KR20010082753A - 세포사멸 억제단백질 - Google Patents
세포사멸 억제단백질 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010082753A KR20010082753A KR1020010008178A KR20010008178A KR20010082753A KR 20010082753 A KR20010082753 A KR 20010082753A KR 1020010008178 A KR1020010008178 A KR 1020010008178A KR 20010008178 A KR20010008178 A KR 20010008178A KR 20010082753 A KR20010082753 A KR 20010082753A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- mage
- caspase
- seq
- activity
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 159
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000030833 cell death Effects 0.000 title claims description 9
- 102000004066 Caspase-12 Human genes 0.000 claims abstract description 118
- 108090000570 Caspase-12 Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 20
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 claims description 8
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 206010002027 Amyotrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 claims description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 claims description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 claims description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 7
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 166
- 101710204288 Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 166
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 18
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 102400001302 Gasdermin-B, N-terminal Human genes 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000034615 apoptosis-related disease Diseases 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 102100026556 Inactive caspase-12 Human genes 0.000 description 4
- 101710126091 Inactive caspase-12 Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 3
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 description 3
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 3
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 3
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710120319 Photosystem I reaction center subunit IV Proteins 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004612 Calcium-Transporting ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010017954 Calcium-Transporting ATPases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010014405 Electrocution Diseases 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- AQLLBJAXUCIJSR-UHFFFAOYSA-N OC(=O)C[Na] Chemical compound OC(=O)C[Na] AQLLBJAXUCIJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000375392 Tana Species 0.000 description 1
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000362 adenosine triphosphatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012461 cellulose resin Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000010291 electrical method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229960000292 pectin Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 230000006659 positive regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002760 pro-activator Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940080313 sodium starch Drugs 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001926 trapping method Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 카스파아제-12(caspase-12)의 활성을 억제하는 단백질 및 전기 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질에 관한 것이다:
(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,
(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파 아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으로 구성되는 단백질.
Description
1. 발명의 분야
본 발명은 카스파아제-12(caspase-12) 또는 카스파아제-12 전구 단백질
(precursor)에 결합하여 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질 및 전기 단백질을 포함하는 세포사멸 억제제(cell death inhibitor)에 관한 것이다.
2. 전기 분야의 종래기술
카스파아제는 다세포 개체의 세포자멸(apoptosis)에 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 단백질분해효소(protease) 군(family)이다. 카스파아제 군에는 지금까지 인간과 생쥐에서 14 종류의 카스파아제가 동정되었다(참조: Thornberry, N.A. & Lazebnik, Y., "Caspases, enemies within", Science 281, 1312-1316, 1998). 카스파아제의 기능은 특이적인 단백질 가수분해(proteolysis) 활성을 갖는 특정 그룹의 단백질을 절단하는 것이다. 왜 카스파아제가 여러가지 형태로 존재하는가에 대한 이유중의 하나는, 다양한 세포자멸 자극에 반응하여 서로 다른 카스파아제가 기능을 발휘하기 때문이라고 여겨지고 있다.
카스파아제는 발생과정에서의 형태형성(morphogenesis), 성체(adult)에서의 항상성 유지 및 몸에 해로운 세포의 제거와 같은 정상적인 기능에 관여하는 반면, 비정상적으로 활성화되면 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)과 같은 심각한 질병을 일으킨다(참조: Yuan, J. & Yankner, B.A., Nat. Cell Biol. 1:E44-45, 1999).
카스파아제는 비활성화된 전구단백질(precursor)로서 생합성되며 분자내의 특정결합을 절단하는 과정에 의해 활성화된다. 따라서, 전기 과정이 억제될 수만 있다면, 카스파아제-유도 세포자멸을 억제하는 것이 가능하다.
본 발명의 목적은 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질 및 전기 단백질을 포함하는 세포사멸 억제제를 제공하는 것이다.
상기 문제점의 해결을 위하여 포괄적이고 집중적인 연구 결과, 본 발명자들은 암-특이적 단백질인 MAGE-3 또는 MAGE-3의 절단된 형태(truncated form)가 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질(이 이후로, 종종 "전구-카스파아제-12"로 언급된다)과 결합한다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질에 관한 것이다:
(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,
(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파 아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으로 구성되는 단백질.
본 발명의 한 실시태양에서, 상기 유전자는 하기 (c) 및 (d)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 DNA로 구성되는 유전자이다:
(c) 서열번호 3에 개시된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA; 및,
(d) 엄중한(stringent) 조건에서 서열번호 3에 개시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화(hybridize)하고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질을 암호화하는 DNA.
더 나아가서, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 (transformant)에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하고 전기 배양액으로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)와 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질(precursor)의 결합에 의해 형성된 복합체(complex)에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 유효성분으로서 MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태를 포함하는 세포사멸(cell death) 억제제에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양에서, MAGE-3 단백질은 하기 (e) 및 (f)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질이다:
(e) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,
(f) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 2에 개시된 아미노산으 로 구성되는 단백질.
본 발명의 한 실시태양에서, MAGE-3 단백질의 절단된 형태 형태는 상기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질이다.
본 발명의 한 실시태양에서, 세포사멸은 세포자멸(apoptosis), 괴사(necrosis), 예정화된 세포사멸(scheduled cell death), 프로그램화된 세포사멸(programmed cell death) 및 세포 손상(cell injury)을 포함하는 그룹으로부터 적어도 한 가지 이상 선택된다.
더 나아가서, 본 발명은 유효성분으로서 MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태를 포함하는 세포사멸 연관 질병 치료제(therapeutic agent)에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양에서, 세포사멸 연관 질병은 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease), 자가면역질환 (autoimmune disease), 근위축증(amyotrophy) 및 장기부전증(organ disorder)을 포함하는 그룹으로부터 적어도 한 가지 이상 선택된다.
더 나아가서, 본 발명은 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)와 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질(precursor)이 결합하는 단계를 포함하는 카스파아제-12의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 조직 또는 세포에 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)를 특이적으로 인식하는 항체를 처리하여, 전기 조직 또는 세포에서 전기 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 항-세포자멸 활성(anti-apoptotic activity)을 검출하는 방법(MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태의 과발현 검출은 세포조직이 항-세포자멸 활성을 갖고 있다는 것을 암시한다)에 관한 것이다.
더 나아가서, 본 발명은 조직 또는 세포에서 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태를 암호화하는 mRNA의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 항-세포자멸 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 대장균(Escherichia coli)에서 정제된 MAGE-3 단백질의 SDS-PAGE 겔전기영동 패턴을 나타낸 사진이다.
도 2는 포유동물 세포에서 MAGE-3와 카스파아제-12의 결합을 조사한 시험결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 MAGE-3와 카스파아제-12 p10 영역의 결합을 조사한 시험결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 MAGE-3의 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.
도 5는 MAGE-3 및 카스파아제-12의 두 가지 형태(활성형 효소 및 효소전구체) 사이의 결합 친화도(affinity) 비교결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 카스파아제-12 전구단백질의 모식도이다.
도 7은 MAGE-3에 의해 카스파아제-12 전구단백질의 활성억제를 조사한 시험결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 MAGE-3의 과발현에 의한 세포의 세포자멸 저항성 유도 시험결과를 나타낸 사진이다.
본 명세서는 본 출원의 우선권 주장의 기초가 되는 일본특허출원 제 2000-41927호에 개시된 명세서의 내용 및/또는 도면을 포함한다.
본 발명은 "흑색종 연관 항원 3(melanoma associated antigen-3, MAGE-3)"라고 명명된 암-특이적 단백질, 전기 단백질의 절단된 형태, 및 전기 단백질들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 상기 단백질이 카스파아제-12의 활성과정을 억제하는 기능을 가지고 있다는 발견에 기초하여 달성되었다.
카스파아제-12 전구단백질은 세포에서 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 위치해 있으며, ER-특이적 스트레스에 의해 촉발된 자가과정(autoprocessing)을 통해 활성형 카스파아제-12로 된다(참조: Nakagawa, T. et al., Nature 403: 98-103, 2000). ER 스트레스는 알츠하이머 병 및 퇴행성 신경질환의 원인이라고 제안되었다. 따라서, 카스파아제-12 전구단백질로부터 활성형 카스파아제-12로 되는 과정을 억제하거나 또는 MAGE-3를 이용하여 카스파아제-12 자체의 활성을 억제함으로써, 알츠하이머 병과 같은 ER-스트레스 연관 질병을 치료하거나 예방할 수 있다. 더 나아가서, MAGE-3에 의한 카스파아제 활성화 억제는 카스파아제-12에만 특이적이기 때문에, MAGE-3를 사용한 억제제는 매우 특이적이며 다른 카스파아제의 정상적인 기능에 아무런 부작용도 주지 않을 것으로 예상된다.
