CN103509796B - 一种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用RNAi技术和RNAi rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体。本发明的降低SPP1基因表达的小干扰RNA序列如SEQ ID NO：1‑2所示；本发明的突变型克隆载体针对前述降低SPP1基因表达的RNAi的靶序列构建。本发明的方法通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回复突变的载体与RNAi同时感染或转染目的细胞，沉默内源目的基因，通过外源突变型载体表达与内源相同功能的蛋白，经过这样组合处理细胞功能不发生改变；或者将突变型载体导入RNAi沉默后，功能得到回复，证明功能表型是由此基因引起的，为基因功能研究提供了一种新的模型和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于RNAi rescue原理制备突变型克隆载体的方法。
背景技术
RNAi（RNA interference，RNA干扰）是一种高效的特异性强的基因阻断技术，通过切断目的基因mRNA达到沉默目的基因的作用，RNAi技术是一种新兴的基因研究工具，目前已经被广泛常规应用于各种领域的基因功能研究。
随着研究深入发现RNAi存在比较普遍的脱靶现象，为了证实沉默的是否为靶基因，人们采用不同的RNAi靶点证实获得相同的基因功能结果来证明对目的基因进行了特异性沉默，但这种方法存在所设计的RNAi靶点均发生脱靶的几率，如果所设计的RNAi靶点均发生脱靶，则无法证明对目的基因是否进行了特异性沉默。
另一种方法就是构建RNAi target区突变体，即对该区的碱基序列进行同义突变，一方面不被RNAi沉默，一方面能保证表达的蛋白与内源、野生型载体表达的蛋白功能一致，该方法被称为RNA干扰回复（即：RNAi rescue）技术。通过RNA干扰回复技术对基因表达进行回复，如果回复的结果和RNAi的结果相反，则可以确认该基因功能。RNA干扰回复方法在设计上更加科学，也更加严格。对于RNA干扰回复的应用目前报道不多，其主要原因在于获得突变型过表达载体的关键技术不够成熟。
发明内容
本发明的目的在于构建沉默SPP1基因表达的小干扰RNA，以及针对该RNAi的靶序列构建的突变型克隆载体，该突变型克隆载体能够避免RNAi沉默，同时该突变型克隆载体能够表达正常功能的蛋白；两者结合可用于SPP1基因功能的研究。
本发明首先提供了一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA（siRNA），包括正义链和反义链，序列如下：
正义链：5’-CCAUUCUGAUGAAUCUGAU-3’（SEQ ID NO:1）；
反义链：5’-AUCAGAUUCAUCAGAAUGG-3’（SEQ ID NO:2）。
进一步的，本发明所述小干扰RNA针对的SPP1基因上的RNA干扰靶序列如SEQ IDNO：3所示。
一种降低SPP1基因表达的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO：1所示序列的正义链片段和SEQ ID NO：2所示序列的反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构。
进一步的，所述降低SPP1基因表达的shRNA可剪切成前述含有如SEQ ID NO：1所示正义链以及SEQ ID NO：2所示反义链的降低SPP1基因表达的siRNA。
优选的，所述茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
一种SPP1基因干扰慢病毒载体，含有编码前述降低SPP1基因表达的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA，并剪切获得如SEQ ID NO：1-2所示序列的siRNA。
所述SPP1基因干扰慢病毒载体是将编码前述SPP1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述SPP1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述SPP1基因小干扰RNA，用于特异性沉默SPP1基因的表达。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
最优选的，所述慢病毒载体为pGCL-GFP。
一种SPP1基因干扰慢病毒，由前述SPP1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明第二方面公开了一种SPP1基因突变型克隆载体，针对前述降低SPP1基因表达的siRNA的RNA干扰靶序列突变获得；该突变型克隆载体含有突变的RNA干扰靶序列，并编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA。
优选的，所述突变型克隆载体含有SPP1蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPP1蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA；所述RNA干扰靶序列为权利要求1-2任一权利要求所述siRNA所针对的RNA干扰靶序列；所述RNAi target mRNA区为所述RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。
所述RNAi target mRNA区为RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。本发明突变型克隆载体表达的S PP1蛋白序列可参考Gene Bank（NM_000582.2）。
本发明所述RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变是指将目的基因RNA干扰靶序列中，所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但表达的氨基酸种类不变。
优选的，所述突变的RNA干扰靶序列为5’-TCACTCCGACGAGTCCGAC-3’（SEQ ID NO：4）。即采用SEQ ID NO：4所示突变的RNA干扰靶序列替换掉SEQ ID NO：3所示RNA干扰靶序列，从而使SPP1基因RNAi target mRNA区发生同义突变。
