JPH0438392B2 - - Google Patents

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JPH0438392B2
JPH0438392B2 JP62193612A JP19361287A JPH0438392B2 JP H0438392 B2 JPH0438392 B2 JP H0438392B2 JP 62193612 A JP62193612 A JP 62193612A JP 19361287 A JP19361287 A JP 19361287A JP H0438392 B2 JPH0438392 B2 JP H0438392B2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新しい工業製品としての胎児型精製
チミジンキナーゼに関するものである。本発明
は、また、本製品の製法、特にその精製方法に関
するものでもある。本製品は、（）定量分析の
分野−特に抗原抗体反応を伴う免疫学的分析に関
して、及び（）治療においては薬剤として使用
される抗体の製造に有益である。
〔従来の技術〕
チミジンキナーゼ（以下TKと略す）は、チミ
ジンがチミジン5′−一リン酸（以下ｄ−TMPと
略す）になるリン酸化反応を触媒する酵素であ
り、DNA合成に、従つて細胞繁殖に重要な役割
を果たすことが公知である。その酵素活性は、増
殖又は再生過程にある組織やウイルス感染細胞に
おいて、高い。また、TKの二つのアイソザイム
が、真核細胞で検出されたことも公知である。す
なわち、胎児型チミジンキナーゼ（以下“胎児チ
ミジンキナーゼ”又はTK−Ｆと言う）と、成人
型チミジンキナーゼ（以下“成人チミジンキナー
ゼ”又はTK−Ａと言う）である。
TK−Ｆは胚組織内に存在し、ホルモン依存
癌、特に、乳癌や前立腺癌の癌組織で検出されて
いる。この点については、J.L.Javreその他の、
Bull.Cancer（Paris）73（No.１），p.8−p.16
（1986）に掲載の論文「乳癌における胎児型チミ
ジンキナーゼの検出」およびJ.L.Javreその他に
よる癌研究所で発表するために提出された論文
「ヒトの乳癌における胎児チミジンキナーゼの存
在」を参照。
また、生体内のTK−Ｆ合成は、性ホルモンに
よつてそれらの標的器官、つまり前立腺や子宮内
で大いに増加する。この点については、M.
Bourtouraultその他のJ.steroid Biochem.，21
（No.５），p.613−620（1984）に掲載の論文「ラツ
トの子宮におけるチミジンキナーゼ活性の17β−
エストラジオールによる刺激」およびG.Gayetそ
の他のTheProstate７，p.261−270（1985）に掲
載の論文「ラツトの前立腺における胎児型チミジ
ンキナーゼのアンドロゲンによる誘導」を参照。
電気泳動あるいは陰イオン交換樹脂を使つたク
ロマトグラフイー〔例えば、アクリルミドゲルの
電気泳動か、好ましくは、DEAE−セルロースゲ
ル又はDEAE−セフアデツクスゲル（Pharmacia
社より販売されている）のクロマトグラフイー〕
によつて、TK−ＦをTK−Ａから分離する。こ
の時、胎児アイソザイムの易動度は０か、もしく
はゆつくりしているが、成人アイソザイムの易動
度は速い。
〔発明が解決しようとする問題点〕
このように単離したTK−Ｆは、１mg当たり２
国際単位のオーダーの酵素活性を有し、（）高
度に正確な定量分析の実効に不適当であり、また
特に（）診断の分野や治療の分野で役立つ多ク
ローン性抗TK−Ｆ抗体、特に単クローン性抗
TK−Ｆ抗体の製造に不適当である。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明の第１の特徴は、従来の方法により単離
されたTK−Ｆに比べてはるかに大きな酵素活性
を有する精製TK−Ｆを、新しい工業製品として
提供することにある。
診断の分野では、精製TK−Ｆが特に不足して
いる。事実、TK−Ｆ活性は癌のタイプによつて
さまざまである。TK−Ｆ活性はG0期の細胞では
低くＳ期の細胞では高いから、低TK−Ｆ活性を