여기 사용된 "카스파아제-12의 활성화를 억제한다(inhibit the activation of caspase-12)"라는 표현은 카스파아제-12 전구단백질에 결합하여 카스파아제-12 전구단백질로부터 활성형 카스파아제-12로 되는 과정을 억제하거나, 또는 활성형 카스파아제-12 그 자체에 특이적으로 결합하여 활성형 카스파아제-12의 기능을 억제하는 것을 의미한다. 그러한 억제 결과, 활성형 카스파아제-12에 의해 유발된 세포사멸을 억제하는 것이 가능해졌다. 그러나, 본 발명에서는, MAGE-3 및 MAGE-3의 절단된 형태가 카스파아제-12 전구단백질과 결합하도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, MAGE-3(참조: Gaugler, B. et al., J. Exp. Med. 179: 921-930, 1994) 및 MAGE-3의 절단된 형태를 사용하여 카스파아제-12의 활성화를 억제하는 것이 가능하다. 본 발명에서, MAGE-3 단백질은 "MAGE-3"라고 표현되며 MAGE-3 단백질을 암호화하는 유전자는 "MAGE-3"로서 표현된다. MAGE-3 및 MAGE-3의 절단된 형태는 카스파아제-12에 특이적이며 다른 카스파아제에는 결합 활성을 나타내지 않는다.
본 발명에서,MAGE-3는 통상적인 유전공학 기술에 의해 분리될 수 있다. 전기 유전자를 벡터로 도입시켜 재조합 벡터를 작제하며, 이것을 다시 적당한 숙주로 도입시켜 형질전환체(transformant)를 만든다. 재조합 벡터가 숙주에서 기능을 발휘할 수 있는 발현벡터로서 구축되었을때, 형질전환체를 배양함으로써 MAGE-3를 획득할 수 있다.
1.MAGE-3 및 전기 단백질의 절단된 형태를 암호화하는 유전자의 클로닝
먼저, 본 발명의 MAGE-3를 획득하기 위하여,MAGE-3를 클로닝한다.MAGE-3의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있더라도(참조: Gaugler, B. et al., J. Exp. Med. 179: 921-930, 1994), 유전공학 기술에 의해 하기와 같이 제조될 수 있다.
(1)MAGE-3cDNA 라이브러리의 제조 및 스크리닝
MAGE-3mRNA의 제조는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 정소(testis) 또는 종양으로부터의 조직 또는 세포를 구아니딘 시약(guanidine reagent) 또는 페놀로 처리하여 전체 RNA를 획득한다. 그 다음에, 올리고(dT)-셀룰로오스(oligo(dT)-cellulose) 또는 세파로오스 2B(sepharose 2B)를 담체로 사용한 폴리 U-세파로오스(poly U-sepharose)를 이용한 친화도 컬럼(affinity column) 또는 배치 방법(batch method)에 의해 poly(A+) RNA(mRNA)를 획득한다. 전기 mRNA를 주형으로 하여, 올리고(dT) 프라이머 및 역전사효소를 사용하여 한쪽 가닥의 cDNA를 합성한다. 그 다음에, 한쪽 가닥 cDNA로부터 양쪽 가닥 cDNA를 합성한다. 전기 방법으로 획득된 cDNA를 적당한 클로닝 벡터에 도입시켜 재조합 벡터를 작제한다. 대장균과 같은 숙주를 재조합 벡터로 형질전환시킨다. 테트라사이클린 및 암피실린 저항성을 표지로 사용하여 형질전환체를 골라내어 cDNA 라이브러리를 획득한다.
선택적으로, 상업적인 cDNA library(예를 들어, 인간 정소 cDNA 라이브러리; Clontech)를 본 발명에 사용할 수 있다.
선택된 형질전환체로부터 관심 대상의 DNA를 가지는 클론을 골라내는 스크리닝 방법으로서, 항체를 이용하는 면역 스크리닝 법 또는 DNA의 알려진 서열에 기초한 프라이머를 합성하여 전기 프라이머를 가지고 PCR을 수행하는 방법이 사용될 수 있다.
(2) MAGE-3의 절단된 형태의 제조
본 발명에서, MAGE-3의 절단된 형태를 암호화하는 유전자가 고안되고 합성될 수 있다. MAGE-3의 절단된 형태란 N-말단, C-말단 또는 MAGE-3(서열번호 2)의 전체 아미노산 서열의 양쪽 끝에 아미노산의 결실을 가지는 MAGE-3 단백질을 의미하는데, 결실될 수 있는 아미노산의 숫자는 최대로 312개이다. 좀 더 자세하게, MAGE-3의 절단된 형태란, 결실 후에 적어도 2개, 바람직하게는 10개 또는 그 이상의 서열번호 2의 아미노산을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 구체적인 예를 들면, 본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태는 서열번호 2의 1번 위치부터 81번 위치(세린)의 아미노산이 결핍된 MAGE-3 단백질; 서열번호 2의 1번 위치부터 88번 위치(세린)의 아미노산이 결핍된 MAGE-3 단백질; 서열번호 2의 1번 위치부터 90번 위치(글루타민)의 아미노산이 결핍된 MAGE-3 단백질; 및 서열번호 2의 1번 위치부터 93번 위치(글루타민)의 아미노산이 결핍된 MAGE-3 단백질을 포함한다.
본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태 중에서, 서열번호 2의 1번 위치부터 93번 위치(글루타민)의 아미노산이 결핍된 MAGE-3의 절단된 형태를 서열변호 4에 나타냈다. 이 아미노산 서열은 94번부터 314번 위치의 서열번호 2의 일부분 아미노산 서열과 일치한다.
MAGE-3(서열번호 1; 참조: Gaugler, B. et al., J. Exp. Med. 179: 921-930, 1994)를 주형으로 하고, 서열번호 1에서 MAGE-3의 절단된 형태의 암호화 영역을 제외한 영역에 위치한 부분 서열에 기초하여 고안된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 MAGE-3의 절단된 형태를 획득할 수 있다. MAGE-3의 절단된 형태를 합성하기 위하여, 암호화영역의 5' 말단에 번역 개시 코돈(translation start codon)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 첨가하는 것이 바람직하다.
(3) 돌연변이MAGE-3및 돌연변이MAGE-3의 절단된 형태의 제조
본 발명에서, MAGE-3 또는 MAGE-3의 절단된 형태의 아미노산 서열에 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다. 따라서, 돌연변이를 포함한 단백질들도 본 발명의 MAGE-3 또는 MAGE-3의 절단된 형태에 포함된다. 아미노산 서열에 돌연변이를 도입하기 위하여, 표적 아미노산을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 기술이 사용된다.
유전자에 돌연변이를 도입하는 것은 쿤켈(Kunkel)의 방법 또는 갭트 듀플렉스 방법(gapped duplex method)같은 알려진 기술 또는 전기 방법들에 기초한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이가 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 부위특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)에 의해 돌연변이를 도입할 수 있다(참조: Yoshikawa, F. et al., J. Biol. Chem. 271: 18277-18284, 1996). 또한, 뮤탄-K(Mutan-K, Takara), 뮤탄-G(Mutan-G, Takara) 또는 LA PCRin vitroMutagenesis Series kit(Takara)같은 상업적인 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 돌연변이된 뉴클레오티드 및MAGE-3또는MAGE-3의 절단된 형태의 뉴클레오티드 서열에서 발견되는 전기 돌연변이된 뉴클레오티드의 인접영역(각각에 대해 약 10 뉴클레오티드 정도)으로 구성되는 프라이머를 합성한다. 그 다음에, 전기 프라이머를 가지고MAGE-3를 주형으로 하여 PCR을 수행한다. PCR 생성물을 정제하고 적당한 제한효소를 처리하여MAGE-3또는MAGE-3의 절단된 형태를 획득한다.
(4) 뉴클레오티드 서열의 결정
상기와 같이 획득된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 염기서열결정은 막삼-길버트(Maxam-Gilbert)의 화학적 변형 방법 또는 M13 파아지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법(dideoxynucleotide chain termination method)을 사용하여 수행되었다. 그러나, 염기서열결정은 대개 자동화된 DNA 시퀀서(377A DNA sequencer; Perkin-Elmer)를 가지고 수행되었다.
MAGE-3의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1에 개시되어 있고, MAGE-3의 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시되어 있다.MAGE-3의 절단된 형태의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 개시되어 있고 전기 MAGE-3의 절단된 형태의 아미노산 서열은 서열번호 4에 개시되어 있다. 전기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드가 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질에 특이적인 결합활성을 가지고 있는 한(즉, 전기 폴리펩티드가 카스파아제-12의 활성을 억제할 수 있는 한), 전기 아미노산 서열은 한 개 또는 그 이상의 아미노산(예를 들어, 한 개 또는 여러 개, 바람직하게는 1개 내지 10개, 보다 바람직하게는 1개 내지 5개)의 결실, 치환 또는 삽입과 같은 돌연변이를 가질 수 있다.
