JP6723230B2 - 神経障害性疼痛を治療するためのｃｓｆ１−ｄａｐ１２経路のメンバー遺伝子の標的破壊 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月９日に出願された米国特許仮出願第６２／０６２，０４７号の優先権の利益を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、一般に、神経障害性疼痛を治療するための組成物及び方法に関する。

序論
ミクログリアは、末梢神経損傷によってもたらされる神経障害性疼痛と関連する機械的過敏症を含めた、多くの神経学的状態に寄与する。しかし、どのようにして神経損傷がミクログリアを活性化するかに関して、意見の一致がほとんどない。ミクログリア活性化は、後根神経節（ＤＲＧ）中の損傷した感覚ニューロンと脊髄の間のインタクトな接続を必要とし、損傷したＤＲＧニューロンが、ミクログリアと連絡するシグナルを伝達する必要がある。

いくつかのグループは、ケモカインのＣＣＬ２及びＣＣＬ２１が損傷した感覚ニューロンとミクログリアの間の接続をもたらすと結論した。しかし、ミクログリアにおいて、主要なＣＣＬ２受容体であるＣＣＲ２の発現がなく、ＣＣＬ２は、感覚ニューロンと脊髄のミクログリアの間の接続をもたらすことができない。基礎条件下では、ミクログリアが主要なＣＣＬ２１受容体、ＣＣＲ７９を発現しないことも問題になる。ＣＣＬ２１はＣＸＣＲ３を標的にするが、この受容体は、ミクログリア、星状細胞中で発現しており、ニューロン中でさえも発現している。さらに、ＣＸＣＲ３の欠失は、神経損傷誘導性過敏症に影響を与えない。

したがって、損傷した感覚ニューロンとミクログリアの間のシグナルの伝達に関与する成分は、まだ解明されていない。

概要
本開示は、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーの生成の低下をもたらすために、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１つのメンバー遺伝子（例えば、ＣＳＦ１、ＤＡＰ１２）の標的破壊による神経障害性疼痛の治療のための方法及び組成物を提供する。したがって、本開示は以下の特徴を提供する。

特徴１．ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー、例えば、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）遺伝子（例えば、ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子）、ＤＡＰ１２遺伝子（例えばヒトＤＡＰ１２（ｈＤＡＰ１２）遺伝子）のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結されたニューロンプロモーター、例えば、三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターを含む、ポリヌクレオチド。

特徴２．上述のヌクレオチド配列への上述のエンドヌクレアーゼの結合が、後根神経節細胞などの神経細胞におけるＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバー（例えば、ｈＣＳＦ及び／またはｈＤＡＰ１２）遺伝子の発現を低下、低減、または排除する、特徴１に記載のポリヌクレオチド。

特徴３．上述のニューロンプロモーターが、ｈＳＹＮ１プロモーター、ＴＲＰＶ１プロモーター、Ｎａｖ１．７プロモーター、Ｎａｖ１．８プロモーター、Ｎａｖ１．９プロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びアドビリンプロモーターから成る群から選択されるＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターである、特徴１または２に記載のポリヌクレオチド。

特徴４．上述のＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子がｈＣＳＦ１遺伝子中のヌクレオチド配列であり、ｈＣＳＦ１遺伝子の調節領域、ｈＣＳＦ１のプロモーター、ｈＣＳＦ１の転写開始点、ｈＣＳＦ１のエクソン配列、ｈＣＳＦ１のイントロン配列、及びｈＣＳＦ１の５’または３’非翻訳領域から成る群から選択される、特徴１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

特徴５．上述のエンドヌクレアーゼが、上述のＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子（例えば、ｈＣＳＦ１またはｈＤＡＰ１２遺伝子）の上述のヌクレオチド配列に結合するように操作されたエンドヌクレアーゼである、特徴１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

特徴６．上述の操作されたエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）関連（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、またはメガＴＡＬヌクレアーゼである、特徴５に記載のポリヌクレオチド。

特徴７．上述のホーミングエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、またはＨＮＨエンドヌクレアーゼである、特徴６に記載のポリヌクレオチド。

特徴８．上述のホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−Ｏｎｕ Ｉ、Ｉ ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ Ｉ、Ｉ−Ｄｍｏ Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ、ＰＩ−Ｔ１１ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩＩ、ＨＯ、Ｐ１−Ｃｉｖ Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ Ｉ、ＰＩ−Ａａｅ Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ Ｉ、ＰＩ−Ｍａｙ Ｉ、ＰＩ−Ｍｃｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｌ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇｏ Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ Ｉ、ＰＩ−Ｍｋａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｌｅ Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｒｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ Ｉ、ＰＩ−Ｆａｃ Ｉ、ＰＩ−Ｍｊａ Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ Ｉ、ＰＩ−Ｔａｇ Ｉ、ＰＩ−Ｔｈｙ Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ Ｉ、またはＰＩ−Ｔｓｐ Ｉである、特徴６に記載のポリヌクレオチド。

特徴９．上述のＣａｓ９ヌクレアーゼが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、及びナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、特徴６に記載のポリヌクレオチド。

特徴１０．上述のＣａｓ９ヌクレアーゼが、ＨＮＨもしくはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインまたは上述のＨＮＨ及び上述のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメイン中に１つまたは複数の変異を含む、特徴９に記載のポリヌクレオチド。

特徴１１．上述の変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼがニッカーゼである、特徴１０に記載のポリヌクレオチド。

特徴１２．ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡにまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む、先行の特徴のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

特徴１３．上述のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、ヒトもしくはマウスのＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトもしくはマウスのＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターである、特徴１２に記載のポリヌクレオチド。

特徴１４．１対のオフセットｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含む、特徴１２に記載のポリヌクレオチド。

特徴１５．上述の一対のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが互いに約２５〜約１００ヌクレオチドだけオフセットされる、特徴１２〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

特徴１６．上述のエンドヌクレアーゼがＴＲＥＸ２ドメインを含む、先行の特徴のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

特徴１７．ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのｍＲＮＡ（例えば、ｈＣＳＦ１ ｍＲＮＡ及び／またはｈＤＡＰ１２ ｍＲＮＡ）に結合する阻害性ＲＮＡに作動可能に連結された、ＴＧＧまたはＤＲＧで作動可能なプロモーターなどのニューロンプロモーターを含む、ポリヌクレオチド。

特徴１８．上述のニューロンプロモーター、例えば、ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが誘導性プロモーターである、特徴１７に記載のポリヌクレオチド。

特徴１９．上述の誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトもしくはマウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトもしくはマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターを含む、特徴１８に記載のポリヌクレオチド。

特徴２０．上述のニューロンプロモーター、例えば、ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが、ｈＳＹＮ１プロモーター、ＴＲＰＶ１プロモーター、Ｎａｖ１．７プロモーター、Ｎａｖ１．８プロモーター、Ｎａｖ１．９プロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びアドビリンプロモーターから成る群から選択される、特徴１７に記載のポリヌクレオチド。

特徴２１．上述のポリヌクレオチドがＣｒｅリコンビナーゼに作動可能に連結されたＴＧＧまたはＤＲＧプロモーター及び上述の阻害性ＲＮＡに作動可能に連結されたＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸ誘導性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、特徴１７に記載のポリヌクレオチド。

特徴２２．上述の阻害性ＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはｐｉＲＮＡである、特徴１７〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

特徴２３．特徴１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

特徴２４．プラスミド系ベクターまたはウイルスベクターである、特徴２３に記載のベクター。

特徴２５．エピソームまたは非組込み型である、特徴２３または特徴２４に記載のベクター。

特徴２６．上述のウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、特徴２５に記載のベクター。

特徴２７．上述のレトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、特徴２６に記載のベクター。

特徴２８．上述のＡＡＶが、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶ２４ＹＦから成る群から選択される血清型を含む、特徴２５に記載のベクター。

特徴２９．ＪΔＮＩ５、ＪΔＮＩ７及びＪΔＮＩ８から成る群から選択される血清型を含む、特徴２５に記載のベクター。

特徴３０．Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結されたｈＳＹＮ１プロモーターを含むポリヌクレオチド、及びＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡ（例えば、ｈＣＳＦ１遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡまたはｈＤＡＰ１２遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡ）に作動可能に連結されたＵ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、ベクター。

特徴３１．特徴１７〜３０のいずれか１項に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、神経障害性疼痛または中枢性疼痛の治療方法。

特徴３２．特徴１７〜３０のいずれか１項に記載のベクターを対象に投与することを含む、上述の対象に鎮痛をもたらす方法。

特徴３３．特徴１７〜３０のいずれか１項に記載のベクターを対象に投与することを含む、上述の対象のニューロン（例えば、ＴＧＧまたはＤＧＧ）におけるＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバー遺伝子（例えば、ｈＣＳＦ１遺伝子、ｈＤＡＰ１２遺伝子）の発現の低下方法。

特徴３４．特徴１７〜３０のいずれか１項に記載のベクターを上述の対象に投与することを含む、神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化の低減方法。

特徴３５．髄腔内のボーラス注射もしくは注入、神経節内注射、神経内注射、皮下注射、または脳室内注射によって上述のベクターが上述の対象に投与される、特徴３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。

特徴３６．ＤＲＧ導入のために、脊柱の複数のレベルでの髄腔内のボーラス注射または注入によって、上述のベクターが上述の対象に投与される、特徴３１〜３５に記載の方法。

特徴３７．上述のベクターが、単一の後根神経節、複数の後根神経節または三叉神経節中への直接的な神経節内注射によって上述の対象に投与される、特徴３１〜３５に記載の方法。

特徴３８．上述のベクターが、神経束（例えば、坐骨神経、三叉神経）中への神経内注射によって上述の対象に投与される、特徴３１〜３５に記載の方法。

特徴３９．上述のベクターが、末梢神経の末端（真皮下または内臓壁）での皮下注射によって上述の対象に投与される、特徴３１〜３５に記載の方法。

特徴４０．上述のベクターが、（三叉神経節導入のために）脳室内注射によって上述の対象に投与される、特徴３１〜３５に記載の方法。

特徴４１．上述の神経障害性疼痛が中枢神経障害性疼痛であり、上述のベクターが実質内投与、大槽内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与または定位的脳注射によって投与される、特徴３１〜１５に記載の方法。
[本発明1001]
ヒトコロニー刺激因子1（ｈＣＳＦ1）遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結された三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターを含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1002]
前記ヌクレオチド配列への前記エンドヌクレアーゼの結合が、後根神経節細胞におけるｈＣＳＦ遺伝子の発現を低下、低減、または排除する、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1003]
前記ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが、ｈＳＹＮ1プロモーター、ＴＲＰＶ1プロモーター、Ｎａｖ1．7プロモーター、Ｎａｖ1．8プロモーター、Ｎａｖ1．9プロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びアドビリンプロモーターから成る群から選択される、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1004]
前記ｈＣＳＦ1遺伝子中の前記ヌクレオチド配列が、ｈＣＳＦ1遺伝子の調節領域、ｈＣＳＦ1のプロモーター、ｈＣＳＦ1の転写開始点、ｈＣＳＦ1のエクソン配列、ｈＣＳＦ1のイントロン配列、及びｈＣＳＦ1の5’または3’非翻訳領域から成る群から選択される、本発明1001〜1003のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1005]
エンドヌクレアーゼが、前記ｈＣＳＦ1遺伝子の前記ヌクレオチド配列に結合するように操作されたエンドヌクレアーゼである、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1006]
前記操作されたエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）関連（Ｃａｓ9）ヌクレアーゼ、またはメガＴＡＬヌクレアーゼである、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1007]
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスエンドヌクレアーゼ、またはＨＮＨエンドヌクレアーゼである、本発明1006のポリヌクレオチド。
[本発明1008]
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ−Ｏｎｕ Ｉ、Ｉ ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ Ｉ、Ｉ−Ｄｍｏ Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ、ＰＩ−Ｔ11 Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩＩ、ＨＯ、Ｐ1−Ｃｉｖ Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ Ｉ、ＰＩ−Ａａｅ Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ Ｉ、ＰＩ−Ｍａｙ Ｉ、ＰＩ−Ｍｃｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｌ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇｏ Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ Ｉ、ＰＩ−Ｍｋａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｌｅ Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｒｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ Ｉ、ＰＩ−Ｆａｃ Ｉ、ＰＩ−Ｍｊａ Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ Ｉ、ＰＩ−Ｔａｇ Ｉ、ＰＩ−Ｔｈｙ Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ Ｉ、またはＰＩ−Ｔｓｐ Ｉである、本発明1006のポリヌクレオチド。
[本発明1009]
前記Ｃａｓ9ヌクレアーゼが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、本発明1006のポリヌクレオチド。
[本発明1010]
前記Ｃａｓ9ヌクレアーゼが、ＨＮＨもしくはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインまたは前記ＨＮＨ及び前記ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメイン中に1つまたは複数の変異を含む、本発明1009のポリヌクレオチド。
[本発明1011]
前記変異型Ｃａｓ9ヌクレアーゼがニッカーゼである、本発明1010のポリヌクレオチド。
[本発明1012]
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡにまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む、前記本発明のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1013]
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、ヒトもしくはマウスのＵ6 ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトもしくはマウスＨ1 ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターである、本発明1012のポリヌクレオチド。
[本発明1014]
1対のオフセットｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含む、本発明1011のポリヌクレオチド。
[本発明1015]
前記一対のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが互いに約25〜約100ヌクレオチドだけオフセットされる、本発明1012〜1014のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1016]
前記エンドヌクレアーゼがＴＲＥＸ2ドメインを含む、前記本発明のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1017]
ｈＣＳＦ1 ｍＲＮＡに結合する阻害性ＲＮＡに作動可能に連結された、ＴＧＧまたはＤＲＧで作動可能なプロモーター
を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1018]
前記ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが誘導性プロモーターである、本発明1017のポリヌクレオチド。
[本発明1019]
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトもしくはマウスＵ6 ｓｎＲＮＡプロモーター、ＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトもしくはマウスＨ1 ＲＮＡプロモーター、またはＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターを含む、本発明1018のポリヌクレオチド。
[本発明1020]
前記ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが、ｈＳＹＮ1プロモーター、ＴＲＰＶ1プロモーター、Ｎａｖ1．7プロモーター、Ｎａｖ1．8プロモーター、Ｎａｖ1．9プロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びアドビリンプロモーターから成る群から選択される、本発明1017のポリヌクレオチド。
[本発明1021]
Ｃｒｅリコンビナーゼに作動可能に連結されたＴＧＧまたはＤＲＧプロモーター及び前記阻害性ＲＮＡに作動可能に連結されたＬＯＸ−ｓｔｏｐ−ＬＯＸ誘導性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、本発明1017のポリヌクレオチド。
[本発明1022]
前記阻害性ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはｐｉＲＮＡである、本発明1017〜1021のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1023]
本発明1001〜1022のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1024]
プラスミド系ベクターまたはウイルスベクターである、本発明1023のベクター。
[本発明1025]
エピソームまたは非組込み型である、本発明1023または本発明1024のベクター。
[本発明1026]
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、本発明1025のベクター。
[本発明1027]
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、本発明1026のベクター。
[本発明1028]
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ9、ＡＡＶ6、ＡＡＶｒｈ10、ＡＡＶ7Ｍ8、及びＡＡＶ24ＹＦから成る群から選択される血清型を含む、本発明1026のベクター。
[本発明1029]
前記ＨＳＶベクターが、ＪΔＮＩ5、ＪΔＮＩ7、及びＪΔＮＩ8から成る群から選択される血清型を含む、本発明1025のベクター。
[本発明1030]
Ｃａｓ9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結されたｈＳＹＮ1プロモーターを含むポリヌクレオチド、及びｈＣＳＦ1遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡに作動可能に連結されたＵ6 ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1031]
本発明1023〜1030のいずれかのベクターを、それを必要とする対象に投与する段階を含む、神経障害性疼痛を治療する方法。
[本発明1032]
本発明1023〜1030のいずれかのベクターを対象に投与する段階を含む、前記対象に鎮痛をもたらす方法。
[本発明1033]
本発明1023〜1030のいずれかのベクターを対象に投与する段階を含む、前記対象のＴＧＧまたはＤＧＧにおけるｈＣＳＦ1発現を低下させる方法。
[本発明1034]
本発明1023〜1030のいずれかのベクターを対象に投与する段階を含む、神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化を低減する方法。
[本発明1035]
髄腔内のボーラス注射または注入、神経節内注射、神経内注射、皮下注射、または脳室内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1031〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
ＤＲＧ導入のために、脊柱の複数のレベルでの髄腔内のボーラス注射または注入によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
単一の後根神経節、複数の後根神経節、または三叉神経節中への直接的な神経節内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1035の方法。
[本発明1038]
神経束（例えば、坐骨神経、三叉神経）中への神経内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1035の方法。
[本発明1039]
末梢神経の末端（真皮下または内臓壁）での皮下注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1035の方法。
[本発明1040]
（三叉神経節導入のために）脳室内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、本発明1035の方法。