示す癌は休止状態にあり、高TK−Ｆ活性を示す
癌は増殖しつつあると考えるべき十分な理由があ
る。それゆえに乳癌や前立腺癌におけるTK−Ｆ
の定量分析は、癌の増殖状態を測定する上で非常
に重要である。さらに、精製TK−Ｆに対して生
じた抗TK−Ｆ抗体を使つてTK−Ｆを定量分析
することは、癌疾患の進行状態を判断するため
の、従つてその治療を方向づけるための一因子で
ある。
本発明の第２の特徴は、上述の精製TK−Ｆの
ある製法を推奨することにある。この製法は、精
製すべきTK−Ｆをチミジンとカツプリングし、
生じた複合体（チミジン／TK−Ｆ）を分解して
精製TK−Ｆを集めることよりなる。
本発明のもう一つの特徴は、抗TK−Ｆ抗体を
調製するために、精製TK−Ｆの使用を勧めるこ
とにある。これらの抗体は診断に使用される一
方、治療でも使用されている、驚いたことに、ホ
ルモン依存癌（特に乳癌又は前立腺癌）をわずら
つている患者に、抗TK−Ｆ抗体を投与すると、
治療上有益な効果があることが解つた。
〔作用〕
本発明によつて、現在まで得られたことのない
精製TK−Ｆを新しい工業製品として勧める。こ
のTK−Ｆは、定量分析の分野や抗TK−Ｆ抗体
の調製分野で有益であり、１mg当りの比酵素活性
は5000ユニツト以上である、好ましくは、8000ユ
ニツト以上である。さらに好ましくは10000ニユ
ツト以上である。
非変性媒質（例えば下記の緩衝液ＡとＢ）中で
（PH約8.6の時）電気泳動のRf値は、１mg当たり約
11800ユニツトのオーダーの比酵素活性をもつ精
製TK−Ｆについて、約0.15である。
慣例に従つて、比酵素活性はタンパク質１mg当
りの酵素（活性の）単位で示す。TK−Ｆのいわ
ゆる国際単位は、１分間にタンパク質１mg当りで
合成されるヌクレオチド１ナノモル（nanomol）
に相当する。言い換えれば、酵素活性は、
nmol／タンパク質mg／minで表示しうるもので
ある。比較すると、下記の実施例１で次のことが
わかる。
− 最初の生物学的媒質中の活性は、
1.03nmol／タンパク質mg／minである。
− DEAE−セフアデツクスでクロマトグラフイ
ーを行つた後の活性は、2.08nmol／タンパク
質mg／minである。
精製TK−Ｆの活性は11875nmol／タンパク
質mg／minである。
精製すべきTK−Ｆをチミジンとカツプリング
させ、生じたチミジン／TK−Ｆ複合体を分裂さ
せる、本発明の推奨する、精製TK−Ｆの製法
は、以下より成る。
(a) 精製すべきTK−Ｆを、あらかじめ第１の適
当な支持体（第１支持体）に固定させたチミジ
ンと接触させることにより、TK−Ｆとチミジ
ンをカツプリングさせる。
(b) このように結合させたTK−Ｆを、チミジン
を含む適当な溶離液で溶出させる。
(c) このように溶出させたチミジン／TK−Ｆ複
合体を、第１支持体と異なる第２支持体を使つ
て分裂させ、上記のチミジン／TK−Ｆ複合体
からチミジンを選択的に吸着させる。
この製法を実行する最良の流儀は、いわゆる競
争機構を含むアフイニテイークロマトグラフイー
から成る。そこで、段階(a)では、精製すべきTK
−Ｆを、あらかじめチミジンとカツプリングさせ
た適当な樹脂上を通過させる。この樹脂に結合し
たチミジンは、TK−Ｆを固定し、それを保持す
るが、TK−Ｆを汚染するタンパク質型不純物
は、チミジンに固定されず、保持されない。
段階(b)では、あらかじめ支持体にカツプリング
させたチミジンによつて、前記支持体に固定した
TK−Ｆを、遊離チミジンを含む溶離液で溶出す
る。段階(b)はいわゆる競争機構から成り、支持体
に固定されたチミジンと結合したTK−Ｆは、溶
離液中の遊離チミジンとカツプリングする。この
ように集めた溶出液には、形成されたチミジン／
TK−Ｆ複合体が含まれている。
段階(c)では、チミジンに対して選択性をもつ第
２支持体にチミジンを吸着させて、前記のチミジ
ン／TK−Ｆ複合体を非安定化する。
実際上、段階(c)における好ましい支持体は、エ
ポキシ−セフアロース6Bの商品名でPharmacia
社から市販されているエポキシ−セフアロースゲ
ルである。このゲルを、公知の方法、特にP.