본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태(서열번호 4)에 포함되는 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 3)에 더하여, 같은 폴리펩티드를 암호화하고 서로 다른 축퇴코돈(degenerate codon)을 가지는 축퇴 이성질체(degenerate isomer)가 또한 본 발명의 유전자에 포함된다. 더 나아가서, 엄중한 조건(stringent condition)하에MAGE-3의 절단된 형태(서열번호 3)의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고(hybridize) 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질을 암호화하는 DNA가 본 발명의 유전자에 포함된다. 여기서 사용된 "엄중한 조건(stringent condition)"이란 특정한 혼성체(hybrid)는 형성되지만 특정하지 않은(non-specific) 혼성체는 형성되지 않는 조건을 의미한다. 예를 들어, 매우 높은 상동성을 가지는 두 개의 핵산(즉, 60% 또는 그 이상의, 바람직하게는 80% 또는 그 이상의 상동성을 가지는 DNA)이 서로 혼성화되지만, 낮은 상동성을 가지는 두 핵산 사이에는 혼성화가 일어나지 않는 조건을 의미한다. 보다 자세하게는, 15-900mM, 바람직하게는 15-150mM의 나트륨 농도 및 37-70OC, 바람직하게는 68OC의 온도가 사용된다.
일단 본 발명의MAGE-3의 절단된 형태의 뉴클레오티드 염기서열이 결정되면, 화학적 합성 또는 결정된 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성된 프라이머를 사용하한 PCR에 의해 본 발명의 유전자를 획득할 수 있다.
2.본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조
(1) 재조합 벡터의 작제
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 적당한 벡터에 연결(삽입)하여 획득할 수 있다. 본 발명의 유전자가 삽입될 벡터는 그것이 숙주안에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다.
플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pBluescript SK+(Stratagene) 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용된 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 더 나아가서, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스; 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 더 나아가서, 유전자 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 융합 플라스미드는 상기 언급된 pJG4-5에 한정되지 않는다. GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등이 연결된 융합 플라스미드가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자는 벡터에 작동가능하게 연결되어 있어야 한다. 이것을 위해서, 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 유전자 이외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마아커(selection marker), 리보소옴 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마아커로서, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 열거될 수 있다.
(2) 형질전환체의 제조
관심 대상의 유전자가 발현되도록 본 발명의 재조합 벡터를 숙주로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다. 숙주는 본 발명의 유전자를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)같은Escherichia세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은Bacillus세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은Pseudomonas세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모;동물세포 및 곤충세포가 있다.
대장균과 같은 세균이 숙주로서 사용될 때, 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 숙주내에서 자율적인 복제를 할 수 있을 뿐만 아니라 프로모터, 리보소옴 결합서열, 본 발명의 유전자 및 전사 종료 서열(transcription termination sequence)로 구성되어 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 BL21(DE3), JM109 및 HB101이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 및 LKS87이 있다.
프로모터로서, 본 발명의 유전자를 대장균과 같은 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL프로모터 또는 PR프로모터같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터가 사용될 수 있다. tac 프로모터같은 인공적으로 변형된 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
재조합 벡터를 세균으로 도입하는 방법에 대해서, 세균으로 DNA를 운반하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 이온을 이용하는 방법(참조: Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114, 1972) 또는 일렉트로포레이션 방법이 사용될 수 있다.
효모가 숙주로 사용될 때는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 피키아파스토리스(Pichia pastoris)가 사용될 수 있다. 이 경우 사용될 수 있는 프로모터는 제한되지 않는다. 효모에서 본 발명의 유전자 발현을 시킬 수 있는한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, 열충격 단백질(heat shock promoter) 프로모터, MFα1 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, AOX1 프로모터 등이 열거될 수 있다. 재조합 벡터를 효모로 도입시키는 방법으로서, 효모로 DNA를 운반하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션(참조: Becker, D.M., Methods Enzymol., 194: 182-187, 1990), 스피로플라스트(spheroplast) 법(참조: Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:1929-1933, 1978), 리튬 아세테이트(lithium acetate) 법(참조: Itoh, H., J. Bacteriol., 153: 163-168, 1983) 등이 열거될 수 있다.
동물세포가 숙주로서 사용될 때는, 유인원 COS-7 또는 Vero 세포; CHO 세포(Chinese hamster ovary cell); 생쥐 L 세포; 쥐 GH3, PC12 또는 NG108-15 세포; 인간 FL, HEK293, HeLa 또는 Jurkat 세포; 등이 사용될 수 있다. 프로모터로서, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, β-actin 프로모터 등이 사용될 수 있다. 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 초기 유전자 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 재조합 벡터를 동물세포로 도입시키는 방법으로서, 일렉트로포레이션, 인산칼슘(calcium phosphate) 법, 또는 리포펙션(lipofection)을 사용할 수 있다.
곤충세포가 숙주로서 사용될때는, Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용될 수 있다. 재조합 벡터를 곤충세포로 도입시키는 방법으로서, 인산칼슘(calcium phosphate) 법, 리포펙션(lipofection), 또는 일렉트로포레이션을 사용할 수 있다.
3.MAGE-3의 절단된 형태의 제조
상기 기술된 형질전환체를 배양하고 전기 배양액으로부터 단백질을 회수함으로써 본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태를 획득할 수 있다. "배양물(culture)"라는 용어는 다음과 같은 물질을 의미한다: 배양 상등액(culture supernatant), 배양된 세포 또는 미생물, 배양된 세포 또는 미생물의 파쇄된 산물. 본 발명의 형질전환체의 배양은 숙주를 배양하는데 흔히 사용되는 통상적인 방법으로 수행된다.
대장균 또는 효모같은 미생물 숙주의 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 탄소원, 질소원 및 미생물에 의해 동화될 수 있는 무기염류를 포함하고 형질전환체의 효율적인 배양을 할 수 있는 한, 임의의 자연산 또는 합성 배지가 사용될 수 있다.
탄소원으로서는, 포도당, 과당, 설탕, 녹말같은 탄수화물; 초산, 프로피온산(propionic acid)같은 유기산; 및 에탄올, 프로판올과 같은 알코올이 사용될 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아; 염화암모늄, 황산 암모늄, 초산 암모늄, 인산 암모늄같은 무기 또는 유기산 암모늄 염; 질소를 포함한 화합물; 펩톤; 고기 추출물(meat extract); 옥수수 추출액 등이 사용될 수 있다. 무기물로서는, 인산칼륨(monobasic), 인산칼륨(dibasic), 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산철(II), 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
대개, 배양은 37OC에서 6시간 내지 24시간동안 호기성 조건(shaking or aeration agitation)하에 수행된다. 배양중에, pH는 6.5 내지 7.5로 유지된다. pH 조정은 무기산, 유기산 또는 알칼리 용액 등을 사용하여 수행된다. 배양중에, 암피실린이나 테트라사이클린같은 항생제가 배지에 첨가될 수 있다.
유도적 프로모터(inducible promoter)를 포함한 발현벡터로 형질전환된 미생물이 배양될 때, 유도제(inducer)가 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)에 의해 유도되는 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양할때, IPTG가 배지에 첨가될 수 있다. 인돌초산(indoleacetic acid, IAA)에 의해 유도되는 trp 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양할때는, IAA가 배지에 첨가될 수 있다.
숙주로서 동물세포 형질전환체를 배양하는 배지로서, 흔히 사용되는 RPMI1640 배지, DMEM 배지 또는 FBS(fetal bovine serum)을 보충한 전기 배지 등이 사용될 수 있다. 대개, 배양은 37OC에서 1일 내지 30일동안 5% CO2조건하에서 수행된다. 배양중에, 카나마이신 또는 페니실린같은 항생제가 배지에 첨가될 수 있다.
배양후, 만약 단백질이 미생물 또는 세포내에서 생성된다면, 소니케이션, 반복된 얼림과 녹임(repeated freezing & thawing) 또는 호모지나이저(homogenizer)등의 방법으로 미생물 또는 세포를 파쇄함으로써 본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태를 회수할 수 있다.
본 발명의 MAGE-3의 절단된 형태가 미생물 또는 세포 밖으로 생성된다면, 배양액을 그대로 사용하거나 또는 미생물 혹은 세포를 제거하기 위하여 원심분리를 할 수 있다. 그후, 배양상등액을 통상적인 생화학적 단백질 분리공정에 적용한다. 전기 분리공정은 황산암모늄 침전, 겔 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피를 포함하며, 독립적으로 또는 적절한 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질은 상기언급된 배양액으로부터 분리되고 정제될 수 있다.
4.세포사멸 억제제
MAGE-3 및 MAGE-3의 절단된 형태는 카스파아제-12 또는 그것의 전구단백질과 특이적으로 반응하여 전구단백질로부터 활성화 효소로 되는 과정을 억제한다. 따라서, MAGE-3 및 MAGE-3의 절단된 형태는 세포사멸억제제로서 사용될 수 있다. 또한, MAGE-3 및 MAGE-3의 절단된 형태는 세포사멸과 연관된 질병(세포사멸-관련질병)을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다. 더 나아가서,MAGE-3및MAGE-3의 절단된 형태는 유전자 치료법에도 유용하다. 부가적으로, 세포에 포함된 MAGE-3의 양을 결정함으로써, 세포 또는 조직의 세포자멸 저항능력을 조사하는 것이 가능하다.
