg de proteína/min.

O processo para a preparação da TK-F purificada, que se preconiza de acordo com a invenção no qual se efectua a união da TK-F, que se pretende purificar com a timidina, e em seguida a clivagem do complexo timidina-TK-F resultante, é caracterizado pelo facto de

a) se efectuar a união timidina -TK-F, por meio de contacto da TK-F a purificar com timidina fixada previamente sobre um primeiro suporte conveniente,

b) se efectuar a eluiçao da TK-F assim ligada por meio de um eluente conveniente que contém timidina, e, em seguida

c) se efectuar a clivagem do complexo timidina -TK-F assim eluido por meio de um segundo suporte que é diferente do primeiro suporte e adsorve selectivamente a timidina do referido complexo timidina -TK-F.

-Ί-

Ο melhor modo de realizar este processo consiste numa cromatografia de afinidade que compreende um mecanismo denaninado de competição. Assim, na fase a) faz-se passar a TK-F que se pretende purificar sobre uma resina apropriada unida previamente com timidina. A timidina ligada à referida resina fixa a TK-F que é retida, enquanto que as impurezas de natureza proteínica que poluem ou contaminam a TK-F, visto que não se fixam à timidina, não são retidas.

Na fase b) a TK-F fixada ao suporte i por intermédio da timidina unida previamente ao referido suporte, é eluida por meio de um eluente que contém timidina livre. A fase b) compreende o mecanismo denominado de competição, unindo-se a TK-F ligada à timidina fixada ao suporte com a timidina livre do eluente. 0 eluato assim colhido contém o complexo timidina -TK-F assim formado.

Na fase c), desestabiliza-se o referido complexo timidina TK-F adsorvendo a timidina sobre um segundo suporte selectivo da timidina.

Na prática, o suporte preferido da fase c) é um gel de Epoxi-Sepharose vendido pela sociedade denominada Pharmacia com a designação de Epoxi-Sepharose 6B. Este gel é unido previamente à timidina por um método conhecido, designadamente o descrito por P. Grõbner et al., J. Biol. Chem., 259, páginas 8012-8014, (1984) ou um método análogo. O suporte preferido da fase c) para fixar a timidina é uma composição que compreende carvão, dextrano e gelatina. A TK-F purificada é seguidamente isolada, designadamente por meio de centrifugação do eluato que a encerra com o referido segundo suporte utilizado na fase c).

A TK-F de partida é uma substância

proteínica de origem animal (obtenção a partir de tecido fetal animal, em particular de fígado de feto de roedor como o rato), de origem humana (obtenção a partir de tecido canceroso humano), ou ainda de origem sintética (obtenção por engenharia genética em particular).

A TK-F assim purificada é útil de acordo com a invenção para obter anticorpos anti TK-F, preferivelmente anticorpos monoclonais, mais do que anticorpos policlonais. Estes anticorpos são obtidos por um método clássico conhecido. Por exemplo, inocula-se a referida Tk-F purificada a um ratinho, extrai-se o baço do alimal imunizado, extraem-se os linfécitos do baço, reunem-se os referidos linfócitos com células de mieloma de ratinho em crescimento exponencial, à razão de 5 a 20, de preferência 10 linfócitos por célula de mieloma, seleccionam-se os hibridomas secretores assim obtidos a fim de obter anticorpos monoclonais que reagem selectivamente com a TK-F mas não com a TK-A, desenvol vem-se tumores ascíticos no ratinho com clones seleccionados recuperam-se os liquidos de ascite que contêm os anticorpos, e purificam-se os anticorpos monoclonais assim obtidos.

Para efectuar dosagens, quer seja para detectar a presença ou ausência de TK-F num tecido, quer seja para avaliar quantitativamente o conteúdo de TK-F no referido tecido, fixa-se o anticorpo anti TK-F sobre um suporte apropriado (esferas de vidro, poliestireno, paredes de recipiente, etc.) para obter um material (1)

Suporte - anti TK-F põe-se seguidamente este material em contacto com um meio capaz de conter TK-F, dando a presença da referida TK-F o

-9complexo

(2)

Suporte - anti TK-F - TK-F

Este complexo constitui um sinal que se amplifica por um método conhecido para observação e/ou detecção com um conjugado marcado anti TK-F / por exem pio, método EIA (desig-adamente EIA-sandwich ou EIA-competição 7 segundo o qual se une o complexo 2 com um conjugado enzimático apropriado, método RIA que compreende a união do referido complexo 2 com um conjugado marcado por meio de um isótopo radioactivo, método de fluorescência que compreen de a união do referido complexo 2 com um conjugado marcado por meio de fluoresceína 7. A amplificação pode também ser realizada por aglutinação ou ainda segundo um método ERICA em que se empregam células.