Grobnerその他がJ.Biol.Chem.，259，p8012−
8014（1984）に記述した方法もしくは類似の方法
によつて、まずチミジンとカツプリングさせる。
チミジンを固定するための、段階(c)での好ましい
支持体は、木炭、デキストランおよびゼラチンか
ら成る組成物である。つぎに、段階(c)で使つた前
記の第２支持体と共に精製TK−Ｆを含む溶出液
を、特に、遠心分離して、精製TK−Ｆを単離す
る。
出発のTK−Ｆは、動物由来のタンパク物質
（動物の胎児組織から得たもの、特にラツトのよ
うな囓歯動物の胎児の肝臓）か、ヒト由来のタン
パク物質（ヒトの癌組織から得たもの）か、又合
成由来のタンパク物質（特に、遺伝子工学によつ
て得たもの）かを用いる。
本発明によれば、このように精製したTK−Ｆ
は、抗TK−Ｆ抗体（多クローン性よりむしろ単
クローン性）の製造に有益である。
これらの抗体は、公知の従来技術で得られる。
例えば、前記の精製TK−Ｆをマウスに接種し、
免疫のできたマウスから脾臓を除去して、脾臓か
らリンパ球を抽出する。
このリンパ球を指数的増殖期にあるマウスの骨
髄腫細胞に融合させる。その割合は１骨髄腫細胞
当り５〜20リンパ球であり、10リンパ球が好まし
い。このようにして得た分泌性ハイブリドーマ
（hybridomas）を選別して、TK−Ａではなく
TK−Ｆと選択的に反応する単クローン性抗体を
得る。選んだクローンをもつマウスで腹水腫瘍を
発生させ、前記抗体を含んだ腹水を回収し、その
結果得た単クローン性抗体を精製する。
組織中のTK−Ｆの有無を検出したり、または
前記組織中のTK−Ｆの含有度を定量的に評価し
たりする目的で、分析を行なうために、抗TK−
Ｆ抗体を適当な支持体（ガラスビーズ、ポリスチ
レンビーズ、容器の内壁など）に固定すると、次
の材料が得られる。
(1) 支持体／抗TK−Ｆ 次に、この材料をTK−Ｆを含んでいる可能性
のある媒質と接触させる。TK−Ｆがあれば次の
複合体が得られる。
(2) 支持体／抗TK−Ｆ／TK−Ｆ この複合体は、一つの“シグナル”を構成し、
このシグナルは、可視化するためおよび／もしく
は抗TK−F*でラベルされた抱合体（conjugate）
と共に検出するために、公知の方法によつて“増
幅”される。〔たとえば、EIA法〔特にEIA−サ
ンドイツチ法又はEIA−競争法）では、複合体２
を、適当な酵素抱合体とカツプリングさせる。
RIA法では、前記複合体２と放射性同位元素でラ
ベルした抱合体とをカツプリングさせる。また、
蛍光法は、フルオレスシンでラベルした抱合体と
前記複合体２をカツプリングさせる。〕また、増
幅は、凝集によるか、または細胞を利用する
ERICA法のどちらか一方によつて行なうことが
できる。
本発明が推奨する分析具は、抗原−抗体反応、
特に以下の反応を行なうために必要な試薬を含ん
でいる。
(a) 支持体／抗TK−Ｆ＋TK−Ｆ→ 支持体／抗TK−Ｆ／TK−Ｆ (b) 支持体／抗TK−Ｆ／TK−Ｆ＋抗TK−
F*→ 支持体／抗TK−Ｆ／TK−Ｆ／抗TK−
F* 本発明においては、生理学的に許容できる賦形
剤と関連して、治療上有効量の抗TK−Ｆを含む
治療用組成物を推奨する。
本発明は、特に乳癌や前立腺癌の治療において
用いられる抗癌剤を製造する目的で抗TK−Ｆ抗
体を用いることに関するものでもある。
〔実施例〕