세포사멸-관련질병의 구체적인 예로는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease), 자가면역질환(autoimmune disease), 근위축증(amyotrophy) 및 장기부전증(organ disorder)을 포함한다. 전기 질병들은 그것들이 독립적으로 발생하든 또는 복합적인 형태로 발생하는지에 관계없이 본 발명의 치료제로서 치료될 수 있다. 상기 언급된 질병과 다른 질병과의 조합도 복합적인 형태에 포함된다.
본 발명의 치료제 또는 유전자 요법제는 경구 또는 비경구 및 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 유전자가 세포사멸-관련질병에 대한 치료제(유전자요법제 포함) 또는 예방제로서 사용될 때, 그 대상은 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 치료제는 중추신경계(뇌, 척수), 혈관계(동맥, 정맥, 심장), 호흡계(기관지, 폐), 소화계(침샘, 위, 소장, 간, 이자), 림프계(림프절, 비장, 흉선), 비뇨계(신장) 또는 생식계(정소, 난소, 자궁)의 조직에 발생하는 세포사멸-관련 질병을 예방하거나 또는 치료하는 구체적인 목적으로 사용될 수 있다. 전기 질병은 독립적인 질병일 수 있거나, 다른 세포사멸-관련 질병과 복합될 수 있거나 또는 세포사멸-관련질병 이외의 다른 질병과 복합적으로 나타날 수 있다.
본 발명의 치료제가 경구로 투여될 때, 치료제는 정제(tablet), 캡슐, 입자(granule), 분말(powder), 환제(pill), 트로키(troches), 내액제(internal liquid agent), 현탁제(suspension), 유화제(emulsion) 또는 시럽(syrup) 등의 제형으로 제조될 수 있다. 선택적으로, 치료제는 무수형태로 제조되어 사용 바로 직전에 녹여서 사용할 수 있다. 본 발명의 치료제가 비경구적으로 투여될 때는, 치료제는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 좌제(suppositories) 등의 제형을 가질 수 있다. 주사제는 유닛 용량 앰퓰 또는 다중 용량 컨테이너의 형태로 공급된다.
상기 제형들은 약학적 조제물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제(excipient), 충전물(filler), 결합제(binder), 습윤제(wetting agent), 분해제(disintegrating agent), 윤활제(lubricating agent), 계면활성제(surfactant), 분산제(dispersant), 완충액(buffer), 방부제(preservative), 용해보조제(dissolution aids), 소독제(antiseptics), 감미료/향신료(flavoring/perfuming agent), 진통제(analgesics), 안정화제(stabilizer), 등장액제(isotonic agent) 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제(additive)를 포함할 수 있다. 전기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine), 카복시비닐 중합체(carboxyvinyl polymer), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 수용성 덱스트란(water-soluble dextran), 카복시메틸 나트륨 녹말(sodium carboxymethyl starch), 펙틴(pectin), 잔탄 고무(xanthan gum), 아라비아 고무(gum arabic), 카제인(casein), 겔라틴(gelatin), 한천(agar), 글리세롤, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 스테아린 산(stearic acid), 인간 혈청 알부민, 만니톨(mannitol), 소비톨(sorbitol) 및 젖산(lactose) 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여용량은 환자의 나이, 투여경로 및 투여횟수와 같은 요인들에 따라 넓은 범위에서 변화할 수 있다. 본 발명의 단백질의 유효량이 적절한 희석제 및 약학적으로 허용되는 담체와 조합되어 투여될 때, 단백질의 유효량은 0.0001 내지 1000mg/체중/투여의 범위에 있다. 치료제는 하루 한 번 또는 하루에 여러 번 투여될 수 있다.
본 발명의 유전자가 유전자요법 치료제로 사용될 때, 본 발명의 유전자는 주사제로 직접 투여될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 유전자를 포함한 벡터가 투여될 수 있다. 이 목적에 적합한 벡터의 구체적인 예로는 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 허피스 바이러스(herpes virus) 벡터, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 벡터 및 리트로바이러스(retrovirus) 벡터가 있다. 전기 바이러스 벡터를 사용하여, 본 발명의 유전자를 효율적으로 투여할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 유전자는 리포소옴(liposome)같은 인지질 소포(vesicle)에 둘러싸여서 환자에 투여될 수 있다. 리포소옴은 생분해될 수 있는 물질을 포함한 닫혀있는 소포이기 때문에, 본 발명의 유전자 및 리포소옴은 유전자가 리포소옴의 지질 이중층 및 내부 물층에 갇혀 있도록 혼합된다(리포소옴-유전자 복합체가 형성된다). 결과적으로, 이 복합체가 세포에서 배양될때, 복합체속의 유전자는 세포 내로 들어간다(lipofection). 그 다음에, 유전자가 들어간 세포를 하기 기술되는 방법으로 투여한다.
본 발명의 유전자요법 치료제 투여방법으로서, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에, 중추신경계(뇌, 척수), 혈관계(동맥, 정맥, 심장), 호흡계(기관지, 폐), 소화계(침샘, 위, 소장, 간, 이자), 림프계(림프절, 비장, 흉선), 비뇨계(신장) 또는 생식계(정소, 난소, 자궁)로의 국소적 투여가 행해질 수 있다. 더 나아가서, 카테터(catheter) 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자요법 치료제 투여용량은 환자의 나이, 성별, 상태, 투여경로, 투여횟수 및 제형의 유형 등의 요인에 따라 변화한다. 대개, 본 발명의 유전자를 0.1-100mg/성인/1일의 양으로 투여하는 것이 적당하다.
5.항-세포자멸 활성(Anti-apoptotic activity)의 검출
본 발명은 세포 또는 조직의 항-세포자멸 활성 검출에 적용될 수 있다. 간단히 말해서, MAGE-3의 정량결과 MAGE-3(전기 단백질의 절단된 형태를 포함해서)를 높은 수준으로 발현하는 세포 또는 조직은 항-세포자멸 활성을 갖고 있다고 판단할 수 있다. MAGE-3 및 전기 단백질의 절단된 형태의 검출 및 정량은 MAGE-3 또는 MAGE-3의 절단된 형태를 특이적으로 인식하는 항체(다중항체 또는 단일항체)와 반응시켜서 수행할 수 있다. 세포 또는 조직 추출물을 니트로셀룰로오스같은 막 위에 점적하여 도트 블라팅(dot blotting)을 실시하거나 또는 추출물을 전기영동하여 웨스턴 블라팅을 준비한다. 항-MAGE-3 항체 및 이차항체를 블라트(blot)와 반응시켜 MAGE-3를 검출한다. 선택적으로, 추출물을 직접 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 적용하여 MAGE-3를 정량한다. 또한 세포 또는 조직을 항-MAGE-3 항체로 직접 염색하여 항-세포자멸 활성을 지닌 세포 또는 조직을 검출한다.
더 나아가서, MAGE-3 및 전기 단백질의 절단된 형태의 mRNA를 세포 또는 조직에서 검출함으로써 세포 또는 조직의 항-세포자멸 활성을 결정하는 것이 가능하다. mRNA의 검출은in situhybridization 혹은in situRT-PCR(reverse transcription/polymerase chain reaction)을 조직에 적용하거나 또는 노던 블라팅 혹은 RT-PCR을 조직 또는 세포로부터 추출된 핵산에 적용함으로써 수행될 수 있다.
여기서부터, 하기 실시예를 참조함으로써 본 발명을 보다 구체적으로 기술하고자 한다. 그러나, 본 발명의 목적은 하기 실시예에만 한정되지는 않는다. 실시예에 사용된 핵산-관련 시약 및 효소들은 다까라(Takara Biochemical, Japan) 사 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs, U.S.A.) 사로부터 구입하였다. 대장균을 배양하기 위한 배지는 디프코(Difco, U.S.A.) 사로부터 구입하였다. 포유동물세포 배양을 위한 배지는 지브코-비알엘(Gibco-BRL, U.S.A.) 사로부터 구입하였다. 특별히 언급되지 않는 한, 그 이외의 시약들은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, U.S.A.) 사로부터 제조된 시약들이다.
실시예 1: MAGE-3의 클로닝
인간 정소 cDNA 라이브러리(Clontech, U.S.A.)를 주형으로 하여 대규모발현실험에 사용할 MAGE-3 단백질의 암호화영역을 획득하기 위하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 실험과정의 개요가 하기에 기술되어 있다. 본 실시예뿐만 아니라 그 뒤에 연속되는 실시예에서도, DNA 및 RNA를 취급하는 일반적인 과정은 샘브룩 등(Sambrook, J., Fritsch, E.F., & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989)에 의해 기술된 방법과 일치하였다.
