KR101290799B1 - 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 - Google Patents
목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델에 관한 것이다. 본 발명은 목적 유전자를 효과적으로 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현하는 방법을 제공한다. 또한, 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 얻기 위한 비용 절감적이고 보다 효율적인 제조방법을 제공함으로써, 신경세포에서 유전자 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델에 관한 것이다.
배아 형성되는 과정에서 신경관은 뇌와 척수 발생의 기초가 된다. 초기의 신경관은 뇌실이라 불리는 큰 구멍으로써, 이것은 상대적으로 기관에 벡터가 주입되기 쉽게 한다. 이러한 초기 신경관으로 특이적인 백터의 전달이 가능하게 하는 목적으로 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery) 기술이 개발되었다. 신경 줄기 세포의 초기에 감염시켜 뇌실로 주입된 벡터는 뇌실영역에 존재한다. 이어, 신경 줄기세포가 분화됨에 따라 벡터는 다양한 신경 세포로 전달된다. 이 기술을 이용함으로써 외생적(exogeneous) 유전자를 마우스의 중추신경계에서 효과적으로 발현시킬 수 있다(1-3).
아데노바이러스(adenovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)의 벡터는 기초 연구부터 유전자 치료의 의학적인 접근까지 다양한 범위에서 다용도의 유전자 전달 운반체로써 널리 사용되고 있다(4-6). 아데노바이러스 벡터는 높은 역가로 수득할 수 있으며 분열되지 않은 세포를 형질전환할 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 숙주의 염색체로 인테그레이션(integration)하지 않기 때문에 아데노바이러스의 DNA는 숙주 세포에서 에피좀(episome)으로 존재한다. 일반적으로, 아데노바이러스는 E1 및 E3 유전자를 제거함으로써 제작된 복제 결함 벡터로 사용되고 있다(7, 8). 이러한 복제 결함 벡터는 E1 유전자를 발현하는 특정 293 세포주에서만 복제될 수 있으며, 일반적인 세포에서는 불가능하다(9). 아데노바이러스 벡터와는 달리, 레트로 바이러스 벡터는 상대적으로 수득 역가가 낮으며 증식하는 세포만 형질전환한다. 또한, 숙주 염색체로 인테그레이션되기 때문에 레트로바이러스의 유전적 정보도 숙주세포와 같이 딸세포로 전달될 수 있다.
뇌에서 신경세포는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte)로 구성되는 주요한 세가지 타입이 있으며 각각의 세포 타입에 특이적인 유전자의 조절이 필요하다. 세포 특이적 프로모터(promoter)는 트렌스제닉 마우스 또는 녹아웃(knock out) 마우스 모델에서 개발되어왔다. 그러나 생식세포계열(germ line) 조작은 상당한 비용과 시간이 요구되는 프로세스이다. 이전 연구에서 UIGD 기술이 마우스의 초기배아의 뇌(embryonic brain) 및 성숙 뇌(adult brain)에 유전자 전달을 쉽고 빠르게 하는 방법임을 확인하였음에도 불구하고, 전이유전자의 세포-타입 특이적 조절은 보고된 바 없다(1-3).
본 연구자들은 신경 세포의 유전자 연구, 특히 목적 유전자를 신경 세포 타입 특이적으로 발현하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 뉴런에서 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 제작하였고, 이를 이용한 UIGD 기술을 통해 목적유전자를 뉴런 특이적으로 발현하는 동물모델을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적 유전자의 신경세포(neural cell)-타입 특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 뉴런-특이적 목적 유전자의 발현용 재조합 레트로바이러스 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법을 제공한다.
(a) (i) 신경세포 타입-특이적 프로모터; 및 (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 목적 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 제작된 바이러스 벡터를 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery)을 이용하여 인간을 제외한 동물의 배아(embryo)의 뇌실에 주입하는 단계; 및
(c) 상기 배아를 발달시켜 상기 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 신경세포를 얻는 단계.