本発明の他の利点や特徴は、以下の実施例の記
述から一層明瞭に理解できるだろう。しかし、以
下の記述は何ら限定的なものではなく、実例とし
て提示されるものにすぎない。
実施例 １ ラツトの胎児の肝臓からTK−Ｆを単離し、精
製する。
(1) 均質化 ラツトの胎児の肝臓組織を次の緩衝液中でポリ
トロンで均質化する。すなわち10mMのトリス
（Tris）−Hcl、10mMのMgCI2、5μMのNaＦおよ
び0.4mMのβ−メルカプトエタノールから成る
PH7.5の緩衝液である。（緩衝液Ａ） (2) 細胞質ゾル（cytosol）の調製 上記の方法で得たホモジネートを冷却遠心分離
機を使つて、まず800×ｇで、次に12000×ｇで10
分間続けて遠心分離し、得られた上澄液をL8−
55型Beckman超遠心機により５℃で、45分間
105000×ｇで遠心分離した。105000×ｇで得た上
澄液（細胞質ゾル）が、TK−Ｆの供給源とな
る。TK−Ｆの比酵素活性の定量分析を細胞質ゾ
ルのアリコートで行なつた。この活性は、
1.03nmol／mg／minであつた。
(3) TK−Ｆの単離 TK−ＦをDEAE−セフアデツクスA50ゲル
（Pharmacia社より市販）を使つたクロマトグラ
フイーで単離した。セフアデツクスゲルは緩衝液
Ａで膨潤させる。沈降により微細粒子を除去した
後、そのゲルを７cm×１cmのミニカラムに沈着さ
せた。ゲル800μlをカラム中に挿入した。ゲルの
カラムを調製した後、細胞質ゾルのアリコートを
ゲルに吸着させた。４容（４×500μl）の緩衝液
Ａを連続的に通すことによつてTK−Ｆを溶出し
た。冷却遠心機を使い、200×ｇでカラムを遠心
分離することによつて、連続溶出を行なつた。遠
心分離によつて溶出家庭が加速され、TK−Ｆの
変性が防止される。TK−Ｆ酵素活性の定量分析
を溶出液のアリコートで行ない、その結果得た溶
出液を凍結乾燥させた。この段階で酵素活性は
2.08nmol／mg／minであつた。
(4) TK−Ｆの精製 チミジンとカツプリングしたエポキシ−セフア
ロース6Bゲル（Pharmacia社により販売されて
いるもの）を用いたアフイニテイークロマトグラ
フイーで、精製を実行した。チミジンは、上述の
P.Groberその他の方法に由来する技術を用いて、
24時間に亘り、25℃でPH12・０のアルカリ媒質中
セフアロースゲルカツプリングさせた。チミジン
のカツプリング度はゲル1ml当り9μmolであつ
た。ゲルを以下の緩衝液で洗浄した。10mMのト
リス（Tris）、10mMのMgCI2、5μMのNaＦ、
0.4mMのβ−メルカプトエタノールおよび1mM
のATPから成るPH7.5の緩衝液である（緩衝液
Ｂ）。ゲル3mlを高さ10.6cm、直径0.6cmのカラム
に沈着させた。TK−Ｆを含む凍結乾燥物を蒸留
水で吸収し、アフイニテイーゲルに沈着させた。
試料を、１時間に1.2mlの割合で浸透させた。
このアフイニテイーゲルを緩衝液Ｂで洗浄し
て、ゲルを固定されていないタンパク質を除去し
た。タンパク質は、1.2ml／ｈの速さで溶出し、
その後4ml／ｈの速さで溶出した。ゲルに保持さ
れないタンパク質の総量を、緩衝液B24mlで溶出
した。
以下の緩衝液4.5mlをアフイニテイーゲルに通
してTK−Ｆを溶出する。10mMのトリス
（Tris）、10mMのMgCI2、5μMのNaＦ、0.4mM