De acordo com a invenção, preconi zam-se estojos de dosagem que compreendem os meios reagentes necessários para efectuar reacções antigene-anticorpo, designadamente as reacções seguintes:

(a) Suporte - anti TK-F + TK-F — suporte - anti TK-F __ TK-F (b) Suporte -anti TK-F —TK-F + anti TK-F⁺—“£ suporte -anti TK-F—-TK-F .— anti TK-F⁺

De acordo com a invenção, preconi za-se uma composição terapêutica que contém em associação com um excipiente fisiologicamente aceitável, uma quantidade terapeuticamente eficaz de anti TK-F.

Tem-se particularmente em vista a utilização de anticorpos anti TK-F para a obtenção de um medicamento anticanceroso destinado a uma utilização terapêutica relativamente a cancros do seio e da próstata.

Outras vantagens e caracteristicas da invenção serão melhor compreendidas com a leitura que se segue de exemplos de realização, exemplos cujo conjunto não é limitativo mas apresentado como descrição.

EXEMPLO 1

Isolamento e purificação de TK-F de_fígado_de feto de_rato_

1) Homogeneização

Os tecidos de fígado de feto de rato são homogeneizados com Polytron na solução tampão: Tris 10 mM, MgClg 10 mM, NaF 5 μΜ, e p-mercaptoetanol com pH 7,5 (Tampão A).

2) Preparação do citosol homogenado resultante é centri fugado sucessivamente a 800 x g e 12 000 x g durante 10 min. numa centrifugadora refrigerada. O sobrenadante obtido a 12 000 x g é depois centrifugado a 105 000 x g durante 45 min. a +5°C numa ultracentrifugadora Beckman, tipo L8-55. 0 sobrenadante obtido a 105 000 x g (citosol) constitui a fonte de TK-F. Uma dosagem da actividade enzimática especifica da TK-F é efectuada numa parte alíquota do citosol; esta actividade é de 1,03 mmoles/mg/min.

3) Isolamento da TK-F

A TK-F é isolada por cromatografia sabre gel de DEAE-Sephadex A50 (vendido pela sociedade denominada Pharmacia): 0 gel de Sephadex é posto a dilatar no tampão A. Depois de eliminação das partículas finas por sedimentação, o gel é depositado numa minicoluna de 7 cm x x 1 cm. Introduzem-se 800 μΐcb gel na coluna. Depois de preparação da coluna de gel, deposita-se sobre o gel uma parte alíquota do citosol. A TK-F é eluída por passagens sucessivas de 4 volumes (4 x 500 gl) de tampão A. As eluições sucessivas são efectuadas por centrifugação da coluna a 200 x g numa centrifugadora refrigerada. A eluição-centrifugação acelera a eluição e evita a desnaturação da TK-F. Uma dosagem da actividade enzimática da TK-F é efectuada sobre uma parte alíquota do eluato e o eluato lestante é liofilizado. Nesta fase, a actividade enzimática é de 2,08 nmoles/ /mg/min.

4) Purificação da TK-F

A purificação faz-se por cromatografia de afinidade sobre um gel de epoxi-Sepharose 6B (vendido pela sociedade denominada Pharmacia) unido com timidina. A união da timidina com o gel de Sepharose efectua-se em meio alcalino, com pH 12,0 e a 25°C, durante 24 horas, por meio de uma técnica derivada da de P. Grober et al., já mencionada. A proporção de união da timidina é de 9 μΜ por ml de gel. O gel é lavado com tampão Tris 10 mM, MgCl₂10 mM, NaF 5 μΜ, p-mercaptoetanol 0,4 mM, com pH 7,5 (Tampão B). Depositam-se 3 ml de gel numa coluna de 10,6 cm de altura e 0,6 cm de diâmetro. O liofilizado que contém a TK-F é retomado com água destilada e depositado sobre o gel de afinidade. A penetração da amostra efectua-se à velocidade de 1,2 ml por hora.

O gel de afinidade é lavado com tampão B para eliminar as proteínas não fixadas no gel. A sua eluição efectua-se com a velocidade de 1,2 ml por hora, e em seguida de 4 ml por hora. A totalidade dos produtos não retidos pelo gel são eluídos com um volume de 24 ml do tampão B.