본 연구자들은 신경 세포의 유전자 연구, 특히 목적 유전자를 신경 세포 타입 특이적으로 발현하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 뉴런에서 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 제작하였고, 이를 이용한 UIGD 기술을 통해 목적유전자를 뉴런 특이적으로 발현하는 동물모델을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): (i) 신경세포 타입-특이적 프로모터; 및 ( ii ) 상기 프로모터에 작동적으 로 결합된 ( operatively linked to ) 목적 유전자를 포함하는 바이러스 벡터의 제작
본 발명의 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법을 위해 신경세포 타입-특이적 발현벡터를 제작한다. 본 발명에서 이용되는 벡터는 기본적으로 발현 컨스트럭트를 포함하며, 이는 “신경세포 타입-특이적 프로모터-목적 유전자-폴리아데닐화 서열”을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 발현 벡터에서, 목적 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 목적 유전자에 결합된 프로모터는, 신경세포 타입-특이적 프로모터로써 뉴런(neuron)-, 성상세포(astrocyte)- 또는 희돌기교세포(oligodendrocyte)-특이적 프로모터가 바람직하며, 이 중 뉴런-특이적 프로모터는 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터, ICAM-4 프로모터(US 5753502), 에놀라아제(enolase) 프로모터 또는 시냅신(synapsin) 프로모터가 바람직하다. 보다 바람직하게는 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터이다.
본 발명에서 이용되는 폴리아데닐화 서열은 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열, 소성장 호르몬 터미네이터, HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열을 포함하며, 바람직하게는 토끼 글로빈 폴리 아데닐화 서열이다.
본 발명의 벡터에 의해 운반되는 목적 유전자는 예를 들어 리포터(예컨대, GFP) 유전자, 신경생장인자(nerve growth factor), 신경전달물질(neurotransmitter), 신경세포접착분자(neural cell adhesion molecule), 신경영양인자((BDNF;Brain-derived neurotrophic factor), 인지능력에 관여하는 유전자 (CREB: cAMP response element-binding), 신경퇴행성 질환의 원인 유전자(amyloid precursor protein, tau, Huntingtin) 또는 외부 스트레스로부터 신경세포를 보호한다고 알려진 유전자(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Heme oxygenase-1)가 바람직하다.
발명에 이용되는 벡터는 바이러스 벡터가 바람직하며 보다 바람직하게는 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)) 또는 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999))에 적용될 수 있다. 보다 바람직하게는 레트로 바이러스이다.
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 또한, 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 목적 유전자 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 목적 유전자 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
본 발명에 이용되는 레트로바이러스는 MoMuLV(moloney murine leukemia virus), HaMuSV(harvey murine sarcoma virus), MuMPSV(murine myeloproliferative sarcoma virus), Rev(reticuloendotheliosis virus), MSCV(murine stem cell virus) 또는 RSV(rous sarcoma virus)인 것이 바람직하다. 레트로바이러스 벡터는 LTR(long terminal repeat)을 포함하며, LTR은 일반적으로 프로바이러스(provirus)에서 기능적으로 한정된 3가지 부위 U3, R, U5를 5´과 3´양쪽 모두에 갖는다. U3 부위는 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 위한 서열을 포함한 전사에 중요한 서열들을 가지고 있으며, 일반적으로 5´쪽에 있으면 프로모터로 3´쪽에 있으면 전사의 터미네이터로 작용한다. 전사는 R 부위의 시작부위에서 개시되므로 R의 5´ 끝부분은 mRNA가 시작되는 점이며, 3´ 끝부분은 mRNA가 끝나는 점이다. 따라서 바이러스의 RNA에서 5' 말단은 프로바이러스의 5' LTR에서 유래한 R과 역전사가 시작되는 부위인 U5 부위를 가지고 있는 반면에 3' LTR에서 유래된 U3 부위는 3' 말단에 존재한다. 본 발명에 이용되는 레트로바이러스는 세포타입 특이적 발현을 위해 U3부위를 결손시켜 사용할 수 있다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp . Hematol . (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (목적 유전자 서열)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors : A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995))로부터 유래된 벡터들도, 목적 유전자 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
단계 (b): 인간을 제외한 동물의 배아( embryo )의 뇌실에 UIGD ( Ultrasound Image - Guided Gene Delivery )을 이용한 상기 제작된 바이러스 벡터의 주입
본 발명의 신경세포 타입-특이적 발현벡터는 인간을 제외한 동물의 배아의 뇌실에 주입되는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 인간을 제외한 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 마우스이다. 일반적으로 배아는 접합체(수정란)이 세포분열을 통해 여러 개의 세포가 되고, 분열된 세포가 세포분열과 분화를 거쳐 형성하는 것으로 태아 이전까지의 상태이다. 본 발명에서 이용되는 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery) 기술은 초기 신경관(뇌실)으로 특이적인 백터의 전달이 가능하게 하는 목적으로 개발되었다. 신경 줄기 세포의 초기에 감염시켜 뇌실로 주입되어 뇌실영역에 존재하는 벡터는 신경 줄기세포가 분화됨에 따라 다양한 신경 세포로 전달된다. 따라서, 본 발명에서 배아의 뇌실에 바이러스 벡터를 주입할 때 UIGD를 이용하는 것이 효과적이다.