図１Ａ〜Ｇは、末梢神経損傷後のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１誘導の影響を示す図である。 図１Ｈ〜Ｌは、末梢神経損傷後のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１誘導の影響を示す図である。 図１Ｍ〜Ｏは、末梢神経損傷後のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１誘導の影響を示す図である。 図２Ａ〜Ｄは、末梢神経損傷後のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１誘導の影響を示す図である。 図２Ｅ〜Ｈは、末梢神経損傷後のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１誘導の影響を示す図である。 図３Ａ〜Ｄは、神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性の機械的過敏症に対してＤＡＰ１２が必要であることを示す図である。 図４Ａ〜Ｅは、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおいて、ベースラインの運動及び疼痛行動が損なわれておらず、ＤＲＧニューロンにおけるＳＮＩ誘導性デノボＣＳＦ１発現が保持されることを示す図である。 図５Ａ〜Ｇは、神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性のミクログリア遺伝子誘導に対してＤＡＰ１２が必要であるが、ミクログリア増殖に対しては必要でないことを示す図である。 自体損傷表現型へのＤＡＰ１２の寄与を示す図である。 ミクログリアで発現豊富な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）遺伝子は神経損傷後の後索で誘導されるが、単球特異的遺伝子は誘導されないことを示す図である。 図８Ａ〜Ｅは、末梢神経損傷がミクログリア増殖を誘導することを示す図である。 図９Ａ〜Ｄは、後角における神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性のミクログリア増殖がＤＡＰ１２非依存性であることを示す図である。 図１０Ａ〜Ｋは、損傷した運動ニューロンにおける神経損傷誘導性のＣＳＦ１発現が前角のミクログリア活性化に必要とされることを示す図である。 損傷した運動ニューロンにおけるＡＴＦ３とＣＳＦ１の共発現を示す図である。 図１２Ａ〜Ｃは、ＣＳＦ１が損傷した運動ニューロンでアップレギュレートされ、脊髄の前角における神経損傷誘導性のミクログリア活性化及び増殖に必要とされることを示す図である。 損傷した感覚ニューロンの神経損傷誘導性ＣＳＦ１がネスチン−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌマウスで保持されることを示す図である。 損傷した感覚ニューロンにおけるＣＳＦ１のデノボ発現が、神経障害性疼痛に寄与する、ミクログリアのＤＡＰ１２依存的遺伝子の誘導を誘発することを示す概略図である。 損傷した感覚ニューロンにおけるデノボＣＳＦ１発現が、ミクログリアのＤＡＰ１２非依存性自己複製及び神経障害性疼痛表現型に寄与するミクログリア遺伝子のＤＡＰ１２依存性アップレギュレーションを誘発することを示す概略図である。 図１６Ａ〜Ｂは、ＣＳＦ１誘導性過敏症に対するミノサイクリンの効果（図１６Ａ）、およびＰ２Ｘ４変異型マウスにおける髄腔内ＣＳＦ１誘導性の機械的過敏症（図１６Ｂ）を示す図である。

詳細な説明
本発明の実施は、そうでないと特に示されない限り、当技術分野の範囲内である、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学及び細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは、例示の目的で以下に記載される。そのような技法は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）を参照されたい。

本明細書で引用するすべての刊行物、特許出願及び登録特許は、個々の刊行物、特許出願または登録特許のそれぞれが、参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

理解を明瞭にする目的で例示及び例として前述の発明をある程度詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲内から逸脱することなく、それらにある種の変更及び修正を行うことができることが、本発明の教示に照らせば、当業者に容易に明らかになるであろう。以下の例は、例示のためのみに提供され、限定のために提供されるものではない。本質的に類似した結果を得るように変更または改変することができる様々な重要でないパラメーターを当業者なら容易に認識するであろう。

別段規定されない限りは、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本発明において、次の用語を以下に定義する。

冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、冠詞の文法上の対象物の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１要素」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「約」または「およそ」は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。特定の実施形態では、用語「約」または「およそ」は、数値の前にある場合、その値プラスまたはマイナス１５％、１０％、５％または１％の範囲を示す。

本明細書全体にわたって、文脈上別段必要でない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するものであり、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除を意味するものではないと理解される。「から成る」は、フレーズ「から成る」に続くものはなんでも含み、且つそれらに限定されることを意味する。したがって、フレーズ「から成る」は、列挙される要素が必要とされるか、必須であること、及び他の要素は存在することができないことを示す。「から本質的に成る」は、このフレーズの後に列挙される任意の要素を含み、且つ列挙される要素について本開示で特定される活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、フレーズ「から本質的に成る」は、列挙される要素が必要とされるか、必須であるが、他の要素は随意でなく、これらが列挙される要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在してもしなくてもよいことを示す。

「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連実施形態」、「ある種の実施形態」、「追加的な実施形態」もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの本明細書全体にわたる言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述のフレーズの出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及するとは限らない。さらに、特定の特徴、構造または特性を、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方式で組み合わせることができる。

したがって、本明細書で論じる発見を考慮すると、例えばＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー（例えば、ＣＳＦ１、ＣＳＦＲ１またはＤＡＰ１２の少なくとも１つ）の発現を低下させるための、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の標的化は、神経障害性疼痛の薬理学的管理に対して、及び潜在的には、多くの末梢神経損傷誘導性ニューロン機能変化に対しても、新規なアプローチを提供する。

したがって、本開示は、神経障害性疼痛を有するか神経障害性疼痛の危険性がある対象において神経障害性疼痛を治療または予防するために、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバー遺伝子（例えば、ＣＳＦ１、ＤＡＰ１２）の標的破壊をもたらすための組成物及び方法を提供する。

さらに、本明細書によって明らかなように、損傷後に誘導されるＣＳＦ１の末梢性及び中枢性輸送が存在するので、ＣＳＦ１は、末梢の神経損傷（神経腫）部位へのマクロファージの動員において役割を果たすことができる。したがって、ＣＳＦ１の標的破壊は、治療を必要としている対象にＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子（例えば、ＣＳＦ１（例えば、ｈＣＳＦ１）、ＤＡＰ１２、（例えば、ｈＤＡＰ１２）のモジュレーターを投与することによって末梢神経損傷部位へのマクロファージの動員を低減させる方法を提供することもできる。

ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーの発現をモジュレートするための組成物
本開示で意図される神経障害性疼痛を治療するための組成物は、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバー（例えば、ＣＳＦ１、ＤＡＰ１２）を標的にするための核酸組成物を含む。例えば、そのような組成物は、例えば、（例えば、標的遺伝子をコードする遺伝子のすべてもしくは一部を効果的に欠失させるための）ゲノム編集、標的タンパク質をコードするＲＮＡの生成を阻害すること、及び／または標的タンパク質をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することによって、標的遺伝子の発現阻害をもたらすことができる。本明細書に記載のように効果的に遺伝子を標的にしてその発現を低下させるためのそのような組成物を作製及び使用するために、様々なツールが利用可能である。さらに、哺乳類のＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子（例えば、ヒトＣＳＦ−１、ヒトＤＡＰ１２）の配列が、当技術分野で利用可能であり、特異的に遺伝子または目的物を標的にするようにプラットフォームを適合させる方法も同様である。以下で開示されるようなＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバーの標的化で使用するための組成物は、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のモジュレーターと本明細書で言及され得る。

特定の実施形態では、ニューロンプロモーターを含むポリヌクレオチドが提供され、これは、ニューロン特異的プロモーターでもよい。プロモーターは、例えば、末梢神経障害性疼痛または中枢神経障害性疼痛の治療で使用するために、治療されるニューロンのタイプに従って選択することができる。例えば、ニューロンプロモーターは、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバー遺伝子（例えば、ＣＳＦ１遺伝子、ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子、ヒトＤＡＰ１２遺伝子）中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結された、三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターでもよい。

ニューロンで作動可能なプロモーター配列の他の例としては、限定されないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照されたい）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照されたい）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照されたい）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７−１９を参照されたい）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照されたい）；チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：２３６３−２３８４（１９８７）及びＮｅｕｒｏｎ ６：５８３−５９４（１９９１）を参照されたい）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２−３４０６（１９９１）を参照されたい）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３−２２６（１９９０）を参照されたい）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８−３６５２（１９８８）を参照されたい）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３−３８０５（１９８８）を参照されたい）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；ならびにＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−βプロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２−６０を参照されたい）が挙げられる。ニューロン特異的プロモーター及び他の制御エレメント（例えば、エンハンサー）を含む、ニューロンで作動可能なプロモーターは当技術分野で既知である。

本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ポリヌクレオチドとしては、限定されないが、以下が挙げられる：プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡまたは組換えＤＮＡ。

ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態において、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００または少なくとも１５０００またはそれ以上のヌクレオチド長、及びすべての中間の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この文脈における「中間の長さ」は、示された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することは、容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは変異体は、本明細書に記載のまたは当技術分野で既知の参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、一般的には、この場合、変異体は参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する。

本明細書で使用する場合、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、そのフラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。特定の実施形態では、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在せず、人間の手によって作製された、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドを指す。

ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）及び３’（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向でアノテートされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、５’から３’の鎖は、「センス」、「プラス」または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用する場合、用語「逆方向」は、３’から５’方向で書かれた５’から３’の配列または５’から３’の方向で書かれた３’から５’の配列を指す。

用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対合則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、左に５’末端及び右に３’末端を有する逆相補鎖、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エクソンなどを含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。特定の実施形態では、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするゲノム配列とポリヌクレオチド配列が同一であるかどうかに関係なく、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。

「の転写を調節するゲノム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ）」または「転写を調節するゲノム配列または（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｒ）」は、遺伝子の転写と関連するポリヌクレオチド配列を指す。

一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、限定されないが、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイムまたは別の阻害性ＲＮＡを含めた阻害性ポリヌクレオチドを含む。