A eluição da TK-F efectua-se por meio da passagem, sobre o gel de afinidade, de 4,5 ml de tampão: Tris 10 mM, MgCl₂ 10 mM, NaF 5 μΜ, p-mercaptoetanol 0,4 mM, ATP 1 mM e timidina rádio-inerte 10 mM, com pH 7,5. A eluição efectua-se com um débito de 0,5 ml por hora. O eliuato assim obtido contém o complexo timidina - TK-F.

5) Eliminação da timidina rádio-inerte

A eliminação da timidina rádio-inerte efectua-se por meio de passagem do eluato obtido anteriormente sobre um sarro de carvão-dextrano-gelatina (carvão 1% em peso, dextrano T70 0,1% em peso e gelatina 0,2% em peso em tampão Tris-HCl 10 mM com pH 7,5). A mistura é agitada em turbilhão durante 10 minutos a O°C e em seguid centrifugada a 800 x g durante 10 minutos. 0 sobrenadante contém a TK-F purificada. A sua dosagem é efectuada sobre uma parte alíquota do sobrenadante. A actividade enzimática da TK-F assim purificada é de 11 875 nmoles/min.

O rendimento em actividade total é de 7,4%. A proporção de purificação é da ordem de 11 530 vezes, e o Rf electroforético da TK-F purificada (determinado em meio não desnaturante) é de 0,15 com pH 8,6.

EXEMPLO 2

Técnica de_dosagem da actividade_da TK-F a 20 μΐ do extracto que contém a TK-F, juntam-se 5 μΐ de tampão Tris-HCl (pH 7,8) 200 mM que contém 76 mM de MgCl„, 160 mM de fosfoglicerato. 40 mM ^z _ 14 _ de ATP e 40 a 50 μΜ de / 2- C_/-timidina (actividade es~ z” 8 pecifica 54-58 mCi/nmole; isto é, aproximadamente 2 x 10 a 2,15 x 10 Bq/nmole). O meio de reacção é incubado a 37 C durante 25 min, e, em seguida, a reacção é detida por meio

da adição de 10 μΐ de CIO^H 2,1 M e centrifugação a 2400 x g durante 10 min. Em seguida utilizam-se 10 μΐ do sobrenadante de centrifugação para a separação, por electroforese de alta tensão, dos nucleótidos sintetizados. A separação dos d-TMP, d-TDP e d-TTP (timidina-monofosfato, -difosfato e -trifosfato) efectua-se sobre papel Whatman 3MM, em tampão citrato com pH 4,1 sob 47 vóltios por cm de comprimento de papel, durante 30 min e a 3°C. Depois de secagem do electroforegrama e em seguida referenciação sob U.V. dos nucleótidos testemunhas, o papel é cortado em tirinhas com 2,5 cm de largura por 0,5 cm de altura e estas são transferidas para frasquinhos de contagem da radioactividade que contêm 10 ml de líquido cintilante (Ready-solv EP, Beckman).

EXEMPLO 3

Controlo_da_pureza da TK-F_por_electroforese sobre_gel_de_ poliacrilamida

Efectua-se a electroforese num gel de poliacrilamida em gradiente linear de 10 a 15% em presença de dodecilsulfato de sódio (SDS), sobre placa vertical. A migração das proteínas efectua-se em tampão Tris 12 g °/oo, glicina 28,8 g °/oo e SDS 0,1 g % com pH 8,7 sob 70 vóltios durante 12 horas.

As proteínas provenientes do citosol e do eluato DEAE-Sephadex são coloridas por uma solução de Azul de Coomassie R 250 com a concentração de 0,5 g em 250 ml de metanol a 90%. A coloração das proteínas obtidas depois de cromatografia de afinidade efectua-se pelo método

de coloração com prata de acordo com a técnica de P. Tunon e K.E. Johansson, J. Biol.Chem. and Biophys, Methods, _9, páginas 171-179, (1984).

EXEMPLOS 4 e 5

Procedendo conforme indicado no exemplo 1, mas substituindo os tecidos de fígado de feto de rato por tecidos cancerosos humanos de seio e de próstata, obtém-se uma TK-F purificada análoga à do figado de feto de rato e com aproximadamente as mesmas propriedades (actividade enzimática, Rf) que a referida TK-F purificada de fígado de feto de rato.