흑색종 세포를 포함하여 많은 암세포에서 MAGE-3의 높은 발현이 나타나지만, 정상세포에서의 MAGE-3의 발현은 정소(testis)에만 한정되어 있다(참조: Van Pel, A. et al., Immunol. Rev. 145: 29-250, 1995). PCR에 사용되는 프라이머(즉, NTOP77, NBOT68, NTOP79 및 NBOT65)는 하기의 서열을 갖는다. 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 5'프라이머(NTOP79)는 EcoRV 제한효소에 의해 절단될 수 있는 GATATC 서열을 포함하며, 3'프라이머(NBOT65)는 XhoI 제한효소에 의해 절단될 수 있는 CTCGAG 서열을 포함한다.
NTOP77: GCCCAGCTCCTGCCCACACT(서열번호 5)
NBOT68: GGATGCGGCCCCGGAAGGT(서열번호 6)
NTOP79: CTCGATATCGCACCATGCCTCTTGAGCAGAGG(서열번호 7)
NBOT65: CTCCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCT(서열번호 8)
일련의 DNA 중합효소 및 PCR 반응완충액은 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim, Germany) 사로부터 구입하였다. PCR 반응조건은 다음과 같다. 간단히 말해서, 1차 PCR은 NTOP77 및 NTOP68을 프라이머로 사용하고 1ng의 정소 cDNA를 주형으로 하여 수행되었다. 1차 반응은 40주기로 수행되었으며, 각 주기는 94OC, 1분간의 변성(denaturing), 59OC, 1분간의 프라이머 어닐링(annealing), 72OC, 1분간의 DNA 확장(extension)으로 구성되었다. 1차 PCR 산물의 1/1000을 2차 PCR에 사용하였다. NTOP79 및 NBOT65를 프라이머로 하여 2차 PCR은 35 주기로 수행되었으며, 각 주기는 94OC, 1분간의 변성(denaturing), 50OC, 1분간의 프라이머 어닐링(annealing), 72OC, 1분간의 DNA 확장(extension)으로 구성되었다.
PCR 반응결과, 약 900bp의 DNA 절편을 특이적으로 증폭시켰다. 제한효소 EcoRV 및 XhoI(모두, Takara)을 가지고 전기 절편의 양쪽 끝을 절단한 후, 아가로오스 겔 전기영동 및 DNA 추출(Geneclean kit, Bio101, U.S.A.)에 의해 전기 절편을 정제하였다. 정제된 DNA 절편을 pBluescript SK(-) 벡터의 EcoRV 및 XhoI 부위에 삽입하여 플라스미드 pNB178을 작제하였다.
실시예 2: MAGE-3의 대규모 생산
MAGE-3를 대장균에서 대규모로 생산하였다.
먼저, pNB178에 클론된MAGE-3를 PCR로 증폭하였다. 제한효소 NheI으로 잘리는 서열을 5'프라이머에 첨가했으며, 제한효소 XhoI으로 잘라는 서열을 3'프라이머에 첨가하였다. 반응은 25주기로 수행되었으며, 각 주기는 94OC, 1분간의 변성(denaturing), 51OC, 1분간의 프라이머 어닐링(annealing), 72OC, 2분간의 DNA 확장(extension)으로 구성되었다.
증폭된 DNA 절편을 실시예 1에서와 같은 방법으로 정제하고 대장균 발현 플라스미드 벡터인 pRSET-A(Invitrogen, U.S.A.)의 NheI 및 XhoI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pNB202를 획득하였다. 전기 pRSET-A 벡터의 사용은 His-His-His-His-His-His를 포함하는 꼬리(tag) 서열(Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Met-Ala-Ser: 서열번호 9)을 클론된 유전자의 5'-말단에 첨가한다. 이것은 니켈(nickel) 이온 수지(Probond; Invitrogen)를 사용하여 발현된 단백질을 정제할 수 있게 한다.
대장균 BL21(DE3) pLysS를 pNB202로 형질전환시켰다. 획득된 형질전환체를 암피실린(100μg/ml) 및 클로람페니콜(34μg/ml)을 포함한 LB 배지에서배양하였다(참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989).MAGE-3의 발현은 0.2mM IPTG를 성장기에 있는 형질전환체를 포함한 배지에 첨가함으로써 유도되었다. 상기 발현조건에서 생산된 MAGE-3 단백질을 Novagen(U.S.A.) 사의 방법에 따라 Probond(Invitrogen) 수지를 사용하여 정제하였다.
그 결과, 배양액 1리터 당 약 100μg의 정제된 MAGE-3 단백질을 획득하였다. 상기 방법으로 정제된 MAGE-3의 순도가 높다는 것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인하였다(도 1).
실시예 3: MAGE-3 및 카스파아제-12 전구단백질 사이의 결합실험
MAGE-3 및 카스파아제-12 전구단백질을 COS-1 세포에서 과발현하였다. 그 다음에, COS-1 세포 추출물에서의 전기 단백질간의 결합을 면역침전(immunoprecipitation) 기술로 조사하였다.
면역침전 검출법에 사용되는 항-MAGE-3 항체는 토끼로부터 제조되었다. 간단히 말해서, MAGE-3의 C-말단 서열 펩티드(CHISYPPLHEWVLREGEE; 서열번호 10, Tana Laboratories, U.S.A.)를 담체 단백질(활성형 헤모시아닌, Pierce, U.S.A.)에 연결하여 아주반트와 함께 토끼에 주사하였다. 상기 펩티드 N-말단의 "C"는 전기 펩티드가 담체 단백질 및 친화성 수지에 결합하도록 인공적으로 첨가되었다. 반면, 상기와 같은 서열의 펩티드를 활성형 FMP-셀룰로오스 수지(Seikagaku Corp., Japan)에 커플링시켜 펩티드 컬럼을 제조하였는데, 이것은 곧 이어질 친화도 정제에 사용되었다. 면역화된 토끼로부터 얻은 항-혈청을 펩티드 컬럼에 적용하여 특정 항체가 전기 펩티드에 결합하도록 한다. 특정항체를 글리신 용액(glycine solution, pH2.6)으로 컬럼으로부터 용출시켰다. 유출액(effluent)의 pH를 1M 트리스(Tris)를 첨가하여 중성으로 올렸다. 전기 유출액 안의 항체를 곧 이어질 실험에 사용하였다.
카스파아제-12 전구 단백질을 암호화하는 cDNA 및 MAGE-3를 암호화하는 cDNA를 각각 포유동물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(-)(Invitrogen, U.S.A.)에 클로닝하였다. 카스파아제-12 전구단백질에 대해서, 발현산물의 N-말단에 FLAG 서열(참조: Hopp, T.P. et al., Bio/Technol. 6:1204-1210, 1988)이 첨가되도록 유전공학적으로 조작된 유전자를 사용하였다. 상기 유전자들의 COS-1 세포로의 운반을 위해서, 수퍼펙트 트랜스펙션 키트(Superfect Transfection kit, Qiagen, Germany)를 사용하였다.
트랜스펙션 이틀 후에, COS-1 세포를 수집하여 세포추출물을 제조하였다. 항-FLAG 친화 겔(Sigma-Aldrich, U.S.A.)을 사용하여, FLAG-첨가된 카스파아제-12를 세포추출물로부터 선택적으로 면역침전시켰다. 단백질 검출은 웨스턴 블라팅(참조: Harlow, E. & Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1988)으로 확인하였다.
결과가 도 2에 나타나 있다. 도 2에서, 레인 1은 면역침전물에 MAGE-3가 동시에 존재하는 것을 보여준다. 이것은 항-FLAG 친화 겔에 의해 침전된 카스파아제-12 전구단백질에 MAGE-3가 결합했기 때문이다. 대조군 실험으로서, MAGE-3 단독으로 COS-1 세포에서 과발현되었을때, MAGE-3는 항-FLAG 친화 겔에 의해 면역침전될 수 없었다(레인 2).
따라서, MAGE-3 및 카스파아제-12 전구단백질은 배양된 포유동물 세포에서 안정한 복합체(complex)를 형성한다.
실시예 4: 카스파아제-12 내의 MAGE-3 결합 영역 조사 및 특이성
카스파아제-12 내의 MAGE-3 결합영역을 미국의 브렌트 등(R. Brent et al.)에 의해 개발된 효모 하이브리드 방법에 다라서 조사하였다(참조: Gyuris, J. et al., Cell, 75: 791-803, 1993). 전기 방법에 의하면, 두 가지 단백질의 유전자를 포함하는 효모가 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성을 나타낼 때 두 단백질의 결합을 검출할 수 있다.
간단히 말해서, MAGE-3를 암호화하는 cDNA를 벡터 pJG4-5로 클로닝하여MAGE-3및 유전자 발현 활성화 단백질인 B42를 암호화하는 유전자로 구성된 융합 유전자를 만들어내었다. 전기 융합유전자를 포함하는 플라스미드를 pNB321이라고 명명하였다.