更优选的，所述突变型克隆载体含有SEQ ID NO：23所示突变的SPP1基因序列。
本发明突变型克隆载体的关键在于通过分子克隆的方法在目的基因的RNAitarget序列的所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个位置的碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但氨基酸不变，通过碱基同义突变后获得的克隆载体具有不被RNAi沉默又能表达正常功能蛋白的特性。
本发明还公开了前述突变型克隆载体的方法，包括下列步骤：目的基因RNAi有效靶点设计、构建shRNA载体；RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变；多重PCR获得含同义突变的目的基因全长mRNA；突变型克隆载体构建；突变型克隆载体构建成功证明；回复功能实验证实细胞克隆形成。
本发明最后一方面公开了前述降低SPP1基因表达的小干扰RNA，前述突变型克隆载体在SPP1基因功能研究中的应用。
本发明制备的突变型载体不被RNAi干扰沉默，能表达出功能与野生型载体相同的蛋白；它是研究基因功能的良好模型，对内源基因进行沉默，外源基因导入后不被沉默。同时，本发明通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回复突变的载体与RNAi同时感染或转染目的细胞，一方面沉默内源目的基因，但不沉默外源目的基因，通过外源突变型载体表达与内源相同功能的蛋白，经过这样组合处理细胞功能不发生改变；或者将突变型载体导入RNAi沉默后，功能得到回复，证明功能表型是由此基因引起的。本发明为基因功能研究提供了一种新的模型、方法。
附图说明
图1：用于shRNA构建的质粒图谱。
图2：载体线性化电泳图。
图3：shRNA载体阳性克隆PCR琼脂糖电泳图。
图4：突变型载体构建流程图。
图5：突变型载体质粒图谱。
图6：突变型载体线性化电泳图。
图7：突变型载体阳性克隆PCR琼脂糖电泳图。
图8：RT-PCR验证实突变型克隆载体的突变是否成功。
图9：WB验证实突变型克隆载体的突变是否成功。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1突变型克隆载体制备
1.制备原理
本实施例中使用的目的基因为SPP1（NM_000582.2）基因，制备两端设酶切位点粘端的表达干扰序列的双链DNA oligo序列，直接连入干扰载体；然后将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，在进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。
突变型慢病毒过表达载体在目的基因的RNAi target序列的所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个位置的碱基进行同义突变，即虽然目的基因碱基序列发生改变，但由于其编码的mRNA的RNAi target mRNA区发生了同义突变，因此突变型克隆载体表达的氨基酸序列不变；因此，该突变型能够避免被RNAi降解，同时翻译出的蛋白具有正确的生物学功能。
2、制备步骤：
2.1针对目的基因SPP1，根据AA-N19-TT设计原则，设计RNA干扰靶序列为：
5’-CCATTCTGATGAATCTGAT-3’（SEQ ID NO：3）。
2.2根据已经设计的RNA干扰靶序列，设计两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的表达干扰序列的双链DNA oligo序列，设计结果如表1中SEQ ID NO：4-5序列所示：
表1两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的双链DNA oligo序列
2.3shRNA载体的构建
将两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的表达干扰序列的双链DNA oligo序列直接连入酶切后的RNA干扰载体pGCL-GFP上，该RNA干扰载体结构如图1所示，具体步骤如下：2.3.1载体的线性化：本实施例所用限制性内切酶，购自New England Biolabs(NEB)公司。
1）使用Hpa I和Xho I进行酶切消化，酶切反应体系如下表2所示：
表2酶切反应体系
| 纯化的DNA质粒（1ug/μl） | 2μl |
| 10×buffer | 5μl |
| 100×BSA | 0.5μl |
| Hpa I(10U/μl) | 1μl |
| Xho I(10U/μl) | 1μl |
| H2O | 40.5μl |
| Total | 50μl |
将上述混合的反应物置于37℃保温1h；加人0.5mol／L EDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol／L，终止反应；然后将上述混合的反应物置于37℃保温1h。
2）验证：载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。
2.3.2感受态制备（氯化钙法）
1)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时（旋转摇床，转速为300转/分）。
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
3)于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。
9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。
2.3.3克隆制备
1）连接：连接反应体系如下表3所示：
表3连接反应体系
上述混合物于4℃12小时连接反应制备克隆连接液，准备转化。
2）转化
a）冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
b）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
c）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。
d）每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。
e）将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol／L MgSO4和Amp抗性的SOB琼脂培养基上。
