CN103710372A

CN103710372A - 一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法

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Publication number: CN103710372A
Application number: CN201310754411.5A
Authority: CN
Inventors: 周宇荀; 马骁骁; 肖君华; 李凯
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103710372B

Abstract

本发明涉及一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，包括：（1）采用PCR方法得到shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR-505片段；（2）将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR和BamHI酶切检测目的基因插入的方向和拷贝数，测序确认后，得到表达载体。本发明的构建方法操作简单，得到的载体可实现miR-505成熟体在哺乳动物细胞中的高表达。

Description

一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法

技术领域

本发明属于表达载体构建领域，特别涉及一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法。

背景技术

MicroRNA是长度为21-25碱基单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控^[1]，miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关^[2]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。miR-505位于小鼠X染色体X:57647578-57647667处，ATP11C基因的第一和第二外显子之间的第一个内含子中，对于其生物学功能的研究目前还处于起步阶段。

2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2（可变剪接因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用^[3]，Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路^[4]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族^[5]。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢、生长、增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关^[6]。

在细胞水平对小RNA进行研究，可采用合成的双链siRNA或者构建在表达载体上的shRNA转染细胞进行。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体（Lentiviral vector,LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。目前慢病毒也被广泛地应用于表达microRNA的研究中[7]。

1.Bartel DP(2004)MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell116(2):281-297；

2.Ambros V,朱万渠（2010）：MicroRNAs与疾病和发育生命科学3:27-29；

3.Verduci,L,Simili M,Rizzo M,Mercatanti A,Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)andAlternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblastsenescence and apoptosis.J Biol Chem,285:39551-39563；

4.Karni R,Hippo Y,Lowe SW,Krainer AR(2008)The splicing-factor oncoprotein SF2/ASFactivates mTORC1.Proc Natl Acad Sci USA105(40):15323-15327；

5.Yamamoto Y,Yoshioka Y,Minoura K,Takahashi R,Takeshita F et al.,(2011)Anintegrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression fordrug-resistance in human breast cancer cells.Mol Cancer,10:13539551-39563；

6.Mathieu Laplante and David M.Sabatini，mTOR signaling at a glance（2009）J Cell Sci122,3589-3594；

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，该方法操作简单，得到的载体可实现miR-505成熟体在哺乳动物细胞中的高表达。

本发明的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，包括：

（1）miR-505的shRNA基因的获得

采用PCR方法将microRNA-505的shRNA基因从pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505扩增得到包含miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR-505片段；

（2）FUGW-miR-505及Fsy-miR-505载体的构建

将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与步骤（1）得到的经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接，再转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，并涂布到1%氨苄抗性的琼脂糖平板至长出菌落，对单菌落进行PCR鉴定，初步确定阳性克隆并根据PCR产物大小推测插入片段的拷贝数；将阳性克隆提取质粒后，进行BamHI的酶切，根据产物大小确认外源片段插入的方向，将正确插入的片段进行测序确认，得到表达载体。

步骤（1）中所述的PCR方法中所用的一对引物如下：

PcDNA-left：5’CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG；

PcDNA-right：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。

步骤（1）中所述的miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的序列长度分别为173bp、175bp、171bp。

步骤（2）中所述的连接的具体操作为4℃下过夜连接。

步骤（2）中所述的PCR鉴定中的引物为：

FUGW–EcoR1Upper：5’CATGGACGAGCTGTACAAGT；

FUGW–EcoR1Lower：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。

本发明构建了在哺乳动物细胞中表达miR-505的慢病毒载体，通过启动子的选择和多拷贝shRNA插入的筛选获得成熟体的高表达；通过具有组织特异性表达启动子的选择和多拷贝shRNA插入的筛选获得在中枢神经系统的高表达。

本发明技术方案包括用PCR方法获得目的基因，在PCR引物两端设计相同的酶切位点EcoRI，同时还保留了原载体上目的基因两侧的分别位于上下游的BamHI和BglII位点，将PCR产物用EcoRI酶切后，与经相同酶切的FUGW和Fsy载体分别连接，转化至大肠杆菌的感受态细胞。根据上述两个载体上位于EcoRI位点两侧的序列设计引物，对菌落进行PCR筛选，初步确定阳性克隆并根据PCR产物大小推测插入片段的拷贝数。将阳性克隆提取质粒后，进行BamHI的酶切，根据产物大小确认外源片段插入的方向，将正确插入的片段进行测序确认。

将构建好的miR-505慢病毒载体转染哺乳动物细胞，48小时后，提取细胞RNA，用特异引物进行逆转录反应，然后用荧光定量PCR反应进行细胞内成熟体miR-505的定量以检测转染及表达情况。

本发明构建能高效表达microRNA-505的慢病毒载体，选用UBC作为启动子的FUGW载体。泛素启动子UBC为人和小鼠细胞的组成型启动子，包含多种转录因子，且具有泛素系统本身的特性，与常用的病毒启动子相比，其细胞来源的特性以及组成型表达的特点可能使它们更加适合驱动外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达。另外，为了提高miR-505在中枢神经系统中表达的特异性，选用大鼠SynaptinI（突触蛋白I）启动子（FsyI）的Fsy载体。FsyI是在神经元中特异表达的启动子，细胞实验及体内实验结果都证明，FsyI启动子能指导其所调控的基因在神经元细胞中特异性高效表达。在构建上述两种载体时，都保留了载体上的EGFP位点，以方便通过荧光显微镜观察质粒的转染效率。

本发明的工艺过程，首先采用PCR方法和带有两端带有EcoRI酶切位点的引物将microRNA505的shRNA基因从pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505扩增，得到miR-505-3p和miR-505-5p的shRNA基因，EcoRI酶切PCR产物，同时FUGW和Fsy空载体经EcoRI酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化；处理后的线性化载体FUGW和Fsy分别与shRNA片段4℃过夜连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR和BamHI酶切检测目的基因插入的方向和拷贝数，测序确认后，得到表达载体。表达载体转染哺乳动物细胞，经荧光定量PCR确认miR-505的表达量。

以FUGW-miR505-3p为例，载体构建过程如图7所示。

有益效果

本发明构建了能够在哺乳动物细胞中表达外源miR-505的慢病毒载体，选择在人和小鼠细胞中组成型表达的UBC启动子和在神经元中特异表达的Syn启动子，前者是为了提高外源基因表达的效率和持续性，后者可用于研究miR-505在神经元中的生物学功能，并且保留载体上的EGFP蛋白编码基因以方便地指示转染效率。

本发明在载体上的单酶切位点插入外源片段，尽管阳性克隆中大约有一半会以反向插入，但是，在连接过程中，也可将目的片段进行串联形成多拷贝，在插入的目的基因上游保留了BamHI位点，PCR引物设计上保留了一个采用单酶切位点的方式将外源基因连接到载体上，以在设计了位于表达载体EcoRI位点两侧的PCR引物以方便用菌落PCR方法筛选阳性克隆。

附图说明

图1miR505目的片段的PCR电泳图；其中泳道1-miR505-3P，泳道2-miR505-5P，泳道3-miR505-nc，泳道4-marker；

图2菌落PCR电泳图；其中泳道1～9-FUGW-miR505-3p，泳道10-阴性，泳道11-Marker，a箭头指示单拷贝，b箭头指示两拷贝，c箭头指示三拷贝；

图3FUGW-miR505-3p BamHI酶切产物电泳图；泳道1-marker，泳道2～3-FUGW-miR505-3p单拷贝正向插入酶切产物，泳道4-FUGW-miR505-3p单拷贝反向插入酶切产物，泳道5-FUGW-miR505-3p两拷贝正向插入酶切产物，泳道6-FUGW-miR505-3p两拷贝-正向-反向插入酶切产物；

图4FUGW-miR505-3p载体图谱；

图5HEK293T细胞转染后EGFP表达，其中A：pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505-3p，B：pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505-nc，C：FUGW-miR505-3p，D：FUGW-miR505-nc，E：L26Fsy(1.1)GW-miR505-3p，F：L26Fsy(1.1)GW-miR505-nc，G：FUGW-miR505-3p单拷贝，H：FUGW-miR505-3p两拷贝，I：FUGW-miR505-3p三拷贝；

图6miR505-3p不同拷贝数质粒在HEK293T细胞中的表达；

图7FUGW-miR505-3p为例，载体构建过程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1）.miR-505的shRNA基因的获得

根据基因序列设计并合成2对miR-505寡聚单链DNA，分别为miR-505-5p，miR-505-3p序列见表一：

表1.miRNA寡聚单链DNA序列（附阴性对照序列）

将3对寡聚单链DNA退火成双链。然后用载体构建试剂盒BLOCK-iT^TMPol II miRRNAi Expression Vector Kit with EmGFP(invitrogen,Catalog no.K4936-00)进行重组克隆，得到pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505-3p/5p/nc。

利用以下一对引物：

PcDNA-left：5’CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG

EcoRI BamHI

PcDNA-right：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC

EcoRI BglII

采用PCR方法将microRNA-505(miR-505-3p/5p/nc)的shRNA基因从pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505扩增得到包含miR-505-3p，miR-505-5p及miR-505-nc(有相似结构但无关序列的对照组)的shRNA基因，序列长度分别为173bp、175bp、171bp。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物和预期相符，纯化回收（图1），并用限制性内切酶EcoRI（大连宝生物公司）进行酶切。

2）.FUGW-miR-505及Fsy-miR-505载体的构建

FUGW载体（中科院神经生物所）用EcoRI进行酶切，碱性磷酸酶CIAP处理使其5’端去磷酸化；线性化载体FUGW与上述经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接后，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布到1%氨苄抗性的琼脂糖平板至长出菌落，用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定，

FUGW–EcoR1Upper：5’CATGGACGAGCTGTACAAGT,

FUGW–EcoR1Lower：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC

1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，未有条带出现说明目的片段miR-505没有插入载入，208bp处出现条带说明插入了一个目的片段miR-505，416bp处出现条带说明插入两个目的片段条带miR-505，624bp处出现条带说明插入3个目的片段miR-505（图2，其中a箭头指示单拷贝，b箭头指示两拷贝，c箭头指示三拷贝）。

虽然菌落PCR能够指示目的片段是否插入到载体质粒，但无法判断目的片段插入载体上的方向是否正确，鉴于原有载体序列含有单一BamHI酶切位点，插入的目的基因片段miR-505在5’端也含有一个BamHI酶切位点，BamHI酶切后琼脂糖凝胶电泳，根据酶切片段大小就可以判断目的片段miR-505插入的方向，对于插入一个拷贝的重组载体来说，如果是正向插入，那么在770bp处出现条带，如果是反向插入，则在913bp处出现条带(图3)。对于插入两拷贝来说，如果两个串联的miR-505都是正向插入，则在770bp与161bp处同时出现条带，如果前一个目的片段miR-505是反向插入，第二个目的片段miR-505是反向插入，则在913bp与161bp处同时出现条带。

选取正向插入的重组载体进行测序，结果与GenBank中提供的序列一致，证明载体构建成功。以FUGW-miR505-3p为例，构建成功的FUGW-miR505-3p载体图谱如图4。

3）.FUGW-miR-505及Fsy-miR-505对HEK293T细胞转染

实验前将HEK293T细胞以5×10⁵的/每孔的密度铺于12孔板，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，经预实验优化，融合度选择为70%～80%时进行转染。转染前2h将DMEM培养基换成opti-MEM培养基，各孔转染用质粒与脂质体Lipofectamine2000量分别为：2μg和4μl，转染后6h更换成含有1%青链霉素的DMEM培养基。转染步骤按脂质体Lipofectamine2000转染试剂说明书操作。转染后细胞置37℃，5%CO₂的培养箱中孵育48小时。荧光显微镜下观察EGFP表达，pcDNA-miR505-3p,pcDNA-miR505-nc,FUGW-miR505-3p，FUGW-miR505-nc，Fsy-miR505-3p，Fsy-miR505-nc可见高表达绿色荧光（图5，A～F），表明转染成功。FUGW-miR505-3p不同拷贝数转染，拷贝数越高，荧光强度越高。

4）.miR-505成熟体在哺乳动物细胞中的高表达

Trizol法提取细胞的总mRNA，实验组与对照组抽提的总mRNA分别取2μg进行逆转录，MiR505-3p/5p基因引物分别与内参照m16基因引物一同进行处理，

miR-505-3p引物：5’GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGCAGAAAACCAGC；

m16基因引物：

5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA

逆转录步骤按试剂盒说明书操作。制备的cDNA稀释5倍作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，

miR505-3p基因上游引物：GCGAGCACCGTCAACACT，

下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCGGC，

m16基因上游引物：CGCGCTAGCAGCACGTAAAT，

下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。

95℃变性2s,62℃退火延伸32s，共反应40个循环，分析溶解曲线。以△Ct表示miR505-3p的表达，△Ct=Ct（miR505-3p）-Ct（m16），2^-△△Ct表示实验组与对照组比较，miR505-3p表达量的增加值。如图7显示转染不同单拷贝与多拷贝FUGW-miR505-3p细胞中miR505-3p表达量不同，拷贝数增加，表达量增加。

Claims

1.一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，包括：

（1）采用PCR方法将microRNA-505的shRNA基因从pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-505扩增得到包含miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR-505片段；

（2）将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与步骤（1）得到的经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接，再转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，并涂布到1%氨苄抗性的琼脂糖平板至长出菌落，对单菌落进行PCR鉴定，初步确定阳性克隆并根据PCR产物大小推测插入片段的拷贝数；将阳性克隆提取质粒后，进行BamHI的酶切，根据产物大小确认外源片段插入的方向，将正确插入的片段进行测序确认，得到表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PCR方法中所用的一对引物如下：

PcDNA-left：5’CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG；

PcDNA-right：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。

3.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的序列长度分别为173bp、175bp、171bp。

4.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的连接的具体操作为4℃下过夜连接。

5.根据权利要求1所述的一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR鉴定中的引物为：

FUGW–EcoR1Upper：5’CATGGACGAGCTGTACAAGT；

FUGW–EcoR1Lower：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。