のβ−メルカプトエタノール、1mMのATPおよ
び10mMの非放射性チミジンから成るPH7.5の緩
衝液である。溶出は0.5ml／ｈの速さで行なつた。
その結果得た溶出液は、チミジン／TK−Ｆ複合
体を含んでいる。
(5) 非放射性チミジンの除去 非放射性チミジンは、木炭／デキストラン／ゼ
ラチン（PH7.5の10mMのトリス（Tris）−塩酸緩
衝液中、木炭１％ｗ／ｗ、デキストランT700.1
％ｗ／ｗ、ゼラチン0.2％ｗ／ｗの割合で含まれ
る）のプラグに、上で得た溶出液を通すことによ
つて除去した。この混合物を、渦をおこしなが
ら、０℃で、10分間振盪した後、10分間800×ｇ
で遠心分離した。上澄液は精製TK−Ｆを含んで
いた。上澄液のアリコートを分析した。このよう
に精製したTK−Ｆの酵素活性は11875nmol／
mg／minであつた。
全活性収率は7.4％であつた。精製係数
（purification factor）は、11530のオーダーであ
り、精製TK−Ｆの電気泳動によるRf値（非変性
媒質中で測定した）はPH8.6のとき0.15である。
実施例 ２ TK−Ｆ活性の測定法 76mMのMgCI2、160mNのホスホグリセリン酸
塩（phosphoglycerate）、40mMのATPおよび40
〜50μMの〔２−14Ｃ〕−チミジン）比活性：54〜
58mCl／nmol、すなわち約２×108〜2.15×108
Bq／mmol）を含む200mMのトリス（Tris）−
Hcl緩衝液（PH7.8）5μlを、TK−Ｆを含む抽出物
20μlに加えた。反応媒質を37℃で25分間温置した
後、2.1MのHC104 10μlを加えて反応を止め、
2400×ｇで10分間遠心分離する。その後、遠心分
離で得た上澄液10μlを高圧電気泳動にかけ、合成
ヌクレオチドを分離した。ｄ−TMP、ｄ−
TDP、ｄ−TTP（チミジン−リン酸、チミジン
二リン酸、チミジン三リン酸）の分離には、ワツ
トマン紙3MMを使い、PH4.1のクエン酸緩衝液
中、濾紙の長さ１cm当り47Vで、30分間電気泳動
を行なつた。電気泳動図（electropherogram）
を乾燥させ、紫外線（uv）で標準となるネヌレ
オチドの位置を調べた後、濾紙を2.5cm（幅）×
1.5cm（高）の細片に切る。そしてこれらの細片
を液体シンチレータ（Ready−solvEP、
Beckman）10mlを含んだ放射活性計数バイアル
に封入する。
実施例 ３ ポリアクリルアミドゲルを使つた電気泳動による
TK−Ｆ純度のチエツク 電気泳動を、垂直板（vertical plate）上で、
硫酸ドデシルナトリウム（SDS）の存在下で、濃
度が10％から15％までの直線的に変化するポリア
クリルアミドゲル中で行なつた。タンパク質の泳
動を以下の緩衝液で行なつた。つまり、トリス
（Tris）12g0/00、グリシン28.8g0/00、SDS0.1g
％ｏから成る緩衝液（PH8.7）で、12時間70Vで
行なう。
細胞質ゾルと、DEAE−セフアデツクス溶出液
に由来するタンパク質を、90％メタノール250ml
中0.5g濃度のクーマシーブルー（Coomassie
Blue）R250溶液で染色した。アフイニテイーク
ロマトグラフイーを実施した後、得たタンパク質
を、P.TunonとK.E.JohanssonのJ.Biol.Chem.