f）将平板置于室温直至液体被吸收。
g）倒置平皿，于37℃培养，16小时。
3）阳性克隆PCR鉴定
Primer：
Up（+）：5’-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3’（SEQ ID NO：7）；
Down(-)：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：8）。
表4阳性克隆PCR鉴定反应体系
其中，PCR循环条件见表5：
表5PCR循环体系
其中，菌落PCR Template的制备：在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基中，混匀后取1μl作为模板。
阴性对照，用于排除系统中由外源核酸污染导致的假阳性结果。表达阴性对照shRNA的双链DNA oligo序列如表6中SEQ ID NO：9-10所示。参考本实施例2.3部分，将两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的表达阴性干扰序列的双链DNA oligo序列连入酶切后的RNA干扰载体pGCL-GFP上，获得阴性对照质粒Lv-Scr-siRNA。
表6表达阴性对照shRNA的两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的双链DNA oligo序列
琼脂糖凝胶电泳图片结果如图3所示；其中1#泳道对应空白对照(ddH2O)；2#泳道对应阴性对照（空质粒组，pGCL-GFP）；3#泳道对应Marker（5，3，2，1.5，1Kb，750，500，250，100bp）；4-8#泳道对应Psc1-1,2,3,4,5（表4中鉴定组1-5）。
PCR条带大小：
a）连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：341bp；
b）没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：307bp。
4）阳性克隆测序鉴定：
挑选阳性克隆psc1-1菌液送测序（Invitrogen公司使用ABI3733型测序仪进行测序分析），测序结果RNAi靶点序列如SEQ ID NO：3中所示。构建成功的阳性克隆命名为SPP1-shRNA-plasmid。
2.4突变型克隆载体的构建
2.4.1实验原理：
以含有SPP1（NM_000582.2）基因片段的质粒为模板（SPP1plasimd，购自吉凯基因化学技术有限公司），利用PCR方法钓取目的基因，将目的基因与目的载体分别进行酶切。纯化酶切产物后进行定向连接，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，其上下游引物分别设计在载体和目的基因上，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提。实验流程图如图4所示。
2.4.2实验步骤：
1.载体的线性化：
本实施例中用于构建突变型克隆载体的质粒为pGC-FU-EGFP（购自吉凯基因化学技术有限公司），载体结构如图5所示；载体酶切：使用Age I进行酶切消化，酶切反应体系如表7所示：
表7酶切反应体系
| 质粒（1ug/μl） | 2μl |
| 10×buffer | 5μl |
| 100×BSA | 0.5μl |
| Age I（10U/μl） | 1μl |
| H2O | 41.5μl |
| Total | 50μl |
将上述混合的反应物置于37℃，酶切1h，载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱如图6所示。1#泳道为AgeI酶切的pGC-FU-EGFP质粒，2#泳道为未酶切的pGC-FU-EGFP质粒，3#泳道为Marker。
2.引物合成
1)SPP1-Age I-F：CAGGATCCCCGGGT CGCCACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC（SEQID NO：11）。
引物说明：含交换配对碱基（CAGGATCCCCGGGT ）、Age I酶切位点（）以及表达增强序列（CGCCACC），并含有目的基因5’端部分序列（NM_000582.2对应序列位置：166-186，ATGAGAATTGCAGTGATTTGC），用于PCR钓取目的基因。
2)SPP1-Age I-R：TCACCATGGTGGCG ACATTGACCTCAGAAGATGCACTA（SEQ IDNO：12）
引物说明：含交换配对碱基(TCACCATGGTGGCG )和Age I酶切位点（），并含有目的基因3’端部分序列（NM_000582.2对应序列位置：1044-1065,ATTGACCTCAGAAGATGCACTA），用于PCR钓取目的基因。
3)SPP1-140-F：CATCGAGATCGAGAACTGGTCACTGATTTTCCCA（SEQ ID NO：13）
引物说明：在psc140的相应位点设计了同义突变（其中，阴影标出的位点部分为同义突变位置，NM_000582.2对应序列位置：495-535）。
4)SPP1-140-R：TCGATCTCGATGTGAGACTCATCAGACTGGTGAG（SEQ IDNO：14）
引物说明：在psc140的相应位点设计了同义突变（其中，阴影标出的位点部分为同义突变位置，NM_000582.2对应序列位置：473－513）。
5)SPP1-2-R：TGGAAGGGTCTGTGGGGCTAGGAGATTC（SEQ ID NO：15）
引物说明：用于获得突变型SPP1基因转录本与原SPP1基因转录本相同的前半部分（NM_000582.2对应序列位置：321－348）。
6)SPP1-2-F：TAGCCCCACAGACCCTTCCAAGTAAGTCCA（SEQ ID NO：16）
引物说明：用于获得突变型SPP1基因转录本与原SPP1基因转录本相同的后半部分（NM_000582.2对应序列位置：329－358）。
7)SPP1-SEQF：GTTTCGCAGACCTGACATCC（SEQ ID NO：17）
引物说明：该引物（NM_000582.2对应序列位置：642－661）用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落。
8)pGC-FU-SEQR：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG（SEQ ID NO：18）