Observa-se em particular no conjunto dos produtos dos exemplso 1, 4 e 5, que, ao contrário da TK-A, a actividade da TK-F não é inibida pelo d-CTP, e que a mobilidade electroforética da TK-F em gel de poliacrilamida e com pH 8,6 é nula ou muito pequena, enquanto que a TK-A tem uma mobilidade rápida. Estas duas isoenzimas têm também comportamentos diferentes sobre coluna de DEAE-Sephadex ou DEAE-celulose. A TK-F não é retida sobre este tipo de resina e é eluida por soluções com pouca força iónica. A TK-A é retida sobre estas resinas e só pode ser eluida por soluções com grande força iónica. 0 comportamento electroforético e cromatográfico indica, portanto, que a TK-F tem um caracter alcalino e a TK-A um caracter ácido. 0 pH da TK-F seria, no estado actual dos conhecimentos, de 9,0-9,7 e o da TK-A de 5,0-5,7.

De acordo com a invenção, preco-16-

nizam-se como produtos industriais novos os anticorpos anti TK-F germinados contra a TK-F purificada de acordo com a invenção obtida a partir de uma fonte qualquer, em particular uma TK-F purificada de origem animal ou humana.

Conforme indicado acima, os anticorpos anti TK-F, em particular os anticorpos monoclonais anti TK-F, germinados contra a TK-F purificada são particularmente úteis no dominio das dosagens. Preferivelmente, a TK-F purificada utilizada para se obterem os referidos anticorpos monoclonais é de origem animal (designadamente o tecido de fígado fetal de roedor) ou humana (designadamente de tecido canceroso humano).

REIVINDICAÇÕES:

Claims

lã. - Processo para a preparação de timidina quinase de tipo fetal (TK-F)purificada na qual se efectua a união da TK-F, que se pretende purificar, com timidina, e em seguida a clivagem do complexo timidina -TK-F resultante, caracterizado pelo facto de:

a) se efectuar a união timidina -TK-F, por meio de contacto da TK-F a purificar com a timidina previamente fixada sobre um primeiro suporte conveniente,

b) se efectuar a eluiçao da TK-F assim ligada por meio de um eluente conveniente que contém timidina, e em seguida

c) se efectuar a clivagem do complexo timidina - TK-F assim eluido por meio de um segundo suporte que é diferente do primeiro suporte e adsorve selectivamente a timidina do referido complexo timidina - TK-F.
2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o produto obtido ter uma actividade enzimática por mg igual ou maior que 5000 unidades, preferivelmente igual ou maior que 8000 unidades, e mais preferivelmente igual ou maior que 10 000 unidades .
3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o produto obtido ter uma actividade enzimática de aproximadamente 11 800 unidades.
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o produto obtido ter um Rf electroforético, em meio nao desnaturante, de aproximadamente 0,15 com pH de aproximadamente 8,6.
5§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o primeiro suporte ser epoxi-sefarose.
6i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a eluição das impurezas proteínicas não retidas sobre o primeiro suporte unido à timidina ser efectuada com um tampão Tris 10 mM, MgCl₂ 10 mM, naF 5 μΜ, p-mercaptoetanol 0,4 mM e ATP 10 mM, com pH 7,5.
7ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a eluição da TK-F fixada na timidina do suporte unido à referida timidina ser efectuada comum tampão Tris 10 mM, MgCl₂ 10 mM, NaF 5 μΜ, 'p-mercaptoetanol 0,4 mM, ATP 1 mM e timidina 10 mM com pH 7,5.
8â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o segundo suporte ser uma composição que compreende 1% em peso de carvão 0,1% em peso de dextrano e 0,2% em peso de gelatina em tampão Tris-HCl 10 mM com pH 7,5.
9§. _ Processo para a obtenção de anticorpos, preferivelmente monoclonais, anti TK-F de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se inocular a referida TK-F purificada num rato, se retirar o baço do animal imunizado, se extraírem os linfócitos do baço se fundirem os referidos linfócitos com células de mieloma de rato em crescimento exponencial, na proporção 5 para 20, de preferência 10 linfócitos por célula de mieloma, se seleccionarem os hibridomas secretores assim obtidos a fim de se obter anticorpos monoclonais que reagem selectivamente com a TK-F mas não com a TK-A, se desenvolvrem tumores asciticos no rato com clones selecciona recuperarem ascite anticorpos monoclonais assim obtidos.

lOâ. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de os anticorpos TK-F serem utilizados contra a TK-F purificada de acado com a reivindicação 1.

llê. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o anticorpo anti TK-F útil no domínio das dosagens, ser monoclonal e ser utilizado contra a TK-F purificada de acordo com a reivindicação 1 obtida a partir de uma fonte animal ou humana.
12â. - Processo para a obtenção de um medicamento anticanceroso destinado a uma utilização

-20em terapêutica relativa a cancros da próstata a do seio caracterizado pelo facto de se utilizar anticorpos monoclonais anti TK-F de acordo com a reivindicação 9.