단계 (c): 상기 배아의 발달을 통한 상기 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 신경세포의 수득.
본 발명의 신경세포 타입-특이적 발현 벡터를 주입한 배아는 발달하여 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타낸다.
하기 실시예를 따르면, 컨트롤로 이용되는 MS 벡터를 주입한 마우스는 뉴런 특이적 마커인 NeuN-양성과 NeuN-음성 세포 모두에서 목적 유전자인 eGFP 발현이 관찰되었으나, 본 발명의 벡터 POK를 주입한 마우스의 경우에는 NeuN-양성 세포에서 선택적으로 eGFP를 발현하는 양상을 보였다. 결과적으로 뉴런 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 신경 세포를 수득할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 목적 유전자의 신경세포(neural cell)-타입 특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조방법을 제공한다.
(a) (i) 신경세포 타입-특이적 프로모터; 및 (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 목적 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 제작된 바이러스 벡터를 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery)을 이용하여 인간을 제외한 동물의 배아(embryo)의 뇌실에 주입하는 단계; 및
(c) 상기 배아를 발달시켜 상기 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 얻는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 발현벡터를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): (i) 신경세포 타입-특이적 프로모터; 및 ( ii ) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된( operatively linked to ) 목적 유전자를 포함하는 바이러스 벡터의 제작
본 발명의 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 방법을 위해 신경세포 타입-특이적 발현벡터를 제작한다. 본 발명에서 이용되는 벡터는 기본적으로 발현 컨스트럭트를 포함하며, 이는 “신경세포 타입-특이적 프로모터-목적 유전자-폴리아데닐화 서열”을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 발현 벡터에서, 목적 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 본 발명에 있어서, 목적 유전자에 결합된 프로모터는, 신경세포 타입-특이적 프로모터로써 뉴런(neuron)-, 성상세포(astrocyte)- 또는 희돌기교세포(oligodendrocyte)-특이적 프로모터가 바람직하며, 이 중 뉴런-특이적 프로모터는 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터, ICAM-4 프로모터(US 5753502), 에놀라아제(enolase) 프로모터 또는 시냅신(synapsin) 프로모터가 바람직하다. 보다 바람직하게는 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터이다.
본 발명에 이용되는 벡터는 바이러스 벡터가 바람직하며 보다 바람직하게는 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)) 또는 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999))에 적용될 수 있다. 보다 바람직하게는 레트로 바이러스이다.
단계 (b): 인간을 제외한 동물의 배아( embryo )의 뇌실에 UIGD ( Ultrasound Image - Guided Gene Delivery )을 이용한 상기 제작된 바이러스 벡터의 주입
본 발명의 신경세포 타입-특이적 발현벡터는 인간을 제외한 동물의 배아의 뇌실에 주입되는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 인간을 제외한 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 마우스이다. 일반적으로 배아는 접합체(수정란)이 세포분열을 통해 여러 개의 세포가 되고, 분열된 세포가 세포분열과 분화를 거쳐 형성하는 것으로 태아 이전까지의 상태이다. 본 발명에서 이용되는 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery) 기술은 초기 신경관(뇌실)으로 특이적인 백터의 전달이 가능하게 하는 목적으로 개발되었다. 신경 줄기 세포의 초기에 감염시켜 뇌실로 주입되어 뇌실영역에 존재하는 벡터는 신경 줄기세포가 분화됨에 따라 다양한 신경 세포로 전달된다. 따라서, 본 발명에서 배아의 뇌실에 바이러스 벡터를 주입할 때 UIGD를 이용하는 것이 효과적이다.
단계 (c): 상기 배아의 발달을 통한 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 얻음
본 발명의 신경세포 타입-특이적 발현 벡터를 주입한 배아는 발달하여 신경세포 타입-특이적 발현 양상을 나타낸다. 하기 실시예를 따르면, 컨트롤은 뉴런 특이적 마커인 NeuN-양성과 NeuN-음성 세포 모두에서 목적 유전자의 발현이 관찰되었으나, 본 발명의 벡터 주입한 마우스의 경우 NeuN-양성 세포에서 선택적으로 eGFP를 발현하는 양상을 보였다. 결과적으로 뉴런 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 동물모델을 얻을 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 뉴런-특이적 목적 유전자의 발현용 재조합 레트로바이러스 벡터를 제공한다.
(a) U3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus)의 5‘-LTR(long terminal repeat);
(b) 토끼 글로빈 (Rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열-목적 유전자-뉴런 특이적 프로모터로서 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터를 포함하는 목적 유전자 발현 컨스트럭트; 및
(c) 서열목록 제1서열의 ΔU3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 3‘-LTR.
본 발명에 있어서 뉴런-특이적으로 목적 유전자를 발현하기 위해 재조합 레트로바이러스 벡터를 이용한다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 LTR(long terminal repeat)을 포함하며, LTR은 일반적으로 프로바이러스(provirus)에서 기능적으로 한정된 3가지 부위 U3, R, U5를 5´과 3´양쪽 모두에 갖는다. U3 부위는 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 위한 서열을 포함한 전사에 중요한 서열들을 가지고 있다. 전사는 R 부위의 시작부위에서 개시되므로 R의 5´ 끝부분은 mRNA가 시작되는 점이며, 3´ 끝부분은 mRNA가 끝나는 점이다. 따라서 바이러스의 RNA에서 5' 말단은 프로바이러스의 5' LTR에서 유래한 R과 역전사가 시작되는 부위인 U5 부위를 가지고 있는 반면에 3' LTR에서 유래된 U3 부위는 3' 말단에 존재한다. 본 발명에 이용되는 레트로바이러스의 LTR은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(moloney murine leukemia virus)이며 뉴런 특이적 발현을 위해 3‘의 U3부위를 결손시켜 사용한다.
본 발명의 재조합 벡터가 포함하는 목적 유전자 발현 컨스트럭트는 프로모터로서 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터를 포함하며 이에 목적 유전자가 작동적으로 결합되어 있다. 본 발명의 벡터에 의해 운반되는 목적 유전자는 예를 들어 리포터(예컨대, GFP) 유전자, 신경생장인자(nerve growth factor), 신경전달물질(neurotransmitter), 신경세포접착분자(neural cell adhesion molecule), 신경영양인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor), 인지능력에 관여하는 유전자(CREB; cAMP response element-binding), 신경퇴행성 질환의 원인 유전자(amyloid precursor protein, tau, Huntingtin) 또는 외부 스트레스로부터 신경세포를 보호한다고 알려진 유전자(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Heme oxygenase-1)가 바람직하다. 목적 유전자는 폴리 아데닐화 서열과 결합되어 있으며 본 발명의 벡터에 이용되는 폴리아데닐화 서열은 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열이다.
본 발명의 벡터는 인비트로(in vitro) 세포 배양 실험 또는 유전자 치료(gene therapy)와 같은 임상 등 다양한 신경세포에서 유전자 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 목적 유전자를 효과적으로 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 목적 유전자의 신경세포(neural cell) 타입-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 얻기 위한 비용-절감적이고 보다 효율적인 제조방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 목적 유전자를 신경세포 타입-특이적 발현하는 방법 및 이를 이용한 동물모델을 제공함으로써, 신경세포에서 유전자 연구에 유용하게 이용될 수있다.
도 1은 초기배아의 뇌에서 신경세포 특이적 유전자 전달을 나타낸 것이다. MS-eGFP와 Adeno-eGFP는 각각 293T와 293 세포에서 수득하였다. 두 벡터는 배아(배아일 9.5; embryonic day)의 뇌실로 주입되었고 배아일 14.5에 초기배아의 뇌를 분석하였다. (a) 배아일 14.5에 뇌를 eGFP 및 TuJ1(성숙 신경세포 마커)로 이중 레이블링(labeling)하였다. (b) 세 개의 뇌 절편에서 eGFP-양성 세포 중에 TuJ1-음성와 TuJ1-양성 세포를 카운팅하였다. (scale bar; 100 ㎕)
도 2는 성숙 마우스의 뇌에서 뉴런 특이적 유전자 발현을 나타낸 것이다. (a)는 컨트롤로서 5‘에 MoMLV LTR 및 3’에 MSCV LTR를 포함하는 MS 벡터를 사용하였다. 내부 프로모터를 위해 hPDGF 프로모터 및 3’LTR에 결손이 있는 U3(ΔU3, 447-bp-길이의 U3에서 393 bp가 결손된 U3)를 포함하는 POK 벡터를 사용하였다. pA(폴리아데닐화 서열)로서 토끼 글로빈 폴리아데닐화 서열을 이용하였다. 두 벡터는 리포터 유전자로서 eGFP를 발현한다. (b) MS-eGFP 및 POK-eGFP는 배아일 9.5에 배아의 뇌실에 주입되었고 생후 3-4주의 마우스 뇌를 eGFP와 NeuN(뉴런 마커)로 이중 레이블링하였다. (c) 세 개의 뇌 절편에서 eGFP-양성 세포 중에 NeuN-양성 세포의 수를 카운팅하였다. (Scale bar; 100 ㎛) 축약(Abbreviation): MoMLV, Moloney murine leukemia virus; MSCV, murine stem cell virus; LTR, long terminal repeat; hPDGF, human platelet-derived growth factor pA, poly A 시그널 서열(토끼 글로빈 폴리 아데닐화 서열).
도 2는 성숙 마우스의 뇌에서 뉴런 특이적 유전자 발현을 나타낸 것이다. (a)는 컨트롤로서 5‘에 MoMLV LTR 및 3’에 MSCV LTR를 포함하는 MS 벡터를 사용하였다. 내부 프로모터를 위해 hPDGF 프로모터 및 3’LTR에 결손이 있는 U3(ΔU3, 447-bp-길이의 U3에서 393 bp가 결손된 U3)를 포함하는 POK 벡터를 사용하였다. pA(폴리아데닐화 서열)로서 토끼 글로빈 폴리아데닐화 서열을 이용하였다. 두 벡터는 리포터 유전자로서 eGFP를 발현한다. (b) MS-eGFP 및 POK-eGFP는 배아일 9.5에 배아의 뇌실에 주입되었고 생후 3-4주의 마우스 뇌를 eGFP와 NeuN(뉴런 마커)로 이중 레이블링하였다. (c) 세 개의 뇌 절편에서 eGFP-양성 세포 중에 NeuN-양성 세포의 수를 카운팅하였다. (Scale bar; 100 ㎛) 축약(Abbreviation): MoMLV, Moloney murine leukemia virus; MSCV, murine stem cell virus; LTR, long terminal repeat; hPDGF, human platelet-derived growth factor pA, poly A 시그널 서열(토끼 글로빈 폴리 아데닐화 서열).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
세포 배양
293(CRL-1537)과 293T(CRL-11268) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매하였고 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)배지에 배양하였다.