引物说明：该引物（载体对应序列位置3920－3939）用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落以及测序。
3.PCR获得目的基因片段，PCR反应体系见表8：
表8目的片段的PCR反应体系
a）片段A
PCR引物说明：
Primer（＋）：SPP1-Age I-F
Primer（—）：SPP1-2-R
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
PCR产物大小：200bp；
b）片段B
PCR引物说明：
Primer（＋）：SPP1-2-F
Primer（—）：SPP1-140-R
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
PCR产物大小：200bp；
c）片段C
PCR引物说明：
Primer（＋）：SPP1-140-F
Primer（—）：SPP1-Age I-R
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
PCR产物大小：593bp
d）基因全长的获得（注：模板为前面得到的片段A+B+C）
PCR引物说明：
Primer（＋）：SPP1-Age I-F
Primer（—）：SPP1-Age I-R
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
PCR产物大小：952bp
4.重组克隆制备：
2.4.1PCR产物交换连接入酶切真核表达载体：所采用的真核表达载体为pGC-FU-EGFP，反应体系见下表9；反应条件为23℃，反应15分钟，再于42℃反应15分钟制备克隆交换液，准备转化。
表9连接反应体系
2.4.2感受态细胞的制备：用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
1)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时（旋转摇床，转速为300转/分）。
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
3)于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。
9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。
2.4.3转化：
1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1—2分钟。
4)每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。
5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol／L MgSO4和AMP抗性（100ug/ml）的LB琼脂培养基上。
6)将平板置于室温直至液体被吸收。
7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。
8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。
2.5阳性克隆的PCR鉴定
表10PCR鉴定的反应体系
PCR引物说明：
Primer（＋）：SPP1-SEQF（SEQ ID NO：17所示）
Primer（—）：pGC-FU-SEQR（SEQ ID NO：18所示）
PCR仪进行反应，按以下循环条件：
1)菌落PCR Template：在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB，混匀取1μl作为模板；
2)阴性对照：用于排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；该阴性对照为空载体pGC-FU-EGFP。
2.6实验结果：
PCR产物大小：506bp；PCR阳性克隆鉴定结果如图7所示；其中，1#泳道为阴性对照（空质粒组，pGC-FU-EGFP）；3#泳道为Marker（5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp）；2#泳道为pGC-FU-SPP1（-1）；4#泳道为pGC-FU-SPP1（-2）；5#泳道为pGC-FU-SPP1（-3）；6#泳道为pGC-FU-SPP1（-4）；7#泳道为pGC-FU-SPP1（-5）；8#泳道为pGC-FU-SPP1（-6）；9#泳道为pGC-FU-SPP1（-7）。
对阳性克隆进行测序，其序列如SEQ ID NO：23所示，且与数据库中的已知SPP1序列（NCBI的序列号为：NM_000582.2）进行序列比对，比对结果显示：阳性克隆序列与已知SPP1序列的形似度为99%以上。构建成功的阳性克隆命名为SPP1-res-plasmid。
实施例2RT-PCR法对突变型克隆载体的验证
1.细胞转染
1.1细胞铺板：将对数生长期的293T细胞胰酶消化后，铺到24孔板中，确保细胞密度在第二天时达到80%，即可用于转染。
1.2质粒转染：设置阴性对照组（Lv-Scr-siRNA质粒转染组，实施例1构建获得）、RNAi质粒转染组（SPP1-shRNA-plasmid）、RNAi质粒（SPP1-shRNA-plasmid）和RNAi rescue质粒（SPP1-res-plasmid）共同转染组，第二天将1ug阴性对照质粒、1ug RNAi质粒、1ugRNAi质粒和1ug RNAi rescue质粒转染293T细胞，转染试剂为Invitrogen公司的Lipo2000，转染方法参考Lipo2000说明书。
1.3转染效率鉴定：第四天荧光显微镜观察细胞转染效率。
2.RT-PCR鉴定RNAi沉默效率
转染第四天收集上述细胞，根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA（逆转录反应体系见表11，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。
表11逆转录反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 5×RT buffer | 4.0 |
| 10mM dNTPs | 2.0 |
| RNasin | 0.5 |
| M-MLV-RTase | 1.0 |
| DEPC H2O | 3.5 |
| Total | 11.0 |