andBiophya.Methods，９，p171−179（1984）に
記載の方法による銀汚染法（silver staining
method）で染色する。
実施例４および５ 実施例１で示した方法を実施して（ただし、ラ
ツトの胎児の肝臓組織をヒトの乳癌および前立腺
癌の癌組織と置き換える）、ラツトの胎児の肝臓
から得られたTK−Ｆと類似の精製TK−Ｆを得
た。この精製TK−Ｆは、ラツトの胎児の肝臓か
ら得た前記の精製TK−Ｆと、ほぼ同じ性質（酵
素活性、Rf）をもつ。
特に実施例１、４、５のすべての生成物につい
て以下のことが認められた。すなわち、TK−Ａ
活性とちがい、TK−Ｆ活性はｄ−CTPによつて
阻害されないこと、また、PH8.6のポリアクリル
アミドゲル中でTK−Ｆの電気泳動易動度は０も
しくは非常に低いのに、TK−Ａの易動度は高い
こと。さらに、この二つのアイソザイムは、
DEAE−セフアデツクスカラムもしくはDEAE−
セルロースカラムで異なつた挙動を示すこと。
TK−Ｆはこのタイプの樹脂に保持されず、イオ
ン強度の低い溶液で溶出される。TK−Ａはこれ
らの樹脂に保持され、イオン強度の高い溶液での
み溶出できる。よつて、電気泳動やクロマトグラ
フイーにおける挙動から、TK−Ｆはアルカリ性
を有し、TK−Ａは酸性を有することがわかる。
現状の知見に従えば、TK−ＦのPHは9.0−9.7で
あり、TK−ＡのPHは5.0−5.7であろう。
本発明に従つてある種の源から得た精製TK−
Ｆ、特に動物由来またはヒト由来の精製TK−Ｆ
に対して生じた抗TK−Ｆ抗体を、本発明では新
しい工業製品として勧める。
〔効果〕 上述の通り、精製TK−Ｆに対して生じた抗
TK−Ｆ抗体、特に単クローン性抗TK−Ｆ抗体
は、定量分析の分野で特に有益である。前記の単
クローン性抗体を調整するために使用する精製
TK−Ｆは、動物由来（特に囓歯動物の胎児の肝
臓組織）のもの、又はヒト由来（特にヒトの癌組
織）のものであることが望ましい。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ 精製すべき胎児型チミジンキナーゼ（以下、
    TK−Ｆという）をチミジンとカツプリングさ
    せ、精製すべきTK−Ｆに含まれる、チミジンに
    保持されないタンパク質型不純物を、10mMのト
    リス、10mMの塩化マグネシウム、5μMのフツ化
    ナトリウム、0.4mMのβ−メルカプトエタノー
    ル、10mMのATPからなる緩衝液で溶出し、上
    記カツプリングによつて生じたチミジン／TK−
    Ｆ複合体を、チミジンを含有する溶出液に溶出さ
    せ、この溶出したチミジン／TK−Ｆ複合体を分
    裂させることによつて得られる、酵素活性が、
    10000nmol／タンパク質mg／min以上の精製TK
    −Ｆを製造する方法。
JP62193612A 1986-07-31 1987-07-30 胎児型精製チミジンキナーゼの製造方法 Granted JPS6359886A (ja)

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