바이러스 벡터의 구축
E1/E3가 제거된 아데노바이러스 벡터(pAxCAwtit2)(Takara, Osaka, 일본)를 사용하였다. pAxCAwtit2의 제한효소 SwaⅠ 사이트를 이용하여 eGFP 서열을 넣어 Adeno-eGFP를 완성하였다. MS-eGFP는 이전 연구에 보고된 방법에 의해 실시하였다(12). hPDGF(human platelet-derived growth factor)의 프로모터는 프라이머 hPDGF F(5’-ACGCGTGATCCACAGTCTCCTGAG-3’)와 hPDGF R (5’-GGATCCCCTAGGGAGGCAGCGGGG-3’)을 사용하여 HT1080의 지놈 DNA를 주형으로 증폭하였다. 증폭된 hPDGF 프로모터는 pGem T easy(Promega, Madison)로 클로닝하여 pGem T easy-hPDGF 프로모터를 완성하였다. hPDGF 프로모터를 제한효소 MluⅠ/BamHⅠ로 처리한 후 ROK-eGFP(14)의 MluⅠ/BamHⅠ 사이트를 이용하여 POK-eGFP를 완성하였다.
바이러스 벡터의 생산
아데노바이러스 벡터는 구입처의 설명서에 따라 수득 및 농축하였다. 레트로바이러스 벡터는 림포펙타민-플러스(Lipofectamine-PLUS)(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 gag-pol(pCA-gag-pol)과 env 발현벡터(pCA-VSV-G)로 293T 세포에 형질감염 되었다(12, 15). 형질감염 후 48시간 배양한 상층액을 회수하여 SW32 로터로 25,000 rpm, 4 ℃에서 90분간 원심분리함으로써 농축하였다. 펠렛은 4 ℃에서 약 12동안 PBS 50 ㎕로 재현탁하였으며 분주한 바이러스는 -80 ℃에 보관하였다.
초기배아의
뇌의 뇌실로의
인비보
(
in
vivo
) 주입
모든 동물 실험 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul National University)에 의해 승인되었다. 바이러스 주입을 위해 적절한 시기에 임신한 CD-1 마우스가 사용되었으며 오전에 질전(vaginal plug)이 관찰된 마우스의(0.5 days)의 배아를 이용하였다. 바이러스 전달은 종뇌(telencephalic)의 뇌실(배아일 9.5; embryonic day)로 이전 연구에서 보고된 UIGD를 이용하여 수행하였다(2). 간단하게, 임신한 마우스는 졸레틸 50(Zoletil 50; Virbac, SA, Carros, France)과 롬펀(rompun; Bayer Korea, Korea)을 사용하여 마취시켰다. 자궁을 착출한 후 태아를 UBM(ultrasound biomicroscopic) 이미징 시스템(Vevo660; VisualSonics, Toronto, Canada)을 이용하여 정밀 촬영하였다. 레트로바이러스와 아데노바이러스는 최종농도 80 ㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene)과 중뇌 뇌실(배아일 9.5)로 주입되었다.
면역 조직 화학(
immunohistochemistry
)
면역형광염색을 위해 다음의 항체를 사용하였다: rabbit anti-GFP (1:500, Invitrogen), mouse anti-NeuN (1:100, Millipore, Bedford, MA), mouse anti-class III β-tubulin antibody (TuJ1) (1:500, Covance, Richmond, CA)
또한 이차항체로는 다음의 항체를 사용하였다: Alexa Fluor 488- donkey anti-rabbit IgG (1:500, Invitrogen), Alexa Fluor 555-donkey anti-mouse IgG (1:500, Invitrogen)
뇌 절편은 PBS(phosphate buffered saline)에서 세척된 후 1% FBS 및 0.2% Triton X-100을 포함한 PBS로 1시간동안 블러킹되었다. 이후 4°C, 오버나이트(overnight)의 조건하에서 일차 항체로 처리하였고 PBST(0.1% Tween-20을 포함한 PBS)로 3번 반복하여 세척하였다. 이후 이차 항체로 상온에서 1시간 동안 처리되었다.
실험 결과
아데노바이러스를
이용한
초기배아
뇌에서의 신경세포 특이적 유전자의 전달
레트로바이러스와는 다르게 아데노바이러스 DNA는 숙주 세포에서 숙주 유전자로 인테그레이션 하지 않고 에피좀으로 존재한다. 그러므로 초기배아의 뇌에 전달되는 아데노바이러스 벡터의 유전자 발현 패턴은 레트로바이러스 벡터와는 다를 것이라고 기대되었다. 이러한 이유로, eGFP를 발현하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터(Adeno-eGFP)를 구축하였고 293 세포주에서 수득하였다. 이전 연구에서 마우스 뇌에서 유전자 발현에 적합하다고 보고된 레트로바이러스 벡터 MS를 컨트롤로써 사용하기 위해서 eGFP를 발현하는 MS 벡터는 293T 세포에서 수득하였다. 수득한 각각의 벡터는 UIGD 기술을 이용하여 배아의 뇌실에 주입되었으며(배아일 9.5), 마우스의 뇌는 신경발생의 정점(배아일 14.5)에서 분석하였다. MS 벡터의 경우, eGFP-양성 세포가 신경 줄기 세포가 존재하는 뇌실영역과 TuJ1(성숙 신경세포 마커) 염색 부분 모두에서 관찰되었다(도 1a). 마우스 뇌에서 전체 eGFP-양성 세포 중 TuJ1-음성 세포는 약 15%이고, 약 85%가 TuJ1-양성 세포이다(도 1b). 반면에, Adeno-eGFP가 초기배아의 뇌에 주입된 경우에는 거의 모든 eGFP-양성 세포가 TuJ1-양성 세포였고, 극소수의 eGFP-양성 세포만 뇌실영역에서 발견되었다(도 1a 및 도 1b). 배아 신경발생의 시작이 약 배아일 10이기 때문에, 배아일 9.5 배아의 뇌실에 주입된 바이러스 벡터는 신경 줄기세포로 초기에 이동된다. 레트로바이러스 벡터는 숙주 염색체에 인테그레이션되므로 전이 유전자가 신경 줄기세포만큼 딸 뉴런에서 발현될 수 있는 반면, 복제 결함 아데노바이러스 DNA는 신경 줄기 세포의 분화동안 두 개의 딸세포 중 어느 하나로 전이된다. 따라서 신경발생 과정동안 신경 줄기세포 분화의 수에 따라, 아데노바이러스 DNA는 분화하는 뉴런으로 거의 전달될 것이다. 이러한 사실은 신경발생 초기에 초기배아의 뇌에 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 주입함으로써, 전이 유전자가 초기배아의 신경세포에 선택적으로 전달될 수 있다는 것을 나타낸다.
레트로바이러스 벡터를 사용한 성숙 마우스의 뇌에서 뉴런 특이적 유전자 발현.
상기 언급한 신경세포 선택적인 유전자 전달을 응용하여 뉴런 특이적인 유전자의 발현은 벡터의 유전자 발현조절을 통해 성취할 수 있다. 뉴런에서 전이유전자를 특이적으로 발현하기 위해서, 뉴런 특이적 프로모터를 포함한 레트로바이러스 벡터를 구축하였다. 바이러스 프로모터 U3는 다양한 세포 타입에서 활성화되고 내부 프로모터의 전사적 활성에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있다(12, 13). U3 결함 레트로바이러스 벡터는 본 발명자의 이전 연구에서 사용된 것을 백본으로서 사용되었다(10, 11). 도 2a에서 볼 수 있듯이 뉴런 특이적으로 알려진 인간 혈소판에서 유도된 성장 호르몬(human platelet-derived growth factor; hPDGF) 프로모터가 POK 벡터에서 전이 유전자 활성을 조절하는 데 사용되었다. 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포로 구성된 모든 주요 신경세포 타입에서 발현한다고 보고된 MSCV LTR을 포함한 MS 벡터가 컨트롤로 사용되었다. eGFP를 발현하는 두 벡터를 배아일 9.5의 초기배아의 뇌에 주입하였고 생후 3-4주에 마우스 뇌를 분석하였다. MS벡터의 경우, NeuN-양성(뉴런)과 NeuN-음성 세포 모두에서 eGFP 발현이 관찰되었다(도 2b). eGFP-양성 세포를 뇌에서 카운팅한 결과에서 NeuN-양성 세포가 전체의 약 30%였다(도 2c). 이와 대조적으로 POK 벡터는 NeuN-양성 세포에서 선택적으로 eGFP를 발현하였으며, 극히 일부 eGFP-양성 세포만 NeuN-음성 세포에서 관찰되었다(도 2b 및 도 2c). 이러한 데이터는 UIGD 기술을 사용하여 POK 벡터를 주입함으로써 뉴런 특이적으로 전이 유전자를 발현하는 성숙 동물 모델을 개발할 수 있음을 나타낸다.