一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。これらのＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムの一部であり、このシステムは、哺乳類のゲノム工学に使用することができる、細菌性システムに基づいて最近作り出されたヌクレアーゼシステムである。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３−８２６；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３−１１８３；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１；Ｄａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８（１１）：２２８１−２３０８；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０２５０９７号；第ＷＯ２００８０２１２０７号；第ＷＯ２０１００１１９６１号；第ＷＯ２０１００５４１０８号；第ＷＯ２０１００５４１５４号；第ＷＯ２０１２０５４７２６号；第ＷＯ２０１２１４９４７０号；第ＷＯ２０１２１６４５６５号；第ＷＯ２０１３０９８２４４号；第ＷＯ２０１３１２６７９４号；第ＷＯ２０１３１４１６８０号；第ＷＯ２０１３１４２５７８号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００９３６１７号；第ＵＳ２０１３００１１８２８号；第ＵＳ２０１００２５７６３８号；第ＵＳ２０１０００７６０５７号；第ＵＳ２０１１０２１７７３９号；第ＵＳ２０１１０３００５３８号；第ＵＳ２０１３０２８８２５１号；第ＵＳ２０１２０２７７１２０号；及び米国特許第ＵＳ８５４６５５３号（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、標的ポリヌクレオチド配列中に二本鎖切断を導入するのに使用することができ、この切断は、ポリヌクレオチド鋳型、例えばＤＮＡ鋳型の非存在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはポリヌクレオチド修復鋳型の存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち、相同組換えによって、修復され得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ニッカーゼとして操作することもでき、これは一本鎖ＤＮＡ切断を生成し、この切断は、細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または修復鋳型の存在下での相同組換えを使用して修復され得る。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を破壊する小さな挿入及び欠失を形成することが多いエラーを起こしやすいプロセスである。相同組換えは、修復のための鋳型として相同なＤＮＡを必要とし、相同組換えを活用して、標的に対して相同性を有する配列がいずれかの側に隣接する所望の配列を含む供与ＤＮＡの導入によって特定される、無限の様々な改変を起こすことができる。一実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に向けられる場合、切断されたゲノム配列末端のＮＨＥＪは、正常なポリペプチド、機能欠損型もしくは機能獲得型ポリペプチド、または機能的ポリペプチドのノックアウトをもたらすことができる。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡ発現を調節するシス作用配列をコードするポリヌクレオチド配列に向けられる場合、ゲノム配列のＮＨＥＪは、ｍＲＮＡ及びポリペプチドの発現の増加、発現の低下または発現の完全な喪失をもたらすことができる。

本明細書で使用する場合、用語「ｃｒＲＮＡ」は、標的ポリヌクレオチド配列（プロトスペーサーモチーフと本明細書で言及する）に対する部分的なまたは完全な相補性領域（「スペーサーモチーフ」と本明細書で言及する）を含む、ＲＮＡを指す。一実施形態では、プロトスペーサーモチーフは２０ヌクレオチドの標的配列である。特定の実施形態では、プロトスペーサーモチーフは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のヌクレオチドである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、様々な長さのプロトスペーサー標的配列が異なる細菌種に認識されることが考えられる。

一実施形態では、相補性領域は、プロトスペーサー配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。関連する実施形態では、相補性領域中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上のポリヌクレオチドがプロトスペーサーモチーフに対して同一である。好ましい実施形態では、プロトスペーサーモチーフの最も３’側の配列の少なくとも１０個がｃｒＲＮＡ配列に対して相補的である。

本明細書で使用する場合、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、部分的相補性領域を介してｃｒＲＮＡ配列と結合するトランス活性化ＲＮＡを指し、プロトスペーサーモチーフにＣａｓ９ヌクレアーゼを動員する働きをする。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは約８５ヌクレオチドの長さである。

一実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と本明細書で言及する１つのポリヌクレオチド配列中に操作される。ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを導いて、任意の所望のプロトスペーサーモチーフを標的にするように、操作される。一実施形態では、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分は、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のヌクレオチドの長さになるように操作される。

プロトスペーサーモチーフは、Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体の動員において役割を果たす短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接している。Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、特定のＣａｓ９ポリペプチドに特異的な特定の３’ＰＡＭ配列が隣接する二本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的にする及び切断することができる。バイオインフォマティクスを使用して、または実験的アプローチを使用して、ＰＡＭを特定することができる。Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６−１１２１（その内容全体を参照により本明細書に組み込む）。

本明細書で使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」は、動物において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する、短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９；Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１；及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。ある種の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１鎖及び第２鎖を含む。しかし、第１鎖及び第２鎖はオフセットされ、その結果、第１鎖及び第２鎖の２つの末端ヌクレオシドは相補鎖の残基と対合しない。場合によっては、対合しない２つのヌクレオシドはチミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介することができるように、標的遺伝子に対して十分な相同性領域を含むべきであり、且つヌクレオチドの点から十分な長さであるべきである。したがって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的な領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的の間に完全な相補性がある必要はないが、一致は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などによって配列特異的サイレンシングを導くことを可能にするのに十分である必要がある。標的鎖との相補性または相同度が、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性が所望されることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して１つまたは複数の、好ましくは１０、８、６、５、４、３、２またはそれ以下のミスマッチを含む。ミスマッチは末端領域で最も許容され、存在する場合は、好ましくは、末端領域、または例えば、５’及び／もしくは３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内の領域に存在する。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖性状を維持するのに十分なほどアンチセンス鎖と相補的である必要があるだけである。ｓｉＲＮＡの各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ヌクレオチドの長さ以下でもよい。鎖は、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチドの長さである。例えば、各鎖は２１から２５ヌクレオチドの長さの間でもよい。好ましいｓｉＲＮＡは、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド対の二本鎖領域及び２〜３ヌクレオチドの１つまたは複数の突出、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’突出を有する。

本明細書で使用する場合、用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、一般的には、プレｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドの折り返し型ＲＮＡ前駆体構造体から切り取られる、２０〜２２ヌクレオチドの小分子非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度に応じて、２つの方法のうちの１つでその標的を負に調節する。第１に、タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に完全なまたはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。そのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補的部位に結合することによってその調節作用を発揮するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと類似している、またはおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体を介して、明らかに翻訳レベルで転写後に標的遺伝子の発現を抑制する。翻訳制御と矛盾せず、このメカニズムを使用するｍｉＲＮＡはその標的遺伝子のタンパク質レベルを低減させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限にしか影響を受けない。ｍｉＲＮＡは、任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的にすることができる、天然に存在するｍｉＲＮＡ及び人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写産物として発現する低分子ヘアピン型ＲＮＡコンストラクトを設計することができる。この設計は、ドローシャプロセシング部位をヘアピンコンストラクトに加え、ノックダウン効率を非常に増大することを示した（Ｐｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ヘアピンのステムは２２−ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に対して完全な相補性を有する）及びヒトｍｉＲ由来の１５〜１９−ｎｔのループから成る。ヘアピンのいずれかの側または両側にｍｉＲループ及びｍｉＲ３０隣接配列を加えると、マイクロＲＮＡを有さない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較した場合、発現したヘアピンのドローシャ及びダイサーのプロセシングが１０倍を越えて増大する。ドローシャ及びダイサーのプロセシングの増大は、より多くのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの生成及び発現したヘアピンに対するより大きな効力につながる。

本明細書で使用する場合、用語「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」は、一本の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造物を指す。標的遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかの部分と同一のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡコンストラクトが、阻害に好ましい。標的配列と比較して挿入、欠失及び単一の点変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが見出された。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部の間が、９０％を越える配列同一性、または１００％の配列同一性でさえも好ましい。ある種の好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの二本鎖形成部分の長さは、少なくとも２０、２１または２２ヌクレオチドの長さであり、例えば、ダイサー依存的切断によって生成されるＲＮＡ産物にサイズが対応する。ある種の実施形態では、ｓｈＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基の長さである。ある種の実施形態では、ｓｈＲＮＡコンストラクトは４００〜８００塩基の長さである。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ループ配列及びループサイズのばらつきに非常に許容性がある。

本明細書で使用する場合、用語「リボザイム」は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断ができる、触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。いくつかのサブタイプが述べられており、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム及びヘアピンリボザイムである。非触媒性塩基のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって、リボザイムの触媒活性及び安定性を向上させることができる。部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを特定のｍＲＮＡを破壊するのに使用することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決まる位置でｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡが２塩基の以下の配列：５’−ＵＧ−３’を有することが唯一の要件である。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び生成は当技術分野で周知である。

当技術分野で既知且つ利用可能な十分に確立されている様々な技法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドを調製、操作及び／または発現することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクター中に挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自律複製配列及び転位因子である。さらなる例示的ベクターとしては、限定はされないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例は、限定はされないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含める）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞での発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞でのレンチウイルス媒介性遺伝子導入及び発現用のｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞でキメラタンパク質を発現するために、本明細書に開示されるキメラタンパク質のコード配列をそのような発現ベクター中に連結することができる。

発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」または「調節配列」は、転写及び翻訳を行うために宿主の細胞タンパク質と相互作用する、ベクターの非翻訳領域（複製開始点、選抜カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガノ配列またはコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域）である。このようなエレメントは、その強さ及び特異性が様々であり得る。利用するベクターシステム及び宿主に応じて、遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターを含めた、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを使用することができる。

用語「作動可能に連結された」は、記載される成分が、その意図された方式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここでは、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を導く。一実施形態では、用語「阻害性ＲＮＡに作動可能に連結された」及び「阻害性ＲＮＡの鋳型として使用されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された」または同義語は、互換的に使用される。

本明細書で使用する場合、「条件発現」は、限定されないが、誘導性発現；抑制性発現；特定の生理的状態、生物学的状態または病態を有する細胞または組織における発現などを含めた、任意のタイプの条件発現を指すことができる。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を除外することを意図しない。本発明のある種の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件発現を提供し、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドを発現させる、または目的のポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドの発現を増大もしくは低下させる処理または条件にかけることによって、発現が制御される。

誘導性プロモーター／システムの実例としては、限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のためのプロモーター（対応するホルモンによる処理によって誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属による処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節性システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クマート誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節システムなどが挙げられる。

条件発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。本発明のある種の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのために、少なくとも１つの（一般的には２つの）部位（複数可）を含む。本明細書で使用する場合、用語「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」は、１箇所もしくは複数箇所の組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所もしくはそれ以上）を含む組換え反応に関与する、切り出し型もしくは組込み型タンパク質、酵素、補助因子もしくは関連タンパク質（これらは、野生型タンパク質でもよい）（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの突然変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはそのフラグメントを含む融合タンパク質）、フラグメント及び変異体を含む。本発明の特定の実施形態での使用に適するリコンビナーゼの実例としては、限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥｌ及びＰａｒＡが挙げられる。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現することになるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、それにより、翻訳効率の増大に寄与する。一般に認められているポリアデニル化部位は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）または当技術分野で既知の別の適切な異種性もしくは内在性のポリＡ配列を含む。

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、以下の例示的リストの細菌種から得られるＣａｓ９ポリペプチドである。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・イタリカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ガロリチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マセドニクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・パステウリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・サブフラバ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｕｂｆｌａｖａ）、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・サリヴァリゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・アコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・マツルショッティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、))トレポネーマ・ビンセンティ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、トレポネーマ・ファゲデニス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ）、及びトレポネーマ・デンティコーラ。

Ｃａｓ９ポリペプチドは、特定のＣａｓ９ポリペプチドに特異的な特定の３’ＰＡＭ配列が隣接する二本鎖ポリヌクレオチド配列を標的にする。各Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、一方の鎖のＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨとＲｕｖＣエンドヌクレアーゼの両方に相同なドメインを天然に含む。ＨＮＨ及びＲｕｖＣ様ドメインは、それぞれ、二本鎖ＤＮＡ標的配列の一方の鎖の切断に関与する。Ｃａｓ９ポリペプチドのＨＮＨドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ポリペプチドのＲｕｖＣ様ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに非相補的なＤＮＡ鎖を切断する。

一実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のＴＡＬＥドメインを含むＴＡＬＥＮである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、宿主植物において遺伝子発現をモジュレートするために及び細菌のコロニー形成及び生存を助長するために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの多数の種によって分泌される、天然のＩＩＩ型エフェクタータンパク質である（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ ２０１０；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ２０１０）。ＴＡＬＥの最近の研究によって、ＴＡＬＥの反復領域をその標的ＤＮＡ結合部位と連結するエレガントなコード（ｅｌｅｇａｎｔ ｃｏｄｅ）が明らかにされた（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９）。主に３３または３４アミノ酸のセグメントのタンデムリピートから成る、タンパク質の中央内の高度に保存され且つ反復した領域が、ＴＡＬＥの全ファミリーによく見られる。反復モノマーは、主にアミノ酸位置１２及び１３（反復可変二残基）において互いに異なり、最近のコンピューター的及び機能的解析によって、位置１２及び１３のアミノ酸のユニークな対とＴＡＬＥ結合部位中の対応するヌクレオチドとの間の強い相関が明らかにされた（ＮＩ対Ａ、ＨＤ対Ｃ、ＮＧ対Ｔ、ＮＮ対Ｇ（及びより低い程度のＡ））（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１１）。

一実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼが所望の核酸標的配列に結合するのを可能にするように、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失を用いて設計または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼである。操作され得るホーミングエンドヌクレアーゼの実例としては、限定されないが、Ｉ−Ｏｎｕ Ｉ、Ｉ ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ Ｉ、Ｉ−Ｄｍｏ Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ、ＰＩ−Ｔ１１ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩ、Ｉ−Ｓｃｅ ＩＩＩ、ＨＯ、Ｐ１−Ｃｉｖ Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ Ｉ、ＰＩ−Ａａｅ Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ Ｉ、ＰＩ−Ｍａｙ Ｉ、ＰＩ−Ｍｃｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｌ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｇｏ Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ Ｉ、ＰＩ−Ｍｋａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｌｅ Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｍ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ Ｉ、ＰＩ−Ｒｍａ Ｉ、Ｐｌ−Ｓｐｂ Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ Ｉ、ＰＩ−Ｆａｃ Ｉ、ＰＩ−Ｍｊａ Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ Ｉ、ＰＩ−Ｔａｇ Ｉ、ＰＩ−Ｔｈｙ Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ ＩまたはＰＩ−Ｔｓｐ Ｉが挙げられる。