采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA）进行实时定量检测。SPP1基因的PCR引物如下：上游引物5’-TGATGAATCTGATGAACTGGTC-3’（SEQ ID NO：21）和下游引物5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTAG-3’（SEQ ID NO：22）。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（SEQ ID NO：23）和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（SEQ ID NO：24）。按下表13中的比例配置反应体系。
表12Real-time PCR反应体系
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了SPP1mRNA的表达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA）的细胞作为对照。
实验结果表明，与阴性对照组相比，RNAi质粒转染组细胞中SPP1mRNA的表达水平下调了88.6%，但RNAi质粒和RNAi rescue质粒共同转染组细胞中SPP1mRNA的表达水平没有明显变化（结果如图8所示）。表明对SPP1基因进行回复突变后，目的基因不能被沉默。
实施例3WB验证实施例1制备的突变型克隆载体的突变是否成功
1.细胞转染
1.1细胞铺板：将对数生长期的293T细胞胰酶消化后，铺到24孔板中，确保细胞密度在第二天时达到80%，即可用于转染。
1.2质粒转染：设置阴性对照组（Lv-Scr-siRNA质粒转染组，实施例1构建获得）、RNAi质粒转染组（SPP1-shRNA-plasmid）、RNAi质粒（SPP1-shRNA-plasmid）和RNAi rescue质粒（SPP1-res-plasmid）共同转染组，第二天将1ug阴性对照质粒、1ug RNAi质粒、1ugRNAi质粒和1ug RNAi rescue质粒转染293T细胞，转染试剂为Invitrogen公司的Lipo2000，转染方法参考Lipo2000说明书。
1.3转染效率鉴定：第四天荧光显微镜观察细胞转染效率，保证细胞转染效率达75%以上。
1.4总蛋白抽提：
1)从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤2次；
2)弃去PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer；
3)细胞刮刮下细胞，将样品转移入Ep管中，冰上裂解细胞10～15min；
4)超声破碎仪破碎细胞（200W共4次，每次5秒，间隔2秒）；
5)4℃，12000g，离心15min；
6)取上清，测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2μg/μl，-80℃保存备用。
1.5上样样品准备
1）每个样品取相同总蛋白量，加入相同体积的2X loading buffer上样缓冲液，配方如下：1M Tris-HCl（pH6.8）100mM；巯基乙醇2%；溴酚兰0.02%；甘油20%；SDS4%；
2）混匀后，沸水浴煮5-10min，4℃存放备用。
1.5SDS-PAGE
1）根据目的蛋白分子量大小配制12%浓度的分离胶，5%的浓缩胶；
2）上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样；
3）电泳：30mA2h。
1.6免疫印迹（湿转）
电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上.
1.7免疫显色
1)封闭：用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜；
2)一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜；SPP1抗体来自Santa Cruz公司。
3)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；
4)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h；
5)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；
6)采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色；
7)X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片。
1.8实验结果
通过SPP1抗体检测（图9），可以看到共同转染RNAi质粒和RNAi rescue质粒组，在33KDr附近有条特征带，与SPP1蛋白大小基本吻合；而单独转染RNAi质粒组却没有检测到目的条带。其中条带1为体系阳性对照（48KD），条带2为转染RNAi质粒组，条带3为共同转染RNAi质粒和RNAi rescue质粒组。
以上结果显示，RNAi质粒转染组细胞，SPP1抗体没有检测到目的蛋白的表达，但共同转染RNAi质粒和RNAi rescue质粒的细胞，目的抗体检测到目的蛋白的表达。RNAi质粒能敲减内源表达的蛋白，但不能敲减外源表达的蛋白，说明RNAi rescue质粒突变成功。
Claims (2)
1.一种SPP1基因突变型克隆载体，含有SPP1蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPP1蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPP1基因mRNA；所述RNA干扰靶序列为一种降低SPP1基因表达的小干扰RNA所针对的RNA干扰靶序列；所述小干扰RNA包括正义链和反义链，所述正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述RNAi target mRNA区为所述RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA；所述突变的RNA干扰靶序列如SEQ ID NO：4所示；所述RNA干扰靶序列如SEQ ID NO：3所示；所述SPP1蛋白表达序列如SEQ ID NO：23所示。
2.如权利要求1所述突变型克隆载体在SPP1基因功能研究中的应用。
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