참고문헌
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서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 다음의 단계를 포함하는 목적 유전자의 뉴런(neuron)-특이적 발현 방법:
(a) 뉴런-특이적 목적 유전자의 발현용 재조합 레트로바이러스 벡터를 제작하는 단계에서, 상기 벡터는 (i) U3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus)의 5‘-LTR(long terminal repeat); (ii) 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열-목적 유전자-뉴런 특이적 프로모터로서 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터를 포함하는 목적 유전자 발현 컨스트럭트; 및 (iii) 서열목록 제1서열의 ΔU3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 3‘-LTR를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계;
(b) 상기 제작된 레트로바이러스 벡터를 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery)를 이용하여 인간을 제외한 동물의 배아(embryo)의 뇌실에 주입하는 단계; 및
(c) 상기 배아를 발달시켜 상기 목적 유전자의 뉴런-특이적 발현 양상을 나타내는 신경세포를 얻는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 목적 유전자의 뉴런(neuron)-타입 특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조방법:
(a) 뉴런-특이적 목적 유전자의 발현용 재조합 레트로바이러스 벡터를 제작하는 단계에서, 상기 벡터는 (i) U3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus)의 5‘-LTR(long terminal repeat); (ii) 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열-목적 유전자-뉴런 특이적 프로모터로서 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터를 포함하는 목적 유전자 발현 컨스트럭트; 및 (iii) 서열목록 제1서열의 ΔU3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 3‘-LTR를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계;
(b) 상기 제작된 레트로바이러스 벡터를 UIGD(Ultrasound Image-Guided Gene Delivery)를 이용하여 인간을 제외한 동물의 배아(embryo)의 뇌실에 주입하는 단계; 및
(c) 상기 배아를 발달시켜 상기 목적 유전자의 뉴런-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 얻는 단계.
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- 제 6 항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는 뉴런-특이적 목적 유전자의 발현용 재조합 레트로바이러스 벡터:
(a) U3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus)의 5‘-LTR(long terminal repeat);
(b) 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열-목적 유전자-뉴런 특이적 프로모터로서 hPDGF(human platelet-derived growth factor) 프로모터를 포함하는 목적 유전자 발현 컨스트럭트; 및
(c) 서열목록 제1서열의 ΔU3 부위-R 부위-U5 부위를 포함하는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 3‘-LTR.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110082718A KR101290799B1 (ko) | 2011-08-19 | 2011-08-19 | 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110082718A KR101290799B1 (ko) | 2011-08-19 | 2011-08-19 | 목적 유전자의 신경세포 타입-특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 |
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Family Applications (1)
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| US20040197313A1 (en) * | 2003-04-02 | 2004-10-07 | Institute Of Materials Research And Engineering | Promoter construct for gene expression in neuronal cells |
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2011
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Nat. Neurosci. Vol. 2, No. 9, pp. 812-819 (1999. 9.) * |
| Nat. Neurosci. Vol. 2, No. 9, pp. 812-819 (1999. 9.)* |
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| KR20130020222A (ko) | 2013-02-27 |
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