카스파아제-12에 있는 p10 서브유닛에 해당하는 cDNA 절편을 벡터 pEG202로클로닝하여 p10 및 LexA DNA 결합 영역으로 구성되는 융합유전자를 만들어내었다(참조: Thornberry, N.A. & Lazebnik, Y., Science, 281: 1312-1316, 1998). 전기 융합유전자를 포함하는 플라스미드를 pNB316이라고 명명하였다.
β-갈락토시다아제 유전자를 포함하는 플라스미드 pSH18-34 뿐만 아니라 플라스미드 pNB321 및 pNB316를 출아중인(budding) 효모 균주 EGY48에 도입시켜 NMY307 균주를 제조하였다. NMY307을 합성배지[0.67% yeast nitrogen source(Difco, U.S.A.); histidine-, tryptophan- and uracil-free amino acids/nucleic acids mixture(Bio-101, U.S.A.), 2% galactose]에서 배양하였다. NMY307 에서의 β-갈락토시다아제 활성을 Gyuris et al.의 방법에 따라서 조사하였다(참조: Gyuris et al., cell, 75: 791-803, 1993).
반면, 다른 종류의 카스파아제(즉, 카스파아제-1, -2, -3 및 -8)의 p10을 암호화하는 유전자 절편(각각 pEG202로 클론된) 및MAGE-3(pJG4-5로 클론된)을 포함하는 효모 균주에서 같은 방법으로 β-갈락토시다아제의 활성을 조사하였다.
결과가 도 3에 나타나 있다. 도 3에서, "1", "2", "3", "8" 및 "12"는 각각 카스파아제-1, -2, -3, -8, 및 -12의 p10과MAGE-3를 암호화하는 유전자 절편을 포함하는 효모 세포를 나타낸다. "P"는 전사활성인자(active transcription factor, 플라스미드 pSH17-4로 클론된) 및 β-갈락토시다아제(플라스미드 pSH18-34로 클론된)를 암호화하는 유전자를 EGY48에 도입시킴으로써 제조된 양성대조군 균주를 나타낸다. "N"은 카스파아제-12의 p10 및 β-갈락토시다아제를 암호화하는 유전자를 EGY48에 도입시킴으로써 제조된 음성대조군 균주를 나타낸다.
β-갈락토시다아제 활성이 나타난 효모 세포는 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-thiogalactoside)로부터 색깔을 띤 물질을 발생시키는 것으로 나타났다("12"). 이것은 활성화형 카스파아제-12의 p10에 MAGE-3 단백질이 결합했다는 것을 의미한다. β-갈락토시다아제 활성은 양성대조군 균주("P")에서 관찰되는 것과 광도면에서 거의 동일하다. 반면, 음성대조군 균주("N")에서는 발색이 거의 관찰되지 않았다. 더 나아가서, 시험된 다른 카스파아제(즉, 카스파아제-1, -2, -3 및 -8)에서도 음성대조군 "N"에서와 같이 발색이 거의 일어나지 않았다. 따라서, 전기 종류의 카스파아제에 대해서 MAGE-3의 결합이 검출되지 않았다.
결과적으로, 카스파아제-12의 C-말단에 위치한 p10영역(약 10kDa)은 MAGE-3가 카스파아제-12에 결합하는데 필수적이며, 카스파아제-12에 대한 MAGE-3의 결합은 특이적인 것이다.
실시예 5: 카스파아제-12 및 MAGE-3의 절단된 형태 사이의 결합실험
카스파아제-12 전구단백질의 p10영역에 결합할 수 있는 인자를 HeLa 세포 cDNA 라이브러리에서 탐색하였다.
카스파아제-12 전구단백질의 p10 영역을 암호화하는 유전자 절편을 pEG202에 클로닝하고 브렌트 등(R. Brent et al.)에 의해 개발된 상호작용 트래핑(interaction trapping) 법에 적용시켰다(참조: Gyuris, J. et al., Cell, 75: 791-803, 1993). 모든 결합단백질은 MAGE-3의 절단된 형태이었다. 전기 절단된 형태는 하기와 같이 기술되었다. 가장 짧은 절단된 형태(절단된 형태 1)는 MAGE-3 단백질 전체길이(서열번호 2) 94번의 글리신부터 C-말단의 글루탐산에 걸치는 아미노산 서열로 구성된다.
절단된 형태 1: 1-93의 아미노산이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구 성되는 MAGE-3 단백질
절단된 형태 2: 1-90의 아미노산이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구 성되는 MAGE-3 단백질
절단된 형태 3: 1-88의 아미노산이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구 성되는 MAGE-3 단백질
절단된 형태 4: 1-81의 아미노산이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구 성되는 MAGE-3 단백질
각각의 절단된 형태에 대해서, 상기 언급된 Gyuris 등의 방법과 똑같이 카스파아제-12에 대한 결합을 조사하였다. 간단히 말해서, 카스파아제-12 전구단백질의 p10영역을 암호화하는 유전자 절편, MAGE-3의 절단된 형태를 암호화하는 유전자 절편 및 lacZ 유전자를 출아중인 효모 균주 EGY48에 형질전환시켰다. 전기 형질전환체를 합성 갈락토오스 배지 플레이트에서 배양시켰다. 플레이트에 형성된 콜로니를 나일론 막(Hybond-N+; Amersham-Pharmacia) 위로 옮기고 효모세포를 파쇄하기 위해 액체질소에 담궜다. 파쇄된 세포가 존재하는 나일론 막을 X-gal 염색 인산완충액(참조: Gyuris, J. et al., Cell, 75: 791-803, 1993)에 담궈서 30OC에서 4시간 내지 6시간동안 방치하였다. 그 다음에, 카스파아제-12 전구단백질 p10과 MAGE-3의 절단된 형태 사이의 결합결과로 효모세포 내에서 lacZ 유전자가 발현되었을때 생성되는 β-갈락토시다아제의 효소활성에 의해 막 표면에서 발생하는 푸른 색 반응을 확인하였다.
상기 모든 MAGE-3의 절단된 형태가 강한 색깔 반응을 나타내었다. 결과적으로, Gly94부터 Glu314(C-말단)에 걸치는 MAGE-3의 일부분의 폴리펩티드조차 카스파아제-12에 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이 확인되었다.
실시예 6: MAGE-3 단백질 및 카스파아제-12(활성화형) 사이의 결합실험
본 실시예에서, 어느 정도까지 카스파아제-12 전구단백질 및 활성형 카스파아제-12가 각각 MAGE-3에 결합하는지를 GST-융합 단백질 결합실험으로서 조사하였다.
본 실험에서 사용된 활성형 카스파아제-12(이 이후 종종 p30으로 언급)는 카스파아제-12 전구단백질로부터 활성형 카스파아제-12에는 존재하지 않는 N-말단 프로도메인(prodomain)을 제거하고 N-말단에 His-His-His-His-His-His 서열을 첨가함으로써 제조되었다. 이 p30 단백질을 암호화하는 cDNA 절편을 대장균 발현벡터pRSET-A(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 대장균에서 p30이 대규모로 발현될때, 이 단백질은 자가과정(autoprocessing)에 의해 활성형으로 바뀐다.
반면, 본 실험에 사용된 불활성형 카스파아제-12는 하기와 같이 제조되었다. 간단히 말해서, 불활성형 카스파아제-12를 안정화시키기 위해(즉, 자가과정을 방지하기 위해), 카스파아제-12 활성부위에 위치한 Cys 잔기를 Ser 잔기로 대체시켜 돌연변이 p30("p30C/S"로 명명되는)을 만들었다. 전기 돌연변이를 대장균에서 대규모로 발현시켰다. 대장균 배양 및 p30 단백질의 유도합성은 Invitrogen 사의 방법과 일치하게 수행하였다. p30 및 p30C/S 모두 다 N-말단의 6x(His) 서열을 이용한 니켈 친화 크로마토그래피(Probond Affinity Resin; Invitrogen)로 정제되었다.
카스파아제-12 결합 산물의 빠른 회수 목적으로, MAGE-3 및 N-말단으로 결합된 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST)로 구성되는 융합 단백질을 암호화하는 cDNA를 제조하였다(pNB341). 간단히 말해서, MAGE-3를 암호화하는 cDNA를 대장균 발현 플라스미드 벡터 pGEX-4T-3(Amersham-Pharmacia; Sweden)으로 클로닝하여, 전자의 해독틀(reading frame)이 후자의 해독틀과 일치하도록 하여 융합유전자를 구축한다. pNB341을 대장균 XL-2 Blue MRF로 도입한 후, 세포배양 및 GST-MAGE-3 융합 단백질의 유도 합성은 Amersham-Pharmacia의 방법에 따라서 수행되었다. GST-MAGE-3 융합단백질을 대장균 추출물로부터 글루타치온 수지(Glutathione Sepharose 4B; Amersham-Pharmacia)를 사용하여 정제하였다. 정제는 Amersham-Pharmacia의 방법에 따라서 수행되었다.