一実施形態では、エンドヌクレアーゼはＺＦＮである。ＺＦＮは、１つまたは複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び１つのエンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋ Ｉを含む。その標的に対して高親和性を有する（例えば、好ましくは約２５ｎＭ未満のＫｄを有する）１種または複数のジンクフィンガータンパク質を操作するのに、次いで使用することができるいくつかの方法が、当技術分野で既知である。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを、遺伝子座中の任意の適切な標的部位に高親和性で結合するように設計または選択することができる。ＷＯ００／４２２１９は、選択された標的部位に対するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むＡＴＰの設計、構築及び発現の方法を包括的に記載している。各ジンクフィンガーは、およそ３ｂｐのＤＮＡを認識する。一実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、３、６、９、１２、１５、１８、２１または２４またはそれ以上のｂｐのＤＮＡを認識するように設計することができる。所与の３ｂｐのＤＮＡ標的配列に対するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン候補が特定されており、対応する複合ＤＮＡ標的配列を標的にするマルチフィンガーペプチド中に複数のドメインを連結するためのモジュール組み立てストラテジーが考案されている。当技術分野で既知の他の適切な方法も、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計及び構築するのに使用することができ、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター／合理的設計、親和性選抜、ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築などである（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２：３４４−３４８（１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；Ｒｅｂａｒ ＆ Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３（１９９４）；Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）；Ｃｈｏｏ ＆ Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ８９：７３４５−７３４９（１９９２）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２：９７５２−９７５６（１９９５）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：５５２５−５５３０（１９９７）；Ｇｒｉｅｓｍａｎ ＆ Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６６１（１９９７）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照されたい）。

特定の実施形態での使用に適した例示的レトロウイルスとしては、限定されないが、以下が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））及びレンチウイルス。

本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルス」は、複雑なレトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、限定されないが、以下が挙げられる：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含める）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が好ましい。

レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターを本発明の特定の実施形態の実施において使用することができる。したがって、本明細書で使用する場合、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」は、それぞれ、「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むことが意図される。

当業者に明らかなように、用語「ウイルスベクター」は、一般的には、核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム中への組込みを助長するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移行プラスミド）または核酸移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを言及するのに広く使用される。ウイルス粒子は、一般的には様々なウイルス成分を含み、核酸（複数可）に加えて宿主細胞成分も含むこともある。

様々な実施形態では、本明細書で意図されるベクターは、非組込みまたは組込み欠陥レトロウイルスを含む。一実施形態では、「組込み欠陥」レトロウイルスまたはレンチウイルスは、宿主細胞のゲノムにウイルスゲノムを組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレトロウイルスまたはレンチウイルスを指す。様々な実施形態では、インテグラーゼタンパク質を、そのインテグラーゼ活性を特異的に低下させるように変異させる。組込み能力がないレンチウイルスベクターは、インテグラーゼタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子を改変して、組込み欠損型インテグラーゼをコードする変異ｐｏｌ遺伝子を生成することによって得られる。このような組込み能力がないウイルスベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されている。

インテグラーゼ活性を低減させるのに適したＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子中の例示的変異は、限定されないが、以下が挙げられる：Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ及びＫ２６４Ｈ。２３．請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、第２のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの存在に細胞中での増殖を依存する、小さな（約２６ｎｍ）複製欠陥性の無エンベロープウイルスである。ＡＡＶは疾患を引き起こすことが知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。これらの特徴から、ＡＡＶは、遺伝子療法用のウイルスベクターを作出するための非常に魅力的な候補になる。ある種の実施形態では、神経系の細胞に感染するのに有効な血清型を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ７Ｍ８及びＡＡＶ２４ＹＦから成る群から選択される血清型を含む。

本発明の「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、一般的には、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列ならびに５’及び３’ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）から構成される。カプシドタンパク質中にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列にとって異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞でその導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にする方法で調節成分に作動可能に連結される。

ベクターのＡＡＶ配列は、一般的には、シス作用性５’及び３’逆位末端配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に全配列が該分子で使用されるが、この配列のある程度の軽微な改変は許容される。このＩＴＲ配列を改変する能力は当技術分野の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの教科書を参照されたい）。本発明で用いられるそのような分子の例は、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントに５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳類のＡＡＶ型を含めた任意の既知のＡＡＶから得ることができる。

一実施形態では、Ｃａｓ９ ｃＤＮＡを含むＡＡＶは、一本鎖のＡＡＶベクターとしてパッケージングされる。別の実施形態では、二重ＡＡＶベクターシステムが使用され、このシステムでは、Ｃａｓ９ ｃＤＮＡが二分割され、スプライシング（トランススプライシング）、相同組換え（オーバーラッピング）またはそれら２つの組み合わせ（ハイブリッド）のいずれかによって、２つのＡＡＶベクターがＣａｓ９遺伝子を再構成する。二重ＡＡＶトランススプライシングストラテジーでは、スプライス供与（ＳＤ）シグナルは５’側半分のベクターの３’末端に配置され、スプライス受容（ＳＡ）シグナルは３’側半分のベクターの５’末端に配置される。二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染及び二分割体の逆位末端配列（ＩＴＲ）媒介性ヘッドトゥーテールコンカテマー化の際に、トランススプライシングによって、成熟ｍＲＮＡ及びフルサイズのタンパク質が生成される（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。トランススプライシングは、筋肉及び網膜で大きな遺伝子を発現するのに首尾よく使用されている（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ，２００３；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ，２００５）。あるいは、二重ＡＡＶベクターに含まれる大きな導入遺伝子発現カセットの二分割体は、相同なオーバーラッピング配列（５’側半分のベクターの３’末端及び３’側半分のベクターの５’末端にある、二重ＡＡＶオーバーラッピング）を含むことができ、これは、相同組換えによる単一の大型ゲノムの再構成を媒介する（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ，２００１）。このストラテジーは、導入遺伝子オーバーラッピング配列の組換え誘導特性に依存する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２００６）。第３の二重ＡＡＶストラテジー（ハイブリッド）は、外来性遺伝子［すなわちアルカリホスファターゼ、ＡＰ（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２００８，２０１１）］由来の高度組換え誘導性領域をトランススプライシングベクターに加えることに基づく。加えられる領域は、二重ＡＡＶ間の組換えを増大させるために、５’側半分のベクターのＳＤシグナルの下流に及び３’側半分のベクターのＳＡシグナルの上流に配置される。

一実施形態では、ベクターはＨＳＶベースのウイルスベクターである。成熟したＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子から成るウイルスゲノムを有する包被された正２０面体のカプシドから成る。一実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、少なくとも１つの必須のＨＳＶ遺伝子が欠損している。当然ながら、このベクターは、代わりにまたは加えて、非必須の遺伝子について欠失され得る。一実施形態では、少なくとも１つの必須のＨＳＶ遺伝子が欠損しているＨＳＶベースのウイルスベクターは複製欠損性である。ほとんどの複製欠損性のＨＳＶベクターは、複製を妨げるために、１つまたは複数の中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）、初期または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７及びそれらの組み合わせから成る群から選択される前初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期のＤＮＡ発現、及び２５ｋｂまでの外来性ＤＮＡインサートを収容するその大型ウイルスＤＮＡゲノムをもたらすことができる、潜伏段階へ入る能力である。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号及び第５，８０４，４１３号ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号及び第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されている。好ましくは、ＨＳＶベクターは「多重欠損性」であり、これは、ＨＳＶベクターが、ウイルス複製に必要とされる１つより多くの遺伝子機能を欠損していることを意味する。

一実施形態では、ＨＳＶベクターはＪΔＮＩ５、ＪΔＮＩ７及びＪΔＮＩ８から成る群から選択される血清型を含む。

様々な因子、例えば、投与の部位及び経路、送達されるその組成物などに従って対象に送達するために、本明細書に開示される組成物を製剤化することができる。

製剤、キット及び治療方法
ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の少なくとも１メンバーの標的化において使用するために含む治療用組成物も提供される。そのような組成物は、一般的には、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーター及び医薬的に許容可能な担体を含む。

そのような組成物は、治療有効量の、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターを含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」または「有効量」は、細胞、組織または対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）に単独でまたは別の治療剤と組み合わせて投与される場合、例えば神経障害性疼痛の危険性があるか神経障害性疼痛を有する、治療を必要としている対象において、神経障害性疼痛を予防または改善するのに有効な、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターの量を指す。治療有効量は、さらに、神経障害性疼痛の症状の完全なまたは部分的な改善をもたらすのに十分である、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターの量を指す。治療有効量は、さらに、対象において鎮痛を、例えば、治療を必要としている対象において局部的及び／または全身的鎮痛をもたらすのに十分である、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターの量を指す。治療有効量は、さらに、例えば、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターでの治療前と比較して、対象において神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化を低減させるのに十分である、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターの量を指す。

本開示に照らせば、様々な医薬組成物及びそれらの調製及び使用に関する技法が当業者に既知である。適切な薬理学的組成物及びその投与技法の詳細なリストについては、本明細書の詳細な教示を参照することができ、この教示は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５；Ｂｒｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００５；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ｅｄｓ．），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５；及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ｅｄｓ．），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００８などの教科書によってさらに補足され得る。

開示する治療用組成物は、医薬的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材、すなわち、担体をさらに含む。これらの担体は、体のある器官または領域から体の別の器官または領域へ主題のモジュレーターを輸送するのに関与する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害でないという意味で「許容可能」であるべきである。

本開示の別の態様は、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターの投与を行うためのキットに関する。

本開示は、対象において神経障害性疼痛を治療する方法、及びそうした方法で使用するための、本明細書で開示される製剤、すなわちＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターも提供する。そうした方法は、一般に、上で開示したＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーター、例えば、ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子中のヌクレオチド配列またはＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路の別のメンバー遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結されたニューロン特異的プロモーター（例えば、三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーター）を含むポリヌクレオチドを、必要とする対象に投与することを含む。

治療に適した対象としては、神経障害性疼痛を有するか神経障害性疼痛の危険性がある任意の対象が挙げられる。対象としては、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の両方、例えば、霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどを含めた哺乳動物が挙げられる。

本開示の方法は、例えば、神経障害性疼痛の危険性があるか神経障害性疼痛を有する、治療を必要としている対象において、神経障害性疼痛を予防または改善するのに有効な量でＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターを投与することを含む。そうした方法は、神経障害性疼痛の症状の完全なまたは部分的な改善をもたらすことができる。そうした方法は、治療を必要としている対象において鎮痛を、例えば、局部的及び／または全身的鎮痛をもたらすことができる。本方法は、例えば、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターでの治療前と比較して、対象において神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化を低減させることができる。

ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、任意の適切な経路によって、例えば、髄腔内のボーラス注射または注入、神経節内注射、神経内注射、皮下注射または脳室内注射によって、投与することができる。例えば、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターがＤＲＧに送達されることになる場合、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、例えば、脊柱の複数のレベルでの髄腔内のボーラス注射または注入によって、対象に投与することができる。ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、単一の後根神経節、複数の後根神経節または三叉神経節中に直接的に神経節内注射することによって、対象に投与することができる。例えば、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーは、神経束（例えば、坐骨神経、三叉神経）中への神経内注射によって、対象に投与することができる。別の例では、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、末梢神経の末端（真皮下または内臓壁）での皮下注射によって、対象に投与される。別の例では、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、（三叉神経節導入のために）脳室内注射によって、対象に投与される。

中枢神経障害性疼痛の治療方法については、ＣＳＦ１−ＤＡＰ１２経路のメンバーのモジュレーターは、中枢神経系への送達、例えば、実質内投与、大槽内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、定位的脳注射などによって、必要とする対象に投与することができる。

概して、本明細書に開示される方法による治療を受けることができる対象は、神経障害性疼痛を有するか神経障害性疼痛の危険性がある。一般に、神経障害性疼痛は、末梢性または中枢神経系に影響を及ぼす損傷、障害または機能不全の結果である。神経障害性疼痛は、末梢神経系または中枢神経系（脳及び脊髄）の障害に起因し得る。神経障害性疼痛は、末梢神経障害性疼痛、中枢神経障害性疼痛または混合性（末梢性及び中枢性）神経障害性疼痛に分けることができる。例えば、疼痛は損傷によって引き起こされ得るが、この損傷は、神経系への実際の損傷を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。例えば、神経は、腫瘍によって浸潤または圧迫され得、瘢痕組織によって絞扼され得、または感染によって炎症を起こし得る。疼痛は、熱傷性、電撃性または電気性ショックの性質を有することが多い。軽い接触などの無痛の刺激に起因する持続性の異痛、疼痛も、神経障害性疼痛の共通の特性である。

神経障害性疼痛の例としては、ヘルペス後（または帯状疱疹後）神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー、癌性疼痛の成因、幻肢痛、絞扼性神経障害（例えば、手根管症候群）及び末梢性神経障害（広汎性神経損傷）が挙げられる。神経障害性疼痛はまた、糖尿病ならびに慢性アルコール摂取、（多くの化学療法剤を含めた）毒物への暴露及びビタミン欠乏と関連し得る。

神経障害性疼痛と関連し得る状態の例としては、限定されないが、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、代謝疾患、例えば、糖尿病性神経障害（末梢性、限局性、近位性及び自律性のものを含める）、感染症、例えば、帯状疱疹、ヘルペス後神経痛、血管疾患、外傷、化学療法に起因する疼痛、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ、脊椎または背部の手術、切断後疼痛、中枢性疼痛症候群、ヘルペス後神経痛、幻肢、三叉神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、神経圧迫、卒中、脊髄損傷及び癌が挙げられる。一般に、疼痛につながる病変は侵害受容性経路を直接的に伴い得る。神経障害性疼痛はまた、特発性であり得る。

実験
材料及び方法
マウス系統
すべての動物実験はＵＣＳＦの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ）に従って行った。野生型ＢＬ６／Ｃ５７マウス及びＣＳＦ１Ｒ−ＥＧＦＰマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＤＡＰ１２ノックアウト、ＣＳＦ１ ｆｌ／ｆｌ、アドビリン−Ｃｒｅ及びＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅマウスは、以前に記載された。高（ＨＡ）及び低自体損傷（ＬＡ）ラットは、以前に記載したように飼育した。

手術及び髄腔内注射
神経障害性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルを使用した。簡単に述べると、２％イソフルランで麻酔した後、坐骨神経の腓腹枝及び浅腓骨枝を８−０絹製縫合糸で堅く結紮し、次いで、結紮に対して遠位側で横切し、脛骨神経は未処理のままにした。上に覆い被さる筋肉及び皮膚を縫合し、動物を回復させ、次いでホームケージに戻した。ＤＲＧから脊髄へのＣＳＦ１の輸送を解析するために、末梢神経損傷時にＬ４及びＬ５の後根を８−０絹製縫合糸で結紮した。髄腔内注射を前述のように行った。１０マイクロリットルの３ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ１（合計で３０ｎｇ）または４０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ１中和抗体（合計で４００ｎｇ）を髄腔内注射した。ＣＳＦ１誘導性のミクログリア増殖を研究するために、ＣＳＦ１を３日間毎日注射した。ＣＳＦ１誘導性のミクログリア遺伝子誘導を研究するために、ＣＳＦ１を２４時間以内に２回注射し、最初の注射から２４時間後に脊髄組織を収集した。

抗体
以下の抗体を使用した。ＡＴＦ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ウサギ、１：２０００）、ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、ラット、１：４００）、ＣＳＦ１（Ｒ＆Ｄ、ヤギ、１：１０００）、ＣＳＦ１Ｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＤｌｌｂ（Ａｂｃａｍ）、ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ）、ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、ニワトリ、１：２０００）、Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ、ウサギ、１：１０００）、ＮＰＹ（Ｊ．Ａｌｌｅｎから譲渡された、ウサギ、１：５０００）、ＰＫＣγ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏ、モルモット、１：１０，０００）。一次抗体を検出するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの適切なフルオロフォア結合二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、５５５、５９４、６４７）を使用した。ＤＲＧニューロン及びその突起中のＣＳＦ１の場所を突き止めるために、ブリッジ免疫染色（ｂｒｉｄｇｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）プロトコールを使用して、一次抗血清：抗ヤギビオチンＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８または５９４に結合したストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００）を検出した。

免疫組織化学
アバチン（２５０ｍｇ／ｋｇ；２，２，２−トリブロモエタノール、Ｓｉｇｍａ）でマウスに麻酔をかけ、室温（ＲＴ）で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、続いて１０％ホルマリンのＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で経心的に灌流した。脊髄及びＤＲＧを切開し、同じ固定液中で３時間室温で後固定し、次いで、３０％ショ糖のＰＢＳ中で一晩４℃で凍結保護した。１４ｍｍ（ＤＲＧ）または３０μｍ（脊髄、冠状）のクリオスタット切片を、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）または正常ウマ血清（ＮＨＳ）を含むＰＢＳ／０．３％トリトンＸ−１００中で６０分間室温でプレインキュベートし、次いで、０．３％トリトンＸ−１００、１％ＮＧＳまたはＮＨＳ及び一次抗体を含むＰＢＳ中で一晩室温で免疫染色した。ＰＢＳ中で３回洗浄してから、切片を二次抗体とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中にマウントし、カバーガラスをかけた。

ミクログリア増殖
神経損傷及びＣＳＦ１誘導性のミクログリア増殖をモニターするために、灌流の２時間前にＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｇ体重、腹腔内）でマウスを注射した。上記のように脊髄切片を収集した。抗ＢｒｄＵ抗体で免疫標識するために、組織切片を１Ｍ ＨＣｌ（１０分、氷上）、２Ｍ ＨＣｌ（１０分、ＲＴ）及び２Ｍ ＨＣｌ（２０分、３７℃）で処理した。組織切片をＰＢＳ中で５回洗浄し、次いで、上記のプロトコールに従って免疫染色した。

画像化及び画像解析
Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００顕微鏡で画像を収集した。Ｆｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で画像処理及び定量化を行い、対応する画像（例えば、同側対対側；ＣＳＦ１対ＰＢＳ；野生型対ノックアウト）を同一方式で処理した。ＣＳＦ１とＡＴＦ３の共発現を評価するために、坐骨神経損傷に対して同側及び対側のＬ４及びＬ５のＤＲＧ由来の１４μｍの切片を収集した（６マウス／群）。動物あたり６〜８切片を画像化し、Ｆｉｊｉ／Ｉｍａｇｅ Ｊの閾値処理及び粒子解析機能を使用して、目に見える核を有するニューロンを数えた。この解析は、群に対して盲検化して行った。髄腔内ＣＳＦ１後のＩｂａ１の免疫反応性を定量化するために、ＰＫＣγの免疫染色を使用して、表面後角の前縁を定め、閾値処理を使用して、シグナル強度を測定した。３マウス／群及び３画像／マウスを解析した。画像は自動的に処理した。結果は、ビヒクル（ＰＢＳ）を注射したマウスで得られた値に対して標準化した。後角のＢｒｄＵ免疫反応性細胞も、閾値処理及び粒子解析（Ｆｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪ）を使用して自動的に数えた。ＳＮＩ後に経時的にＢｒｄＵの発現を定量化するために、ＮｅｕＮで表面後角をはっきりさせ、損傷に対して同側の、４マウス／時点、３画像／マウスを解析した。髄腔内のビヒクル（ＰＢＳ）またはＣＳＦ１に反応してＢｒｄＵ標識された細胞を定量化するために、中心管に対して背側の灰白質中のＢｒｄＵ標識された細胞を数えた（３〜４マウス／群及び少なくとも３画像／マウス）。

後角のミクログリアにおけるＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰ及びＩｂａ１のシグナル強度の定量化のために、群当たり３〜４マウス由来の腰膨大の３０μｍ凍結切片を収集した。共焦点画像を、各動物において最も高いミクログリアシグナルを示す３切片から得た。後角の縁をはっきりさせ、別個のミクログリアマーカー（Ｉｂａ１またはＣＤ１１ｂ）を使用してすべてのミクログリア細胞を特定し、Ｆｉｊｉ／Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してこのマスク内のシグナル強度を解析した。

ＲＮＡ−Ｓｅｑ
神経損傷後７日目に、脊髄の同側と対側のＤＲＧ及び背側の四分円を収集した。ＤＮａｓｅ Ｉ消化を伴うＱＩＡｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ ｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製キットを使用して作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００によってシーケンスした。差次的発現試験を、デフォルトパラメーターを使用するＣｕｆｆｄｉｆｆ１．３．０を使用して行った。得られた有意な遺伝子のリストを、２を越える絶対倍数変化を有する遺伝子について選別した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
マウスをアバチンで麻酔し、ＰＢＳで経心的に灌流した。末梢神経損傷を有するマウスにおいて、損傷に対して同側及び対側のＬ４〜６のＤＲＧ及び背側脊椎を収集した。髄腔内ＣＳＦ１注射を受けたマウスについては、全腰髄を収集した。トリゾール−クロロホルム（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて全ＲＮＡを精製し、ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＳｕｐｅｒｍｉｘまたはＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ及びＭａｘｉｍａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＮＣＢＩのプライマー−ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、以下に記載のすべてのプライマー（表１）を設計した。すべてのＤＲＧ試料に対する内部コントロールとしてΒ−アクチンを使用し、すべての脊髄試料に対する内部コントロールとしてＳｎａｐ２５を使用した。上記のプロトコールに加えて、先に記載されているように（Ｂｒａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１２，７４：６６３−６７５）、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。

（表１）

インサイチュハイブリダイゼーション
Ｐａｎｏｍｉｃｓ’ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＶｉｅｗＲＮＡ組織アッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して、マウスＣｓｆ１コード配列の３変異体（ＮＭ＿００７７７８．４、ＮＭ＿００１１１３５３０．１及びＮＭ＿００１１１３５２９．１）について設計したプローブセットを用いて、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行った。蛍光性Ｆａｓｔ Ｒｅｄ基質を用いて、アルカリホスファターゼ反応を使用して、シグナルを検出した。以下のプロトコールをして、ＩＳＨをＡＴＦ３に対する免疫組織化学と組み合わせた。上記のように、マウスを深麻酔し、１０％ホルマリンで経心的に灌流した。ガラススライド上に収集した１２μｍのクリオスタット切片を１０％ホルマリン中に１０分間浸し、次いで、製造者のＩＳＨプロトコールに従って処理した。１２分間のプロテアーゼ処理が、ＩＳＨを免疫組織化学と組み合わせるのに最適であった。ＩＳＨステップに続いて、このスライドを、５％正常ヤギ血清／０．ｌＭ ＰＢＳ（トリトンＸ−１００非含有）中で１時間室温でブロッキングし、次いで、上記のように免疫染色について処理した。

行動解析
すべての行動アッセイを盲検化方式で以前に記載の３３のように行った。運動協調性を加速ロータロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、モデル＃７６５０）上で試験した。マウスがロータロッド上で費やした持続時間を３００秒のカットオフで記録した。試験に先立って、各マウスは３回の訓練試行を受けた。熱疼痛感受性に関するハーグリーブスの足底試験については、放射熱源が後肢に集中する、ガラス面上の透明なプラスチックチャンバー中にマウスを配置した。熱板試験では、後肢をなめるもしくは引っ込める、または跳躍するまでの潜伏時間を記録した。異なる３温度（４８℃、５２．５℃、５５℃）で反応をモニターした。機械的反応性を試験するために、ワイヤーの網状格子上の透明なプラスチックチャンバー中にマウスを配置し、段階的なフォンフライフィラメントで後肢を刺激した。上げ下げ法３４を使用して引き込み閾値を決定した。

統計解析
データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示す。スチューデントのｔ検定及び二元配置反復測定分散分析ＡＮＯＶＡ（チューキーの事後検定）を使用して、遺伝子発現変化、免疫蛍光強度、細胞数及び行動の結果を解析した。統計的有意性：^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．０１、^＊＊＊ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

実施例１：末梢神経損傷はｈＣＳＦ１を誘導する
本発明者らは、マウスの末梢神経損傷が、損傷したＤＲＧニューロンにおいて、サイトカインである（マクロファージ）コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のデノボ発現を誘導することを発見した。ＣＳＦ１は脊髄に輸送され、ここで、ＣＳＦ１はミクログリアのＣＳＦ１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）を標的にする。Ｃｒｅ媒介性の、感覚ニューロンからのＣｓｆ１の欠失は、過敏症を完全に予防し、神経損傷によってもたらされるミクログリア活性化を有意に低減した。これに対して、ＣＳＦ１の髄腔内（脊髄）注射は、ミクログリアを活性化するだけでなく、神経損傷によってもたらされるものに匹敵する機械的過敏症も誘導する。ミクログリアのＣＳＦ１Ｒの下流では、神経損傷と髄腔内ＣＳＦ１の両方が、ＤＡＰ１２、すなわち、ミクログリアシグナリングの中心となるアダプタータンパク質をアップレギュレートすることが分かった。

ＤＡＰ１２の欠失は、神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性の両方の機械的過敏症を抑止する。ＤＡＰ１２は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びカテプシンＳ、すなわち神経障害性疼痛の発生に関与するミクログリア遺伝子の、神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性の初期アップレギュレーションにも必要とされるが、神経損傷誘導性またはＣＳＦ１誘導性のミクログリア増殖には必要とされない。本明細書に開示される結果は、ＣＳＦ１が、損傷した感覚ニューロンと神経損傷誘導性の神経障害性疼痛の発生に必要とされる、ミクログリアの遺伝子のＤＡＰ１２依存性誘導との間の重要なシグナルであることを示す。

サイトカインのＣＳＦ１は、ミクログリア及びＣＳＦ１受容体、すなわちＣＳＦ１Ｒを含めた骨髄系列集団の分化及び維持において役割を果たし、ミクログリアの発生にも必要とされる。さらに、成熟ＣＮＳでは、ＣＳＦ１Ｒはミクログリアでのみ発現している。

神経障害性疼痛の部分的坐骨神経損傷（ＳＮＩ）モデルを使用して、行動変化ならびにＤＲＧの感覚ニューロン及び腰髄における損傷の分子的結果をモニターした（図１Ａ）。最初に、ＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰレポーターにおけるＩｂａ１の発現をモニターすることによって、ＣＳＦ１Ｒが脊髄のミクログリアにおいて実際に排他的に発現しており、Ｉｂａ１に関しては、ＳＮＩ後に活性化されたミクログリアにおいてアップレギュレートされることが示された（図１Ｂ）。さらに、ＳＮＩの１日以内に、神経損傷に対して同側のＬ４〜Ｌ６ ＤＲＧにおいて、Ｃｓｆ１ ｍＲＮＡの有意な誘導（図１Ｃ）が記録された。第２のＣＳＦ１Ｒリガンド、すなわちＩＬ−３４（これもミクログリアの発生について必要とされる）のＤＲＧ誘導は観察されなかった（図２Ａ）。

図１：（図１Ａ）重要な神経解剖学的構造（坐骨神経の求心性線維；ＤＲＧ中の感覚ニューロン；後角の疼痛伝達（ＰＴ）ニューロンを調節するＧＡＢＡ作動性阻害性介在ニューロン及びミクログリア；Ｘ：坐骨神経損傷；矢印：後根結紮部位）を図示する、概略図。（図１Ｂ）ＳＮＩに対して同側の、ＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰレポーターマウスにおける背側脊椎のＩｂａ１及びＧＦＰ標識の増大。挿入図：休止（左；コントロール）及び活性化（右；被損傷）ミクログリアの形態。（図１Ｃ）ＳＮＩ後のＤＲＧにおけるＣｓｆ１ ｍＲＮＡの急速な誘導。（図１Ｄ）損傷に対して同側のＤＲＧニューロンにおけるＡＴＦ３とＣＳＦ１の共発現（１日）。（図１Ｅ）後根結紮におけるＣＳＦ１の蓄積（図１Ｆ）。アドビリン−Ｃｒｅ媒介性の、感覚ニューロンからのＣｓｆ１欠失は、ＳＮＩ誘導性機械的過敏症の発生を予防する（ｎ＝５〜６マウス／群）。（図１Ｇ）感覚ニューロンからのＣｓｆ１欠失は、ＳＮＩに対して同側のミクログリア活性化を大きく低減させる。（図１Ｈ）髄腔内ＣＳＦ１は、ＰＢＳビヒクルによって誘導されるものよりも有意に大きな機械的過敏症をもたらす（ｎ＝７マウス／群）。（図１Ｉ）髄腔内ＣＳＦ１は、後角のミクログリアも活性化する。スケールバー：１００μｍ（図１Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｉ）；２００μｍ（図１Ｅ）。平均±ＳＥＭ、二元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの事後解析、^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．０１、^＊＊＊ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。（図１Ｊ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＩＬ−３４の誘導がないことを示す。（図１Ｋ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、対側と比較した場合の、神経損傷に対して同側の後索におけるＣｓｆ１ｒの誘導を示す。Ｎ＝３マウス／時点。（図１Ｌ）ＣＳＦ１Ｒ（免疫染色）はミクログリアマーカーのＣＤ１１ｂと共局在し、両方のマーカーは神経損傷後（損傷後３日目）に後角において誘導される。スケールバーは１００μｍに等しい。（図１Ｍ）神経損傷後３日目に、ミクログリアマーカーのＩｂａ１との完全なＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰの共局在があり、ニューロンマーカーのＮｅｕＮとは共局在がない。白い正方形は拡大領域を示す。スケールバーは１００μｍに等しい。（図１Ｎ）神経損傷後３日目の表面後角のＣＤ１１ｂ陽性細胞におけるＣＳＦ１Ｒの免疫染色の定量化。（図１Ｏ）神経損傷後３日目の表面後角のＩｂａ１陽性細胞におけるＧＦＰ強度の定量化。Ｎ＝３〜４マウス／群。

図２：（図２Ａ）ＳＮＩ後のＤＲＧにおいてＩＬ３４ ｍＲＮＡの誘導がない（ｎ＝３マウス／群、同側対対側：平均±ＳＥＭ、二元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定、有意でない）。（図２Ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションと免疫細胞化学を組み合わせは、ＡＴＦ３を共発現する損傷したＤＲＧニューロンにおけるＣｓｆ１ ｍＲＮＡのデノボ発現を示す。スケールバー：１０μｍ。（図２Ｃ）ＣＳＦ１タンパク質もＡＴＦ３タンパク質も神経損傷に対して対側のＤＲＧニューロンで発現していない（損傷後４日目）。（図２Ｄ）神経損傷に対して同側の損傷したＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１タンパク質のデノボ発現は、すなわち同様に神経損傷後にニューロンでのみ発現している神経ペプチドであるＮＰＹ（挿入図）と共局在する。スケールバー：２００μｍ及び１０μｍ（挿入図）。（図２Ｅ）Ｌ４及びＬ５の同時的な後根結紮及びＳＮＩは、結紮においてＣＳＦ１及びＮＰＹを蓄積させる。ＮＰＹとのＣＳＦ１の共局在は、ＣＳＦ１輸送が軸索内であることを立証する。破線は結紮を示す。スケールバー：２００μｍ。（図２Ｆ）ＣＳＦ１の誘導が完全に喪失しているにもかかわらず、ＡＴＦ３の発現が、神経損傷後のＡｄｖ−Ｃｒｅ；ＣＳｆ１ ｆｌ／ｆｌマウス由来のＤＲＧニューロンに存続する。上部パネル：ＣＳＦ１ ｆｌ／ｆｌコントロールマウス；下部パネル：アドビリン−Ｃｒｅ；ＣＳＦ１ ｆｌ／ｆｌマウス。（図２Ｇ）髄腔内ＣＳＦ１中和抗体（ＳＮＩ後２４時間目及び４８時間目）は、神経損傷誘導性の機械的過敏症を低減させる（ｎ＝６マウス／群）。（図２Ｈ）後角におけるＩｂａ１のシグナル強度の定量化（図１Ｈ）は、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較した場合の、髄腔内ＣＳＦ１（毎日３０ｎｇで３日間）後のＩｂａ１の有意な増大を示す。値を、ＰＢＳ後に観察された免疫染色に対して標準化する；ｎ＝３マウス／群、独立ｔ検定、^＊＊ｐ≦０．０１。

実施例２：ＣＳＦ１は損傷した感覚ニューロンでデノボ誘導され、脊髄に輸送され、ここで、ＣＳＦ１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）発現ミクログリアに係合する。
神経損傷後のＤＲＧ及び後角でアップレギュレートされる遺伝子及び損傷した感覚ニューロンがミクログリアと相互作用して疼痛をもたらすシグナルを特定するために、最初に、神経損傷後にＲＮＡ−Ｓｅｑ解析を行った（図１Ａ）。多くの研究が神経損傷後の転写の変化を報告しているが、ＤＲＧと脊髄の両方を検討したものはほとんどなく、且つ大部分はマイクロアレイを使用して行われた（ＬａＣｒｏｉｘ−Ｆｒａｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ．２０１１，１５２：１８８８−１８９８；Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐａｉｎ．２０１４，１０：７）。同側ＤＲＧにおけるコロニー刺激因子１（Ｃｓｆ１）及びその受容体（Ｃｓｆ１ｒ）の著しいアップレギュレーションが、神経損傷後の同側後索で見られた（表２）。

ＣＳＦ１がインビトロでミクログリアを拡大させるために培養培地に加えられる必須因子であり（Ｓｕｚｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，３０：１１１−１２０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１３，１０：８５）、ＣＳＦ１Ｒがインビボでのミクログリアの発生に必要とされる（Ｅｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１４，８２：３８０−３９７）ので、この発見は特に重要である。実際に、Ｃｓｆ１ｒは、ミクログリア発生中の卵黄嚢のミクログリア前駆体で発現する最も初期の遺伝子の１つである（Ｇｉｎｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０，３３０：８４１−８４５；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２，３３６：８６−９０）。別のＣＳＦ１ＲリガンドであるＩＬ−３４（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１３：７５３−７６０）の発現は変化しなかった（表２）。ｑＲＴ−ＰＣＲによって、神経損傷後に、ＤＲＧでＣｓｆ１は誘導されるが、Ｉｌ−３４は誘導されない（図１Ｃ；図１Ｊ）という、及びＣｓｆ１ｒは背側脊椎で誘導されるという発見（図１Ｋ）が確証された。

（表２）

表２：末梢神経損傷後のＤＲＧ及び後索のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析。神経損傷後７日目のＤＲＧ及び背側脊椎における選択された遺伝子についての相対発現レベル（１００万のマップされたフラグメントあたりのエクソンのキロベースあたりのフラグメント：ＦＰＫＭ）。^ａ神経損傷後のＤＲＧでアップレギュレートされない遺伝子；^ｂミクログリアで優勢に発現している遺伝子；^ｃ単球で排他的に発現している遺伝子；^ｄＣＣＬ２１受容体；^ｅ報告によるとミクログリア活性化を妨害するニューロン膜タンパク質をコードする遺伝子。

Ｃｓｆ１ ｍＲＮＡについてのインサイチュハイブリダイゼーションとＡＴＦ３の免疫組織化学的局在を組み合わせると、損傷した末梢性軸索を有する細胞のマーカーによって、Ｃｓｆ１の誘導が損傷したＤＲＧニューロンに限定されることが示された（図２Ｂ）。二重免疫染色によって、すべてのＣＳＦ１＋ニューロンがＡＴＦ３を共発現し、大部分のＡＴＦ３＋ニューロンがＣＳＦ１を共発現することが示された（図１Ｄ；図２Ｃ）。デノボＣＳＦ１発現は、小径の侵害受容性ニューロン及び非侵害受容性の大径ニューロンで生じた（図１Ｄ；図２Ｄ）。実際に、ＡＴＦ３とのＣＳＦ１の共発現は、ニューロンの混合集団においても、早くも神経損傷後１２時間で観察された。損傷がない場合は、ＤＲＧニューロンでＣＳＦ１を検出することができなかった（図１Ｄ）ので、神経損傷が損傷した感覚ニューロンにおけるデノボＣＳＦ１発現を誘導すると結論した。

ＳＮＩモデルにおけるＣＳＦ１誘導後のＣＳＦ１輸送に取り組むために、Ｌ４〜Ｌ６の後根（ＤＲＧと脊髄の間；図１Ａ、矢印）を同時に結紮し、結紮でのＣＳＦ１のせき止めを示した（図１Ｅ）。この結果によって、脊髄のＣＳＦ１輸送が軸索内であることが確証された。図２Ｅは、ＣＳＦ１と神経ペプチドＹ（これも末梢神経損傷後にＤＲＧニューロンのみで発現する）の二重標識を示す。ＤＲＧニューロン中及び結紮部位におけるＣＳＦ１とＮＰＹ（損傷した感覚ニューロンでアップレギュレートされるペプチド（Ｈｏｋｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００７，２８：３６５−３７２））の共発現（図２Ｄ〜２Ｅ）によって、ＣＳＦ１の軸索内輸送が確証された。次に、ＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰレポーターマウス（Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００４，７５：６１２−６２３）を使用して、及びＣＳＦ１Ｒに対する免疫染色によって、ＣＳＦ１Ｒが、脊髄のミクログリアで排他的に発現していることが分かり、実際に、神経損傷後にアップレギュレートされる（図１Ｂ；図１Ｌ〜１Ｏ）。後角における対応するＣＳＦ１の増大は観察されず、これによって、ＣＳＦ１が、索へのその輸送後に急速に放出されることが示唆される。

実施例３：ＣＳＦ１は、脊髄後角における神経損傷誘導性ミクログリア活性化にとって必要且つ十分である
フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）Ｃｓｆ１マウスとＣｒｅ−リコンビナーゼが感覚ニューロンでのみ発現している別のもの（アドビリン−Ｃｒｅ）とを交雑させることでＤＲＧニューロンからＣｓｆ１を選択的に欠失させることによって、ＣＳＦ１の機能的影響に取り組んだ（図２Ｆ）。損傷した感覚ニューロンのＡＴＦ３の反応は、これらのマウスで変化しなかった（図２Ｆ）。しかし、Ｃｓｆ１の欠失は、神経損傷によってもたらされる過敏症を予防し（図１Ｆ）、ミクログリア活性化を大きく低減した（図１Ｇ）。同様に、ＣＳＦ１中和抗体の髄腔内注射は、神経損傷によってもたらされる過敏症を有意に低減した（図２Ｇ）。これに対して、ＣＳＦ１の髄腔内注射は、神経損傷によってもたらされるものに匹敵する、有意な（２時間以内）機械的過敏症を惹起するだけでなく（図１Ｈ）、ビヒクル（ＰＢＳ）が行うよりも有意に大きな程度に脊髄のミクログリアも活性化した（図１Ｉ、図２Ｈ）。したがって、これらの結果によって、ＣＳＦ１が神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化に対する必要且つ十分な寄与体であることが示される。

実施例４：ＤＡＰ１２は、神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性のミクログリア遺伝子アップレギュレーション及び疼痛を媒介する
ミクログリアの機能性の中心となる膜アダプタータンパク質ＤＡＰ１２を調べることによって、ＣＳＦ１及びＣＳＦ１Ｒの下流のシグナル伝達経路を研究した。図３Ａは、末梢神経損傷が背側脊椎においてＤＡＰ１２ ｍＲＮＡのレベルを増大させたことを示す。この増大は損傷の１日以内で有意であり、少なくとも７日間続いた（図４Ａ）。髄腔内ＣＳＦ１もＤＡＰ１２の発現を誘導した（図３Ｂ）。ＤＡＰ１２の欠失は、神経損傷誘導性及び髄腔内ＣＳＦ１誘導性の機械的過敏症の両方を予防した（図３Ｃ〜３Ｄ）。ＤＡＰ１２ノックアウトマウスが正常なベースライン疼痛及び運動行動を有するので（図４Ｂ〜４Ｄ）、過敏症を発生しなかったことは、通常の疼痛処理または運動欠損に起因するものではなかった。さらに、ＤＡＰ１２の欠失は、ＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１のデノボ発現に影響しなかった（図４Ｅ）。まとめると、これらの結果は、感覚ニューロンにおけるＣＳＦ１の誘導は神経障害性疼痛の発生に必要とされること、及びその寄与はミクログリアにおける下流のＤＡＰ１２シグナリングに依存していることを示す。

図３：（図３Ａ）ＳＮＩに対して同側の背側脊椎におけるＤＡＰ１２ ｍＲＮＡのアップレギュレーション（ｑＰＣＲ）（１日）。（図３Ｂ）髄腔内ＣＳＦ１後１日目の背側脊椎（両側）におけるＤＡＰ１２ ｍＲＮＡのアップレギュレーション（ｑＰＣＲ）。（図３Ｃ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、ＳＮＩ後に機械的過敏症を発生しない（ｎ＝５〜６マウス／群）。（図３Ｄ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、髄腔内ＣＳＦ１後に機械的過敏症を発生しない（ｎ＝７マウス／群）。ＤＡＰ１２ノックアウトマウスで観察された軽度の過敏症は、図１、パネルｈの野生型マウスにおいてＰＢＳによってもたらされたものに匹敵する。スチューデントのｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの事後解析、ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．０１、^＊＊＊ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

図４：（図４Ａ）同側後索におけるＤＡＰ１２ ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＳＮＩ後に７日間存続した（ｎ＝３マウス／群）。（図４Ｂ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおいて、ロータロッド試験の運動能力は正常である（ｎ＝７マウス／群、野生型と比較して差異なし）。（図４Ｃ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、侵害性の熱に対して正常な反応を有する（ハーグリーブス試験；ｎ＝６〜７マウス／群；野生型と比較して差異なし）。（図４Ｄ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、いくつかの温度で、熱板試験での侵害性の熱に対して正常な反応を有する（ｎ＝６〜７マウス／群；野生型と比較して差異なし）。（図４Ｅ）ＳＮＩ後の損傷した（ＡＴＦ３−免疫反応性）ＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１のデノボ発現は、ＤＡＰ１２ノックアウトマウス中に存続する。スケールバー＝５０μｍ。スチューデントのｔ検定、^＊＊＊ｐ≦０．００１。

神経損傷後の脊髄遺伝子発現の変化をモニターし、ＤＡＰ１２へのそれらの依存症を評価した。神経損傷の直後に誘導される遺伝子が神経障害性疼痛状態の開始とより関連性があるので、初期の時点を解析した。損傷後１日目では、ＣＤｌｌｂ及びＣＸ３ＣＲ１ならびにＢＤＮＦ及びカテプシンＳをコードするミクログリア特異的遺伝子の有意な増大（図５Ａ）が記録され、これらの両方は神経障害性疼痛に関与する。神経損傷後１日目にミクログリア増殖がないので、この時点で観察されるミクログリア遺伝子誘導は、増殖性ミクログリアよりはむしろ定住性のものに由来するに違いない。同じ時点での髄腔内ＣＳＦ１は、遺伝子アップレギュレーションのこのパターンを再現した（図５Ｃ）。

神経損傷誘導性及びＣＳＦ１誘導性の遺伝子アップレギュレーションの両方は、完全にＤＡＰ１２依存的であった（図５Ｂ；図５Ｄ）。髄腔内ＣＳＦ１は、プリン受容体のＰ２Ｘ４サブタイプならびにＩｒｆ８及びＩｒｆ５（これらは、ＢＤＮＦ及びカテプシンＳの発現を調節する転写因子をコードする）のアップレギュレーションも誘導し、再び完全にＤＡＰ１２依存的様式であった（図５Ｃ〜５Ｄ）。これらの結果によって、脊髄疼痛伝達回路網を増感させるのに、及び神経障害性疼痛を引き起こすのに必須であると考えられるミクログリア遺伝子の神経損傷誘導性アップレギュレーションが、ＣＳＦ１−ＣＳＦ１Ｒ−ＤＡＰ１２依存的なミクログリアシグナル伝達経路を必要とすることが示される。

図５：（図５Ａ）ＳＮＩ後１日目の背側脊椎におけるいくつかのミクログリア遺伝子のアップレギュレーション（ｎ＝４〜８マウス／群）。（図５Ｂ）ＤＡＰ１２ノックアウトは、神経損傷誘導性遺伝子誘導を予防する（ｎ＝４〜５マウス／群）。（図５Ｃ）野生型マウスにおける髄腔内ＣＳＦ１はミクログリア遺伝子を誘導する（ｎ＝３〜４マウス／群）。（図５Ｄ）ＤＡＰ１２ノックアウトは、髄腔内ＣＳＦ１誘導性のミクログリア遺伝子アップレギュレーションを予防する（ｎ＝４マウス／群）。（図５Ｅ）髄腔内ＣＳＦ１はミクログリア増殖を誘導する。挿入図：ミクログリアにおけるＢｒｄＵとＩｂａ１の共局在。挿入図中のＢｒｄＵとＩｂａ１の重なりによって、増殖細胞がミクログリアであることが確証される。スケールバー＝１００μｍ。（図５Ｆ）ＳＮＩ誘導性ミクログリア増殖（ＳＮＩ後２日目）は、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスに存続する（ｎ＝３〜４マウス／群）。（図５Ｇ）髄腔内ＣＳＦ１誘導性ミクログリア増殖は、ＤＡＰ１２ノックアウトマウスに存続する（ｎ＝３〜４マウス／群）。スチューデントのｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの事後解析、ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．０１、^＊＊＊ｐ≦０．００１、^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

神経損傷に対して同側の背側脊椎のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析によって、ＤＡＰ１２をコードする遺伝子であるＴｙｒｏｂｐの有意なアップレギュレーションが見出された（表２）。ＤＡＰ１２は成熟ミクログリアの機能性の中心となり（Ｓａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｇｇｓ，Ｃｅｌｌ．２０１４，１５８：１５−２４；Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１３，１６：１８９６−１９０５）、且つ舌下神経損傷後の第ＸＩＩ核のミクログリアで誘導される（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ．２０１５，１０７３−１０８２）ので、ＤＡＰ１２に着目した。ＤＡＰ１２はＣＳＦ１Ｒの下流にあり、疼痛関連ミクログリア遺伝子及び結果として生じる神経障害性疼痛状態のＣＳＦ１−ＣＳＦＲ１誘発性アップレギュレーションに必要であると結論した。興味深いことに、ＤＡＰ１２はＭ１−表現型マーカーを含めた炎症性サイトカインの舌下神経損傷誘導性発現にも必要とされる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ．２０１５，１０７３−１０８２）。ラットでは、ＤＡＰ１２メカニズムはまた、進行中の神経障害性疼痛に寄与する。自体損傷（除神経肢の自傷）は、切断後の幻肢痛に匹敵する持続性疼痛によって引き起こされると推測される。基底レベルの脊髄ＤＡＰ１２ ｍＲＮＡは、まれにこの状態を発生する（低自体損傷；ＬＡ）ラットのＤＡＰ１２レベルよりも、高自体損傷（ＨＡ）スコアを有するラット系統（Ｄｅｖｏｒ ａｎｄ Ｒａｂｅｒ，Ｐａｉｎ．１９９０，４２：５１−６７）で有意に高いことが見出された。こうしたＤＡＰ１２の違いは、神経損傷の前と後の両方に存在する（図６）。

図６：神経損傷誘導性自体損傷を発生する素因があるラット（ＨＡ系統）は、低自体損傷（ＬＡ）系統と比較して、脊髄のＤＡＰ１２ ｍＲＮＡレベルを上昇させた。ＤＡＰ１２ ｍＲＮＡレベルの違いは、損傷してから３０日存続した（ｎ＝４ラット／群）。スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５。

実施例５：単球浸潤よりはむしろミクログリアの自己複製が神経損傷後の脊髄におけるミクログリア拡大の基礎をなす
神経障害性疼痛状態の確立に加えて、末梢神経損傷は脊髄のミクログリア集団を拡大させる。ミクログリアと単球の匹敵する遺伝子プロファイルにもかかわらず、いくつかの遺伝子（ＣｓＦ１ｒ及びＣｘ３ｃｒｌ）はミクログリアにおいてより高レベルで発現しており、他のもの（Ｔｒｅｍ１及びＴｒｅｍ３）は単球で排他的に発現している（Ｂｅｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ．２００７，５５：７７７−７８９）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析によって、神経損傷後に、ミクログリアで発現豊富な遺伝子はアップレギュレートされるが、単球特異的遺伝子は検出不可能なままであったことが示された（表２）。これらのＲＮＡ−Ｓｅｑの発見は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確証された（図７）。

図７：ｑＲＴ−ＰＣＲは、ミクログリアで発現豊富な遺伝子は神経損傷後３日目の同側後索で誘導され、単球特異的遺伝子のレベルは検出不可能なままであることを示す（ｎ＝３マウス／群）。

実施例６：ＣＳＦ１は、後角における神経損傷誘導性ミクログリア増殖／自己複製にとって必要且つ十分である
次に、損傷した感覚ニューロンにおけるＣＳＦ１のデノボ発現がインビボでの神経損傷誘導性のミクログリア自己複製にも必要とされるかどうかを検討した。神経損傷が後角のミクログリア増殖を誘発するという以前の報告（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ．２００８，１３５：３７−４７）を、ＣＳＦ１Ｒ発現ミクログリアへのチミジン類似体ＢｒｄＵの取り込みによって確証し、実証した（図８Ａ）。神経損傷後３日で、すべての後角ＢｒｄＵ＋細胞がＣＳＦ１Ｒを発現し、これは、これらの増殖細胞が定住ミクログリアに由来すること、すなわち、増殖がミクログリアの自己複製を反映することを示す。損傷後１日目で、後角のミクログリア増殖は検出されず（図８Ｂ）、このときは、感覚ニューロンにおけるＣＳＦ１の誘導が容易に観察される（図８Ｃ；図２Ｂ；図２Ｄ）。アドビリン−Ｃｒｅ媒介性の、ＤＲＧニューロンからのＣｓｆ１欠失は、神経損傷誘導性の後角のミクログリア増殖を大きく排除した（図８Ｃ；図９Ａ）。最後に、ＣＳＦ１の髄腔内注射も後角のミクログリア増殖を誘導し（図５Ｆ；図９Ｃ）、この誘導は、神経損傷によって惹起されるものに匹敵した（図８Ａ〜８Ｂ）。

図８：（図８Ａ）ＣＳＦ１Ｒ−ＧＦＰマウスにおけるＢｒｄＵ及びＧＦＰについての二重標識は、神経損傷後２日目のＢｒｄＵ取り込みがＣＳＦ１Ｒ発現ミクログリアに限定されることを示す。挿入図：ＢｒｄＵ及びＧＦＰについて二重標識されたミクログリア細胞。（図８Ｂ）神経損傷後のＢｒｄＵ取り込みのタイムコース。増殖は、損傷後２日目に始まり、１週でベースラインに戻る（ｎ＝３〜４マウス／群、二元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの事後解析。未処理のマウスのＢｒｄＵ数と比較して増大）。神経損傷後１日目にミクログリア増殖がないことに留意されたい。これは、この時点での遺伝子のアップレギュレーションが定住ミクログリアで生じることを示すものである。（図８Ｃ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおける、保持された神経損傷誘導性ミクログリア増殖（ＳＮＩ後２日目）。（図８Ｄ）ＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおける、保持された髄腔内ＣＳＦ１誘導性（毎日３０ｎｇ、３日）ミクログリア増殖。スケールバー＝１００μｍ。（図８Ｅ）アドビリン−Ｃｒｅ媒介性の、感覚ニューロンからのＣｓｆ１の欠失は、損傷誘導性の後角のミクログリア増殖を有意に低下させる（損傷後３日目、ｎ＝３マウス／群）。

図９：（図９Ａ）アドビリン−Ｃｒｅ媒介性の、感覚ニューロンからのＣｓｆ１の欠失は、損傷誘導性の後角のミクログリア増殖を低下させる（損傷後３日目；群当たり３マウス）；（図９Ｂ）損傷後３日目のミクログリア増殖はＴｙｒｏｂｐ^−／−マウスに存続する（損傷後３日目、ｎ＝４マウス）；（図９Ｃ）髄腔内ＣＳＦ１後の後角のミクログリア増殖（３日）；（図９Ｄ）髄腔内ＣＳＦ１誘導性ミクログリア増殖はＴｙｒｏｂｐ^−／−マウスに存続する。スケールバー：１００μｍ。

実施例７：ＤＡＰ１２はインビボでの神経損傷誘導性またはＣＳＦ１誘導性のミクログリア増殖に必要とされない
図８Ａ〜８Ｂに示すデータは、神経損傷はまた、ミクログリア増殖を誘発する（これは、ＣＳＦ１Ｒ発現ミクログリア中へのＢｒｄＵの取り込みによって示される）が、ＳＮＩ後最初の２日目だけであることを示す。髄腔内ＣＳＦ１が神経損傷によって惹起されるものに匹敵するミクログリア増殖を誘導することが見出された（図５Ｅ）。しかし、ＤＡＰ１２変異型マウスにおいて、神経損傷によってもたらされるミクログリア増殖も髄腔内ＣＳＦ１によってもたらされるミクログリア増殖も変化しなかった（図５Ｆ〜５Ｇ；図８Ｃ〜８Ｄ）。したがって、ＣＳＦ１とＤＡＰ１２の両方が、神経損傷後に生成されるミクログリアにおいて、急速な神経障害性疼痛関連遺伝子誘導に寄与するが、ＣＳＦ１のみがミクログリア増殖に寄与する。

ＳＮＩモデルにおける研究は神経障害性疼痛の特性である過敏症に着目したが、同じメカニズムが、自発的な進行中の神経障害性疼痛に寄与する可能性がある。自体損傷（除神経肢の自傷）は、切断後に生じる幻肢痛に匹敵する進行中の神経障害性疼痛によって引き起こされると推定される。興味深いことに、基底レベルの脊髄ＤＡＰ１２ ｍＲＮＡは、まれに自体損傷状態を発生する系統のＤＡＰ１２レベルよりも、自体損傷の発生率がはるかに高いラット系統で有意に高い（図６）。ＤＡＰ１２レベルの系統による違いは、神経損傷の前及び後の両方に存在した。

実施例８：ＣＳＦ１は損傷した運動ニューロンで誘導され、末梢に輸送され、前角における神経損傷誘導性のミクログリア活性化及び増殖に必要とされる
末梢神経損傷が前角（運動ニューロンの周囲；図１０Ｆ）でミクログリア活性化を誘導することも見出された。損傷に対して対側の前角（図１０Ａ；図１０Ｅ）と比較して、損傷に対して同側のミクログリア活性化は、損傷した運動ニューロンにおけるデノボＣＳＦ１誘導と密接に関連して生じた（図１０Ｂ；図１０Ｆ）。ＤＲＧの感覚ニューロンと同様に、ＣＳＦ１は、ＡＴＦ３を発現する損傷した運動ニューロンでのみ誘導された。

後角において、アドビリン−Ｃｒｅ媒介性の、Ｃｓｆ１の感覚ニューロン欠失は神経損傷誘導性ミクログリア活性化を大きく低減した（図１０Ｃ）が、前角のミクログリア活性化及び運動ニューロンにおけるＣＳＦ１の誘導はほんのわずかにしか低減しなかった（図１０Ｃ；図１０Ｇ）。

これに対して、ネスチン−Ｃｒｅ媒介性の、大部分（およそ７０％）のＣＮＳ運動ニューロンからのＣｓｆ１の欠失（図１１）は、運動ニューロン周囲のミクログリア活性化を大きく排除した（図１０Ｄ；図１０Ｈ）が、これは、ＡＴＦ３の発現に影響を及ぼさなかった（図１１）。これらマウスにおいて、運動ニューロンのミクログリアの貪食も検出できたが、ＣＳＦ１発現運動ニューロンの残存集団においてのみであった（図１０Ｄ；図１０Ｈ）。

図１０：（図１０Ａ〜１０Ｂ）ＳＮＩ後８日目の、前索におけるＣＳＦ１の誘導及び前角及び後角でのミクログリア活性化（Ｉｂａ１）（コントロールマウス）。（図１０Ｅ〜１０Ｆ）ＣＳＦ１発現運動ニューロンは、（図１０Ａ〜１０Ｂ）のミクログリアの増大をもたらし；（図１０Ｃ）ＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１の特異的な欠失は後角におけるミクログリア活性化（Ｉｂａ１）を予防するが、運動ニューロンにおけるＣＳＦ１の誘導は損なわれておらず、ＣＳＦ１発現運動ニューロン周囲のミクログリア活性化は保持される。（図１０Ｇ）（図１０Ｃ）の前索の増大；（図１０Ｄ）大部分のＣＮＳニューロンにおけるＣＳＦ１欠失は、神経損傷誘導性の前角のミクログリア活性化を大きく低減させるが、後角のミクログリア活性化は保持される。（図１０Ｈ）残りのＣＳＦ１発現運動ニューロンはミクログリアをもたらすことに留意されたい。（図１０Ｅ〜１０Ｊ）運動ニューロンの軸索におけるＣＳＦ１の輸送。ミクログリアとＣＳＦ１発現運動ニューロン及びその軸索との接近した並置（矢印）に留意されたい。スケールバー＝１００μｍ（図１０Ｈ）、５０μｍ（図１０Ｊ）。

軸索切断した運動ニューロンにおける神経損傷誘導性のＡＴＦ３発現は、これらのマウスで影響を受けなかったが、運動ニューロンにおけるＣＳＦ１のアップレギュレーションは有意に低減した（図１１）。野生型マウスの１００％のＡＴＦ３＋運動ニューロン（図１１）と比較して、ＡＴＦ３＋運動ニューロンのわずか約３０％がＣＳＦ１を発現した（図１１）。運動ニューロンにおけるＣＳＦ１の残存発現は、運動ニューロン中の不完全なネスチン−Ｃｒｅ媒介性組換えをおそらく反映する。運動ニューロンにおけるＣＳＦ１アップレギュレーションの予防は、前角における神経損傷誘導性のミクログリア活性化（図１０Ｈ）及び増殖（図１２）を大きく排除した。

図１１：コントロールのＣｓｆ１ ｆｌ／ｆｌマウスでは、すべてのＡＴＦ３発現（被損傷）前角運動ニューロンは、末梢神経損傷後にＣＳＦ１を共発現する。このパターンは、Ａｄｖ−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌマウスで有意に変化しない。しかし、大部分のＣＮＳニューロンからＣｓｆ１が欠失しているネスチン−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌマウスでは、ＡＴＦ３発現運動ニューロンの約３０％が、神経損傷後にＣＳＦ１を共発現する。スケールバー：５０μｍ。

図１２：（図１２Ａ）大部分のＣＮＳニューロンからのＣｓｆ１の欠失（ネスチン−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌ）は、損傷後の前角のミクログリア活性化を低減させる。スケールバー：２００μｍ；（図１２Ｂ）末梢神経損傷（３日）は前角のミクログリア増殖を誘導し、これは、Ｃｓｆ１がＣＮＳニューロンから欠失している場合（ネスチン−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌ）、大きく弱められる。（図１２Ｃ）（図１２Ｂ）及び（図１２Ｃ）の定量化；（ｎ＝３〜４マウス／群）。

最後に、運動ニューロンの細胞体及び樹状突起におけるＣＳＦ１のデノボ発現及びミクログリアによるそれらの貪食に加えて、おそらく損傷部位への、ＣＳＦ１の末梢性軸索輸送が存在する（図１０Ｅ；図１０ＥＪ）。したがって、ＣＳＦ１は、損傷後の運動ニューロンプールのミクログリア浸潤に、及びおそらくそのシナプス入力の病態生理学的除去（ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）にも寄与すると思われる。

Ｃｓｆ１のニューロン欠失のトポグラフィックな結果は印象的であった。感覚ニューロンからのＣｓｆ１の欠失（Ａｄｖ−Ｃｒｅ、図２Ｆ）は、神経損傷後に運動ニューロンのＣＳＦ１誘導も前角のミクログリア活性化も変化させなかった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。むしろ、神経損傷誘導性ミクログリア活性化の低減は、後角、すなわち損傷した求心性神経の末端領域内に限定される（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＣＮＳニューロンからのＣｓｆ１の欠失（ネスチン−Ｃｒｅ、図１１）は、前角の神経損傷誘導性ミクログリア活性化を顕著に低減した（図１０Ｄ）。ベースラインのミクログリアの密度もこれらのマウスで低減したことに留意されたい（図１０）。この全体的な低減にもかかわらず、これらのマウスにおいて、後角のミクログリア活性化と同様に（図１０Ｄ）、神経損傷誘導性のＣＳＦ１誘導が感覚ニューロンで保持された（図１３）。

図１４は、感覚ニューロンにおける神経損傷誘導性の変化を脊髄の疼痛伝達回路に影響するミクログリアシグナル伝達経路と結びつける本発明者らの発見を図式化する。このプロセスは、損傷した感覚ニューロンにおけるＣＳＦ１のデノボ発現から始まる。次に、ＣＳＦ１がＤＡＰ１２依存性のミクログリア遺伝子の誘導を誘発し、その生成物は、部分的に、ＧＡＢＡ作動性阻害性制御を低下させることによって、神経障害性疼痛表現型に寄与する。

図１３：神経損傷に対して同側のＤＲＧニューロンにおけるＣＳＦ１の誘導は、ネスチン−Ｃｒｅ；Ｃｓｆ１ ｆｌ／ｆｌマウス（損傷後８日目）で保持され、これによって、ネスチン−ＣｒｅがＤＲＧニューロンで発現していないことが示される。スケールバー：５０μｍ。

図１４：坐骨神経損傷の１日以内に、損傷した（ＡＴＦ３陽性の）ＤＲＧ感覚ニューロンでＣＳＦ１のデノボ発現がある。ＣＳＦ１は脊髄に輸送され、ここで、ミクログリアのＣＳＦ１Ｒと相互作用する。次に、刺激されたミクログリアは、比較的急速な神経障害性疼痛関連遺伝子誘導フェーズ（損傷後１日目）及び遅延型の増殖期（損傷後２日目）を経る。ＤＡＰ１２膜アダプタータンパク質を介して、ＣＳＦ１はミクログリアを刺激して、神経障害性疼痛の機械的過敏特性をもたらす遺伝子をアップレギュレートする。このＤＡＰ１２依存性のミクログリア遺伝子誘導は、転写因子のＩｒｆ８及びＩｒｆ５のアップレギュレーションから始まるものと思われ、それらが次に、カテプシンＳ、ＢＤＮＦ及びＰ２Ｘ４を含めた下流遺伝子の発現を誘導する。他の研究は、ミクログリア由来のＢＤＮＦが、後角の疼痛伝達ニューロンの興奮性亢進の根底にあるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって発揮される阻害性制御を最終的に低減させることを示した。神経細胞膜に対する作用によって、カテプシンＳはフラクタルキン（ＣＸ３ＣＬ１）を切断し、続いて、フラクタルキンがミクログリア上のその受容体（ＣＸ３ＣＲ１）に結合して、ミクログリア活性化を増幅する。未同定のＤＡＰ１２非依存性経路を介して、ＣＳＦ１はまた、ミクログリア増殖を刺激し、これは、神経障害性疼痛行動の維持に寄与する。

図１５：ＣＳＦ１は、損傷の１日以内に、損傷した（ＡＴＦ３陽性の）感覚ニューロンで誘導され、脊髄に輸送され、ここで、ミクログリアのＣＳＦ１Ｒと相互作用する。次に、刺激されたミクログリアは、ＤＡＰ１２非依存性増殖／自己複製及びＤＡＰ１２依存性神経障害性疼痛関連遺伝子誘導（ＢＤＮＦ及びカテプシンＳ（ＣａｔＳ）を含む）を経る。ミクログリア由来のＢＤＮＦは、ＧＡＢＡ作動性阻害性制御の低減及び結果として生じる後角の疼痛伝達ニューロンの興奮性亢進に寄与する。神経細胞膜からＣＸ３ＣＬ１（フラクタルキン）を切断することによって、カテプシンＳはミクログリア活性化を増幅する。神経障害性疼痛の表現型が、同時的なＣＳＦ１誘導性のミクログリア自己複製／増殖によって悪化するかどうか、及びＤＡＰ１２がそのプロセスに寄与するかどうかは、まだ確定されていない。

実施例９：ＣＳＦ１誘導性過敏症はミクログリアの活性化を伴い、Ｐ２Ｘ４を必要としない
上述したように、ＣＳＦ１の髄腔内投与は、小さいが統計学的に有意なＩｂａ１発現の増大を誘導した。これらの発見と一致して、及び図１６Ａに示すように、ミノサイクリンは、ＣＳＦ１の髄腔内注射によってもたらされる過敏症を予防した。

Ｐ２Ｘ４受容体が神経損傷後の過敏症に重要であると考えられるが、髄腔内ＣＳＦ１誘導性の機械的過敏症がＰ２Ｘ４ノックアウトのマウスに存続した。このことによって、ＣＳＦ１の効果はＰ２Ｘ４標的を必要としないことが示される。データを図１６Ｂに示す。

概して、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきでないが、そのような特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲とともに、すべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。

Claims (16)

1. ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結された三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターを含むポリヌクレオチドを含むベクター、を含む、神経障害性疼痛を治療するための医薬であって、対象のＴＧＧまたはＤＧＧにおけるｈＣＳＦ１発現を低下させる、医薬。
2. ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結された三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターを含むポリヌクレオチドを含むベクター、を含む、対象に鎮痛をもたらすための医薬であって、前記対象のＴＧＧまたはＤＧＧにおけるｈＣＳＦ１発現を低下させる、医薬。
3. ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するエンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸に作動可能に連結された三叉神経節（ＴＧＧ）または後根神経節（ＤＲＧ）プロモーターを含むポリヌクレオチドを含むベクター、を含む、神経損傷誘導性の機械的過敏症及びミクログリア活性化を低減するための医薬であって、対象のＴＧＧまたはＤＧＧにおけるｈＣＳＦ１発現を低下させる、医薬。
4. 髄腔内のボーラス注射または注入、神経節内注射、神経内注射、皮下注射、または脳室内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
5. ＤＲＧ導入のために、脊柱の複数のレベルでの髄腔内のボーラス注射または注入によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項４に記載の医薬。
6. 単一の後根神経節、複数の後根神経節、または三叉神経節中への直接的な神経節内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項４に記載の医薬。
7. 神経束（例えば、坐骨神経、三叉神経）中への神経内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項４に記載の医薬。
8. 末梢神経の末端（真皮下または内臓壁）での皮下注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項４に記載の医薬。
9. （三叉神経節導入のために）脳室内注射によって、前記ベクターが前記対象に投与される、請求項４に記載の医薬。
10. 前記組換えベクターが、プラスミド系ベクターまたはウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
11. 前記ＴＧＧまたはＤＲＧプロモーターが、ｈＳＹＮ１プロモーター、ＴＲＰＶ１プロモーター、Ｎａｖ１．７プロモーター、Ｎａｖ１．８プロモーター、Ｎａｖ１．９プロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びアドビリンプロモーターから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
12. 前記ｈＣＳＦ１遺伝子中の前記ヌクレオチド配列が、ｈＣＳＦ１遺伝子の調節領域、ｈＣＳＦ１のプロモーター、ｈＣＳＦ１の転写開始点、ｈＣＳＦ１のエクソン配列、ｈＣＳＦ１のイントロン配列、及びｈＣＳＦ１の５’または３’非翻訳領域から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
13. 前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項記載の医薬。
14. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、請求項１３記載の医薬。
15. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＨＮＨもしくはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメイン中に１つまたは複数の変異を含む変異型Ｃａｓ９である、請求項１４に記載の医薬。
16. 前記変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼがニッカーゼである、請求項１５に記載の医薬。

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