CN1239699C - 利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法。利用细菌转座子作用原理，在大肠杆菌内即能完成家蚕重组杆状病毒的构建。利用家蚕杆状病毒BmNPV和AcNPV基因组高度同源，借鉴AcNPVBac-to-Bac表达系统的构建方法，利用基因重组原理，构建适用于可利用我国特色资源-家蚕的新型快速表达系统。解决了在重组病毒构建过程中传统的需要利用昆虫培养细胞进行重组病毒的空斑筛选的过程中费时费力的缺点，缩短了重组病毒构建所需时间，加快了基因表达系统的工作进程。在未来生物技术产业利用家蚕作为“生物工厂”表达生产重组蛋白、基因药物、工程疫苗及后基因组时代蛋白质结构功能分析方面，具有推广的使用价值。
Description
所属技术领域
本发明涉及DNA重组技术，尤其涉及一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法。
背景技术
昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System，简称BEVS)是利用携带有外源目的基因的重组昆虫杆状病毒作载体在昆虫体内或昆虫培养细胞进行表达生产的一个重组蛋白生产系统。由于该系统所需要的周期远比动物或植物系统短，可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产，生产的重组蛋白产量高，蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统好，且由于昆虫杆状病毒具有限制性的宿主范围，只对特定性的昆虫及其细胞进行感染，对人畜等脊椎动物是非感染性的，因此具有比在哺乳动物及其培养细胞生产的重组蛋白质更为安全等优点而成为目前最有效的真核表达系统之一。目前BEVS主要包括欧美国家正在广泛应用的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，简称AcNPV)和以中国、日本为代表的家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，简称BmNPV)表达系统两大类。AcNPV表达系统主要使用昆虫培养细胞进行表达，而BmNPV表达系统由于可以利用我国饲养量最大的经济昆虫-家蚕作为表达载体从而具有成本低、适合产业规模化生产的优点，非常具有我国特色。但目前该领域国外开发的相关基因工程产品〔包括载体质粒等〕大都是面向AcNPV表达系统，虽然BmNPV与AcNPV两者相似，均具有130Kb大小的环状双链DNA基因组，且高度同源(大于90％)，但寄主范围有各自的专一性，两者不能交叉感染，因此这些产品不能应用于家蚕。
传统的重组病毒构建方法包含两步：首先将所需表达的基因插入到一个转移质粒中，该质粒含有杆状病毒启动子(通常为多角体启动子)和两侧部分同源序列。然后将这样构建的重组转移质粒与环状的野生病毒基因组共转染入昆虫细胞。通过基因同源重组(多角体蛋白基因为病毒复制非必需，可由目的基因替换)，通常产生约0.1-1％的含目的基因的重组病毒。随后采用空斑分析的方法筛选出不含多角体的重组病毒。由于99％以上为野生型的病毒，分离纯化重组病毒有较大难度，尤其对于没有经验的人来说这样的筛选非常困难，一定程度上限制了它的应用。通过对病毒基因组的线性化，重组病毒产生的比例可以提高到近30％。使用删除了多角体下游部分必需基因的病毒基因组，重组病毒产生的比例甚至可提高到80％。但不管那种方法，在共转染后为了除去各种可能的非重组病毒，还必须采用空斑纯化的方法来得到真正的纯重组病毒。这样至少花费4-6个星期甚至更长。
近年来，美国孟山多(MONSANTO)公司成功开发了一种快速、高效产生重组AcNPV病毒的技术，利用细菌转座子作用原理，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为Bac-To-Bac表达系统，意即从细菌(bacterium)到杆状病毒(baculovirus)，改变了传统重组昆虫杆状病毒的构建方法。其基本原理为：将一个改造后AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它象普通质粒一样能在菌内复制(由于太大，只限单拷贝)，将其称之为杆状病毒穿梭载体(baculovirusshuttle vector，又称病毒质粒baculovirus plasmid，将首尾合写而成为Bacmid)，通过位点特异性转座子转座作用，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。杆状病毒穿梭载体Bacmid含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码LacZα肽的部分DNA片段。在LacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子Tn7(mini-attTn7)整合所需的靶位点(attachment site)，但它的插入不影响LacZα基因的表达阅读框架。将杆状病毒穿梭载体Bacmid(136kb)转化入大肠杆菌DH10β，获得转化子将其命名为DH10BacTM。因此，Bacmid象一个大质粒一样，可以在E.Coli中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性(kanR)，且与存在于受体菌染色体上的LacZot缺失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Bluo-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑(lac+)。
重组Bacmid通过pFASTBACTM供体质粒(donor plasmid)上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒(helper plasmid，13.2kb)的功能作用下，将外源目的基因插入到Bacmid中来完成。helper plasmid表达转座酶并含有四环素(tetracycline)抗性基因。pFASTBACTM系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动子(polyhedrin或p10)，在mini-Tn7左右臂间含有一个完整的表达cassette，包括庆大霉素抗性基因(Gmr)、杆状病毒启动子、多克隆位点及SV40ploy(A)。外源基因插入到杆状病毒启动子下游的多克隆位点，将此重组的供体质粒转化入含有helper plasmid和Bacmid的DH10BacTM中，由mini-Tn7转座子将表达cassette插入到Bacmid的靶位点，从而破坏了LacZα基因的表达，使得LacZα+变为LacZα-。在含有卡那霉素、庆大霉素和四环素和X-gal的培养板进行筛选，重组的Bacmid(即重组病毒基因组)转化体菌落呈现白色，而非重组Bacmid转化菌落依然为蓝色，因此可以根据菌落的颜色进行重组病毒的筛选。通过单菌斑的培养，抽提得到重组Bacmid基因，随后转染入昆虫培养细胞获得重组病毒，即可进行重组蛋白的表达生产。
利用位点特异性转座作用将外源基因插入到能在E.Coli增殖的穿梭载体Bacmid，实现重组病毒的构建，此方法的优点在于：a.由于重组病毒的分离是通过蓝白菌斑筛选，不存在野生型和非重组型病毒污染的问题，因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒；b.大大地缩短了重组病毒构建所需的时间，可以由原来的4-6周或更长减少到仅7-10天。因此，此技术允许快速、同时分离多种重组病毒。因此，Bac-To-Bac表达系统是目前最好的杆状病毒表达系统。
由于家蚕BmNPV和AcNPV高度同源，将含有单拷贝数F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组，替换多角体蛋白基因，即能构建适用于家蚕的Bac-To-Bac快速表达系统。
基因工程生物产业被称为21世纪的朝阳产业。随着我国“WTO”的加入，建立起适合于我国国情并具有特色的生物技术产业迫在眉捷。我国具有极为丰富的家蚕资源，家蚕个体大、极易饲养且便于管理，非常适合利用它作为“生物工厂”进行重组蛋白表达生产，在工程疫苗和药物生产、蛋白质研究、生物杀虫剂等领域具有很大潜在的应用前景。另一方面，进入后基因组时代后，蛋白质的结构、功能分析，需要一个快速、高通量的表达系统。开发适用于家蚕的快速基因表达系统具有很强的应用性，期望为我国未来的基因工程生物产业提供一个拥有自主知识产权的高科技产品，成为促使和推动我国生物技术产业崛起的一个重要技术支撑。
发明内容
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，简称BmNPV)表达系统是目前最主要的昆虫杆状病毒表达系统，但目前在重组病毒构建过程中采用的传统的空斑筛选方法具有费时费力的缺点。本发明的目的在于提供一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：
(1)家蚕野生型BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb基因序列的克隆，设计的引物为：左侧正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGTACAAACACGATAGC-3；右侧正向引物为5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物为5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左侧2kb基因PCR反应的条件为：反应液含2.0ul的0.1ug的家蚕BmNPV基因组DNA作为模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左侧基因正反向引物，1单位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至50ul，反应进行30个循环反应条件为95℃变性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一个循环的延伸时间为10分，右侧2kb基因PCR反应的条件与左侧2kb基因PCR反应条件相同，但引物采用右侧2kb基因的正反向引物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；
(2)含有单拷贝数F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点AttTn7、编码LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性选择标记基因的8.6kb片段的克隆，引物设计如下：正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位点，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位点；PCR反应的条件为：反应液含1.0ul的0.1ug的购自美国Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表达系统病毒穿梭载体Bacmid基因组DNA作为模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至25ul，反应进行30个循环，反应条件为95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一个循环的延伸时间为10分；
(3)将上述获得的BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb片段分别进行末端处理加上EcoRI位点和XbaI位点，并对克隆得到的8.6kb的片段进行EcoRI和XbaI消化处理，分别取2.ul并加上连接酶进行体外14℃温度下连接，使之成为一个大小为12.6kb的线性片段；
(4)从AcNPV Bac-to-Bac表达系统DH10Bac感受态细胞中分离出13.2kb辅助质粒helper plasmid，采用常用的DNA分离方法，收集过夜培养的转化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸钾KAc和苯酚，最后用异苯醇沉淀DNA，融解于TE缓冲液；
(5)将(3)连接得到的线性片段与家蚕130kb BmNPV基因组混合，在离子脂质体Lipofectin介导下共转染入家蚕培养细胞，从感染的细胞中分离出病毒基因组，即BmNPV和重组的BmNPV基因组的混合物；在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞，培养基不含血清，24小时后更换含10％胎牛血清的培养基，27℃培养5天，收集感染细胞并从中抽提病毒基因组DNA，将其转化入大肠杆菌DH10β感受态细胞，在含有卡那霉素、X-gal培养基上利用蓝白斑分析法筛选出含病毒穿梭载体的转化子，即蓝斑，并将其命名为家蚕病毒穿梭载体BmBacmid，野生型BmNPV基因组的转化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培养基上生长，最后分离得到蓝斑的家蚕BmBacmid转化子；
(6)将转化子进行象普通大肠杆菌细胞培养的方法，制备其感受态细胞，并将13.2kb辅助质粒转化入其中，在含有四环素和卡那霉素的培养基上进行筛选，获得同时含家蚕病毒穿梭载体BmBacmid和辅助质粒的转化子，将其命名为DH10BmBac，这样就构建完成了适合于家蚕的重组病毒快速基因表达系统，可以用于重组蛋白质的生产。
本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是：
本发明较好地解决了在重组家蚕杆状病毒构建过程中传统的需要利用昆虫培养细胞进行重组病毒的空斑筛选的过程中费时费力的缺点，大大缩短了重组病毒构建所需时间，加快了基因表达系统的工作进程。在未来生物技术产业利用家蚕作为“生物工厂”表达生产重组蛋白、基因药物、工程疫苗及后基因组时代蛋白质结构功能分析方面，具有推广的使用价值。
附图说明
附图是本发明的利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法流程图。
具体实施方式
1、材料：家蚕BmN细胞和昆虫培养细胞Sf21，AcNPV和BmNPV病毒，Sf21细胞培养基TC-100采用GibcoBRL产品，使用前加入体积比为10％的胎牛血清，培养温度均为27℃。家蚕幼虫1-3龄人工饲料育，29℃饲养，4-5龄桑叶育，23-25℃饲养。基因操作所使用的各种酶及PCR扩增试剂盒，为日本宝酒造公司产品，TA克隆试剂盒、质粒pCR2.1及AcNPV Bac-to-Bac表达系统中的DH10，Bacmid购自美国Invitrogen公司，杆状病毒基因组DNA抽提采用Stratagene公司的试剂盒进行，共转染所使用的Lipofectin试剂为LIFETECHNOLOGIES公司产品，DNA序列根据PE Applied Biosystems提供的试剂盒在DNA序列分析仪上测定。
2、工作流程：
(1)家蚕野生型BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb基因序列的克隆，设计的引物为：左侧正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGT ACAAACACGATAGC-3；右侧正向引物为5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物为5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左侧2kb基因PCR反应的条件为：反应液含2.0u1的0.1ug的家蚕BmNPV基因组DNA作为模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左侧基因正反向引物，1单位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至50ul，反应进行30个循环反应条件为95℃变性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一个循环的延伸时间为10分，右侧2kb基因PCR反应的条件与左侧2kb基因PCR反应条件相同，但引物采用右侧2kb基因的正反向引物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；
(2)含有单拷贝数F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点AttTn7、编码LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性选择标记基因的8.6kb片段的克隆，引物设计如下：正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位点，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位点；PCR反应的条件为：反应液含1.0ul的0.1ug的购自美国Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表达系统病毒穿梭载体Bacmid基因组DNA作为模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH 8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至25ul，反应进行30个循环，反应条件为95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一个循环的延伸时间为10分；
(3)将上述获得的BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb片段分别进行末端处理加上EcoRI位点和XbaI位点，并对克隆得到的8.6kb的片段进行EcoRI和XbaI消化处理，分别取2.ul并加上连接酶进行体外14℃温度下连接，使之成为一个大小为12.6kb的线性片段；
(4)从AcNPV Bac-to-Bac表达系统DH10Bac感受态细胞中分离出13.2kb辅助质粒helper plasmid，采用常用的DNA分离方法，收集过夜培养的转化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸钾KAc和苯酚，最后用异苯醇沉淀DNA，融解于TE缓冲液；
(5)将(3)连接得到的线性片段与家蚕130kb BmNPV基因组混合，在离子脂质体Lipofectin介导下共转染入家蚕培养细胞，从感染的细胞中分离出病毒基因组，即BmNPV和重组的BmNPV基因组的混合物；在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞，培养基不含血清，24小时后更换含10％胎牛血清的培养基，27℃培养5天，收集感染细胞并从中抽提病毒基因组DNA，将其转化入大肠杆菌DH10β感受态细胞，在含有卡那霉素、X-gal培养基上利用蓝白斑分析法筛选出含病毒穿梭载体的转化子，即蓝斑，并将其命名为家蚕病毒穿梭载体BmBacmid，野生型BmNPV基因组的转化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培养基上生长，最后分离得到蓝斑的家蚕BmBacmid转化子；
(6)将转化子进行象普通大肠杆菌细胞培养的方法，制备其感受态细胞，并将13.2kb辅助质粒转化入其中，在含有四环素和卡那霉素的培养基上进行筛选，获得同时含家蚕病毒穿梭载体BmBacmid和辅助质粒的转化子，将其命名为DH10BmBac，这样就构建完成了适合于家蚕的重组病毒快速基因表达系统，可以用于重组蛋白质的生产。
Claims (1)
1、一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法，其特征在于：
(1)家蚕野生型BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb基因序列的克隆，设计的引物为：左侧正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGT ACAAACACGATAGC-3；右侧正向引物为5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物为5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左侧2kb基因PCR反应的条件为：反应液含2.0ul的0.1ug的家蚕BmNPV基因组DNA作为模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左侧基因正反向引物，1单位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至50ul，反应进行30个循环反应条件为95℃变性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一个循环的延伸时间为10分，右侧2kb基因PCR反应的条件与左侧2kb基因PCR反应条件相同，但引物采用右侧2kb基因的正反向引物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；
(2)含有单拷贝数F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点AttTn7、编码LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性选择标记基因的8.6kb片段的克隆，引物设计如下：正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位点，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位点；PCR反应的条件为：反应液含1.0ul的0.1ug的购自美国Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表达系统病毒穿梭载体Bacmid基因组DNA作为模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3PCR缓冲液，并加入超纯水至25ul，反应进行30个循环，反应条件为95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一个循环的延伸时间为10分；
(3)将上述获得的BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb片段分别进行末端处理加上EcoRI位点和XbaI位点，并对克隆得到的8.6kb的片段进行EcoRI和XbaI消化处理，分别取2ul并加上连接酶进行体外14℃温度下连接，使之成为一个大小为12.6kb的线性片段；
(4)从AcNPV Bac-to-Bac表达系统DH10Bac感受态细胞中分离出13.2kb辅助质粒helper plasmid，采用常用的DNA分离方法，收集过夜培养的转化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸钾KAc和苯酚，最后用异苯醇沉淀DNA，融解于TE缓冲液；
(5)将(3)连接得到的线性片段与家蚕130kb BmNPV基因组混合，在离子脂质体Lipofectin介导下共转染入家蚕培养细胞，从感染的细胞中分离出病毒基因组，即BmNPV和重组的BmNPV基因组的混合物；在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞，培养基不含血清，24小时后更换含10％胎牛血清的培养基，27℃培养5天，收集感染细胞并从中抽提病毒基因组DNA，将其转化入大肠杆菌DH10β感受态细胞，在含有卡那霉素、X-gal培养基上利用蓝白斑分析法筛选出含病毒穿梭载体的转化子，即蓝斑，并将其命名为家蚕病毒穿梭载体BmBacmid，野生型BmNPV基因组的转化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培养基上生长，最后分离得到蓝斑的家蚕BmBacmid转化子；
(6)将转化子进行象普通大肠杆菌细胞培养的方法，制备其感受态细胞，并将13.2kb辅助质粒转化入其中，在含有四环素和卡那霉素的培养基上进行筛选，获得同时含家蚕病毒穿梭载体BmBacmid和辅助质粒的转化子，将其命名为DH10BmBac，这样就构建完成了适合于家蚕的重组病毒快速基因表达系统，可以用于重组蛋白质的生产。
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