정제된 GST-MAGE-3 융합단백질을 p30(활성형) 또는 p30C/S(비활성형)와 혼합하고 글루타치온 수지로부터 회수하였다. GST-MAGE-3 융합단백질과 같이 침전된 단백질을 웨스턴 블라팅으로 분석하였다.
결과가 도 5에 나타나 있다. 전기 도에서 각각의 레인의 설명은 다음과 같다.
레인 1: 활성형 카스파아제-12와 GST의 혼합실험(MAGE-3는 포함되지 않음)
레인 2: GST-MAGE-3 융합단백질과 함께 침전된 활성형 카스파아제-12
레인 3: 카스파아제-12 전구단백질과 GST의 혼합실험(MAGE-3는 포함되지 않 음)
레인 4: GST-MAGE-3 융합단백질과 함께 침전된 비활성형 카스파아제-12
도 5에서 볼 수 있듯이, p30(활성형) 및 p30C/S(비활성형) 모두 다 침전물에서 인식되었더라도, p30C/S가 p30보다 더 선명하게 인식되었다. 따라서, 비활성형 카스파아제-12가 활성형 카스파아제-12보다 훨씬 효율적으로 GST-MAGE-3 융합단백질에 결합한다(비록 둘 다 결합하지만).
실시예 7: MAGE-3에 의한 카스파아제 활성 억제
본 실시예에서,in vitro에서 합성된 카스파아제-12 전구단백질(48kDa)은 활성형 카스파아제-12에 의해 잘림으로써in vivo활성을in vitro에서 재현하였다.
활성형 카스파아제-12에 의한 카스파아제-12 전구단백질의 절단 부위는 특이적이다. 전기 절단부위는 활성형 카스파아제-12에 포함된 약 20kDa 및 약 10kDa 서브유닛(각각 p20 및 p10으로 불리는) 사이의 경계에 위치한 아스파르트산 잔기이다(도 6; 레인 2, 도 7). MAGE-3 단백질을 첨가함으로써 전기 절단반응을 억제하는 것이 가능하다. 본 실험은 하기와 같이 수행되었다.
간단히 말해서, 카스파아제-12 전구단백질을 전기 단백질을 암호화하는 cDNA 및in vitro단백질 합성 키트(TNTin vitro전사/번역 키트, Promega, U.S.A.)를 사용하여 합성하였다.35S-라벨 메티오닌(Amersham-Pharmacia)을 합성반응에 첨가하여 방사선으로 라벨링시켰다.
방사선 표지된 카스파아제-12 전구단백질, 활성형 카스파아제-12 및 MAGE-3 단백질을 20mM Tris-HCl(pH 7.0) 및 10mM dithiothreitol을 포함한 완충액에 혼합시켰다. 그 다음, 절단 반응을 37OC에서 45분간 수행하였다. 2x 전기영동 완충액[100mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS, 10% mercaptoethanol, 0.2% Bromophenol Blue, 20% glycerol]을 가하고 100OC에서 4분간 가열함으로써 반응을 종료시켰다.
반응용액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(14%)에서 발색시켰다. 겔을 센시타이저(sensitizer; Ampify; Amersham-Pharmacia)로 처리하고, 말린 후 오토레디오그래피(autoradiography)에 적용하였다. 말린 겔 안에 포함된 방사성 단백질을 BAS2500 검출시스템(Fuji film, Japan)으로 검출하였다.
결과가 도 7에 나타나 있다. 각 레인의 설명은 다음과 같다.
(1) 패널 A(Panel A)
레인 1: 방사성 메티오닌 존재하에 in vitro에서 합성된 카스파아제-12 전구 단백질
레인 2-7: 활성형 카스파아제-12(0.28μg)에 의해 잘려진 카스파아제-12 전 구단백질. 절단반응은 다음과 같은 MAGE-3 단백질 양의 존재하에 수행되었다.
레인 2(0μg), 레인 3(0.3μg), 레인 4(1.5μg), 레인 5(3μg), 레인 6(6μg), 레인 7(12μg)
레인 8: 활성형 카스파아제-12(1.1μg)에 의해 잘려진 카스파아제-12 전 구단백질. 절단반응은 12μg의 MAGE-3 단백질 양의 존재하에 수행되었다.
레인 9: 활성형 카스파아제-12(1.1μg)에 의해 잘려진 카스파아제-12 전 구단백질. 대조군. 절단반응은 MAGE-3 단백질 대신에 12μg의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)의 존재하에 수행되었다.
(2) 패널 B(Panel B)
레인 1: 패널 A, 레인 7과 유사한 시료(카스파아제-12 전구단백질이 두배로 반응 혼합물에 첨가되었다).
레인 2: 패널 A, 레인 7과 유사한 시료(24μg의 MAGE-3 단백질의 존재하에절단반응이 수행되었다).
레인 3: 패널 A, 레인 9과 같은 시료
도 7A의 레인 2 내지 7은 점차 증가하는 MAGE-3의 양(0 내지 12μg)이 반응물에 존재하는 실험결과를 보여준다. 12μg의 MAGE-3 첨가는 카스파아제-12에 의한 절단반응을 거의 완전하게 억제하였다. 대조군으로서 MAGE-3대신에 12μg의 소혈청 알부민이 첨가되었을때는, 억제효과가 전혀 관찰되지 않았다(레인 9, 도 7A). 억제효과는 주로 MAGE-3의 카스파아제-12 전구단백질로의 결합에 기인한 것이다.
더 나아가서, 12μg의 MAGE-3에 의해 거의 완전하게 절단반응이 억제되는 조건하에서, 활성형 카스파아제-12의 과잉첨가(즉, 1.1μg; 도 7A의 레인 2-7에 사용된 양의 4배)는 절단반응을 되살리지 못하였다(레인 8, 도 7A). 반면, 비슷한 조건에서 기질(카스파아제-12 전구단백질)의 과잉첨가는(즉, 0.4μl의 in vitro 번역된 단백질 용액; 패널 A의 레인 1 내지 9 및 패널 B의 레인 1에 사용된 양의 2배) 특이적인 절단이 다시 검출되었다(레인 2, 도 7B).
이 결과는 카스파아제가 특이한 본자내 절단에 의해 활성화된다는 것을 밝혀준다. MAGE-3와 카스파아제-12 전구단백질의 결합은 카스파아제-12의 활성화를 강하게 억제한다는 것을 또한 밝혀준다.
실시예 8: 배양세포에서 MAGE-3의 항-세포자멸 효과
본 실시예는 배양세포에서 MAGE-3의 과발현이 ER-스트레스 의존성 세포자멸(endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis)에 대한 세포의 저항성을 강화시키는지에 대한 확인 실험이었다.
세포수준에서 MAGE-3에 의한 카스파아제-12 활성화 억제를 조사하기 위해, MAGE-3를 많이 발현하는 세포 클론을 만들었다. 그 다음, 세포자멸 자극에 대한 세포의 반응을 조사하였다. MAGE-3의 발현은 정소(testis)를 제외하고는 정상세포에서 검출되지 않는다(참조: Van Pel, A. et al., Immunol. Rev. 145:229-250, 1995).
간단히 말해서, MAGE-3를 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pNB179를 생쥐의 미오블라스트(myoblast) 세포주인 C2C12에 수퍼펙트 트랜스펙션 키트(Superfect Transfection kit)를 사용하여 도입하였다. pNB179는 네오마이신 저항성 유전자를 가지고 있기 때문에, 전기 플라스미드가 크로모좀 안에 도입되어 형질전환된 세포를 항생제 제네티신(Geneticin; Gibco-BRL)을 포함하는 배지에서 선택적으로 성장시켰다. 2주후에, 배양플레이트에 형성된 저항성 콜로니를 따서, 배양하고 클론을 골라내었다. 각 클론에서 MAGE-3 발현양은 웨스턴 블라팅(항-MAGE-3 항체를 사용하여)으로 결정하였다. 이리하여, MAGE-3를 높게 발현하는 두개의 클론(C2/MA13 및 C2/MA21)을 획득하였다.
카스파아제-12는 ER-의존성 세포자멸 유도자극에 의해 활성화된다(참조: Nakagawa, T. et al., Nature, 403: 98-103, 2000). 그 다음에, 본 발명자들은 ER-특이적 칼슘 ATPase 억제제인 탑시가긴(thapsigargin; Calbiochem, U.S.A.; 참조: Thastrup, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2466-2470, 1990)을 0.4μM의 농도로 상기 기술된 고발현 클론의 배양액에 첨가하였다(24시간 배양).
그 결과, 세포내 칼슘 항상성이 파괴되고, 카스파아제-12의 활성이 촉진되었다. 결과적으로, 세포에서 세포자멸이 유도되었다. 보다 구체적으로, C2C12 세포(모균주)를 0.4μM의 탑시가긴으로 24시간동안 처리했을때, 50% 또는 그 이상의 세포가 세포자멸 형태를 나타내며 죽었다(도 8의 우측 상단 패널).
반면, C2/MA13 및 C2/MA21 클론을 같은 방법으로 탑시가긴으로 처리했을때, 세포는 저항성을 나타내었다. 현미경 관찰에 의하면, 전기 클론의 90% 또는 그 이상의 세포가 정상적인 형태를 유지하였다(도 8의 우측 중간 및 우측 하단 패널). 좌측 패널은 0.1% 디메틸 설포닉 산(dimethyl sulfonic acid)로 처리한 대조군 실험의 결과를 나타낸다.
결과적으로, 탑시가긴 처리에 대한 저항성을 정량하기 위하여, 각 클론의 생존률을 계산하였다. Cell Counting Kit-8(Dojindo Co., Japan)을 사용하여 측정한 결과, C2C12의 생존률은 탑시가긴 처리 24시간 후 50%로 감소한 반면, C2/MA13 및 C2/MA21의 생존률은 높은 수준(75%)를 유지하였다. 따라서, MAGE-3 고발현 조건에서 세포는 ER-특이적 스트레스에 대해 저항성을 가진다는 것이 밝혀졌다. 이 결과는 MAGE-3가 세포자멸의 발생 및 진행과정을 억제한다는 것을 의미한다.
본 명세서에 인용된 논문, 특허 및 특허출원은 온전한 형태로 참고문헌으로서 이 안에 포함되어 있다.
발명의 효과
본 발명에 따라서, 카스파아제-12에 특이적으로 결합하여 카스파아제-12 단백질의 활성을 억제하는 단백질 및 전기 단백질을 포함한 세포사멸 억제제를 제공한다. 전기 단백질은 세포자멸(apoptosis)과 같은 세포사멸(cell death)을 억제하는 약물로서 유용하다.
Claims (18)
- 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질:(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12(caspase-12)의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으로 구성되는 단백질.
- 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자:(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으로 구성되는 단백질.
- 하기 (c) 및 (d)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 DNA로 구성되는 유전자:(c) 서열번호 3에 개시된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA; 및,(d) 엄중한(stringent) 조건에서 서열번호 3에 개시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화(hybridize)하고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질을 암호화하는DNA.
- 제 2항 또는 제 3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 4항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체(transformant).
- 제 5항의 형질전환체를 배지에서 배양하고 전기 배양액으로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 단백질을 생산하는 방법.
- MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)와 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질(precursor)의 결합에 의해 형성된 복합체(complex).
- 유효성분으로서 MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태를 함유하는 세포사멸(cell death) 억제제.
- 제 8항에 있어서,MAGE-3 단백질은 하기 (e) 및 (f)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는세포사멸 억제제:(e) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(f) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 2에 개시된 아미노산으 로 구성되는 단백질.
- 제 8항에 있어서,MAGE-3 단백질의 절단된 형태는 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는세포사멸 억제제:(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으로 구성되는 단백질.
- 제 8항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,세포사멸은 세포자멸(apoptosis), 괴사(necrosis), 예정화된 세포사멸(scheduled cell death), 프로그램화된 세포사멸(programmed cell death) 및 세포 손상(cell injury)을 포함하는 그룹으로부터 선 택되는 적어도 어느 한 가지 이상인 것을 특징으로 하는세포사멸 억제제.
- 유효성분으로서 MAGE-3 단백질 및/또는 전기 단백질의 절단된 형태를 함유하는 세포사멸 연관 질병 치료제.
- 제 12항에 있어서,MAGE-3 단백질은 하기 (e) 및 (f)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는치료제:(e) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(f) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 2에 개시된 아미노산으 로 구성되는 단백질.
- 제 12항에 있어서,MAGE-3 단백질의 절단된 형태는 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는치료제:(a) 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열로 구성되는 단백질; 및,(b) 한 개 또는 여러 개 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 가지고, 카스파아제-12의 활성을 억제하는 서열번호 4에 개시된 아미노산으 로 구성되는 단백질.
- 제 12항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서,세포사멸 연관 질병은 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease), 자가면역질환(autoimmune disease), 근위축증(amyotrophy) 및 장기부전증(organ disorder)을 포 함하는 그룹으로부터 선택되는 적어도 어느 한 가지 이상인 것을 특징으로 하는치료제.
- MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)와 카스파아제-12 또는 카스파아제-12 전구단백질(precursor)이 결합하는 단계를 포함하는 카스파아제-12의 활성을 억제하는 방법.
- 조직 또는 세포에 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태(truncated form)를 특이적으로 인식하는 항체를 처리하여, 전기 조직 또는 세포에서 전기 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 항-세포자멸 활성(anti-apoptotic activity)을 검출하는 방법(MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태의 과발현 검출은 세포조직이 항-세포자멸 활성을 갖고 있다는 것을 암시한다).
- 조직 또는 세포에서 MAGE-3 단백질 또는 전기 단백질의 절단된 형태를 암호화하는 mRNA의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 항-세포자멸 활성을 검출하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41927/2000 | 2000-02-18 | ||
| JP2000041927A JP3603138B2 (ja) | 2000-02-18 | 2000-02-18 | 細胞死抑制タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010082753A true KR20010082753A (ko) | 2001-08-30 |
Family
ID=18565071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020010008178A KR20010082753A (ko) | 2000-02-18 | 2001-02-19 | 세포사멸 억제단백질 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020164738A1 (ko) |
| EP (1) | EP1126027A1 (ko) |
| JP (1) | JP3603138B2 (ko) |
| KR (1) | KR20010082753A (ko) |
| CN (1) | CN1316432A (ko) |
| SG (1) | SG89378A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0612342D0 (en) * | 2006-06-21 | 2006-08-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method |
| JP2010530736A (ja) * | 2007-05-25 | 2010-09-16 | バーンハム インスティトゥート フォー メディカル リサーチ | タプシガルジンにより誘導される細胞死の阻害剤 |
| CN102250842A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-11-23 | 昆明理工大学 | 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
-
2000
- 2000-02-18 JP JP2000041927A patent/JP3603138B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-16 EP EP01301361A patent/EP1126027A1/en not_active Withdrawn
- 2001-02-16 SG SG200100870A patent/SG89378A1/en unknown
- 2001-02-16 US US09/784,199 patent/US20020164738A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-18 CN CN01116517A patent/CN1316432A/zh active Pending
- 2001-02-19 KR KR1020010008178A patent/KR20010082753A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020164738A1 (en) | 2002-11-07 |
| SG89378A1 (en) | 2002-06-18 |
| EP1126027A1 (en) | 2001-08-22 |
| CN1316432A (zh) | 2001-10-10 |
| JP3603138B2 (ja) | 2004-12-22 |
| JP2001231566A (ja) | 2001-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ottilie et al. | Dimerization properties of human Bad: Identification of a BH-3 domain and analysis of its binding to mutant Bcl-2 and Bcl-Xl proteins | |
| Kolpakova et al. | Cloning of an intracellular protein that binds selectively to mitogenic acidic fibroblast growth factor | |
| Mueller et al. | Human RanBP3, a group of nuclear RanGTP binding proteins | |
| US6831155B2 (en) | Inhibition of p53 degradation | |
| US6545128B1 (en) | Anti-bax inhibitor protein antibodies | |
| US6570002B1 (en) | Inhibitor of programmed cell death | |
| US6245885B1 (en) | Bax-mediated apoptosis modulating reagents and methods | |
| US5955429A (en) | Human apoptosis-associated protein | |
| US20020086830A1 (en) | Human apoptosis-related calcium-binding protein | |
| KR20010082753A (ko) | 세포사멸 억제단백질 | |
| US7070940B2 (en) | Method for determining the ability of a compound to modify the interaction between parkin and the p38 protein | |
| US20080045608A1 (en) | Gene Encoding a Guanine Nucleotide Exchange Factor Binding to Rhoa | |
| JP2003210183A (ja) | ヒトＩκＢ−β | |
| JP4544715B2 (ja) | ラットｂｃｌ−ｘ遺伝子の改変型ｃＤＮＡと改変型タンパク質 | |
| US8173778B2 (en) | Antibody to a guanine nucleotide exchange factor | |
| US7166701B2 (en) | Human survivin interacting protein 1 (SIP-1) | |
| JPH10117788A (ja) | ヒト・ｍｙｔ−１キナーゼクローン | |
| JP4615230B2 (ja) | ガラクトシルセラミド発現因子−１のｃ領域によるがん細胞転移抑制剤 | |
| US5972654A (en) | Human microfibril-associated glycoprotein 4 splice variant | |
| US20020001823A1 (en) | Novel compounds | |
| JPH11243971A (ja) | Ｓｂｐｅｒｒ４ポリペプチドおよびポリヌクレオチド | |
| JP3993439B2 (ja) | Ａｉｐ処理により発現の変化する新規遺伝子群 | |
| US7011951B1 (en) | Apoptosis-associated gene | |
| Wu et al. | TS G) 1996 Nature Publishing Group http://www. nature. com/naturegenetics | |
| US20020061553A1 (en) | Partners of the PTB1 domain of FE65, preparation and uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |